CN114250283A - 基于环境敏感染料的单色荧光mrt基因测序试剂及方法 - Google Patents

基于环境敏感染料的单色荧光mrt基因测序试剂及方法 Download PDF

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CN114250283A CN202111203792.9A CN202111203792A CN114250283A CN 114250283 A CN114250283 A CN 114250283A CN 202111203792 A CN202111203792 A CN 202111203792A CN 114250283 A CN114250283 A CN 114250283A
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Abstract

本发明涉及一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法，包括聚合酶、四种不同的被标记的核苷酸类似物，四种核苷酸类似物的核苷酸3′位置处的羟基均被保护基团或可切割连接基团修饰，且保护基团或可切割连接基团能被切割脱离重新将3′‑OH裸露出来，可切割连接基团通过共价键或非共价键与环境高敏荧光基团或环境高敏荧光基团标记物链接；四种核苷酸类似物是能发出或不能发出荧光的核苷酸衍生物，并同时公开了利用该试剂进行基因测序的方法。该发明可以有效的识别并催化3′‑O处有大分子基团修饰时进行聚合反应并进行SBS测序，消除以往二代SBS测序方法中由碱基上残基积累而导致影响测序读长的问题。

Description

基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法
技术领域
本发明涉及基因测序领域，尤其是一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法。
背景技术
测序技术是用于确定核酸、蛋白质、多糖等生物大分子的一级结构，是生命科学研究的基本工具和获取生物信息数据主要手段，尤其是DNA测序技术，即获得目的DNA片段碱基排列顺序的技术，获得目的DNA片段的序列是进一步进行分子生物学研究和基因改造的基础，使研究人员能够研究并更好地了解健康和疾病，是个性化精准医学范式的必备技术。根据原理的不同，测序技术的发展大致可划分为第一代测序、第二代测序、第三代测序、***测序4个历史阶段。由于四代测序技术各有优缺点，应用的领域也不尽相同，因此第一代测序技术仍未被淘汰，目前的测序市场是四代测序技术并存的局面。其中应用最广、发展速度最快的是第二代测序，又称高通量测序，区别于传统的一代测序而言，具有速度快、通量高、成本低的特点。二代测序技术采用克隆扩增和边合成边测序(SBS)的测序化学技术，实现了快速、准确的测序。该过程可在将修饰过带有识别信号基团的脱氧核苷三磷酸(dNTPs)衍生物整合到核酸链的同时对其进行识别。通常的，每个修饰dNTP的碱基带有可切割链连接的荧光标记，并在3’-OH端加以可切割的保护基团(如叠氮，乙烯基，双硫键基团等，US20010972364；US20130079232A1；US20160040225A1；Ju.J.et al.PNAS， 2006,103,19635-19640)，这种碱基衍生物也就荧光标记可逆终止子核苷酸(NRT)，不同的NRT会发出独特的荧光信号，该信号可用于确定DNA序列的顺序。有研究表明(Chen.F.et al.GPB,2013,34–40；Stupi.B.P.et al.Angew Chem Int Ed Engl,2012,51,1724-1727；Ondrus.M.et al.NAR.2020,11982–11993)二代SBS测序方法中影响读长的一个重要原因在于迄今为止开发的可逆终止子核苷酸类似物在切割携带荧光团后，无法将荧光基团和碱基之间的链接基团完全去掉，都会在碱基处残留约一定长度的小分子基团(如乙二醇修饰的炔丙基氨基部分)，并随着每一轮的SBS不断的在新形成的DNA双链上累积，到一定程度后，这些残基可能足以干扰DNA双螺旋结构的稳定性和二级结构,从而影响DNA聚合酶对其的识别进而终止链增长反应，限制测序读段长度。为此，有研究者设计了单修饰可逆终止子(MRT)，即把可逆阻断保护基团和荧光基团同时修饰3'-0H基团上,该修饰可以起到双重作用,既为荧光信号的报道子又作为可逆终止子,该修饰方式理论上可以成功的避免采用NRT测序时在碱基上留下的残基,从而降低对DNA双链稳定性以及聚合酶识别等影响,以提高测序的读长。这种方法的主要挑战是,由于在由聚合酶与互补核苷酸和DNA模板形成的复合物状态下,核苷酸的3’-OH位置非常靠近DNA聚合酶的活性位点处的氨基酸残基,因此DNA聚合酶难以接受3’-0大分子染料修饰的核苷酸作为底物。
发明内容
针对现有的不足，本发明提供一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT 基因测序试剂及方法，包括聚合酶、四种不同的被标记的核苷酸类似物，四种所述核苷酸类似物的核苷酸3′位置处的羟基均被保护基团或可切割连接基团修饰，且保护基团或可切割连接基团能被切割脱离重新将3′-OH裸露出来，所述可切割连接基团通过共价键或非共价键与环境高敏荧光基团或环境高敏荧光基团标记物链接；四种所述核苷酸类似物分别是化合物1、化合物2、化合物3和化合物4，其中，
化合物1是不能发岀荧光信号或不带有荧光基团的核苷酸衍生物；
化合物2是能发出荧光信号的携带有荧光基团的核苷酸衍生物；
化合物3是携带有环境高敏荧光基团的核苷酸衍生物，在一种条件下不能发岀荧光信号或能发出荧光信号且发出的荧光信号与化合物2发出的荧光信号不同，在另一种条件下能发出荧光信号且发出的荧光信号与化合物2发出的荧光信号相同，所述环境高敏荧光基团的结构与化合物2中的荧光基团的结构不同；
