CN114259327A - 一种基于3d打印用于髋臼骨缺损重建的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法，包括如下步骤：S1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的制备、表征以及细胞相容性检测；S2、电子束熔融3D打印的钛金属植入物生物学特性的体外表征；S3、电子束熔融3D打印的钛金属植入物生物学特性的体内表征；S4、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的临床研究。本方案基于CT三维重建髋臼骨缺损形态，借助计算机辅助设计（CAD）建立数字化垫块填充物模型，利用电子束熔融(EMB)3D打印技术制作个性化且具有良好生物学特性的金属垫块内植物,以实现对髋臼骨缺损的有效重建，从而为髋关节翻修术中骨缺损难题带来新的解决方案。

Description

一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法

技术领域

本发明属于医疗技术领域，具体涉及一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法。

背景技术

髋骨由髂骨、坐骨和耻骨三部分组成，其外侧面有一个大而深的窝称为髋臼，与股骨头组成髋关节。髋臼是髋关节的重要组成部分，由于髋关节负重大，活动度大，因此很容易发生损伤。

随着我国人口老龄化进程的加快以及国人生活质量的不断提升，因髋关节疾患接受关节置换的患者数量逐年增加且呈年轻化的趋势；据不完全统计，我国每年接受髋关节置换的患者高达近30万人次，随之而来的髋关节翻修数量也与日俱增；髋关节翻修的常见原因包括假体无菌性松动、感染、聚乙烯内衬磨损、骨溶解、假体周围骨折等；在髋关节翻修术中，严重骨缺损的处理可谓是最具挑战性的难题；骨缺损通常以髋臼侧较为多见，髋臼骨缺损过多将直接导致翻修术中臼杯无法获得有效支撑，压配失效，假体稳定性难以保证；据Johanson所报道，在髋关节翻修手术中合并髋臼骨缺损的占17％，但手术失败率却高达30％；因此，髋臼骨缺损是否能得到有效重建，将直接影响髋关节翻修手术的成败；

正确评估和处理髋臼骨缺损是髋关节翻修手术成功的关键；Paprosky分型由Paprosky等学者在1994年提出，由于这种分型方法可以判断预后和指导治疗，被越来越多地应用于临床；Paprosky分型主要根据坐骨骨溶解程度、泪滴破坏程度、股骨头中心内移及上移程度将髋臼骨缺损分为三型；其中PaproskyⅠ、ⅡA型髋臼骨缺损，由于骨缺损较小通常无需进行额外的植骨；而对于PaproskyⅡB及以上的骨缺损类型则需要进行结构性植骨，通常需借助自体、异体骨块或成品金属垫块来充填；但髋臼骨缺损形态多变，对于结构性植骨，无论是采用自体/异体骨还是使用成品金属垫块，从外型而言都无法与宿主骨的缺损部分形成完好的契合，术中需进行额外的修整磨搓，操作比较繁琐，且无法达到解剖重建的目的；同时同种异体骨块或成品金属垫块价格都十分昂贵，临床也很难推广；因此，对于髋关节翻修术中髋臼侧骨缺损重建的问题目前临床尚缺乏便捷有效且经济实用的填充物；

3D打印技术是快速成形(RapidPrototype,RP)技术的一种，其以三维数据模型为基础，通过计算机辅助设计(ComputerAidedDesign，CAD)完成一系列模块设计和数字切片处理，并将这些切片的信息传送到3D打印机上,以粉末状或液态的金属、塑料等粘合材料为原料，通过分层加工、叠加成型的方式来构建实体物件，也称为“增材制造”；

电子束熔融技术(ElectronBeamMelting，EBM)，是近年来新兴的快速成型制造技术，其原理是将三维模型数据导入EBM打印设备，在真空环境中以金属粉末为原料，通过高能电子束经磁场诱导偏转聚焦后所产生的高能使金属微粒熔融，再通过凝固融合形成金属薄层，经过逐层铺设的方式完成金属实体的构建；目前，国内已有一些采用EBM技术3D打印钛合金内植物(见图1)用于临床，其短期疗效令人满意，但是此方法难以实现对髋臼骨缺损的有效重建。

随着3D打印技术在医疗领域的不断发展与革新，为骨关节外科个性化人工植入物的运用带来了曙光；本课题基于CT三维重建髋臼骨缺损形态，借助计算机辅助设计(CAD)建立数字化垫块填充物模型，利用电子束熔融(EMB)3D打印技术制作个性化且具有良好生物学特性的金属垫块内植物,以实现对髋臼骨缺损的有效重建，从而为髋关节翻修术中骨缺损难题带来新的解决方案。

因此需要设计一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法，包括如下步骤：

S1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的制备、表征以及细胞相容性检测；

A1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的制备：

工程师在UG软件中分别绘制出直径为1.5cm高度为0.5cm以及直径为0.4cm高度为0.15cm的圆柱形人工垫块的三维数字模型图，并将数据以STL格式保存并导入3D打印主程序中进行分层切片处理，再将获得的各断层数据导入EBM设备，进行产品的打印制作；

