CN114236023A - 一种多孔碳载体及其制备方法和在配体垂钓中的应用 - Google Patents

一种多孔碳载体及其制备方法和在配体垂钓中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于配体垂钓技术领域，公开了一种多孔碳载体及其制备方法和在配体垂钓中的应用。该多孔碳载体的制备方法，包括以下步骤：(1)将Zn盐与聚丙烯酸盐溶于水，得到混合物；(2)将所述混合物进行冷冻干燥，再置于惰性气体中进行碳化，得到所述多孔碳载体。该多孔碳载体具有良好的负载和固定蛋白的能力，可用于配体垂钓技术，并展现出良好的稳定性和重复性，可以快速高效并且准确的从天然植物组分中筛选得到目的活性物质。

Description

一种多孔碳载体及其制备方法和在配体垂钓中的应用
技术领域
本发明属于配体垂钓技术领域，特别涉及一种多孔碳载体及其制备方法和在配体垂钓中的应用。
背景技术
配体垂钓(Ligand fishing)是基于分子间的亲和作用辨识相互作用的配体与受体，通过与现代有机分析手段相结合，为研究生物大分子和配体间相互作用开辟了一条新途径。简言之，配体垂钓是基于药物靶点与活性配体之间的相互作用，将活性配体从复杂的样品体系中“垂钓”出来。具有高灵敏度和高通量测定特性的配体垂钓策略在筛选活性化合物方面具有广阔的前景，当前的研究成果表明配体垂钓技术能够实现从复杂的提取物组分中快速筛选出活性产物是开展天然活性分子定向分离的优选策略。由于天然来源中生物活性化合物的传统鉴定涉及重复的分离和活性测试步骤，这些步骤费时、费力且效率低下。而基于将目标生物分子固定在微纳米材料上，从复杂的生物样品中选择配体进行配体垂钓可能是一种可行且方便的方法。
然而，现有配体垂钓方法中用于固定生物分子的微纳米材料还存在负载率有限、稳定性不足等缺陷，一定程度上限制了配体垂钓方法的发展和应用。基于此，本发明希望提供一种负载率和稳定性更优的载体材料，以更好满足配体垂钓技术在天然来源中生物活性化合物筛选中的需求。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种多孔碳载体及其制备方法和在配体垂钓中的应用，该多孔碳载体(SAZn-HPC)具有良好的负载和固定蛋白的能力，可用于配体垂钓技术，并展现出良好的稳定性和重复性，可以快速高效并且准确的从天然植物组分中筛选得到目的活性物质。
本发明提供了一种多孔碳载体(SAZn-HPC)的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Zn盐与聚丙烯酸盐溶于水，得到混合物；
(2)将所述混合物进行冷冻干燥，再置于惰性气体中进行碳化，得到所述多孔碳载体。
采用上述方法所制得的多孔碳载体(SAZn-HPC)对蛋白质、核酸等生物大分子具有很好的负载能力，因而可作为生物大分子的固定材料得到应用，并体现出良好的稳定性和重现性。
相比较其他干燥方式，本发明所采用的冷冻干燥可以更好地保护混合物。由于在冻结的状态下进行干燥，因此体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象，且一些易氧化的物质得到了保护。冷冻干燥能排除95-99％以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质。
优选的，步骤(1)所述Zn盐为ZnCl2。
优选的，步骤(1)所述聚丙烯酸钠。
优选的，步骤(1)中在超声搅拌下将所述Zn盐与所述聚丙烯酸盐溶于水。
优选的，在步骤(2)中，当所述混合物中出现明显体积膨胀的雪花外观时，进行所述冷冻干燥。
优选的，步骤(2)所述惰性气体为Ar气。
优选的，步骤(2)中进行所述碳化后，还进行研磨、洗涤和烘干的操作。
本发明还提供了一种多孔碳载体(SAZn-HPC)，为具有单原子Zn位点的分级多孔碳，所述多孔碳载体由上述制备方法所制得。
本发明还提供了上述多孔碳载体在配体垂钓中的应用。
本发明还提供了上述多孔碳载体在天然植物活性成分筛选中的应用。使用上述多孔碳载体并结合配体垂钓，可用于天然植物活性成分的筛选。
本发明还提供了一种配体筛选体系，包括上述多孔碳载体和生物大分子，所述生物大分子固定在所述多孔碳载体上。根据亲和原理，使用该配体筛选体系可从待筛选混合物中筛选得到可与生物大分子特异性结合的相应活性配体(配体垂钓)。
优选的，所述生物大分子为β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)。
本发明还提供了一种从姜黄提取物中筛选Aβ潜在抑制剂的方法，包括以下步骤：
S1.用缓冲液将Aβ进行稀释后，与上述多孔碳载体进行混合，经震荡、洗涤，制得Aβ@SAZn-HPC；