化合物4是不能发岀荧光信号的但携带有能发生连接反应的可反应性基团的核苷酸衍生物，所述可反应性基团与可反应性荧光基团发生连接反应后能够发岀与化合物1相同的荧光信号；或者化合物4是能够发岀与化合物2相同的荧光信号，但携带有与化合物2不同的可断裂链荧光基团的核苷酸衍生物，所述可断裂链荧光基团能在一定条件下可断裂移除，此条件对化合物2没有影响。
作为优选，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4是各自独立地具有式(I) 或式(II)或式(III)结构的化合物，
Figure BDA0003306080100000031
其中，
Figure BDA0003306080100000032
是非共价键；
B代表不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物是指腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶 (C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其类似物；
R1各自独立地选自氢、单磷酸基团、二磷酸基团、三磷酸基团、四磷酸基团或更多个磷酸基团；
R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护性基团；
R3各自独立地选自卤素、-H、-OH、N3或C2-C10柔性链；
L为可切割连接基团或不存在；
R4各自独立地为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团。
R5各自独立地为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团标记的可反应性基团或能发出相同荧光信号的荧光基团标记的可反应性基团。
作为优选，所述碱基或类似物是如下任意一种结构的化合物，
Figure BDA0003306080100000033
作为优选，所述保护基团是能被聚合酶有效识别,能掺入生长中的DNA链中,并在每一轮SBS测序后能被切割脱离的3’-OH修饰基团；所述可切割连接基团是指链接3’-OH和环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团或能够进行连接反应的可反应性基团之间的小分子基团；所述能发出相同荧光信号的荧光基团是在同一激发光源波长下能够发出和选用的环境高敏荧光染料一致或接近的发射波长，并被检测判断为同一荧光信号的非环境高敏荧光染料。
作为优选，所述保护基团是具有如下任意一种结构的基团：
Figure BDA0003306080100000041
所述可切割连接基团如下任意一种结构的基团：
双硫链基团
Figure BDA0003306080100000042
氰乙基链基团
Figure BDA0003306080100000043
叠氮链基团
Figure BDA0003306080100000044
二烷基缩酮链基团
Figure BDA0003306080100000045
烯丙基链基团
Figure BDA0003306080100000046
Figure BDA0003306080100000047
1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环已-1-基)乙基链基团
Figure BDA0003306080100000048
硝基苄基链基团
Figure BDA0003306080100000049
偶氮链基团
Figure BDA00033060801000000410
其中R1’,R2’各自独立地选自卤素，-H，C1-C5脂肪链；
所述能发出相同荧光信号的荧光基团来自于如下任意一种或多种荧光染料：AF488、 AF532、AF633、AF680、AF660、AF700、AF647、AF 594、AF 555、AF568、CY3、CY5、CY5.5、CY7、CY7.5、ROX、R6G、ATTO 495、ATTO532、ATTO700、ATTO680、ATTO655、ATTO647N、ATTO594、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO Thio12、FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red635、iFluor 488、 iFluor 514、iFluor 532、iFluor 546、iFluor 555、iFluor 568、iFluor 590、iFluor610、 iFluor 633、iFluor 647、iFluor 680、iFluor700、iFluor710、Quasar705、Quasar670。
作为优选，所述环境高敏荧光基团选自环境高敏荧光染料，所述环境高敏荧光染料是 pH值敏感荧光染料。
作为优选，所述pH值敏感荧光染料是包括如下任意一种结构式的化合物，
Figure BDA0003306080100000051
其中：X各自独立地选自卤素、-H、-OH、N3、NH2、S、Si或C2-C10柔性链；
R6各自独立地选自氢、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇马来酰亚胺、聚乙二醇巯基、C1-C10饱和烷基、饱和烷基链炔基、C1-C10饱和烷基链羧基、C1-C10烷基链叠氮基、C1-C10C1-C10烷基链氨基、C1-C10烷基链巯基、C1-C10烷基链磺酸基、C1-C10烷基链马来酰亚胺；
R7各自独立地选自氢、C1-C6饱和烷基；
环A和环B各自独立地选自具有式(Ⅵ)，(Ⅶ)，(Ⅷ)，(Ⅸ)的杂环基团，
Figure BDA0003306080100000052
Figure BDA0003306080100000061
其中；Y各自独立地选自氢、氧、碳、氮、硫；