在粉仓内装入钛合金(Ti6Al4V)粉末，由粉耙均匀铺设在工作平台上，厚度为0.5～1mm；关闭舱门，工作舱抽至真空，真空度需达到10-4～10-5mbar；电子束枪在电脑程序控制下发射高能电子束并聚焦至工作平台，受到高能电子束照射的钛金属粉末颗粒瞬间被加热熔融再经冷却凝固，通过分层加工、叠加成型的方式打印出所需要的金属定制物；去除未熔融的金属粉末，并经后续的抛光加工等处理即可获得最终的个性化金属垫块成品，经消毒后无菌存放备用；

B1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的孔隙率检测；

孔隙率的测定：采用排液法测定孔隙率；取直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块，将其浸没在已知体积(V1)的无水乙醇中，减压使乙醇充满支架内部所有孔隙，总计体积为V2；一段时间后，轻轻取出支架，剩余乙醇体积标记为V3；孔隙率由公式(a)得到；

Porosity＝(V1–V3)/(V2–V3) (a)

C1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的表面结构观察；

形貌及结构：分别将3D打印人工垫块及传统成品人工垫块在20mA条件下喷金2min制备样品，用扫面电镜观察其表面结构以及孔隙大小等；

D1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的抗压强度测试；

分别取直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块各6个式样，在37℃、100％相对湿度环境中养护72小时，上下表面打磨平整，置于万能试验机上进行压缩测试；加载速率为1mm/min，记录载荷-位移曲线；按照以下公式(b)计算得出式样的抗压强度值：

P＝4NπD2 (b)

式中P代表式样的抗压强度，N代表载荷峰值，D代表式样的直径；

S2、电子束熔融3D打印的钛金属植入物生物学特性的体外表征；

A2、成骨细胞的培养；

将MC3T3-E1细胞系用0.25％Trypsin-EDTA消化、计数，取1×107个细胞，接种于直径为75cm2的细胞培养皿中，于37℃、5％CO2条件下培养，每皿加入8～10mL培养基，隔天换液；待细胞90％融合后，用0.25％Trypsin-EDTA消化传代；

B2、细胞在材料表面黏附增殖的形态学检测；

将直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块进行辐照灭菌以用于生物学试验；两种垫块各取30个置入24孔板中，一个垫块对应一孔，加入细胞培养基于37℃、5％CO2条件下浸泡3天后，每孔植入1×105个MC3T3-E1细胞，另取15孔无材料孔亦植入1×105个MC3T3-E1细胞作为空白对照；

分别于第1、3、7、14、21天从各组各取3孔吸去培养基并用PBS溶液清洗后，加入4％多聚甲醛固定10分钟；随后用2％BSA溶液封闭2小时，封闭结束后于避光环境下依次加入工作浓度为5μg/mL的FITC-鬼笔环肽溶液和DAPI溶液，各反应20分钟，反应结束后均吸除反应溶液并用PBS溶液清洗；将染色后的样品置于荧光显微镜下观察各组材料表面细胞形态、数量以及孔隙内细胞长入情况，并与空白对照组细胞形态相对比；

另对各时间点的各组细胞-垫块复合物行SEM检测；第1、3、7、14、21天时于3D打印人工垫块组及传统成品人工垫块组各取出3个样品以PBS洗净，并以1％锇酸于4℃固定4小时，随后采用酒精梯度脱水，各浓度脱水时间不小于20分钟；完成脱水后空气干燥，并抽真空、喷金，采用SEM观察垫块表面细胞的数量、数量以及孔隙内细胞长入情况；

C2、垫块生物相容性的定量检测；

将直径为0.4cm高度为0.15cm3D打印人工垫块及传统成品人工垫块置于96孔板中，另设无材料对照组，于各孔中植入1×104个MC3T3-E1细胞进行培养，取第1、3、7、14、21天作为观察点行MTS法检测分析；于各时间点各组取3孔，吸尽孔内的培养基，并用PBS溶液清洗后再于各孔内加入100mL细胞完全培养基及20μL、1.90mg/mL的MTS溶液，并于细胞培养箱内孵育3小时后从各孔内吸出100μL于新孔中，运用紫外分光光度仪检测490nm波长处的OD值，记录结果，绘制各组细胞生长曲线；

S3、电子束熔融3D打印的钛金属植入物生物学特性的体内表征；

A3、山羊股骨缺损模型的建立及材料植入术前先采用电子束熔融3D打印技术制备φ1cm×1cm/φ3cm×3cm/φ5cm×5cm的钛金属垫块，辐照灭菌消毒后无菌存放备用；

选取重20～25kG青山羊；提前送至动物中心分笼饲养一周以适应环境；试验开始前肌注速眠新(0.15mL/kG)麻醉成功后,将山羊右侧卧位固定于实验台上，后肢备皮,用2.5％碘酒、75％酒精棉球消毒、铺巾；取股骨外侧下端纵向切口长约5cm，依次切开皮肤、皮下组织、阔筋膜，显露外侧股骨髁，采用电钻钻取出φ1cm×1cm/φ3cm×3cm/φ5cm×5cm缺损；并将各组无菌保存的材料置入缺损部位；其中，传统成品人工垫块组以运用各种大小的成品垫块尽可能填满缺损为宜；假手术组中，只行皮肤及肌肉的切开与缝合，不行股骨髁钻孔及样品置入；随后，采用生理盐水冲洗伤口，逐层缝合，无菌敷料包扎，不作外固定，自由活动；术前、中及术后3天肌注青霉素8万单位，链霉素0.5g；高蛋白青饲料圈养,术后12天拆线；