S2.将所述Aβ@SAZn-HPC与姜黄提取物涡旋混合，去除上清液，经孵育、洗涤，与甲醇涡旋混合，对所得溶液进行质谱检测；
所述质谱检测的条件参数包括：
流动相组成：
流动相A：0.1％(v/v)甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
梯度洗脱条件：
0-25min：流动相B 25％-70％，流动相A余量；
25-40min：流动相B 70％-95％，流动相A余量；
40-50min：流动相B 95％-25％，流动相A余量。
姜黄是我国常用传统中药，有能行气破瘀，通经止痛功效，主治胸腹胀痛，肩臂痹痛，心痛难忍，产后血痛，疮癣初发，***，闭经，跌打损伤。2020年版《中国药典》所载姜黄为姜科植物姜黄Curcuma Longa L.的干燥根茎。现代药理研究表明，姜黄具有抗炎、抗癌、保肝、降血压或降脂等多种生物活性。其中，姜黄素等化学成分已显示出显着预防或治疗阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的良好效果。然而，由于姜黄中存在多种成分，因此关于活性成分和机制的信息很少。本发明采用上述多孔碳载体对淀粉样蛋白β-protein(Aβ)进行固定，能够有效实现在姜黄提取物中筛选淀粉样蛋白β-protein(Aβ)的潜在抑制剂的目的。
优选的，步骤S1中所述缓冲液为PBS缓冲液。
优选的，步骤S1中采用PBS缓冲液进行所述洗涤。
优选的，步骤S2中所述姜黄提取物的制备方法为：将姜黄粉碎后，加入75％乙醇回流提取，将所得滤液经旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，制得所述姜黄提取物。
优选的，步骤S2中所述质谱检测的条件参数还包括：采集时间约为55min；流动相流速约为300μL/min；色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(2.1×100mm，3.5μm)；柱温为30-35℃；进样量约为10μL；离子源电压设置为4.0kV，以正检测模式进行检测；以氮气作为鞘气，氦气作为辅助气体，流速分别为10CFM和0；毛细管温度为275℃；在m/z＝100-1000范围内检测；分辨率为30000；归一化碰撞能量为35％，Q值为0.25。
优选的，步骤S2中所述孵育的温度为35-37℃，孵育的时间为25-35min。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明所述多孔碳载体具有良好的负载和固定蛋白的能力，可用于配体垂钓技术，并展现出良好的稳定性和重复性，可以快速高效并且准确的从天然植物组分中筛选得到目的活性物质。
(2)本发明所述从姜黄提取物中筛选Aβ潜在抑制剂的方法，具有特异性高、筛选效率高、人力和时间成本较低和样品前处理要求少等特点。
附图说明
图1为本发明实施例1中多孔碳载体(SAZn-HPC)的形态特征图；
图2为本发明实施例2中Aβ@SAZn-HPC的性能测试结果和对姜黄提取物中活性化合物的筛选结果；
图3为本发明实施例3中对所筛选活性化合物进行生物学验证的结果。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种多孔碳载体，为具有单原子Zn位点的分级多孔碳，命名为SAZn-HPC，其制备方法包括以下步骤：
(1)将ZnCl2与聚丙烯酸钠在超声搅拌下溶解到去离子水中，得到混合物；
(2)将步骤(1)制得的混合物进行冷冻干燥，再置于Ar气中进行碳化，得到初产物；
(3)将步骤(2)制得的初产物经研磨、洗涤和烘干，制得多孔碳载体SAZn-HPC。
图1所示为上述多孔碳载体(SAZn-HPC)的形态特征图，由图1可知：在SAZn-HPC中观察到23°处的宽峰指向无定形碳的(002)峰(JCPDS No.41-1487)，表明存在石墨和乱层堆积的随机组合(图1中A所示)；从扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)来看，SAZn-HPC显示出典型的分层多孔结构，包括长程有序的大孔所形成的粗糙骨架，以及具有相互连接中孔/微孔的侧壁(图1中B和C所示)；SAZn-HPC的拉曼光谱(图1中D所示)表现出典型的非石墨碳特性，具有强D带(归因于缺陷诱导模式)和G带(识别为石墨模式)；EDS映射显示Zn元素高度分散在碳基质的网络中(图1中E和F所示)；SAZn-HPC的氮吸附-解吸等温线和孔径分布曲线(图1中G所示)表现出典型的IV等温线，可同时观察到材料中含有微孔和中孔，Brunauer-Emmett-Teller(BET)比表面积计算结果约为1328.8m2/g。基于Zn元素的更大质量和更强的散射能力，使用了AC-TEM的暗场探头，该结果证实了Zn元素的原子分散(图1中H和I所示)。
