CN114252511B - 一种检测八宝丹指纹图谱的方法及八宝丹标准指纹图谱和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测八宝丹指纹图谱的方法及八宝丹标准指纹图谱和用途,具体涉及一种检测八宝丹指纹图谱的方法、包含该方法的建立八宝丹标准指纹图谱的方法、八宝丹标准指纹图谱和应用。根据本发明的检测八宝丹指纹图谱的方法,所得到的色谱图中,峰数量较多,灵敏高,基线平稳、噪音小,响应敏锐,响应值大,分离度好。此外,空白溶剂对供试品溶液的测试不存在干扰,专属性良好。方法的精密度、稳定性和重复性良好。根据本发明的建立八宝丹标准指纹图谱的方法和所得到的八宝丹标准指纹图谱可以用于进行八宝丹的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于中药分析领域,涉及一种检测八宝丹指纹图谱的方法、包含该方法的建立八宝丹标准指纹图谱的方法、八宝丹标准指纹图谱和应用。
背景技术
中药指纹图谱技术因可全面标示中药主要化学成分的特性及其比例的特点,越来越多用于中药的质量控制。色谱法是分析化学领域中发展较快,应用较广泛的分析方法之一,也是中指纹图谱最基本的技术。常用的色谱法有薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法,其中高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)具有应用范围广、分析速度快、灵敏度高等优点,是目前研究中药指纹图谱应用最广泛的方法。蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector,ELSD)是一种通用型质量检测器,可弥补在HPLC中应用最广的紫外检测器对检测物质必须具有吸收紫外光的生色团的要求。ELSD作为一种浓度型检测器,在无紫外或紫外末端吸收的未知化合物的纯度检测过程中,显示出极大的优越性。
八宝丹源自中药古方,具有清利湿热、活血解毒、去黄止痛等功效。适用于湿热蕴结所致发热、黄疸、小便黄赤、恶心呕吐、纳呆、肋痛腹胀、舌苔黄腻或厚腻干白,或湿热下注所致尿道灼热刺痛、小腹胀痛,以及传染性病毒性感染、急性胆囊炎、急性泌尿***感染等。
现代药理学研究表明八宝丹具有抗炎、解热、镇痛、保肝、利胆、去黄等功效。临床实验显示,八宝丹胶囊治疗慢性胆囊炎总有效率高于胆舒胶囊。八宝丹胶囊辅助黄疸型病毒性肝炎治疗,可改善临床症状及肝功能,具有较好的退黄效果,疗效和苦黄胶囊相似;可有效地改善病毒性肝炎所致的难治性黄疸;对慢性病毒感染引起的肝细胞损伤具有一定的保护作用。
此外,八宝丹还可用于肿瘤的辅助治疗。八宝丹对体外培养的人肺腺癌A549细胞、人***Hela细胞、人结肠癌LoVo细胞均有明显的杀伤作用。八宝丹抑制骨肉瘤U-20S细胞增殖并诱导其凋亡,药效呈时间和剂量的依赖关系。八宝丹与抗肿瘤药物联合用药,在临床上能够降低化疗药物的副作用,提高患者生活质量。此外,八宝丹可促进正常及荷瘤小鼠的T淋巴细胞免疫功能,可降低荷瘤小鼠外周血、脾脏和骨髓细胞中髓系来源的抑制性细胞(MDSCs)比例,改善肿瘤免疫。
近年,随着监管部门对药品质控提出更高要求,要求生产厂家严格控制产品批间稳定性,因此采用有效的质量控制方法尤为重要。
由于八宝丹原料成分多,涉及化学成分更多,对其进行标准指纹图谱的研究非常困难。因此,目前还没有关于检测八宝丹指纹图谱的方法,建立八宝丹标准指纹图谱的方法以及采用其进行质量控制的研究。
发明内容
为了更全面有效控制八宝丹的质量,本发明人经仔细研究采用HPLC-ELSD法并对流动相***、流动相梯度洗脱条件、色谱柱、提取溶剂等条件进行研究,得到了一种检测八宝丹指纹图谱的方法,并由此得到了建立八宝丹标准指纹图谱的方法和八宝丹标准指纹图谱,其可以用于进行八宝丹的质量控制,由此完成了本发明。
本发明一方面提供了一种检测八宝丹指纹图谱的方法,所述方法用配备有蒸发光散射检测器(ELSD)的高效液相色谱仪进行检测,色谱条件如下:
色谱柱:BDS HypersilTM C18(5μm,250×4.6mm);
流动相:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),