B3、体内缺损填补修复检测；

B31、Micro-CT检测:

术后4、8、12周采用速眠新对青山羊进行麻醉后，行CT检测，同时用相关软件分析骨体积分数(BoneVolume/TotalVolume，BV/TV)、骨密度(BoneMineralDensity，BMD)等指标，并进行缺损部位三维重建以直观了解缺损填补、骨长入及缺损修复情况；

B32、组织形态学观察:

第4、8、12周时处死山羊，取出包含样品的组织制作切片；分别行H&E及MASSON三色染色，并于光学显微镜下观察缺损填补、骨长入及缺损修复情况；

H&E染色具体步骤为：将切片再次进行梯度脱水后加入苏木精溶液中染色5分钟，流水洗净后采用1％盐酸乙醇处理3秒，再行水洗蓝化30分钟后酒精梯度脱水，并采用伊红染色20秒，采用纯乙醇脱水并经二甲苯使切片透明，中性树胶封固；

MASSON三色染色具体步骤为：将切片进行铬化处理后采用Weiger铁苏木素染色10分钟，用酸性乙醇分化液分化，并用MASSON蓝化液返蓝；随后采用丽春红品红染色液染色10分钟后用磷钼酸溶液分化2分钟，再用苯胺蓝染色液染色2分钟；95％乙醇及无水乙醇依次脱水后，采用二甲苯使切片透明，中性树胶封固；

S4、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的临床研究；

A4、电子束熔融(EBM)3D打印制作个体化多孔金属垫块；

根据外科医生术前规划结果，通过前述办法制备电子束熔融3D打印个体化多孔金属垫块，并采用辐照灭菌后无菌封存以备术中使用；

B4、前期实验都成功后，伦理委员会批准，报批相关手续，建立传统成品人工垫块对照组，进行临床植入试验；

研究对象的筛选:

患者术前拍摄骨盆正位X线片，根据X线片髋臼旋转中心上移程度、坐骨骨溶解、泪滴骨溶解及Kohler线是否破坏等情况对髋臼侧骨缺损进行Paprosky分型评估；

入选标准：PaproskyⅡB及以上严重骨缺损类型；

排除标准：(1)PaproskyⅠ、ⅡA型骨缺损，由于该型骨缺损较小通常无需进行植骨；(2)对金属植入物过敏者；(3)合并其他严重疾病或全身评估不能耐受手术者；(4)伴有髋关节感染或全身其他部位活动性感染者；(5)严重骨质疏松者；(6)除髋关节以外，下肢的其他关节(膝、踝)疾患致功能严重受损影响下肢功能评估者；(7)筛选前6个月有酒精或药物滥用史；(8)怀孕或哺乳期妇女，或期望生育的妇女；

C4、骨盆数字化三维模型的建立

术前采用金属去伪影技术，利用64层螺旋CT对患者的骨盆进行层厚1mm的薄层扫描；CT图像文件以DICOM格式保存,并导入交互式医学影像控制***,重建患者的骨盆数字化三维模型图；

D4、1:1半骨盆3D模型的制作；

将MIMICS软件建立的数字化三维骨盆模型数据导入工业设计软件UG中进行进一步绘制加工，最后导入到3D打印机主程序中以聚乳酸为原料，按照逐层打印的方式制作出真人大小的1:1半骨盆模型；

E4、骨缺损的评估及手术方案的规划；

根据MIMICS软件获得的三维重建图像及1:1半骨盆3D实体模型进一步评估患者髋臼骨缺损情况，包括髋臼前壁、后壁、内壁、臼顶等的骨缺损量、外形以及残存宿主骨量等情况；根据骨缺损情况，利用计算机辅助设计规划出个性化垫块的三维模型，在重建图像上绘制出其外形、大小及最佳放置位置、螺钉固定数量、方向等，同时确定翻修假体髋臼金属外杯的大小及安装位置，并生成三维效果图；经手术医生确认满意后，根据计算机辅助设计的垫块样式利用EBM3D打印机制作出实体垫块模型，由外科医生在1：1半骨盆模型上进行术前手术操作模拟，评估髋臼骨缺损的预填充效果；

F4、翻修手术置入3D打印内植物重建骨缺损；

经医院伦理委员会批准，告知患者并签署手术及植入物知情同意书；手术均由本课题组医生完成；手术采用改良Harding入路切开暴露，术中彻底清创并取出松动假体，臼杯周围骨溶解和骨缺损与术前3D打印半骨盆模型所示一致；髋臼侧经磨搓后按照术前计划方案在髋臼骨缺损处置入3D打印钛金属垫块，并按术前设计制作的钉孔方向置入螺钉固定；安放金属臼杯，压配牢靠后安装聚乙烯内衬，最后置入生物型股骨柄假体并安装陶瓷球头；