R8，R9和R12各自独立地选自氢、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇马来酰亚胺、聚乙二醇巯基、C1-C10饱和烷基、饱和烷基链炔基、C1-C10饱和烷基链羧基、C1-C10烷基链叠氮基、C1-C10C1-C10烷基链氨基、C1-C10 烷基链巯基、C1-C10烷基链磺酸基、C1-C10烷基链马来酰亚胺；
R10和R11各自独立地选自氢、羧基、磷酸基、磺酸基。
作为优选，所述可反应性基团是能被聚合酶识别的、且能掺入生长中的DNA链中与相对应的互补基团通过共价键或非共价键进行正交连接反应稳定拼接结构的、并在每一轮SBS 测序后能被切割脱离重新产生3’-0H的基团；所述可反应性荧光基团是携带环境高敏荧光基团或能发出相同荧光信号的荧光基团，并与所述可反应性基团通过共价键或非共价键生产进行正交连接反应稳定拼接结构的基团。
作为优选，所述可反应性基团是如下结构中的任意一种，
氨基
Figure BDA0003306080100000062
环炔基
Figure BDA0003306080100000063
Figure BDA0003306080100000064
叠氮基团
Figure BDA0003306080100000065
马来酰亚胺
Figure BDA0003306080100000066
生物素
Figure BDA0003306080100000067
苯基硼酸
Figure BDA0003306080100000068
地高辛；苯酚
Figure BDA0003306080100000069
环烯基
Figure BDA00033060801000000610
所述互补基团是是如下结构中的任意一种：
四氟苯基酯
Figure BDA0003306080100000071
环炔基
Figure BDA0003306080100000072
Figure BDA0003306080100000073
链霉亲和素、4-苯基脲唑
Figure BDA0003306080100000074
叠氮基团
Figure BDA0003306080100000075
水杨基异羟脂酸基、地高辛抗体、巯基
Figure BDA0003306080100000076
四嗪基
Figure BDA0003306080100000077
一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序方法，其特征在于:采用如前任意一项所述的测序试剂，其测试步骤如下，
S1，分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；
S2，将待测序的核酸模板链连接于芯片或微球上形成核酸双链分子簇反应体系；
S3，将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶同时加入核酸双链分子簇反应体系进行核苷酸聚合反应，使其中的任意一种并入生长的核酸链的3′端并终止继续生长；
S4，洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，之后加入缓冲液并调整pH值，检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物；其中：
4a，若化合物2和化合物3能够发出荧光信号，则移除前一步骤的反应体系中的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；然后进行处理，该处理对化合物1、化合物2没有影响，但能使化合物3不再发出荧光信号或发出的荧光信号与化合物2不同，同时使化合物4发生连接反应发岀与化合物2相同的荧光信号，最后调整pH值，并再次检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；
4b，若化合物2和化合物4能够发出荧光信号，则移除前一步骤反应体系中的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；然后进行处理，该处理对化合物1、化合物2没有影响，但能使化合物4可断裂链荧光基团断裂移除荧光基团，同时使化合物3发出与化合物2相同的荧光信号，并再次检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；
S5，荧光信号图像处理分析，判断并入核酸链的核苷酸衍生物，其判断原理如下：
5a，如果在步骤S3中，化合物1被并入生长的核酸链的3′端，那么，由于化合物4 本身不携带荧光基团或者其它可反应性基团，也不受步骤S4中所述处理影响，因此，在步骤S4中都将检测不到荧光信号；
5b，如果在步骤S3中，化合物2被并入生长的核酸链的3′端，那么，由于化合物2 携带荧光基团，并且不受步骤S4中的4a和4b所述处理的影响，因此，在步骤S4中将都能检测到荧光信号；
5c，如果在步骤S3中，化合物3被并入生长的核酸链的3′端，由于化合物3本身携带环境高敏荧光基团，在步骤S4中4a能检测到荧光信号，经过处理调整后，不再发出荧光信号，或发出的荧光信号与化合物2不同，给定滤光片下在步骤S4检测不到荧光信号；在步骤S4中4b不能检测到荧光信号，经过处理调整后，能够发出与化合物2相同的荧光，在步骤S4能检测到荧光信号；
5d，如果在步骤S3中，化合物4被并入生长的核酸链的3′端，若化合物4本身不携带荧光基团，但携带可反应性基团时，在步骤S4中检测不到荧光信号，在处理调整的同时加入对应的携带与化合物2相同荧光基团的互补基团，经过处理后，能够发出与化合物2 相同的荧光，在步骤S4能检测到荧光信号；若化合物4本身携带与化合物2相同荧光基团连接链基团不同，在步骤S4中能检测到荧光信号，在处理调整的同时加入特定的切割试剂，经过处理后，其连接基团断裂并移除荧光基团导致荧光信号丧失，在步骤S4检测不到荧光信号。