梯度洗脱条件如下:
流速:0.8~1.2ml/min,优选1.0ml/min;
柱温:20~30℃,优选25℃;
进样量:20μl;
检测器条件:气体压力:20~40psi,优选40psi;漂移管温度:50~60℃,优选55℃;喷雾方式选自冷却至加热50%,例如10%加热、20%加热、30%加热、40%加热、50%加热等,优选加热40%;以及增益值:5-1000,优选为500。
本发明中,梯度洗脱中的百分数为体积百分数,例如,5%指的是5体积%。
本发明中,检测器条件中的气体压力有时也称作喷雾器气体流量或喷雾器流量。
检测八宝丹指纹图谱的方法中,用于进行检测的八宝丹供试品溶液可以如下配制:取取八宝丹粉末0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得到供试品溶液。
本发明另一方面提供了一种建立八宝丹标准指纹图谱的方法,所述方法包括:
(1)供试品溶液配制:
取八宝丹粉末0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取滤液,即得;
(2)对照品溶液的配制:
取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、胆酸、去氧胆酸、人参皂苷Re加甲醇制成混合对照品溶液;
(3)HPLC检测
将上述(1)和(2)的供试品溶液和对照品溶液用根据本发明上述的检测八宝丹指纹图谱的方法检测得到供试品指纹色谱图和对照品指纹色谱图;
(4)生成标准指纹图谱
基于供试品指纹色谱图生成标准指纹图谱,选择八宝丹中主要成分且分离度较好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰;
(5)共有峰的鉴定
对八宝丹指纹图谱中的共有峰鉴定。
在上述方法中,对于基于供试品指纹色谱图生成标准指纹图谱的方法没有特别限定,可以采用本领域中的常规方法。例如,可以通过将测定的八宝丹供试品色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”(2012.130723版本),将供试品色谱图之一设置为参照图谱,标准图谱生成方法例如为中位数法,同时采用例如多点校正法来建立八宝丹标准指纹图谱。
在上述方法中,共有峰的鉴定可以通过采用对照品溶液的色谱图的比对完成。
在根据本发明的建立八宝丹标准指纹图谱的方法中,对于用于建立标准指纹图谱的供试品数目没有特别限制,本领域技术人员可以容易地选择适合的供试品数目。一般而言,供试品数目可以为5个以上,或者10个以上,例如15个,上限例如是30个以下,20个以下等。
在上述八宝丹供试品溶液的配制过程中,对于八宝丹细粉的粒度没有特别限制,但是优选其为可以至少过中国药典中规定的三号筛的粒度,例如,八宝丹细粉可以过三号筛或四号筛。超声处理时间没有特别限制,只要实现充分萃取即可,例如可以为10~40分钟,优选30分钟。
在上述对照品溶液的配制过程中,对于对照品溶液的浓度没有特别限制,但是优选其中各成分的含量比与供试品溶液大体相当。在一个实施方式中,对照品溶液如下配制:分别取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、胆酸、去氧胆酸、人参皂苷Re,精密称定,分别加甲醇制成每1ml中含人参皂苷Rg1 206.98μg,人参皂苷Rb1 242.22μg,三七皂苷R1212.42μg,胆酸204.80μg,去氧胆酸240.00μg,人参皂苷Re 252.46μg的溶液。
本发明另一方面提供了一种八宝丹标准指纹图谱,其包括15个共有峰,其中,以2号峰为参照,各峰的相对保留时间如下:
经比对,上述1号峰为三七皂苷R1,2号峰为人参皂苷Rg1,3号峰为人参皂苷Re,8号峰为人参皂苷Rb1,11号峰为胆酸,13号峰为去氧胆酸。
在实施方式中,上述八宝丹标准指纹图谱采用根据本发明的建立八宝丹标准指纹图谱的方法得到。
在实施方式中,根据本发明的八宝丹标准指纹图谱大体上如图19所示。
本发明再一方面提供了一种检测八宝丹产品质量的方法,其包括:
(1)使用根据本发明的检测八宝丹指纹图谱的方法得到八宝丹产品的指纹图谱;