G4、术后临床疗效及生物力学评估:

①与同种异体结构性植骨和使用成品金属垫块的翻修手术建立对照，对比术中时间、出血量、术中并发症情况；

②术后1、3、6、9、12个月对患者进行跟踪随访，评估VAS疼痛评分、Harris功能评分；

③拍摄骨盆X线平片及薄层CT，评估内植物位置以及骨长入情况；

④检测患者血液中V、Al等相关金属离子浓度，评估假体的生物毒性。

本发明的技术效果和优点：本发明提出的一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法，与现有技术相比，具有以下优点：

本方案基于CT三维重建髋臼骨缺损形态，借助计算机辅助设计(CAD)建立数字化垫块填充物模型，利用电子束熔融(EMB)3D打印技术制作个性化且具有良好生物学特性的金属垫块内植物,以实现对髋臼骨缺损的有效重建，从而为髋关节翻修术中骨缺损难题带来新的解决方案。

附图说明

图1为电子束熔融3D打印的钛金属植入物的结构示意图；

图2为电子束熔融3D打印机及其内部构造的结构示意图；

图3为以钛合金粉末逐层打印制作一体化金属内植物的结构示意图；

图4为利用MIMICS软件建立骨盆三维数字模型的结构示意图；

图5为利用3D打印机制作的聚乳酸1:1半骨盆模型的结构示意图；

图6为1例PaproskyⅡB型骨缺损经计算机辅助设计的垫块与假体预安放位置效果图及3D打印模型实物的示意图；

图7为1例PaproskyⅢA型骨缺损，通过计算机辅助设计垫块构形及预安装位置，并利用3D打印实物模型完成术前规划及手术模拟的示意图；

图8为Harris功能评分格式图；

图9为基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图2-图9，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图2-图9所示，本发明提供一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法，包括如下步骤：

S1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的制备、表征以及细胞相容性检测；

A1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的制备：

工程师在UG软件中分别绘制出直径为1.5cm高度为0.5cm以及直径为0.4cm高度为0.15cm的圆柱形人工垫块的三维数字模型图，并将数据以STL格式保存并导入3D打印主程序中进行分层切片处理，再将获得的各断层数据导入EBM设备，进行产品的打印制作，如图2所示，图中左侧为瑞典Arcam，右侧为其内部构造；

在粉仓内装入钛合金(Ti6Al4V)粉末，由粉耙均匀铺设在工作平台上，厚度为0.5～1mm；关闭舱门，工作舱抽至真空，真空度需达到10-4～10-5mbar；电子束枪在电脑程序控制下发射高能电子束并聚焦至工作平台，受到高能电子束照射的钛金属粉末颗粒瞬间被加热熔融再经冷却凝固，通过分层加工、叠加成型的方式打印出所需要的金属定制物，如图3所示；去除未熔融的金属粉末，并经后续的抛光加工等处理即可获得最终的个性化金属垫块成品，经消毒后无菌存放备用；

B1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的孔隙率检测；

孔隙率的测定：采用排液法测定孔隙率；取直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块，将其浸没在已知体积(V1)的无水乙醇中，减压使乙醇充满支架内部所有孔隙，总计体积为V2；一段时间后，轻轻取出支架，剩余乙醇体积标记为V3；孔隙率由公式(a)得到；

Porosity＝(V1–V3)/(V2–V3) (a)

C1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的表面结构观察；

形貌及结构：分别将3D打印人工垫块及传统成品人工垫块在20mA条件下喷金2min制备样品，用扫面电镜观察其表面结构以及孔隙大小等；

D1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的抗压强度测试；

分别取直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块各6个式样，在37℃、100％相对湿度环境中养护72小时，上下表面打磨平整，置于万能试验机上进行压缩测试；加载速率为1mm/min，记录载荷-位移曲线；按照以下公式(b)计算得出式样的抗压强度值：

P＝4NπD2 (b)

式中P代表式样的抗压强度，N代表载荷峰值，D代表式样的直径；

S2、电子束熔融3D打印的钛金属植入物生物学特性的体外表征；

A2、成骨细胞的培养；

将MC3T3-E1细胞系用0.25％Trypsin-EDTA消化、计数，取1×107个细胞，接种于直径为75cm2的细胞培养皿中，于37℃、5％CO2条件下培养，每皿加入8～10mL培养基，隔天换液；待细胞90％融合后，用0.25％Trypsin-EDTA消化传代；

B2、细胞在材料表面黏附增殖的形态学检测；

将直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块进行辐照灭菌以用于生物学试验；两种垫块各取30个置入24孔板中，一个垫块对应一孔，加入细胞培养基于37℃、5％CO2条件下浸泡3天后，每孔植入1×105个MC3T3-E1细胞，另取15孔无材料孔亦植入1×105个MC3T3-E1细胞作为空白对照；

