CN114236138B - 一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法、荧光强度参考载体的制作方法及用途 - Google Patents
一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法、荧光强度参考载体的制作方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，包括步骤：在载体表面共价结合凝集素；对体液糖蛋白提取并用荧光标记糖蛋白；将荧光标记的糖蛋白与固定有凝集素的载体结合，在其表面形成凝集素与岩藻糖的亲和结合。该方法还能够用于制作荧光强度参考载体，并用于肺癌的诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物分子分析试剂技术领域，具体涉及岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法、荧光强度参考载体的制作方法及用途。
背景技术
肺癌是全球癌症病人死亡的主要原因，每年有180万人死于肺癌，占所有癌症死亡人数的25％。肺癌高死亡率通常是由于在确诊时，病人已处于癌症晚期，这是因为肺癌在其肿瘤扩散之前是没有任何症状的，以致于难以察觉。肺癌的晚期确诊会大大降低患者生存机会，并增加医疗费用。统计表明非小细胞肺癌(NSCLC)患者，如果癌症仅在单个肺的局部区域，5年生存率大约为60％；如果癌症已扩散到肺外或***(区域性肺癌)，5年生存率降至33％；如果癌症已经发生移动，即癌转移至肺及更远的器官包括大脑、骨骼等，5年生存率只有6％。因此早期诊断是提高生存率和降低医疗费用最有效的手段之一。目前检测肺癌的方法包括胸部X射线(CXR)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、痰液分析和肺活检。尽管目前的技术和癌症研究已大有进步，但是仍有57％的肺癌患者是在肿瘤转移到不同器官后才被诊断出来。
因此，有必要研发一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法、荧光强度参考载体的制作方法及用途来解决现有早期肺癌筛查技术中对绝大多数肺癌难以确诊、早期无症状造成确诊癌症已属于晚期而无法治疗的问题。
发明内容
本发明目的是提供一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法、荧光强度参考载体的制作方法及用途。
本发明的一种技术方案是：
一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，包括步骤：
1)在载体表面共价结合凝集素；
2)对体液糖蛋白提取并用荧光标记糖蛋白；
3)将荧光标记的糖蛋白与固定有凝集素的载体结合，在其表面形成凝集素与岩藻糖的亲和结合。
进一步的，在步骤1)中，所述在载体表面共价结合凝集素包括：
将载体浸入含有氧化剂的缓冲溶液中，在室温下反应，使得所述载体上的葡萄糖中的邻位二羟基被氧化形成两个醛基；
将所述载体取出，浸泡在NaCl溶液中振荡清洗，取出后再浸泡在去离子水中振荡清洗，最后将所述载体取出；
将所述载体在含有凝集素的PBS溶液中反应；
在所述含有凝集素的PBS溶液中加入氰基硼氢化钠，轻微振荡，室温反应得到凝集素载体；
将所述凝集素载体依次浸入NaCl溶液、ACN溶液和去离子水中清洗，获得表面具有岩藻糖凝集素的载体。
进一步的，所述载体为试纸或球状树脂，当选择所述试纸作为载体时，所述试纸具有纤维素，当选择所述球状树脂作为载体时，所述球状树脂具有醛基。
进一步的，所述氧化剂为高碘酸钠，所述氧化剂在所述缓冲溶液中的浓度为5-20mM，所述缓冲溶液为90-100mM的醋酸钠。
进一步的，所述凝集素为LCA、UEAI或AAL中的任意一种或多种。
进一步的，在步骤2)中，所述对体液糖蛋白提取并用荧光标记糖蛋白包括步骤：
采集体液，并放置于离心管内；
在所述体液中加入乙醇，通过沉淀法提取所述体液中的蛋白质；
将所述蛋白质重新溶解于二异丙基乙胺中，并混合均匀，获得样本；
在所述样本中加入与所述蛋白质重量比相等的荧光标记试剂，并在室温下反应，获得具有荧光标记的糖蛋白溶液。