(2)将所得八宝丹产品的指纹图谱与标准指纹图谱进行对比,若相似度大于0.9,则说明该八宝丹产品质量合格。
在实施方式中,上述将所得八宝丹产品的指纹图谱与标准指纹图谱进行对比可以通过将八宝丹产品的指纹图谱和八宝丹标准指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”进行比较,计算样品图谱与标准图谱之间的相似度。
如实验结果所证实的,根据本发明的检测八宝丹指纹图谱的方法,所得到的色谱图中,峰数量较多,灵敏高,基线平稳、噪音小,响应敏锐,响应值大,分离度好。此外,空白溶剂对供试品溶液的测试不存在干扰,专属性良好。方法的精密度、稳定性和重复性良好。
附图说明
图1是显示实施例1中八宝丹供试品溶液与混合对照品溶液的蒸发光检测器下的液相色谱图,其中,a为对照品溶液,b为供试品溶液;峰1为三七皂苷R1,峰2为人参皂苷Rg1,峰3为人参皂苷Re,峰8为人参皂苷Rb1,峰11为胆酸,峰13为去氧胆酸。
图2是显示实施例1中采用不同流动相对同一供试品溶液测定的液相色谱图,其中,1、磷酸二氢钾水溶液-乙腈;2、磷酸二氢钠水溶液-乙腈;3、甲酸水溶液-乙腈;4、醋酸水溶液-乙腈;5、磷酸水溶液-乙腈;6、水-乙腈。
图3是显示实施例1中采用不同流动相对同一供试品溶液测定的液相色谱图,其中,1、甲酸水溶液-甲醇;2、醋酸水溶液-甲醇;3、磷酸二氢钠水溶液-甲醇;4、水-甲醇;5、磷酸水溶液-甲醇。
图4是显示实施例1中采用不色谱柱对同一供试品溶液测定的液相色谱图,其中,1、STAR LP RP-18(5μm,250×4.6mm);2、C18(5μm,250×4.6mm);3、JADE-PAK ODS-Aq(5μm,250×4.6mm);4、Agilent ZORBAX SB-Aq(5μm,250×4.6mm);5、Agilent ZORBAX SB-C18(3.5μm,250×4.6mm);6、Sepax Bio-C18(5μm,250×4.6mm)。
图5是显示实施例1中采用不同提取溶剂处理八宝丹所得供试品溶液的液相色谱图,其中,其中1、正丁醇;2、水饱和正丁醇;3、乙酸乙酯;4、水;5、丙酮;6、30%乙醇;7、乙腈;8、5%乙酸乙酯;9、50%乙醇;10、乙醇;11、甲醇;12、乙醇-氯仿(3:7,V/V);13、甲醇-二氯甲烷-水(4:2:1,V/V/V);14、醋酸-氯仿(1:4,V/V)。
图6是显示实施例1中采用梯度洗脱***1对八宝丹供试品溶液测定的液相色谱图。
图7是显示实施例1中采用梯度洗脱***2对八宝丹供试品溶液测定的液相色谱图。
图8是显示实施例1中采用梯度洗脱***3对八宝丹供试品溶液测定的液相色谱图。
图9是显示实施例1中采用梯度洗脱***4对八宝丹供试品溶液测定的液相色谱图。
图10是显示实施例1中采用梯度洗脱***5对八宝丹供试品溶液测定的液相色谱图。
图11是显示实施例1中采用梯度洗脱***6对八宝丹供试品溶液测定的液相色谱图。
图12是显示实施例1中采用梯度洗脱***7对八宝丹供试品溶液测定的液相色谱图。
图13是显示实施例1中采用梯度洗脱***8对八宝丹供试品溶液测定的液相色谱图。
图14是显示实施例2中专属性试验结果的图,其中,1空白溶剂,2供试品溶液。
图15是显示实施例2中精密度试验结果的图。
图16是显示实施例2中稳定性试验结果的图。
图17是显示实施例2中重复性试验结果的图。
图18是显示实施例3中八宝丹20批的HPLC指纹图谱。
图19是显示实施例3中八宝丹的HPLC标准指纹图谱。
图20是显示实施例3中八宝丹及对照品的HPLC色谱图,其中,S1为三七皂苷R1、S2为人参皂苷Rg1、S3为人参皂苷Re、S4为人参皂苷Rb1、S5为胆酸,S6为去氧胆酸、S7为八宝丹的液相色谱图。
具体实施方式
实施例1
1.1仪器与试药
ME1002E电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司),HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、KQ-600DE数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)、Waterse2695高效液相色谱仪(沃特世有限公司),Waters 2424蒸发光散射检测器(沃特世有限公司)。