分别于第1、3、7、14、21天从各组各取3孔吸去培养基并用PBS溶液清洗后，加入4％多聚甲醛固定10分钟；随后用2％BSA溶液封闭2小时，封闭结束后于避光环境下依次加入工作浓度为5μg/mL的FITC-鬼笔环肽溶液和DAPI溶液，各反应20分钟，反应结束后均吸除反应溶液并用PBS溶液清洗；将染色后的样品置于荧光显微镜下观察各组材料表面细胞形态、数量以及孔隙内细胞长入情况，并与空白对照组细胞形态相对比；

另对各时间点的各组细胞-垫块复合物行SEM检测；第1、3、7、14、21天时于3D打印人工垫块组及传统成品人工垫块组各取出3个样品以PBS洗净，并以1％锇酸于4℃固定4小时，随后采用酒精梯度脱水，各浓度脱水时间不小于20分钟；完成脱水后空气干燥，并抽真空、喷金，采用SEM观察垫块表面细胞的数量、数量以及孔隙内细胞长入情况；

C2、垫块生物相容性的定量检测；

将直径为0.4cm高度为0.15cm3D打印人工垫块及传统成品人工垫块置于96孔板中，另设无材料对照组，于各孔中植入1×104个MC3T3-E1细胞进行培养，取第1、3、7、14、21天作为观察点行MTS法检测分析；于各时间点各组取3孔，吸尽孔内的培养基，并用PBS溶液清洗后再于各孔内加入100mL细胞完全培养基及20μL、1.90mg/mL的MTS溶液，并于细胞培养箱内孵育3小时后从各孔内吸出100μL于新孔中，运用紫外分光光度仪检测490nm波长处的OD值，记录结果，绘制各组细胞生长曲线；

S3、电子束熔融3D打印的钛金属植入物生物学特性的体内表征；

A3、山羊股骨缺损模型的建立及材料植入术前先采用电子束熔融3D打印技术制备φ1cm×1cm/φ3cm×3cm/φ5cm×5cm的钛金属垫块，辐照灭菌消毒后无菌存放备用；

选取重20～25kG青山羊；提前送至动物中心分笼饲养一周以适应环境；试验开始前肌注速眠新(0.15mL/kG)麻醉成功后,将山羊右侧卧位固定于实验台上，后肢备皮,用2.5％碘酒、75％酒精棉球消毒、铺巾；取股骨外侧下端纵向切口长约5cm，依次切开皮肤、皮下组织、阔筋膜，显露外侧股骨髁，采用电钻钻取出φ1cm×1cm/φ3cm×3cm/φ5cm×5cm缺损；并将各组无菌保存的材料，如表1所示，置入缺损部位；其中，传统成品人工垫块组以运用各种大小的成品垫块尽可能填满缺损为宜；假手术组中，只行皮肤及肌肉的切开与缝合，不行股骨髁钻孔及样品置入；随后，采用生理盐水冲洗伤口，逐层缝合，无菌敷料包扎，不作外固定，自由活动；术前、中及术后3天肌注青霉素8万单位，链霉素0.5g；高蛋白青饲料圈养,术后12天拆线；

表1.体内试验分组

B3、体内缺损填补修复检测；

B31、Micro-CT检测:

术后4、8、12周采用速眠新对青山羊进行麻醉后，行CT检测，同时用相关软件分析骨体积分数(BoneVolume/TotalVolume，BV/TV)、骨密度(BoneMineralDensity，BMD)等指标，并进行缺损部位三维重建以直观了解缺损填补、骨长入及缺损修复情况；

B32、组织形态学观察:

第4、8、12周时处死山羊，取出包含样品的组织制作切片；分别行H&E及MASSON三色染色，并于光学显微镜下观察缺损填补、骨长入及缺损修复情况；

H&E染色具体步骤为：将切片再次进行梯度脱水后加入苏木精溶液中染色5分钟，流水洗净后采用1％盐酸乙醇处理3秒，再行水洗蓝化30分钟后酒精梯度脱水，并采用伊红染色20秒，采用纯乙醇脱水并经二甲苯使切片透明，中性树胶封固；

MASSON三色染色具体步骤为：将切片进行铬化处理后采用Weiger铁苏木素染色10分钟，用酸性乙醇分化液分化，并用MASSON蓝化液返蓝；随后采用丽春红品红染色液染色10分钟后用磷钼酸溶液分化2分钟，再用苯胺蓝染色液染色2分钟；95％乙醇及无水乙醇依次脱水后，采用二甲苯使切片透明，中性树胶封固；

S4、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的临床研究；

A4、电子束熔融(EBM)3D打印制作个体化多孔金属垫块；

根据外科医生术前规划结果，通过前述办法制备电子束熔融3D打印个体化多孔金属垫块，并采用辐照灭菌后无菌封存以备术中使用；

B4、前期实验都成功后，伦理委员会批准，报批相关手续，建立传统成品人工垫块对照组，进行临床植入试验；

研究对象的筛选:

患者术前拍摄骨盆正位X线片，根据X线片髋臼旋转中心上移程度、坐骨骨溶解、泪滴骨溶解及Kohler线是否破坏等情况对髋臼侧骨缺损进行Paprosky分型评估，见表2；