进一步的，在步骤3)中，所述将荧光标记的糖蛋白与固定有凝集素的载体结合，在其表面形成凝集素与岩藻糖的亲和结合包括步骤：
(1)用所述具有荧光标记的糖蛋白溶液将所述表面具有岩藻糖凝集素的载体浸湿，在室温下培育，使得凝集素与岩藻糖充分结合；
(2)当所述表面具有岩藻糖凝集素的载体上具有一种凝集素时，用凝集素缓冲液清洗；当所述表面具有岩藻糖凝集素的载体上具有多种凝集素时，用至少一种洗脱液洗脱凝集素结合糖蛋白，使得所述表面具有岩藻糖凝集素的载体上保留至少一种凝集素结合糖蛋白；
(3)将所述表面具有岩藻糖凝集素的载体依次浸入NaCl水溶液、ACN溶液和去离子水中，轻微振荡，将非亲水结合的非岩藻糖糖蛋白洗脱；
(4)将所述表面具有岩藻糖凝集素的载体放置于荧光检测***，定量分析。
进一步的，在步骤(2)中，所述凝集素缓冲液包括：LCA缓冲溶液、UEAI缓冲溶液、AAL缓冲溶液中的任意一种或多种，所述LCA缓冲溶液为10mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1mM CaCl2，所述UEAI缓冲溶液为10mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1mM CaCl2，所述AAL缓冲溶液为10mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1mM CaCl2；所述洗脱液包括：LCA洗脱溶液、UEAI洗脱溶液和AAL洗脱溶液，所述LCA洗脱溶液为200mMα-甲基葡萄糖苷和200mMα-甲基甘露糖苷的混合物；所述UEAI洗脱溶液为50mM-100mM L-岩藻糖；所述AAL洗脱溶液为50mM-100mML-岩藻糖。
本发明的另一种技术方案是：一种荧光强度参考载体的制作方法，包括步骤：
采集健康、早期患者、中晚期患者和恶性肺癌患者的体液，利用上述一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，获得岩藻糖糖蛋白荧光显色载体；
采用荧光检测，定量荧光强度，并与病理结果结合，获得荧光强度递增的荧光强度参考载体。
本发明的第三种技术方案是：一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法在制备用于诊断肺癌的岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的试纸中的用途。
本发明提供了一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法、荧光强度参考载体的制作方法，在肺癌早期也可检测出。对健康人群，在没有症状且无需手术的情况下，可以非常方便地使用载体测试患有肺癌的可能性，可以应用于各种场景，如：
(1)居家采用载体测试唾液中是否具有肺癌特征标志物；
(2)患有非癌症通过载体也可检测出与健康人群不同的标志物特征；
(3)可采用几种载体，每一种载体分别结合单一的凝集素，提高检测的精准度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，
图1为本发明中载体纤维素分子结构和氧化共价结合凝集素的流程示意图；
图2为本发明中蛋白荧光标记共价反应原理示意图；
图3为本发明中岩藻糖凝集素与荧光标记具有岩藻糖糖蛋白亲和结合示意图；
图4为本发明中凝集素载体检测唾液岩藻糖糖蛋白标志物的流程图；
图5为本发明中不同人群唾液通过载体检测制作荧光强度参考载体。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。
人体体液中含有数量和丰度高的糖基化糖蛋白，而糖蛋白糖基化异常显示了肿瘤发生和发展，因此体液筛查肿瘤特异性蛋白糖基化是筛查早期肿瘤标志物的有效手段。通过对唾液病理和糖蛋白组学分析，可发现在肺癌患者中糖蛋白发生异常岩藻糖基化，即其糖蛋白上具有与健康或者非癌症人群迥异的岩藻糖，分别有核心岩藻糖(α1,6链接)和支链岩藻糖(α1,2和α1,3链接)。经研究发现，在疾病早期这些岩藻糖的相对丰度低或检测不到，随着恶化逐渐增加。因此通过对岩藻糖糖蛋的定量，可以在早期筛查肺癌。