本发明的有益效果在于：该发明利用一种环境高敏荧光染料，或者同时使用同一激发条件下能够发出与其同样荧光信号的第二种种荧光染料，来区分4种dNTP，这些dNTP的荧光标记并不像传统的NRT标记在碱基上，而是通过共价键或非共价键的方式标记在3’ -OH上，这些标记dNTPs可被聚合酶识别并整合到DNA双链中完成SBS测序，且每一轮SBS 测序后连接荧光基团链可被切割重新生成3’-OH，从而不影响下一轮SBS反应，聚合酶通过以3’-0处有大分子荧光修饰的dCTP和dGTP为底物，针对性设计，改性并高通量筛选而得到的T9系列改性聚合酶，可以有效的识别并催化3’-0处有大分子基团修饰的dATP、 dTTP/dUTP、dCTP和dGTP进行聚合反应并进行SBS测序，消除以往二代SBS测序方法中由碱基上残基积累而导致影响测序读长的问题，此外，本发明测序方法采用的是单色荧光试剂，测序仪仅需配备一个激发光源和一个相机，从而大大降低了测序仪的制造成本和体积，方便运输和携带，有利于测序仪往更广阔的的三四线城市医院和研究机构扩散，去中心化使用。
附图说明
图1是本发明实施例1中图像A的示意图；
图2是本发明实施例1中图像B的示意图；
图3是本发明实施例2中图像C的示意图；
图4是本发明实施例2中图像D的示意图；
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明中，使用聚合酶来进行核苷酸聚合反应，"聚合酶"是指能够催化聚合反应的任何天然或非天然存在的酶或其他催化剂，包括各种已知的天然和改性的核酸聚合酶，例如 DNA聚合酶(在本发明实施例中使用MEB202T9)、RNA聚合酶，以及逆转录酶，所述聚合酶能够以RNA或单链DNA为模板合成新的DNA链，可根据实际需要，选择合适的聚合酶来进行核苷酸聚合反应，也可以选择多种聚合酶的混合来使用。
在本发明的方法中，步骤S3中所使用的四种化合物分别为核苷酸A、(T/U)、C和G的衍生物，"核苷酸"是指核苷-5′-多磷酸化合物或其结构类似物，具有碱基互补配对能力，其可以通过核酸聚合酶掺入以延伸生长的核酸链，可以在一个或多个碱基、糖或磷酸基团上对核苷酸进行修饰，核苷酸可以携带荧光基团，或可反应性基团。
在本发明中，这四种核苷酸衍生物的3′位置处的羟基(-0H)有保护基团或带有保护基团的连接链，包括但不限于以下几种，如烯丙基
Figure BDA0003306080100000091
邻硝基苯
Figure BDA0003306080100000101
叠氮甲基
Figure BDA0003306080100000102
二硫基
Figure BDA0003306080100000103
甲氧基烷基、偶氮烷基、双硫链基团
Figure BDA0003306080100000104
氰乙基链基团
Figure BDA0003306080100000105
叠氮链基团
Figure BDA0003306080100000106
二烷基缩酮链基团
Figure BDA0003306080100000107
烯丙基链基团
Figure BDA0003306080100000108
1-(4， 4-二甲基-2，6-二氧代亚环已-1-基)乙基链基团
Figure BDA0003306080100000109
硝基苄基链基团
Figure BDA00033060801000001010
偶氮链基团
Figure BDA00033060801000001011
在本发明中，这四种核苷酸衍生物的3’-O端保护基团或荧光基团或可反应性基团之间由单个或多个相同或不同的可正交切割的链基团连接。所述可断裂链基团是指响应于外部刺激(例如，酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂或氧化剂)而可正交切割的(例如，可特异性切割)的链基团，通过切割将3’-O和荧光基团或可反应性基团分离为不同片段，在可断裂链基团被正交切割后，两个分离的片段(例如荧光染料、生物可反应性基团)不进一步反应并也不会形成新的正交的可断裂链基团。在正交切割中，使用的切割剂包括但不限于Na2S2O4)、THP)、TEC、DTT、弱酸、Pd (0)或光照射(例如紫外线照射)等。
在本发明中，所述可反应性基团是能够与携带有荧光基团的互补基团进行特异性正交连接反应的缀合物反应性基团。所述的正交连接反应的化学反应包括但不限于∶施陶丁格连接反应，铜离子催化的叠氮与炔基的环加成反因，环张力驱动的叠氮与炔基的环加成反应，地高辛与地高辛抗体间的结合反应，狄尔斯—阿尔德反应，Suzuki交叉偶联反应，疏基和疏基衍生物的二硫键形成反应，巯基与马来酰亚胺形成硫醚的反应，疏基和烯烃衍生物的光催化自由基加成反应，疏基和炔基衍生物的光催化自由基加成反应，磺酰氟交换反应，生物素与链霉亲和素之间的结合反应，氨基与活化酯之间的反应。
在本发明中，所述环境高敏荧光染料是能够快速响应环境的变化，如极性,pH，电压，光源和粘度等而改变发光颜色，荧光发射波长或强度的荧光染料。所述的正交连接反应的化学反应包括但不限于各种已知的广泛用于荧光探针、化学传感器、微环境变化检测、生物成像、分子开关和相分离可视化等领域的环境敏感荧光染料，所述环境高敏荧光染料包括但不局限于如下荧光染料：Cy-7、Dylight 800、IRDye 800、Alexa Fluor 790、HiLyteFluor 750、Ovster 800、Rhodamine isothiocyanate、Texas Red derivatives、AlexaFluor 680、DyLight 680、Cy5.5 NHS ester(～67O nm,Lumiprobe)、Alexa Fluor 546、DyLight 549、Oregon Green 514、Carboxylic Acid、pHrodoTM Red、6-Carboxynaphthofluorescein、 7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic acid、SNARFR-5F、SNARFB-4F、SNARFR-1、BCECF、 CyPHER5E、HCyC-647、Square-650-pH、 6-Carboxy-4,5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein。
