CN114231598A - 基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法及其配套设备 - Google Patents

基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法及其配套设备 Download PDF

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Abstract

一种基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法及其配套设备。所述方法的包括均相反应部分、可视化成像部分、机器视觉识别部分，其中均相反应部分根据待测物对灵敏度的不同要求，选择不同的放大方案，将点击反应多步信号放大免疫反应，配套仪器设备，微流控芯片和机器视觉软件四大部分有机结合，引入了微流控芯片，缩小了反应体系，这个点击反应的形式+微流控芯片与之前的离心管内反应相比，提高了方法的灵敏度及准确性。

Description

基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法 及其配套设备
技术领域
本发明属于食品安全、体外诊断和环境监测领域，具体涉及一种基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法及其配套设备。
背景技术
随着科学技术日新月异发展和人民生活水平提高，人民对医疗、食品、环境等与健康相关的因素要求越来越高，快速检测具有操作简便、成本低、适合现场分析等优势，在体外诊断，食品安全、环境监测等领域得到了广泛应用。因此，研发相关领域快速检测方法及其配套设备对保护人民生命健康具有重要的现实意义。传统的检测方法大多依靠大型精密昂贵的仪器设备、检测操作步骤复杂且前处理方法繁琐，在使用仪器设备前需由专人对使用仪器人员进行培训，极大地提高了检测成本，并降低了检测效率。
基于抗体-抗原的免疫分析方法因其检测特异性高，在各检测领域均有广泛的应用。其中，传统的酶联免疫吸附法(ELISA)具有检测灵敏度高、成本低等优点，但检测过程操作繁琐，需要多步洗涤且耗时长，无法实现多目标物同时检测；胶体金免疫试纸条法造价成本低廉，便于携带，广泛应用于各领域快速检测，但由于灵敏度不高仅适用于定性检测或半定量检测；基于纳米磁颗粒的免疫分析法具有灵敏度高、操作简便等优点，但纳米磁颗粒价格昂贵，且不易实现多目标物同时检测；荧光微球免疫检测法具有准确度高、多目标物同时检测适应性好等优点，但与之配套的仪器设备大多造价昂贵，荧光试剂价格高，且需避光保存，不利于推广使用。因此，要提高检测效率和稳定性，需要研发免洗涤步骤的一步反应、多指标同时检测的免疫分析方法，同时提供操作简便造价低廉的配套设备，实现“样品进、结果出”的快速检测模式，最终实现快速检测方法及配套装置的原始创新。
目前，以高分子绝缘微球作为信号探针进行快速检测已有多种实现形式。例如，发明人前期申请了一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置及检测方法(CN111413264A)，该发明配套装置结构简单且造价成本低，以绝缘微球作为信号探针与免疫反应相结合实现了对单目标物高灵敏度下的准确检测，但检测过程操作繁琐需磁分离和反复洗涤，无法实现免洗涤和一步法检测。再例如，发明人前期申请了一种基于绝缘微球浓度变化导致微通道电阻改变的生物传感检测方法(CN112595759A)，该发明提供了一种结构简单、造价低廉的配套装置，通过在装置的微通道两端施以恒定电压/电流，从而产生电渗流使通道内微球状态改变导致电阻值发生改变，进而间接得到待测目标物含量，但检测过程需反复洗涤，无法实现多目标物同时检测，降低了检测效率且提高了检测成本。申请人前期也构建了一种基于绝缘微球状态变化的电阻生物传感检测方法(CN 112415058A)，该方法不需要洗涤，是一种均相的反应模式，但该方法不能实现多个目标物的同时检测。同时，前期申请人申请了一种基于磁分离同时检测多种目标物的分析方法(CN112964868A)，该方法采用了显微镜成像与机器视觉识别相结合的检测方法，以不同粒径和/或颜色的高分子绝缘微球作为信号探针，结合磁分离免疫分析方法，实现了多目标物的同时检测，但该方法需要多步的磁分离，无法实现免洗一步法检测，也未能与点击反应结合实现多个检测信号的同步放大。且该方法稳定性有待进一步提升，其原因是该前期申请的专利中所涉及到的生化反应是在离心管中进行，最终的反应体积较大，而显微成像需要的体积小，因此需要从大体积的样品中取出其中一小部分用于计数，一方面会损失了信号，另外一方面从大体积样品中取少量的样品用于检测容易造成微球计数的准确性下降，从而影响整个方法的稳定性。
发明内容
本发明选用高分子绝缘微球作为信号探针，将微流控芯片均相反应、点击反应信号放大、自动化配套装置和机器视觉-可视化微球成像计数相结合，可实现高灵敏度下多个目标物、免洗涤的准确快速检测。
本发明工作原理如下：
选用一种粒径和/或颜色的高分子绝缘微球作为载体，不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球作为信号探针，将与待测目标物相对应的生物识别分子(抗体、抗原、DNA 探针)偶联在不同粒径和/或颜色的载体表面，在检测抗体或完全抗原上修饰点击试剂Ⅰ，在不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针表面修饰与试剂Ⅰ配对的点击试剂Ⅱ，以夹心免疫反应为例(对应捕获抗体和检测抗体)，当目标物存在时，将形成一种粒径和/或颜色的高分子绝缘微球载体-捕获抗体-目标物-检测抗体-点击试剂Ⅰ -点击试剂Ⅱ-不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针，则目标物含量与复合物中不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针成正比，通过对信号探针微球数量进行计数，可以完成对目标物含量的绝对定量检测，同时点击反应实现多个检测信号的同步放大。其中，点击反应是指的是在一定环境条件(温度、水)下，两个相兼容的具有点击功能的功能团A和B被激活，被激活的两个功能团互相结合形成稳定的偶联体，且点击反应具有特异性、无需金属催化、无毒且适用于生物体系。