表2.Paprosky分型参照表

类型	股骨头中心移位	坐骨骨溶解	Kohler线	泪滴
					I	较小(<3cm)	无	完整	完整
IIA	轻度(<3cm)	轻度	完整	完整
					IIB	中度(<3cm)	轻度	完整	完整
IIC	轻度(<3cm)	轻度	破坏	中度骨溶解
					IIIA	严重(>3cm)	中度	完整	中度骨溶解
IIIB	严重(>3cm)	严重	破坏	重度骨溶解

入选标准：PaproskyⅡB及以上严重骨缺损类型；

排除标准：(1)PaproskyⅠ、ⅡA型骨缺损，由于该型骨缺损较小通常无需进行植骨；(2)对金属植入物过敏者；(3)合并其他严重疾病或全身评估不能耐受手术者；(4)伴有髋关节感染或全身其他部位活动性感染者；(5)严重骨质疏松者；(6)除髋关节以外，下肢的其他关节(膝、踝)疾患致功能严重受损影响下肢功能评估者；(7)筛选前6个月有酒精或药物滥用史；(8)怀孕或哺乳期妇女，或期望生育的妇女；

C4、骨盆数字化三维模型的建立

术前采用金属去伪影技术，利用64层螺旋CT(西门子，德国)对患者的骨盆进行层厚1mm的薄层扫描；CT图像文件以DICOM格式保存,并导入交互式医学影像控制***(MIMICS,比利时),重建患者的骨盆数字化三维模型图，如图4所示；

D4、1:1半骨盆3D模型的制作；

将MIMICS软件建立的数字化三维骨盆模型数据导入工业设计软件UG(西门子，美国)中进行进一步绘制加工，最后导入到3D打印机(Arcam，瑞典)主程序中以聚乳酸为原料，按照逐层打印的方式制作出真人大小的1:1半骨盆模型，如图5所示；

E4、骨缺损的评估及手术方案的规划；

根据MIMICS软件获得的三维重建图像及1:1半骨盆3D实体模型进一步评估患者髋臼骨缺损情况，包括髋臼前壁、后壁、内壁、臼顶等的骨缺损量、外形以及残存宿主骨量等情况；根据骨缺损情况，利用计算机辅助设计规划出个性化垫块的三维模型，在重建图像上绘制出其外形、大小及最佳放置位置、螺钉固定数量、方向等，同时确定翻修假体髋臼金属外杯的大小及安装位置，并生成三维效果图；经手术医生确认满意后，根据计算机辅助设计的垫块样式利用EBM3D打印机制作出实体垫块模型，由外科医生在1：1半骨盆模型上进行术前手术操作模拟，评估髋臼骨缺损的预填充效果，如图6和图7所示；

F4、翻修手术置入3D打印内植物重建骨缺损；

经医院伦理委员会批准，告知患者并签署手术及植入物知情同意书；手术均由本课题组医生完成；手术采用改良Harding入路切开暴露，术中彻底清创并取出松动假体，臼杯周围骨溶解和骨缺损与术前3D打印半骨盆模型所示一致；髋臼侧经磨搓后按照术前计划方案在髋臼骨缺损处置入3D打印钛金属垫块，并按术前设计制作的钉孔方向置入螺钉固定；安放金属臼杯，压配牢靠后安装聚乙烯内衬，最后置入生物型股骨柄假体并安装陶瓷球头；

G4、术后临床疗效及生物力学评估:

①与同种异体结构性植骨和使用成品金属垫块的翻修手术建立对照，对比术中时间、出血量、术中并发症情况；

②术后1、3、6、9、12个月对患者进行跟踪随访，评估VAS疼痛评分、Harris功能评分，如图8所示；

③拍摄骨盆X线平片及薄层CT，评估内植物位置以及骨长入情况；

④检测患者血液中V、Al等相关金属离子浓度，评估假体的生物毒性；

统计学分析通过SPSS19.0软件包进行；数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student-Newman-Keuls(SNK)检验，p<0.05表示组间差异具有统计学意义

最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种基于3D打印用于髋臼骨缺损重建的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的制备、表征以及细胞相容性检测；

A1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的制备：

工程师在UG软件中分别绘制出直径为1.5cm高度为0.5cm以及直径为0.4cm高度为0.15cm的圆柱形人工垫块的三维数字模型图，并将数据以STL格式保存并导入3D打印主程序中进行分层切片处理，再将获得的各断层数据导入EBM设备，进行产品的打印制作；

在粉仓内装入钛合金(Ti6Al4V)粉末，由粉耙均匀铺设在工作平台上，厚度为0.5～1mm；关闭舱门，工作舱抽至真空，真空度需达到10-4～10-5mbar；电子束枪在电脑程序控制下发射高能电子束并聚焦至工作平台，受到高能电子束照射的钛金属粉末颗粒瞬间被加热熔融再经冷却凝固，通过分层加工、叠加成型的方式打印出所需要的金属定制物；去除未熔融的金属粉末，并经后续的抛光加工等处理即可获得最终的个性化金属垫块成品，经消毒后无菌存放备用；