在本发明中，荧光基团及其检测方法是公知的，可根据实际需要进行选择。也可以选择合适的激发光条件和光学滤波片使不同的化合物发出相同或实质相同的荧光信号。
在本发明的方法中，使用荧光基团和环境高敏荧光基团配合使用来实现单色荧光测序，荧光基团和环境高敏荧光基团并不像传统的NRT标记在碱基上，而是通过共价键或非共价键的方式标记在dNTPs 3’-OH上，这些标记dNTPs可被改性DNA聚合酶(MEB202T9) 识别并整合到DNA双链中完成SBS测序，且每一轮SBS测序后连接荧光基团链可被切割重新生成3’-OH，从而不影响下一轮SBS反应，可以消除以往二代SBS测序方法中由碱基上残基积累而导致影响测序读长的问题。所述的环境高敏荧光基团与相应选择的非环境高敏荧光基团结构不同，给定一种体系环境能发出相同的荧光信号或在合适的激发光条件和光学滤波片下发出的荧光信号实质上相同，给定另一种体系环境，环境高敏荧光基团丧失荧光性能，不能发出荧光信号或相同的激发光条件和光学滤波片下发出的荧光信号在实质上与选择的非环境高敏荧光基团所发出的荧光信号不同而不被检测到，这样的体系环境就依据基因中碱基衍生物的特性来调节体系的pH值从而达到相应的需求，通过单色荧光测序就可区分4种碱基，测序仪仅需配备一个激发光源和一个相机，从而大大降低了测序仪的制造成本和体积，方便运输和携带，有利于测序仪往更广阔的的三四线城市医院和研究机构扩散，去中心化使用。
实施例1：
制备化合物1，dGTP衍生物(3-N3-dGTP)的制备，该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，HRMS:561.0004，其合成路线以及化合物结构如下所示：
Figure BDA0003306080100000121
制备化合物2，3’OH-环境敏感染料修饰的dTTP衍生物(3’-HCyC-647-LN-dTTP)的制备，该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，MALDI-TOF:1209.10，其合成路线以及化合物结构如下所示：
阶段1∶
Figure BDA0003306080100000122
阶段2∶
Figure BDA0003306080100000131
制备化合物3，3’OH-染料修饰的dATP衍生物(3’-Cy5-LN-dATP)的制备，该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，MALDI-TOF：1213.54，其合成路线以及化合物结构如下所示：
Figure BDA0003306080100000132
制备化合物4，3’OH-可反应基团修饰的dCTP衍生物(3’-Biotin-LN-dCTP)的制备，该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，HRMS:776.0504，其合成路线以及化合物结构如下所示：
Figure BDA0003306080100000141
其所使用的测序方法涉及下述步骤∶
a)将待测DNA模板固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸双链分子簇；
b)将实施例1中四种dNTPs(3’-N3-dGTP、3’-LN3-HCyC647-dTTP、3’-LN3-Cy5-dATP、 3’-LN3-Biotin-dCTP、)和聚合酶MEB202T9同时加入反应体系，进行核苷酸聚合反应，使其中的一种并入生长的核酸链的3′端并终止继续生长；
c)洗去未反应的dNTPs，加入扫描缓冲液，调整pH值为6.8，以640nm光源为激发波长检测荧光信号，拍照，存储图像A，如图1所示；
d)洗去扫描缓冲液，加入水溶性Cy5-链霉亲和素，所述处理对G和A和T碱基衍生物没有影响，同时与Cy5-链霉亲和素能够特异性的与C碱基衍生物上Biotin结合，从而将荧光基团Cy5引入A碱基衍生物，使其发出荧光信号；
e)调整pH值为7.5，弱碱性环境对G和C和A碱基衍生物没有影响，但是能够使T碱基衍生物上的HCyC-647荧光淬灭，640nm光源下检测不到荧光信号；
f)加入扫描缓冲液，以640nm光源为激发波长检测荧光信号，拍照，存储图像B，如图2 所示；
g)洗去扫描缓冲液，加入切割试剂THP对芯片进行处理，脱去dNTPs 3’-位置处的叠氮基团或叠氮基团链重新生成游离的3’-OH，同时去掉荧光基团或可反应性基团。
h)洗去切割缓冲液，然后重复进行步骤(c)-(h)；
i)在每个循环测试步骤过程中两次拍照获得的图像之后，对同一个位置的核酸双链分子簇的荧光信号进行比较，若在扫描图像A和扫描图像B中均有荧光信号(图像A和B中方形框所示)，则并入的核苷酸衍生物的为3’-LN3-Cy5-dATPC，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为T；若在扫描图像A和扫描图像B中均无荧光信号(图像A和B中菱形框所示)，则并入的核苷酸衍生物的为3’-N3-dGTP，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为C；若在扫描图像A中有信号，而扫描图像B中无荧光信号(图像A和B中圆形框所示)，则并入的核苷酸衍生物的为3’-LN3-HCyC-647-dTTP，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为A；若在扫描图像A中无信号，而扫描图像B中有荧光信号(图像 A和B中三角形框所示)，则并入的核苷酸衍生物的为3’-LN3-Biotin-dCTP，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为T。如表1中所示，表1:实施例1检测结果及对应碱基，
Figure BDA0003306080100000151
实施例2：