人参皂苷Rb1(批号:110704-201827,效价:91.2%,中国食品药品检定研究院),人参皂苷Rg1(批号:110703-201832,效价:92.4%,中国食品药品检定研究院),三七皂苷R1(批号:110745-201619,效价:95.0%,中国食品药品检定研究院),胆酸(批号:100078-200414,中国药品生物制品检定所),去氧胆酸(批号:0724-200207,中国药品生物制品检定所),人参皂苷Re(批号:110754-201626,效价:97.4%,中国食品药品检定研究院)。
1.2溶液的配制
1.2.1供试品溶液的配制
取取八宝丹粉末0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得到供试品溶液。
1.2.2对照品溶液的配制
分别取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、胆酸、去氧胆酸、人参皂苷Re,精密称定,加甲醇制成每1ml中含人参皂苷Rg1 206.98μg,人参皂苷Rb1 242.22μg,三七皂苷R1 212.42μg,胆酸204.80μg,去氧胆酸240.00μg,人参皂苷Re 252.46μg的混合溶液。
1.2.3色谱条件的优化
1.2.3.1流动相的选择
考察不同流动相,如水(A)-乙腈(B),0.1%醋酸水溶液(A)-乙腈(B),0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B),0.1%磷酸二氢钾水溶液(A)-乙腈(B),0.1%磷酸二氢钠水溶液(A)-乙腈(B),水(A)-甲醇(B),0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B),0.1%醋酸水溶液(A)-甲醇(B),0.1%磷酸水溶液(A)-甲醇(B),0.1%磷酸二氢钠水溶液(A)-甲醇(B)这11种流动相对样品的分析。其中,0.1%对于溶质为液体(例如醋酸、甲酸、磷酸)指的是体积百分比,对于溶质为固体(例如磷酸二氢钾、磷酸二氢钠)指的是质量百分比。
液相色谱条件:
梯度洗脱:0-120min 95%-0%A,120-150min 0%A;色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(3.5μm,250×4.6mm),检测器:紫外检测器,检测波长195nm,流速:1.0ml/min,柱温25℃。
分别采用上述流动相,进样对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪测定,结果见图2和图3,其中图2的1为磷酸二氢钾水溶液-乙腈;2为磷酸二氢钠水溶液-乙腈;3为甲酸水溶液-乙腈;4为醋酸水溶液-乙腈;5为磷酸水溶液-乙腈;6为水-乙腈。图3的1为甲酸水溶液-甲醇;2为醋酸水溶液-甲醇;3为磷酸二氢钠水溶液-甲醇;4为水-甲醇;5为磷酸水溶液-甲醇。
比较图2和图3,可以看出图3的甲醇流动相***,基线波动大,峰面积均较小;图2的乙腈流动相***,峰形尖锐,出峰数量较多,较适宜此八宝丹样品。
对比图2中各色谱峰,可见以磷酸二氢钾水溶液、磷酸二氢钠水溶液作为水相的色谱峰基线不稳,其余水溶液得到图谱基线较平稳。其中,甲酸水溶液-乙腈的峰形较尖锐,因此八宝丹指纹图谱流动相选择甲酸水溶液-乙腈。
1.2.3.2色谱柱的选择
考察色谱柱:STAR LP RP-18(5μm,250×4.6mm);C18(5μm,250×4.6mm);Agilent ZORBAX SB-Aq(5μm,250×4.6mm);Agilent ZORBAX SB-C18(3.5μm,250×4.6mm);JADE-PAK ODS-Aq(5μm,250×4.6mm);Sepax Bio-C18(5μm,250×4.6mm)。