B1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的孔隙率检测；

孔隙率的测定：采用排液法测定孔隙率；取直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块，将其浸没在已知体积(V1)的无水乙醇中，减压使乙醇充满支架内部所有孔隙，总计体积为V2；一段时间后，轻轻取出支架，剩余乙醇体积标记为V3；孔隙率由公式(a)得到；

Porosity＝(V1–V3)/(V2–V3) (a)

C1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的表面结构观察；

形貌及结构：分别将3D打印人工垫块及传统成品人工垫块在20mA条件下喷金2min制备样品，用扫面电镜观察其表面结构以及孔隙大小等；

D1、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的抗压强度测试；

分别取直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块各6个式样，在37℃、100％相对湿度环境中养护72小时，上下表面打磨平整，置于万能试验机上进行压缩测试；加载速率为1mm/min，记录载荷-位移曲线；按照以下公式(b)计算得出式样的抗压强度值：

P＝4NπD2 (b)

式中P代表式样的抗压强度，N代表载荷峰值，D代表式样的直径；

S2、电子束熔融3D打印的钛金属植入物生物学特性的体外表征；

A2、成骨细胞的培养；

将MC3T3-E1细胞系用0.25％Trypsin-EDTA消化、计数，取1×107个细胞，接种于直径为75cm2的细胞培养皿中，于37℃、5％CO2条件下培养，每皿加入8～10mL培养基，隔天换液；待细胞90％融合后，用0.25％Trypsin-EDTA消化传代；

B2、细胞在材料表面黏附增殖的形态学检测；

将直径为1.5cm高度为0.5cm圆柱形3D打印人工垫块及传统成品人工垫块进行辐照灭菌以用于生物学试验；两种垫块各取30个置入24孔板中，一个垫块对应一孔，加入细胞培养基于37℃、5％CO2条件下浸泡3天后，每孔植入1×105个MC3T3-E1细胞，另取15孔无材料孔亦植入1×105个MC3T3-E1细胞作为空白对照；

分别于第1、3、7、14、21天从各组各取3孔吸去培养基并用PBS溶液清洗后，加入4％多聚甲醛固定10分钟；随后用2％BSA溶液封闭2小时，封闭结束后于避光环境下依次加入工作浓度为5μg/mL的FITC-鬼笔环肽溶液和DAPI溶液，各反应20分钟，反应结束后均吸除反应溶液并用PBS溶液清洗；将染色后的样品置于荧光显微镜下观察各组材料表面细胞形态、数量以及孔隙内细胞长入情况，并与空白对照组细胞形态相对比；

另对各时间点的各组细胞-垫块复合物行SEM检测；第1、3、7、14、21天时于3D打印人工垫块组及传统成品人工垫块组各取出3个样品以PBS洗净，并以1％锇酸于4℃固定4小时，随后采用酒精梯度脱水，各浓度脱水时间不小于20分钟；完成脱水后空气干燥，并抽真空、喷金，采用SEM观察垫块表面细胞的数量、数量以及孔隙内细胞长入情况；

C2、垫块生物相容性的定量检测；

将直径为0.4cm高度为0.15cm3D打印人工垫块及传统成品人工垫块置于96孔板中，另设无材料对照组，于各孔中植入1×104个MC3T3-E1细胞进行培养，取第1、3、7、14、21天作为观察点行MTS法检测分析；于各时间点各组取3孔，吸尽孔内的培养基，并用PBS溶液清洗后再于各孔内加入100mL细胞完全培养基及20μL、1.90mg/mL的MTS溶液，并于细胞培养箱内孵育3小时后从各孔内吸出100μL于新孔中，运用紫外分光光度仪检测490nm波长处的OD值，记录结果，绘制各组细胞生长曲线；

S3、电子束熔融3D打印的钛金属植入物生物学特性的体内表征；

A3、山羊股骨缺损模型的建立及材料植入术前先采用电子束熔融3D打印技术制备φ1cm×1cm/φ3cm×3cm/φ5cm×5cm的钛金属垫块，辐照灭菌消毒后无菌存放备用；

选取重20～25kG青山羊；提前送至动物中心分笼饲养一周以适应环境；试验开始前肌注速眠新(0.15mL/kG)麻醉成功后,将山羊右侧卧位固定于实验台上，后肢备皮,用2.5％碘酒、75％酒精棉球消毒、铺巾；取股骨外侧下端纵向切口长约5cm，依次切开皮肤、皮下组织、阔筋膜，显露外侧股骨髁，采用电钻钻取出φ1cm×1cm/φ3cm×3cm/φ5cm×5cm缺损；并将各组无菌保存的材料置入缺损部位；其中，传统成品人工垫块组以运用各种大小的成品垫块尽可能填满缺损为宜；假手术组中，只行皮肤及肌肉的切开与缝合，不行股骨髁钻孔及样品置入；随后，采用生理盐水冲洗伤口，逐层缝合，无菌敷料包扎，不作外固定，自由活动；术前、中及术后3天肌注青霉素8万单位，链霉素0.5g；高蛋白青饲料圈养,术后12天拆线；

B3、体内缺损填补修复检测；

B31、Micro-CT检测:

术后4、8、12周采用速眠新对青山羊进行麻醉后，行CT检测，同时用相关软件分析骨体积分数(BoneVolume/TotalVolume，BV/TV)、骨密度(BoneMineralDensity，BMD)等指标，并进行缺损部位三维重建以直观了解缺损填补、骨长入及缺损修复情况；

B32、组织形态学观察:

第4、8、12周时处死山羊，取出包含样品的组织制作切片；分别行H&E及MASSON三色染色，并于光学显微镜下观察缺损填补、骨长入及缺损修复情况；

H&E染色具体步骤为：将切片再次进行梯度脱水后加入苏木精溶液中染色5分钟，流水洗净后采用1％盐酸乙醇处理3秒，再行水洗蓝化30分钟后酒精梯度脱水，并采用伊红染色20秒，采用纯乙醇脱水并经二甲苯使切片透明，中性树胶封固；

MASSON三色染色具体步骤为：将切片进行铬化处理后采用Weiger铁苏木素染色10分钟，用酸性乙醇分化液分化，并用MASSON蓝化液返蓝；随后采用丽春红品红染色液染色10分钟后用磷钼酸溶液分化2分钟，再用苯胺蓝染色液染色2分钟；95％乙醇及无水乙醇依次脱水后，采用二甲苯使切片透明，中性树胶封固；

S4、电子束熔融3D打印的钛金属植入物的临床研究；

A4、电子束熔融(EBM)3D打印制作个体化多孔金属垫块；

根据外科医生术前规划结果，通过前述办法制备电子束熔融3D打印个体化多孔金属垫块，并采用辐照灭菌后无菌封存以备术中使用；

B4、前期实验都成功后，伦理委员会批准，报批相关手续，建立传统成品人工垫块对照组，进行临床植入试验；

研究对象的筛选:

患者术前拍摄骨盆正位X线片，根据X线片髋臼旋转中心上移程度、坐骨骨溶解、泪滴骨溶解及Kohler线是否破坏等情况对髋臼侧骨缺损进行Paprosky分型评估；

入选标准：PaproskyⅡB及以上严重骨缺损类型；

排除标准：(1)PaproskyⅠ、ⅡA型骨缺损，由于该型骨缺损较小通常无需进行植骨；(2)对金属植入物过敏者；(3)合并其他严重疾病或全身评估不能耐受手术者；(4)伴有髋关节感染或全身其他部位活动性感染者；(5)严重骨质疏松者；(6)除髋关节以外，下肢的其他关节(膝、踝)疾患致功能严重受损影响下肢功能评估者；(7)筛选前6个月有酒精或药物滥用史；(8)怀孕或哺乳期妇女，或期望生育的妇女；

C4、骨盆数字化三维模型的建立

术前采用金属去伪影技术，利用64层螺旋CT对患者的骨盆进行层厚1mm的薄层扫描；CT图像文件以DICOM格式保存,并导入交互式医学影像控制***,重建患者的骨盆数字化三维模型图；

D4、1:1半骨盆3D模型的制作；

将MIMICS软件建立的数字化三维骨盆模型数据导入工业设计软件UG中进行进一步绘制加工，最后导入到3D打印机主程序中以聚乳酸为原料，按照逐层打印的方式制作出真人大小的1:1半骨盆模型；

E4、骨缺损的评估及手术方案的规划；

根据MIMICS软件获得的三维重建图像及1:1半骨盆3D实体模型进一步评估患者髋臼骨缺损情况，包括髋臼前壁、后壁、内壁、臼顶等的骨缺损量、外形以及残存宿主骨量等情况；根据骨缺损情况，利用计算机辅助设计规划出个性化垫块的三维模型，在重建图像上绘制出其外形、大小及最佳放置位置、螺钉固定数量、方向等，同时确定翻修假体髋臼金属外杯的大小及安装位置，并生成三维效果图；经手术医生确认满意后，根据计算机辅助设计的垫块样式利用EBM3D打印机制作出实体垫块模型，由外科医生在1：1半骨盆模型上进行术前手术操作模拟，评估髋臼骨缺损的预填充效果；

F4、翻修手术置入3D打印内植物重建骨缺损；

经医院伦理委员会批准，告知患者并签署手术及植入物知情同意书；手术均由本课题组医生完成；手术采用改良Harding入路切开暴露，术中彻底清创并取出松动假体，臼杯周围骨溶解和骨缺损与术前3D打印半骨盆模型所示一致；髋臼侧经磨搓后按照术前计划方案在髋臼骨缺损处置入3D打印钛金属垫块，并按术前设计制作的钉孔方向置入螺钉固定；安放金属臼杯，压配牢靠后安装聚乙烯内衬，最后置入生物型股骨柄假体并安装陶瓷球头；

G4、术后临床疗效及生物力学评估:

①与同种异体结构性植骨和使用成品金属垫块的翻修手术建立对照，对比术中时间、出血量、术中并发症情况；

②术后1、3、6、9、12个月对患者进行跟踪随访，评估VAS疼痛评分、Harris功能评分；

③拍摄骨盆X线平片及薄层CT，评估内植物位置以及骨长入情况；

④检测患者血液中V、Al等相关金属离子浓度，评估假体的生物毒性。

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