制备化合物1，dGTP衍生物(3-N3-dGTP)的制备，该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，HRMS:561.0004，其合成路线以及化合物结构如下所示：
Figure BDA0003306080100000152
制备化合物2，3’OH-环境敏感染料修饰的dTTP衍生物(3’-HCyC-647-LN-dTTP)的制备，该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，MALDI-TOF:1209.10，其合成路线以及化合物结构如下所示：
阶段1∶
Figure BDA0003306080100000161
阶段2∶
Figure BDA0003306080100000162
制备化合物3，3’OH-染料修饰的dATP衍生物(3’-Cy5-LN-dATP)的制备，该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，MALDI-TOF：1213.54，其合成路线以及化合物结构如下所示：
Figure BDA0003306080100000171
制备化合物4，3’OH-可反应基团修饰的dCTP衍生物(3’-Cy5-SS-dCTP)的制备，该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，MALDI-TOF：1225.89，其合成路线以及化合物结构如下所示：
Figure BDA0003306080100000172
其所使用的测序方法涉及下述步骤∶
a)将待测DNA模板固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸双链分子簇；
b)将实施例1中四种dNTPs(3’-N3-dGTP、3’-LN3-HCyC-647-dTTP、3’-LN3-Cy5-dATP、 3’-SS-Cy5-dCTP、)和聚合酶MEB202T9同时加入反应体系，进行核苷酸聚合反应，使其中的一种并入生长的核酸链的3′端并终止继续生长；
c)洗去未反应的dNTPs，加入扫描缓冲液，调整pH值为7.4，以640nm光源为激发波长检测荧光信号，拍照，存储图像C，如图3中所示；
d)洗去扫描缓冲液，加入正交切割试剂(低浓度TECP)使3’-SS-Cy5-dCTP双硫键断裂去掉其荧光基团，所述处理对3’-N3-dGTP、3’-LN3-HCyC-647-dTTP、3’-LN3-Cy5-dATP没有影响(或影响很小，不影响图像识别和信号区分)。
e)同时调整pH值为6.8，弱酸性环境对对G和C和A碱基衍生物没有影响，但是能够使T 碱基上的PH敏感荧光基团HCyC-647发出与CY5相同或在同一滤光片下能检测到实质相同的信号荧光信号；
f)加入扫描缓冲液，用激发波长为640nm光源检测荧光信号，拍照，存储图像D，如图4 中所示；
g)洗去扫描缓冲液，加入切割试剂THP对芯片进行处理，脱去dNTPs 3’-位置处的叠氮基团或叠氮基团链重新生成游离的3’-OH，同时去掉荧光基团或可反应性基团。
h)洗去切割缓冲液，然后重复进行步骤(c)-(h)；
i)在每个循环测试步骤过程中两次拍照获得的图像之后，对同一个位置的核酸双链分子簇的荧光信号进行比较，若在扫描图像A和扫描图像B中均有荧光信号(图像A和B中方形框所示)，则并入的核苷酸衍生物的为3’-LN3-Cy5-dATPC，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为T；若在扫描图像A和扫描图像B中均无荧光信号(图像A和B中菱形框所示)，则并入的核苷酸衍生物的为3’-N3-dGTP，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为C；若在扫描图像A中有信号，而扫描图像B中无荧光信号(图像A和B中圆形框所示)，则并入的核苷酸衍生物的为3’-SS-Cy5-dCTP，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为G；若在扫描图像A中无信号，而扫描图像B中有荧光信号(图像A和B 中三角形框所示)，则并入的核苷酸衍生物的为3’-LN3-HCyC-647-dTTP，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为A。如表2中所示，表2:实施例2检测结果及对应碱基
Figure BDA0003306080100000181
Figure BDA0003306080100000191
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:包括聚合酶、四种不同的被标记的核苷酸类似物，四种所述核苷酸类似物的核苷酸3′位置处的羟基均被保护基团或可切割连接基团修饰，且保护基团或可切割连接基团能被切割脱离重新将3′-OH裸露出来，所述可切割连接基团通过共价键或非共价键与环境高敏荧光基团或环境高敏荧光基团标记物链接；四种所述核苷酸类似物分别是化合物1、化合物2、化合物3和化合物4，其中，
化合物1是不能发岀荧光信号或不带有荧光基团的核苷酸衍生物；
化合物2是能发出荧光信号的携带有荧光基团的核苷酸衍生物；
化合物3是携带有环境高敏荧光基团的核苷酸衍生物，在一种条件下不能发岀荧光信号或能发出荧光信号且发出的荧光信号与化合物2发出的荧光信号不同，在另一种条件下能发出荧光信号且发出的荧光信号与化合物2发出的荧光信号相同，所述环境高敏荧光基团的结构与化合物2中的荧光基团的结构不同；
化合物4是不能发岀荧光信号的但携带有能发生连接反应的可反应性基团的核苷酸衍生物，所述可反应性基团与可反应性荧光基团发生连接反应后能够发岀与化合物1相同的荧光信号；或者化合物4是能够发岀与化合物2相同的荧光信号，但携带有与化合物2不同的可断裂链荧光基团的核苷酸衍生物，所述可断裂链荧光基团能在一定条件下可断裂移除，此条件对化合物2没有影响。