液相色谱条件:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱:0-20min 95%-78%A,20-75min78%-61%A,75-90min 61%-38%A,90-140min 38%-0%A,150min 0%A;检测器:紫外检测器,检测波长203nm,流速:1.0ml/min,柱温25℃。
分别采用上述液相色谱条件,进样对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪测定,结果见图4。图4中1为STAR LP RP-18(5μm,250×4.6mm);2为 C18(5μm,250×4.6mm);3为JADE-PAK ODS-Aq(5μm,250×4.6mm);4为Agilent ZORBAXSB-Aq(5μm,250×4.6mm);5为Agilent ZORBAX SB-C18(3.5μm,250×4.6mm);6为SepaxBio-C18(5μm,250×4.6mm)。
结果Agilent ZORBAX SB-Aq的出峰较多,峰形尖锐,响应高。
1.2.3.3提取溶剂的选择
取八宝丹粉末0.5g,精密称定,共12份,置具塞锥形瓶中,分别精密加入正丁醇、水饱和正丁醇、乙酸乙酯、水、丙酮、30%乙醇、乙腈、5%乙酸乙酯、50%乙醇、乙醇、甲醇、乙醇-氯仿(3:7,V/V)、甲醇-二氯甲烷-水(4:2:1,V/V/V)、醋酸-氯仿(1:4,V/V)12份不同溶剂25ml,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用相应溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,得供试品溶液。
液相色谱条件:梯度洗脱:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱:0-20min95%-78%A,20-75min 78%-61%A,75-90min 61%-38%A,90-140min 38%-0%A,150min0%A;色谱柱:Agilent ZORBAX SB-Aq(5μm,250×4.6mm),检测器:紫外检测器,检测波长203nm,流速:1.0ml/min,柱温25℃。供试品溶液进样10μl,注入液相色谱仪测定,结果见图5,其中1、正丁醇;2、水饱和正丁醇;3、乙酸乙酯;4、水;5、丙酮;6、30%乙醇;7、乙腈;8、5%乙酸乙酯;9、50%乙醇;10、乙醇;11、甲醇;12、乙醇-氯仿(3:7,V/V);13、甲醇-二氯甲烷-水(4:2:1,V/V/V);14、醋酸-氯仿(1:4,V/V)。
结果表明,以甲醇、二氯甲烷-甲醇-水混合溶液作为提取溶剂时,八宝丹的峰较多,且峰面积较大,考虑操作的简便性,故选用甲醇作为提取溶剂。
1.2.3.4检测器的选择
在采用紫外检测器的实验过程中,一直存在色谱峰重复性不好、基线不平稳的问题,通过调整流动相,问题未能得到解决。
改用蒸发光散射检测器,其他色谱条件与1.2.3.3中确定的条件相同。结果问题得到了解决,基线平稳,色谱峰重复性良好。
所确定的蒸发光散射检测器的条件为:气体压力:20~40psi,优选40psi;漂移管温度:50~60℃,优选55℃;喷雾方式选自冷却至加热50%,优选加热40%;以及增益值:5-1000,优选为500。
1.2.3.5色谱柱的选择和流动相的优化
上述实验中均未能将人参皂苷Rg1和人参皂苷Re两个峰分开,对流动相进行大量的实验摸索仍未获成功。
为了解决人参皂苷Rg1和人参皂苷Re两峰未能分开的问题,更换色谱柱为BDSHypersilTM C18(5μm,250×4.6mm),并对0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱流动相进行了优化,如下:
梯度1:0-15min,95-78%A;15-75min,78-70%A;75-90min,70-38%A;90-140min,38-0%A;140-150min,0%A;
梯度2:0-20min,95-78%A;20-75min,78-65%A;75-90min,65-38%A;90-140min,38-0%A;140-150min,0%A;