综上所述，所制备的SAZn-HPC具有分层多孔结构，具有典型的硬碳特征、丰富的结构缺陷、高BET表面积和扩大的层间距(0.395nm)，Zn和C元素显示出均匀分布的特点。
实施例2
本实施例提供一种配体筛选体系，包括β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)和实施例1制得的多孔碳载体SAZn-HPC，命名为Aβ@SAZn-HPC。该配体筛选体系的制备方法包括以下步骤：
(1)将Aβ溶解在六氟异丙醇中超声处理15min，然后在氮吹仪中干燥得到Aβ薄膜，并储存在-80℃冰箱中备用。将所得Aβ薄膜用DMSO和PBS重新溶解，再将Aβ在37℃下孵育5天以形成Aβ的聚集形式用于测定。
(2)将Aβ用PBS稀释成不同的浓度(0.125mg/mL、0.250mg/mL、0.500mg/mL)，再与实施例1所制得的SAZn-HPC混合，于4℃振荡器中过夜，用4.0mL PBS洗涤三次，1000×g离心10分钟，制得Aβ@SAZn-HPC。
对比例1
将实施例1中所制得的SAZn-HPC在0.5mM HCL中进行涡旋以去除Zn单原子，所得样品表示为HPC。以所得HPC为材料，采用与实施例2中相同的制备方法，制得相应的配体筛选体系Aβ@HPC。
负载性能、稳定性和重现性测试
采用BCA试剂盒测定实施例2中Aβ@SAZn-HPC和对比例1中Aβ@HPC所负载Aβ的含量，测试结果如图2中A所示。在一定量的Aβ存在下，SAZn-HPC和HPC的负载能力随着Aβ浓度的增加而增加，直到达到最终的负载能力。但在相同的Aβ浓度下，SAZn-HPC对Aβ的最大吸附容量显着高于HPC。该结果表明SAZn-HPC具备比HPC更好的负载能力和更高的吸附容量。
而图2中B为Aβ@SAZn-HPC和Aβ@HPC的稳定性结果，经4℃保存后，SAZn-HPC固定蛋白的量在前两天迅速下降，第三至第六天缓慢下降，而HPC固定蛋白的量在六天内一直在下降。该结果表明通过原子分散的Zn位点和Aβ的氨基酸残基之间的相互作用，使得Aβ能更有效地固定在SAZn-HPC上。
此外，通过固定Aβ蛋白的含量来评估批次间的重现性，测试结果如表1所示。结果表明SAZn-HPC和HPC都具有良好的重现性，RSD值均小于2.0％。
表1重现性测试结果
RSD(％) Intra-day(n＝3) Inter-day(n＝3)
SAZn-HPC 1.87 1.89
HPC 1.7 1.47
实施例3
本实施例提供一种从姜黄提取物中筛选Aβ潜在抑制剂的方法，包括以下步骤：
(1)将中药姜黄粉碎，加入75％(v/v)的乙醇回流提取2小时，滤液在旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，4℃储存；
(2)将实施例2所制得的Aβ@SAZn-HPC与步骤(1)中姜黄提取物涡旋混合，去除上清液，在37℃下孵育30min，用PBS清洗3次后与70％甲醇涡旋混合，对所得溶液进行质谱检测分析；同时使用PBS代替姜黄提取物进行对照实验。
质谱检测的条件参数包括：
流动相组成：
流动相A：0.1％(v/v)甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
梯度洗脱条件：
0-25min：流动相B 25％-70％，流动相A余量；
25-40min：流动相B 70％-95％，流动相A余量；
40-50min：流动相B 95％-25％，流动相A余量。
采集时间为55min，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(2.1×100mm，3.5μm)；流动相流速为300μL/min，柱温为35℃，进样量为10μL。离子源电压设置为4.0kV，以正检测模式进行检测。氮气作为鞘气，氦气作为辅助气体，流速分别为10CFM和0。毛细管温度为275℃，在m/z＝100-1000范围内检测，分辨率为30000，归一化碰撞能量为35％，Q值为0.25。
采用上述方法对姜黄提取物进行分析，根据准确质量数和碎片数确定了64种化合物，如图2中C至I所示，根据峰面积筛选出对Aβ@SAZn-HPC具有强亲和力的5种化合物，包括莪术呋喃二烯furanodiene(56)，莪术烯醇curcumenol(33)，去甲氧基姜黄素demethoxycurcumin(38)，双去甲氧基姜黄素bisdemethoxycurcumin(36)和姜黄素curcumin(42)，并筛选出亲和力较差的化合物莪术醇curcumol(37)作为阴性对照。