2.根据权利要求1所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4是各自独立地具有式(I)或式(II)或式(III)结构的化合物，
Figure FDA0003306080090000011
其中，“----”是非共价键；
B代表不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物是指腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其类似物；
R1各自独立地选自氢、单磷酸基团、二磷酸基团、三磷酸基团、四磷酸基团或更多个磷酸基团；
R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护性基团；
R3各自独立地选自卤素、-H、-OH、N3或C2-C10柔性链；
L为可切割连接基团或不存在；
R4各自独立地为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团。
R5各自独立地为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团标记的可反应性基团或能发出相同荧光信号的荧光基团标记的可反应性基团。
3.根据权利要求2所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述碱基或类似物是如下任意一种结构的化合物，
Figure FDA0003306080090000021
4.根据权利要求1所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述保护基团是能被聚合酶有效识别,能掺入生长中的DNA链中,并在每一轮SBS测序后能被切割脱离的3’-OH修饰基团；所述可切割连接基团是指链接3’-OH和环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团或能够进行连接反应的可反应性基团之间的小分子基团；所述能发出相同荧光信号的荧光基团是在同一激发光源波长下能够发出和选用的环境高敏荧光染料一致或接近的发射波长，并被检测判断为同一荧光信号的非环境高敏荧光染料。
5.根据权利要求4所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述保护基团是具有如下任意一种结构的基团：
Figure FDA0003306080090000031
所述可切割连接基团如下任意一种结构的基团：
双硫链基团
Figure FDA0003306080090000032
氰乙基链基团
Figure FDA0003306080090000033
叠氮链基团
Figure FDA0003306080090000034
二烷基缩酮链基团
Figure FDA0003306080090000035
烯丙基链基团
Figure FDA0003306080090000036
1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环已-1-基)乙基链基团
Figure FDA0003306080090000037
硝基苄基链基团
Figure FDA0003306080090000038
偶氮链基团
Figure FDA0003306080090000039
其中R1’,R2’各自独立地选自卤素，-H，C1-C5脂肪链；
所述能发出相同荧光信号的荧光基团来自于如下任意一种或多种荧光染料：AF488、AF532、AF633、AF680、AF660、AF700、AF647、AF 594、AF 555、AF568、CY3、CY5、CY5.5、CY7、CY7.5、ROX、R6G、ATTO 495、ATTO532、ATTO700、ATTO680、ATTO655、ATTO647N、ATTO594、ATTORho101、ATTO 590、ATTO Thio12、FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red635、iFluor 488、iFluor 514、iFluor532、iFluor 546、iFluor 555、iFluor 568、iFluor 590、iFluor610、iFluor 633、iFluor647、iFluor 680、iFluor700、iFluor710、Quasar705、Quasar670。
6.根据权利要求1所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述环境高敏荧光基团选自环境高敏荧光染料，所述环境高敏荧光染料是pH值敏感荧光染料。
7.根据权利要求6所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述pH值敏感荧光染料是包括如下任意一种结构式的化合物，
Figure FDA0003306080090000041
其中：X各自独立地选自卤素、-H、-OH、N3、NH2、S、Si或C2-C10柔性链；
R6各自独立地选自氢、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇马来酰亚胺、聚乙二醇巯基、C1-C10饱和烷基、饱和烷基链炔基、C1-C10饱和烷基链羧基、C1-C10烷基链叠氮基、C1-C10C1-C10烷基链氨基、C1-C10烷基链巯基、C1-C10烷基链磺酸基、C1-C10烷基链马来酰亚胺；
R7各自独立地选自氢、C1-C6饱和烷基；
环A和环B各自独立地选自具有式(Ⅵ)，(Ⅶ)，(Ⅷ)，(Ⅸ)的杂环基团，
Figure FDA0003306080090000042
其中；Y各自独立地选自氢、氧、碳、氮、硫；
R8，R9和R12各自独立地选自氢、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇马来酰亚胺、聚乙二醇巯基、C1-C10饱和烷基、饱和烷基链炔基、C1-C10饱和烷基链羧基、C1-C10烷基链叠氮基、C1-C10C1-C10烷基链氨基、C1-C10烷基链巯基、C1-C10烷基链磺酸基、C1-C10烷基链马来酰亚胺；