检测岩藻糖糖蛋白可以通过凝集素结合荧光标记来实现。常用的几种岩藻糖凝集素有小扁豆凝集素(LCA)或豌豆凝集素(PSA)(α1,6链接)、荆豆凝集素(UEA I)(α1,2链接)、橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)(α1,3链接)。通过上述几种凝集素与含有岩藻糖糖蛋白亲和结合，将唾液中蛋白荧光标记，与肺癌特异性岩藻糖糖蛋白用荧光检测定量，从而筛查人群肺癌可能性。
实施例1
请参阅图4，图4为本发明中凝集素载体检测唾液岩藻糖糖蛋白标志物的流程图。如图4所示，一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，包括如下步骤：
1、载体材料氧化和凝集素共价结合
选用载体(如试纸、球状树脂等)，当选用试纸必须具有邻位二羟基(可为顺式或反式)，该结构可以用化学试剂氧化，使下一步共价结合得以实现。当选用球状树脂必须具有醛基。载体(试纸)主要成分是纤维素(Cellulose),其主要化学结构请参阅图1，图1为本发明中载体纤维素分子结构和氧化共价结合凝集素的流程示意图。如图1所示纤维素的重复单元单糖为葡萄糖(β1,4-Glucose)，重复单元数量一般大于1万(n>10000)。葡萄糖(Glucose)有一个反式邻二羟基(OH)，可用5-20mM高碘酸钠(NaIO4)氧化。
为了便于理解，本实施例中，选用的载体为商用1级色谱试纸(1.5米长，19毫米宽，0.16毫米厚)，将色谱试纸裁剪成产品所需色谱载体尺寸(60毫米长，10毫米宽)。
将色谱载体浸入含有氧化剂(高碘酸钠(NaIO4))浓度为5-20mM的缓冲溶液中，该缓冲溶液为90-100mM的醋酸钠(sodium acetate)，其pH介于5-6之间,在室温下反应1-2小时，使得色谱载体上的葡萄糖(glucose)中的邻位二羟基被氧化形成两个醛基。
将色谱载体取出，浸泡在1M NaCl溶液中振荡清洗5-6min，取出后再浸泡在去离子水中振荡清洗5-6min，最后将色谱载体取出。
用1×PBS缓冲液将小扁豆凝集素(LCA)，荆豆凝集素(UEAI)，橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)中的任意一种或多种溶解，色谱载体在含有凝集素的PBS溶液中反应，凝集素浓度为10-20μg/mL，室温振荡反应2-3小时，上述步骤中，使用含有凝集素的PBS溶液的体积能将色谱载体全面浸没，得到整个载体具有共价结合凝集素；或将色谱载体部分浸没，得到凝集素仅与浸泡部分的载体形成共价结合，以便于减少凝集素使用。
为了进一步稳定凝集素与载体形成的共价结合，在凝集素PBS溶液中加入终浓度为48-52mM的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)，轻微振荡，室温反应2-3小时。这一步最终在色谱载体上形成稳定的共价结合凝集素。如图1所示，lectin1代表一种凝集素、lectin2-4代表其他几种凝集素，如采用单一凝集素反应，即使用LCA、UEAI或AAL中的一种，则得到一种凝集素载体；如使用多种凝集素反应结合，则得到混合凝集素载体。
将凝集素结合的色谱载体依次浸入三种溶液中清洗，所用三种溶液包括1M NaCl、10％ACN(体积比)和去离子水，每种溶液的使用量以能将凝集素载体完全浸泡的体积为准，且使用每种溶液清洗2-3遍，获得表面具有岩藻糖凝集素的载体。
2、荧光标记岩藻糖糖蛋白(对唾液荧光处理)
采集体液(如唾液、尿样等)，放置在1-2mL离心管中；
将0.1-0.3mL体液中加入0.5-1.5mL乙醇，使体积比为1:5，通过沉淀法提取体液中的蛋白质；
将蛋白质重新溶解于0.10-0.15mL 10mM二异丙基乙胺(N,N-Diisopropylethylamine＝DIEA)，混合均匀，获得样本；
在样本中加入与蛋白质重量比相等的荧光标记试剂(AF488 NHS酯)(ThermoFisher or Promega)；
将样本置于室温或者37℃反应2-4小时。反应过程请参阅图2，图2为本发明中蛋白荧光标记共价反应原理示意图，如图2所示，AF488所具有的NHS酯与样本中的蛋白质胺基或者赖氨酸反应形成共价键，即形成稳定酰胺键(amide)，获得具有荧光标记的糖蛋白，从而使蛋白质具有荧光特性。