梯度3:0-20min,95-78%A;20-40min,78-74%A;40-75min,74-65%A;75-90min,65-38%A;90-120min,38-0%A;120-150min,0%A
梯度4:0-20min,95-78%A;20-75min,78-61%A;75-90min,61-38%A;90-140min,38-0%A;140-150min,0%A;
梯度5:0-15min,95-78%A;15-25min,78%A;25-75min,78-31%A;75-90min,61-38%A;90-120min,38-0%A;
梯度6:0-15min,95-78%A;15-25min,78%A;25-75min,78-65%A;75-90min,65-30%A;90-110min,30-0%A;110-130min,0%A;
梯度7:0-15min,95-78%A;15-25min,78%A;25-75min,78-61%A;75-90min,61-38%A;90-120min,38-5%A;120-150min,5%A;
梯度8:0-15min,95-78%A;15-25min,78%A;25-75min,78-61%A;75-90min,61-38%A;90-120min,38-5%A;120-135min,5%A;135-140min,5-95%A;140-155min,95%A。
其他色谱条件与1.2.3.4中确定的条件相同。
对八宝丹供试品溶液测定结果见图6-13。结果表明,梯度1和2,人参皂苷Rg1和人参皂苷Re两峰未达到分离,因此不选用;梯度3,人参皂苷Rg1和人参皂苷Re两峰分离效果可行,但保留时间过长,可以适当缩短保留时间,同时其它峰的分离效果不佳,因此不选用;梯度4,人参皂苷Rg1和人参皂苷Re两峰未达到分离,需继续优化,因此不选用;梯度5,人参皂苷Rg1和人参皂苷Re两峰的分离效果比梯度4改进,但还需进一步优化,因此不选用;梯度6,人参皂苷Rg1和人参皂苷Re两峰分离效果可行,但保留时间在90min处的两峰分离效果不佳,因此不选用;梯度7,改善了保留时间90min处的两峰分离效果,但影响了保留时间45min处峰的分离效果,因此不选用;梯度8,该色谱条件下,可以使八宝丹样品色谱峰分离效果最优,考虑到保留时间140-155min出现的2个峰空白溶剂峰(可见实施例2中2.1专属性实验部分,图14),因此可以删除140-155min的色谱条件。
因此,最佳的梯度条件为:0-15min,95-78%A;15-25min,78%A;25-75min,78-61%A;75-90min,61-38%A;90-120min,38-5%A;120-135min,5%A;135-140min,5-95%A。
1.2.3.6进样量的选择
在采用蒸发光检测器的实验过程中,人参皂苷Re等部分色谱峰的峰面积较小,响应低,对进样量10μl和20μl分别进行了考察。
其他色谱条件与1.2.3.5中确定的条件相同。
实验表明在进样量20μl下,峰面积增大,响应可行。因此选择最佳进样量为20μl。
1.2.3.7最终确定的液相色谱条件
色谱柱:BDS HypersilTM C18(5μm,250×4.6mm);
流动相:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),
梯度洗脱条件见表1:
表1梯度洗脱条件
流速:1.0ml/min;
柱温:25℃;
进样量:20μl;
检测器:蒸发光散射检测器
检测器条件:气体压力:40psi;漂移管温度:55℃;喷雾方式:加热40%;
增益值:500。
精密吸取供试品溶液与混合对照溶液各20μl注入高效液相色谱仪,按照确定的高效液相色谱条件测定,记录色谱图,如图1所示,其中,a为对照品混合溶液,b为供试品溶液;峰1为三七皂苷R1,峰2为人参皂苷Rg1,峰3为人参皂苷Re,峰8为人参皂苷Rb1,峰11为胆酸,峰13为去氧胆酸。
实施例2
方法学验证
2.1专属性实验
分别取空白溶剂(即甲醇)和八宝丹供试品溶液,按上述液相条件,分别进样,记录色谱图,结果见图14(其中,1为空白溶剂,2为供试品溶液)。在140-155min出现的2个空白溶剂峰,在0-140min处空白溶剂对样品无干扰。