R10和R11各自独立地选自氢、羧基、磷酸基、磺酸基。
8.根据权利要求1所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述可反应性基团是能被聚合酶识别的、且能掺入生长中的DNA链中与相对应的互补基团通过共价键或非共价键进行正交连接反应稳定拼接结构的、并在每一轮SBS测序后能被切割脱离重新产生3’-0H的基团；所述可反应性荧光基团是携带环境高敏荧光基团或能发出相同荧光信号的荧光基团，并与所述可反应性基团通过共价键或非共价键生产进行正交连接反应稳定拼接结构的基团。
9.根据权利要求8所述基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:所述可反应性基团是如下结构中的任意一种，
氨基
Figure FDA0003306080090000051
环炔基
Figure FDA0003306080090000052
Figure FDA0003306080090000053
叠氮基团
Figure FDA0003306080090000054
马来酰亚胺
Figure FDA0003306080090000055
生物素
Figure FDA0003306080090000056
苯基硼酸
Figure FDA0003306080090000057
地高辛；苯酚
Figure FDA0003306080090000058
环烯基
Figure FDA0003306080090000059
所述互补基团是是如下结构中的任意一种：
四氟苯基酯
Figure FDA0003306080090000061
环炔基
Figure FDA0003306080090000062
Figure FDA0003306080090000063
链霉亲和素、4-苯基脲唑
Figure FDA0003306080090000064
叠氮基团
Figure FDA0003306080090000065
水杨基异羟脂酸基、地高辛抗体、巯基
Figure FDA0003306080090000066
四嗪基
Figure FDA0003306080090000067
10.一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序方法，其特征在于:采用如权利要求1至9任意一项所述的测序试剂，其测试步骤如下，
S1，分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；
S2，将待测序的核酸模板链连接于芯片或微球上形成核酸双链分子簇反应体系；
S3，将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶同时加入核酸双链分子簇反应体系进行核苷酸聚合反应，使其中的任意一种并入生长的核酸链的3′端并终止继续生长；
S4，洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，之后加入缓冲液并调整pH值，检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物；
其中：4a，若化合物2和化合物3能够发出荧光信号，则移除前一步骤的反应体系中的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；然后进行处理，该处理对化合物1、化合物2没有影响，但能使化合物3不再发出荧光信号或发出的荧光信号与化合物2不同，同时使化合物4发生连接反应发岀与化合物2相同的荧光信号，最后调整pH值，并再次检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；
4b，若化合物2和化合物4能够发出荧光信号，则移除前一步骤反应体系中的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；然后进行处理，该处理对化合物1、化合物2没有影响，但能使化合物4可断裂链荧光基团断裂移除荧光基团，同时使化合物3发出与化合物2相同的荧光信号，并再次检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；
S5，荧光信号图像处理分析，判断并入核酸链的核苷酸衍生物，其判断原理如下：
5a，如果在步骤S3中，化合物1被并入生长的核酸链的3′端，那么，由于化合物4本身不携带荧光基团或者其它可反应性基团，也不受步骤S4中所述处理影响，因此，在步骤S4中都将检测不到荧光信号；
5b，如果在步骤S3中，化合物2被并入生长的核酸链的3′端，那么，由于化合物2携带荧光基团，并且不受步骤S4中的4a和4b所述处理的影响，因此，在步骤S4中将都能检测到荧光信号；
5c，如果在步骤S3中，化合物3被并入生长的核酸链的3′端，由于化合物3本身携带环境高敏荧光基团，在步骤S4中4a能检测到荧光信号，经过处理调整后，不再发出荧光信号，或发出的荧光信号与化合物2不同，给定滤光片下在步骤S4检测不到荧光信号；在步骤S4中4b不能检测到荧光信号，经过处理调整后，能够发出与化合物2相同的荧光，在步骤S4能检测到荧光信号；5d，如果在步骤S3中，化合物4被并入生长的核酸链的3′端，若化合物4本身不携带荧光基团，但携带可反应性基团时，在步骤S4中检测不到荧光信号，在处理调整的同时加入对应的携带与化合物2相同荧光基团的互补基团，经过处理后，能够发出与化合物2相同的荧光，在步骤S4能检测到荧光信号；若化合物4本身携带与化合物2相同荧光基团连接链基团不同，在步骤S4中能检测到荧光信号，在处理调整的同时加入特定的切割试剂，经过处理后，其连接基团断裂并移除荧光基团导致荧光信号丧失，在步骤S4检测不到荧光信号。
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