3、凝集素对体液肺癌标志物岩藻糖基蛋白的亲和结合
步骤2中得到的糖蛋白为荧光标记，可用于与步骤1中的表面具有岩藻糖凝集素的载体结合使用。请参阅图3，图3为本发明中岩藻糖凝集素与荧光标记具有岩藻糖糖蛋白亲和结合示意图。包括如下步骤：
(1)用吸管取荧光标记蛋白溶液，将结合有凝集素的载体浸湿，在室温或37℃培育30-60分钟，使得凝集素与岩藻糖充分结合；
(2)如果载体上使用1种凝集素，则首先用凝集素缓冲液清洗3-5遍，所使用缓冲液为10mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1mM CaCl2(LCA、UEAI或AAL使用相同缓冲液)；如果载体上使用为多种凝集素，但仅需保留其中一种或两种凝集素亲和结合糖蛋白，则需使用3种凝集素中的1种或2种洗脱液将不需的凝集素结合糖蛋白洗脱。即：如仅需要LCA结合糖蛋白，则用UEAI洗脱液和AAL洗脱液；如需要保留LCA和UEAI结合糖蛋白，则用AAL洗脱液；以下为LCA，UEAI和AAL凝集素与荧光标记岩藻糖糖蛋白亲和结合的缓冲溶液和洗脱溶液分别为：LCA缓冲溶液包括10mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1mM CaCl2；LCA洗脱溶液包括200mMα-甲基葡萄糖苷和200mMα-甲基甘露糖苷的混合物；UEAI缓冲溶液包括10mM HEPES缓冲盐水，pH8.5，0.1mM CaCl2；UEAI洗脱溶液包括50mM-100mM L-岩藻糖；AAL缓冲溶液包括10mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1mM CaCl2；AAL洗脱溶液包括50mM-100mM L-岩藻糖；
(3)将载体浸入1M NaCl水溶液中，轻微振荡，目的是将非亲水结合的非岩藻糖糖蛋白洗脱，使得在载体上仅仅保留亲和结合的岩藻糖糖蛋白；
(4)将载体浸入10％ACN溶液，轻微振荡，进一步将载体表面非糖蛋白清洗干净；
(5)将载体浸入去离子水，进一步将非岩藻糖糖蛋白或非糖蛋白洗脱，提高载体对岩藻糖结合的特异性，减少非特异性蛋白荧光干扰。
4、将载体放置于荧光检测***，岩藻糖糖蛋白具有核心α1,6岩藻糖，和/或α1,2岩藻糖，以及和/或α1,3岩藻糖。其中LCA与α1,6岩藻糖结合，UEAI与α1,2岩藻糖结合，AAL与所有链接岩藻糖结合，岩藻糖糖蛋白的蛋白N-端或者赖氨酸(Lysine)共价结合荧光标记物，在载体表面与凝集素亲和结合的糖蛋白为岩藻糖修饰蛋白，通过荧光检测可以确定测试人群患有癌症的可能性。
实施例2
请参阅图5，图5为本发明中不同人群唾液通过载体检测制作荧光强度参考载体。如图5所示，用所制作的凝集素载体，分别对健康和不同时期肺癌患者唾液测试，得到标准参考，用于待测人群的定量分析标准载体，具体为：
采集健康、早期患者(肿瘤细胞局部，1期或者2期)、中晚期患者(3期或者4期)和恶性肺癌患者(转移)唾液，提取蛋白和荧光标记；
将荧光标记的蛋白，滴定到岩藻糖载体上，与载体上固定的岩藻糖凝集素亲和结合；
将非岩藻糖糖蛋白洗脱，在载体上保留岩藻糖糖蛋白；
采用荧光检测，定量荧光强度，将其强度与病理结果结合，得到如图5所示荧光强度递增的载体，强度越高表明肺癌的可能性越大。
实施例3
岩藻糖糖蛋白荧光显色载体使用测试过程：
收集健康人群唾液(HC)、非肺癌病人唾液(OD)和非小细胞肺癌病人唾液(LC)；
将HC、OD和LC人群唾液按照实施例1中所述步骤进行处理和测试；
将HC、OD和LC人群唾液糖蛋白与载体凝集素结合，用荧光检测成像；
根据RGB颜色规范，纯绿色(0,255,0)设置为100，白色(0,0,0)设置为0，AFF488绿色荧光得到的介于0-100之间(彩色图片可用软件分析，比如Photoshop或ImageJ等)；
所用人群为健康(HC)的荧光强度和肺癌病人为恶性肿瘤荧光强度为最大值；
表1