生物学验证：Aβ用PBS稀释，在37℃下孵育7天。将样品溶液在thioflavin-T(ThT)溶液中稀释，最终浓度为20μM。将190μL ThT溶液和10μL Aβ混合加入96孔板中，孵育1h。使用微量滴定板读数器在450和490nm激发下进行荧光测量。ThT可用于进一步监测和确认体外Aβ原纤维形成的抑制。荧光强度表明，用二甲基亚砜(DMSO)和莪术醇curcumol处理后Aβ原纤维的浓度增加，表明在抗Aβ原纤维形成中没有作用(图3中A所示)。荧光强度与Aβ原纤维的形成成正比。荧光越强，形成的Aβ原纤维就越多。实验结果表明，抗Aβ原纤维形成作用依次为姜黄素curcumin>双去甲氧基姜黄素bisdemethoxycurcumin>黄芩素baicalein>去甲氧基姜黄素demethoxycurcumin>莪术呋喃二烯furanodiene>莪术烯醇curcumen ol。
将EZ-Link NHS-LC-LC-生物素用DMSO溶解至10mM的浓度。Aβ以摩尔比为1:0.5的生物素试剂进行生物素化并在室温下孵育30min，然后加到96孔板中，通过将混合物加载到超级链霉亲和素(SSA)容量吸头上并通过FortéBIO Octet Red仪器检测来确定生物素化。将筛选出来的化合物溶于DMSO，用PBS稀释至适当浓度至终体积200μL/孔，对照孔加入等量D MSO。由四个主要步骤的重复循环组成：洗涤(300s)、基线(120s)、结合(120s)和解离(120s)。使用ForteìBIO数据分析软件分析包括缔合和解离图以及动力学常数在内的结果。结果表明，curcumin，bisdemethoxycurcumin，baicalein，demethoxycurcumin，furanodiene，curcumenol和curcumol的KD值为2.52、4.44、13.1、17.5、32.9、44.6和232μM，其分别表明与Aβ具有直接相互作用和可逆相互作用(图3中B至H所示)。
本发明采用SAZn-HPC筛选出姜黄提取物中抑制Aβ聚集的活性成分并采用Tht和生物层干涉测定法来进行验证，确保了所建立的配体垂钓体系的准确性。
上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种多孔碳载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Zn盐与聚丙烯酸盐溶于水，得到混合物；
(2)将所述混合物进行冷冻干燥，再置于惰性气体中进行碳化，得到所述多孔碳载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中在超声搅拌下将所述Zn盐与所述聚丙烯酸盐溶于水。
3.一种多孔碳载体，其特征在于，为具有单原子Zn位点的分级多孔碳，所述多孔碳载体由权利要求1-2中任一项所述的制备方法所制得。
4.权利要求3所述的多孔碳载体在配体垂钓中的应用。
5.权利要求3所述的多孔碳载体在天然植物活性成分筛选中的应用。
6.一种配体筛选体系，其特征在于，包括生物大分子和权利要求3所述的多孔碳载体，所述生物大分子固定在所述多孔碳载体上。
7.根据权利要求6所述的配体筛选体系，其特征在于，所述生物大分子为Aβ。
8.一种从姜黄提取物中筛选Aβ潜在抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.用缓冲液将Aβ进行稀释后，与权利要求3所述的多孔碳载体进行混合，经震荡、洗涤，制得Aβ@SAZn-HPC；
S2.将所述Aβ@SAZn-HPC与姜黄提取物涡旋混合，去除上清液，经孵育、洗涤，与甲醇涡旋混合，对所得溶液进行质谱检测；
所述质谱检测的条件参数包括：
流动相组成：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
梯度洗脱条件：
0-25min：流动相B 25％-70％，流动相A余量；
25-40min：流动相B 70％-95％，流动相A余量；
40-50min：流动相B 95％-25％，流动相A余量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述姜黄提取物的制备方法为：将姜黄粉碎后，加入75％乙醇回流提取，将所得滤液经旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，制得所述姜黄提取物。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述孵育的温度为35-37℃，孵育的时间为25-35min。
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