结果表明,空白溶剂峰在对供试品溶液的0-140min不存在干扰,专属性良好。
2.2精密度试验
取同一份八宝丹的供试品溶液,按1.2.3.7液相色谱条件,连续进样6次,记录色谱图,结果见图15(其中,精密度实验1-6在图15中分别指示为S1-S6)。以2号峰为参照,计算15个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积,结果见表2和表3。
表2精密度试验结果(相对保留时间)
表3精密度试验结果(相对峰面积)
由表2和3可以看出,15个主要色谱峰的相对保留时间的RSD在0.4-0.8%之间,相对峰面积的RSD在1.2-4.9%之间,RSD均小于5%。上述实验结果表明,本发明的色谱测量方法的精密度良好。
2.3、稳定性试验
取同一份八宝丹的供试品溶液,按1.2.3.7液相色谱条件进样分析,分别在0、2.5、5、8、10.5、24、36、48h进样,记录色谱图,结果见图16(其中,0、2.5、5、8、10.5、24、36、48h的实验在图16中分别指示为S1-S8)。以2号峰为参照,计算15个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积,结果见表4和表5。
表4稳定性试验结果(相对保留时间)
表5稳定性试验结果(相对峰面积)
由表4和5可以看出,15个主要色谱峰的相对保留时间的RSD在0.4-1.6%之间,相对峰面积的RSD在1.7-4.7%之间,RSD均小于5.0%。表明本发明的色谱测量方法的稳定性良好。
2.4、重复性试验
取同一批八宝丹粉,精密称取6份,按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液,按按1.2.3.7液相色谱条件,分别进样分析,记录色谱图,结果见图17(其中,重现性实验1-6在图17中分别指示为S1-S6)。以2号峰为参照,计算15个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积,结果见表6和表7。
表6重现性试验结果(相对保留时间)
表7重现性试验结果(相对峰面积)
由表6和7可以看出,15个主要色谱峰的相对保留时间的RSD在0.3-0.7%之间,相对峰面积的RSD在1.2-4.4%之间,RSD均小于5.0%。上述实验结果表明,本发明的色谱测量方法的重现性良好。
实施例3
3.1共有峰的标定
对20个批次(批号:200201、200202、200203、200204、200205、200206、200207、200208、200101、200102、200103、200104、200301、200302、200303、200304、200305、200306、200307、200308)的八宝丹按上述3中的供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液。并按1.2.3.7中所述色谱条件进行测定,结果见图18。将测定的20批八宝丹供试品色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”(2012.130723版本),标准图谱生成方法为中位数法,同时采用多点校正法建立八宝丹标准指纹图谱,结果见图19。根据八宝丹的指纹图谱分析情况,选择八宝丹中主要成分且分离度较好的色谱峰作为特征峰,确定15个共有峰。
3.2参照峰选择图19中2号峰(人参皂苷Rg1),分离度好,响应值较适宜且稳定,因此选择此峰作为参照峰(S)。
以2号峰为参照,计算20批八宝丹色谱图中共有峰相对保留时间和相对峰面积,结果见表8和表9。
表8共有峰在20批八宝丹HPLC指纹图谱中的相对保留时间分析
表8(续)
表9共有峰在20批八宝丹HPLC指纹图谱中的相对峰面积分析
表9(续)
结果显示,各共有峰相对保留时间RSD值均小于1.9%,说明各共有峰保留时间较均一稳定。相对峰面积RSD%值范围为3.0%-17.4%,表明不同批次八宝丹的化学成分含量存在一定差异。
3.3相似度评价