本发明在微流控芯片内直接进行均相反应，随后含反应复合物的反应液汇聚于微流控芯片内的计数空腔中。随后将微流控芯片的计数空腔置于成像装置处，可编程自动对焦成像装置完成对焦后对微流控芯片计数板中各个计数空腔依次拍照成像并传输至计算机，基于Python的机器视觉识别软件对微球图像进行特征识别，先定位图像中的高分子微球载体，然后识别偶联在该粒径高分子微球载体表面的不同粒径和/ 或颜色的高分子微球信号探针并分类计数。在该方法中，高分子绝缘微球载体与信号探针反应前处于分散状态，通过免疫反应/DNA分子杂交反应和点击反应信号放大后，其状态由分散变成聚集，一个高分子微球载体上可能会偶联不同数量的粒径和/或颜色高分子微球信号探针，偶联在高分子微球载体上的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针用于定性检测目标物的种类，而该偶联在载体上的高分子微球信号探针的数量用于定量检测目标物的含量。
本发明通过偶联在载体表面的高分子微球信号探针通过颜色与不同粒径的相互组合用于区分不同种类的检测对象，在不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针上偶联不同种类的生物识别分子，检测不同种类的目标物时选取不同种类的点击反应功能团组合(叠氮-炔、四嗪(TZ)-反式环辛烯(TCO)、二苯并环辛炔(DBCO)- 叠氮(Azide)、半胱氨酸(Cys)-氰基苯并噻唑(CBT)等)进行点击反应信号放大，其中每一种不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针即代表一种目标物，均相反应完成后无需多余步骤直接对均相反应复合物(载体微球-信号探针微球复合物) 中不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针进行计数，从而实现多目标物的免洗涤、一步法检测。
本发明所使用的技术方案如下：
一种基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法，所述方法的包括微流控芯片-均相反应部分、可视化成像部分、机器视觉识别部分，其中微流控芯片-均相反应部分根据灵敏度的要求，选择从以下方案中进行反应得的反应复合物；
S1-A方案1：当待测目标物的浓度为ng/mL-μg/mL时，选用方案1作为检测方案，包括以下步骤：
S1-A.1在不同粒径和/或颜色的高分子微球载体表面分别偶联不同目标物的生物识别分子A得到偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体；
S1-A.2在不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针表面偶联不同目标物的生物识别分子B得到偶联生物识别分子B的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针，生物识别分子A与生物识别分子B匹配；
S1-A.3偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体、偶联生物识别分子B的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针和含有目标物的待测液混合注入微流控芯片中进行均相反应，得到不同粒径和/或颜色的反应复合物；
S1-B方案2：当待测目标物的浓度为pg/mL-ng/mL时，选用方案2作为检测方案，包括以下步骤：
S1-B.1在不同粒径和/或颜色的高分子微球载体表面分别偶联不同目标物的生物识别分子A得到偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体，每一种粒径和/或颜色对应一种目标物，同时将多种目标物对应的生物识别分子B 上修饰点击试剂Ⅰ，生物识别分子A与生物识别分子B匹配；
S1-B.2在不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针表面修饰与试剂Ⅰ配对的点击试剂Ⅱ得到修饰了点击试剂Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针，其中每一种不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针即代表一种目标物；
S1-B.3将偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体、修饰点击试剂Ⅰ的生物识别分子B、修饰了点击试剂Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针和含有目标物的待测液混合注入微流控芯片中进行均相反应，得到不同粒径和/或颜色的反应复合物；
S1-C方案3：当待测目标物的浓度为pg/mL或者低于pg/mL时，选用方案3作为检测方案，包括以下步骤：
S1-C.1在不同粒径和/或颜色的高分子微球载体表面分别偶联不同目标物的生物识别分子A得到偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体，每一种粒径和/或颜色对应一种目标物，同时将多种目标物对应的生物识别分子B 上修饰点击试剂Ⅰ，生物识别分子A与生物识别分子B匹配；