表1为健康和病人唾液凝集素荧光标记强度和医学检测对照表，荧光强度和病人检测结果对照详见表1。从表1中可以看出，LC人群的荧光强度明显高于HC人群和OD人群，而且荧光强度差距很大，由此可知，本发明所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体可以用于诊断肺癌。而且不管是早期患者(II期)、中晚期患者(IV期)还是恶性肺癌患者均能诊断出。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，其特征在于，包括步骤：
1)在载体表面共价结合凝集素：
将载体浸入含有氧化剂的缓冲溶液中，在室温下反应，使得所述载体上的葡萄糖中的邻位二羟基被氧化形成两个醛基；
将所述载体取出，浸泡在NaCl溶液中振荡清洗，取出后再浸泡在去离子水中振荡清洗，最后将所述载体取出；
将所述载体在含有凝集素的PBS溶液中反应；
在所述含有凝集素的PBS溶液中加入氰基硼氢化钠，轻微振荡，室温反应得到凝集素载体；
将所述凝集素载体依次浸入NaCl溶液、ACN溶液和去离子水中清洗，获得表面具有岩藻糖凝集素的载体；
2)对体液糖蛋白提取并用荧光标记糖蛋白：
采集体液，并放置于离心管内；
在所述体液中加入乙醇，通过沉淀法提取所述体液中的蛋白质；
将所述蛋白质重新溶解于二异丙基乙胺中，并混合均匀，获得样本；
在所述样本中加入与所述蛋白质重量比相等的荧光标记试剂，并在室温下反应，获得具有荧光标记的糖蛋白溶液；
3)将荧光标记的糖蛋白与固定有凝集素的载体结合，在其表面形成凝集素与岩藻糖的亲和结合：
(1)用所述具有荧光标记的糖蛋白溶液将所述表面具有岩藻糖凝集素的载体浸湿，在室温下培育，使得凝集素与岩藻糖充分结合；
(2)当所述表面具有岩藻糖凝集素的载体上具有一种凝集素时，用凝集素缓冲液清洗；当所述表面具有岩藻糖凝集素的载体上具有多种凝集素时，用至少一种洗脱液洗脱凝集素结合糖蛋白，使得所述表面具有岩藻糖凝集素的载体上保留至少一种凝集素结合糖蛋白；
(3)将所述表面具有岩藻糖凝集素的载体依次浸入NaCl水溶液、ACN溶液和去离子水中，轻微振荡，将非亲水结合的非岩藻糖糖蛋白洗脱；
(4)将所述表面具有岩藻糖凝集素的载体放置于荧光检测***，定量分析，
其中，
所述载体为试纸或球状树脂，当选择所述试纸作为载体时，所述试纸具有纤维素，当选择所述球状树脂作为载体时，所述球状树脂具有醛基；
所述凝集素为LCA、UEAI或AAL中的任意一种或多种；
所述凝集素缓冲液包括：LCA缓冲溶液、UEAI缓冲溶液、AAL缓冲溶液中的任意一种或多种，所述LCA缓冲溶液为10 mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1 mM CaCl2，所述UEAI缓冲溶液为10 mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1 mM CaCl2，所述AAL缓冲溶液为10 mM HEPES缓冲盐水，pH 8.5，0.1 mM CaCl2；所述洗脱液包括：LCA洗脱溶液、UEAI洗脱溶液和AAL洗脱溶液，所述LCA洗脱溶液为200 mM a-甲基葡萄糖苷和200 mM a-甲基甘露糖苷的混合物；所述UEAI洗脱溶液为50 mM - 100 mM L-岩藻糖；所述AAL洗脱溶液为50 mM - 100 mM L-岩藻糖。
2.根据权利要求1所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，其特征在于：所述氧化剂为高碘酸钠，所述氧化剂在所述缓冲溶液中的浓度为5-20 mM，所述缓冲溶液为90-100 mM的醋酸钠。
3.一种荧光强度参考载体的制作方法，其特征在于，包括步骤：
采集健康、早期患者、中晚期患者和恶性肺癌患者的体液，利用权利要求1-2任意一项所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法，获得岩藻糖糖蛋白荧光显色载体；
采用荧光检测，定量荧光强度，并与病理结果结合，获得荧光强度递增的荧光强度参考载体。
4.根据权利要求1-2任意一项所述的一种岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的制备方法在制备用于诊断肺癌的岩藻糖糖蛋白荧光显色载体的试纸中的用途。
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