将上述20批八宝丹供试品色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”(2012.130723版本),生成标准指纹图谱,计算各供试品图谱与标准图谱之间的相似度,结果见表10。
表10相似度评价结果
表10(续)
各供试品图谱与标准图谱之间的相似度分别为1.000、0.999、1.000、1.000、0.999、0.996、0.997、1.000、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、0.999、0.997、0.996、0.999,均大于0.9,说明这20批八宝丹质量较为稳定均一。
3.4、主要色谱峰的鉴定
采用对照品的比对,对八宝丹指纹图谱中主要色谱峰进行归属及鉴定,结果见图20,其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、胆酸,去氧胆酸、八宝丹样品的实验在图20中分别指示为S1-S7。
通过比较发现1号峰为三七皂苷R1,2号峰为人参皂苷Rg1,3号峰为人参皂苷Re,8号峰为人参皂苷Rb1,11号峰为胆酸,13号峰为去氧胆酸。
中药指纹图谱是一种多指标的质控式,能较全面的反映复方中的化学成分信息,为中药质量评价提供了新的思路和方法,已经成了国内外广泛接受的中药质量评价模式。本研究建立的八宝丹HPLC-ELSD指纹图谱方法,方法简便稳定可靠,共标定了15个共有峰,并对其主要成分进行鉴定,明确了6个化学成分。对20批八宝丹进行相似度评价,各自的相关系数在0.996-1.000之间,表明不同批次间八宝丹化学组成一致性较好,制剂工艺稳定可控。
Claims (9)
2.根据权利要求1所述的检测八宝丹指纹图谱的方法,其中,流速:1.0ml/min;柱温:25℃;检测器条件:气体压力:40psi;漂移管温度:55℃;喷雾方式:加热40%;以及增益值:500。
3.根据权利要求1所述的检测八宝丹指纹图谱的方法,其中,用于进行检测的八宝丹供试品溶液如下配制:取八宝丹粉末0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得到供试品溶液。
4.一种建立八宝丹标准指纹图谱的方法,所述方法包括:
(1)供试品溶液配制:
取八宝丹粉末0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取滤液,即得;
(2)对照品溶液的配制:
取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、胆酸、去氧胆酸、人参皂苷Re加甲醇制成混合对照品溶液;
(3)HPLC检测
将上述(1)和(2)的供试品溶液和对照品溶液用根据权利要求1所述的检测八宝丹指纹图谱的方法检测得到供试品指纹色谱图和对照品指纹色谱图;
(4)生成标准指纹图谱
基于供试品指纹色谱图生成标准指纹图谱,选择八宝丹中主要成分且分离度较好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰;
(5)共有峰的鉴定
对八宝丹指纹图谱中的共有峰鉴定。
5.根据权利要求4所述的建立八宝丹标准指纹图谱的方法,其中,共有峰的鉴定通过采用对照品溶液的色谱图的比对完成。
6.根据权利要求4所述的建立八宝丹标准指纹图谱的方法,其中,供试品数目为5个以上,以及30个以下。
7.根据权利要求4所述的建立八宝丹标准指纹图谱的方法,其中,对照品溶液如下配制:分别取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、胆酸、去氧胆酸、人参皂苷Re,精密称定,分别加甲醇制成每1ml中含人参皂苷Rg1 206.98μg,人参皂苷Rb1 242.22μg,三七皂苷R1 212.42μg,胆酸204.80μg,去氧胆酸240.00μg,人参皂苷Re 252.46μg的溶液。
9.一种检测八宝丹产品质量的方法,其包括:
(1)使用根据权利要求1或2所述的检测八宝丹指纹图谱的方法得到八宝丹产品的指纹图谱;
(2)将所得八宝丹产品的指纹图谱与标准指纹图谱进行对比,若相似度大于0.9,则说明该八宝丹产品质量合格。
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