S1-C.2在不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针表面修饰与试剂Ⅰ配对的点击试剂Ⅱ得到修饰了点击试剂Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针，其中每一种不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针即代表一种目标物；
S1-C.3在不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针表面修饰试剂Ⅰ得到修饰了点击试剂Ⅰ或Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针，其中每一种不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针即代表一种目标物；
S1-C.4：将偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体、修饰点击试剂Ⅰ的生物识别分子B、修饰了点击试剂Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针、修饰了点击试剂Ⅰ或Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针和含有目标物的待测液混合注入微流控芯片中进行均相反应，得到不同粒径和/ 或颜色的反应复合物；
均相反应得到的反应复合物进行S2可视化成像部分、S3机器视觉识别部分，具体如下：
S2可视化成像部分：
将反应复合物汇聚于微流控芯片内的计数空腔中，将微流控芯片的计数空腔置于成像装置处，可编程自动对焦成像装置完成对焦后对微流控芯片计数板中各个计数空腔依次拍照成微球图像，微球图像传输至计算机；
S3机器视觉识别部分：
基于Python的机器视觉识别软件对导入计算机的图像进行筛选预处理、微球特征提取、识别载体上的不同粒径和/或颜色高分子微球信号探针并完成计数等操作，将所得函数值反馈至计算机输出；实现可视化检测多目标物的均相分析。
优选地，所述高分子微球载体和高分子微球载体与信号探针的粒径为1～50μm；
所述不同颜色的高分子微球，它们的颜色分别为紫色、红色、橙色、黑色、蓝色、绿色、黄色或白色或其他；
所述高分子微球为聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、聚丁二烯微球、聚异戊二烯微球或其他；
所述目标物包括病毒、生物标志物、抗生素分子、农药分子、兽药分子、生物毒素、细菌或其他；还包括各种基质成分的检测对象，例如血清、牛奶、饮料等，且不仅限于这些检测对象；
所述生物识别分子A和生物识别分子B为捕获抗体和检测抗体、检测抗体和捕获抗体、抗体和抗原、抗原和抗体、DNA捕获探针和DNA检测探针、DNA检测探针和DNA捕获探针；
所述微流控芯片反应计数板基板材料为石英玻璃、聚丙乙烯、聚氯乙烯中的任意一种；与基板键合的计数空腔材料为HTL高精度光敏树脂、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、石英玻璃中任意一种；计数空腔形状为多边形组合但不仅限于此类形状；
所述步骤S3中，首先进行特征识别，先定位图像中的一定粒径和/或颜色的高分子微球载体，然后识别在一定粒径的高分子微球载体表面偶联的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针并分类计数，整个过程无需洗涤，根据软件统计不同粒径和/ 或颜色高分子微球信号探针数量直接推算相对应的不同种类待测目标物含量。
优选地，所述步骤S1-A.3、S1-B.3、S1-C.4中的均相反应包括竞争免疫反应、双抗夹心免疫反应、DNA分子杂交反应或点击反应。
进一步优选地，所述点击反应的功能团包括叠氮-炔、四嗪(TZ)-反式环辛烯(TCO)、二苯并环辛炔(DBCO)-叠氮(Azide)、半胱氨酸(Cys)-氰基苯并噻唑(CBT)或其他。
以检测抗体/捕获抗体为例，本发明的检测原理如下：将识别不同检测对象的检测抗体分别偶联在一定粒径/颜色的高分子微球载体(如聚苯乙烯微球)表面，在捕获抗体上修饰点击试剂Ⅰ，在不同粒径/颜色高分子绝缘微球信号探针表面修饰与试剂Ⅰ配对的点击试剂Ⅱ，当目标物存在时，将形成一种粒径/颜色的高分子绝缘微球载体-检测抗体-目标物-捕获抗体-点击试剂Ⅰ-点击试剂Ⅱ-不同粒径/颜色高分子绝缘微球信号探针复合物，则目标物含量与复合物中不同粒径/颜色高分子绝缘微球信号探针成正比，当待测样品中的目标物含量越高则生成的复合物越多，反之，当待测样品中的目标物含量越少则生成的复合物越少，复合物的数量与目标物的含量正相关，且点击反应可对整个免疫反应体系起到信号放大作用，进一步提高了本检测方法的灵敏度与准确性。
通过均相反应复合物上偶联的不同粒径/颜色高分子微球信号探针的数量，可间接计算待测目标物含量。由于高分子微球信号探针的粒径/颜色对应的是一种目标物，故通过高分子微球信号探针粒径/颜色的不同，相互组合即可实现多目标物同时检测；同时改变高分子微球载体的粒径/颜色，与不同粒径/颜色的信号探针相互组合，也可以进一步扩大检测目标物的种类；使用不同的点击反应功能功能团配对组合，在对免疫反应的结果不产生信号干扰的同时能起到信号放大作用，提高了均相反应的灵敏度。
图1为点击反应多步信号放大检测多目标物原理图。为降低检测成本和提高检测效率，参见1A所示本发明可根据检测目标物的种类不同，选用不同形式的信号放大***进行信号放大，以双抗夹心均相免疫法检测大分子目标物为例，具体为三种：①对于检测灵敏度要求不高(ng/mL-μg/mL)的待测物，选用均相免疫法进行检测，无需点击反应信号方法；②对于检测灵敏度要求较高(pg/mL-ng/mL)的待测物，选用均相免疫法与点击反应一步信号放大相结合的检测形式；③对于检测灵敏度要求非常高 (pg/mL或者低于pg/mL)的待测物，选用均相免疫法与点击反应两步信号放大相结合的检测形式。参见1B所示为本发明通过点击反应信号放大检测多目标物原理图，以竞争均相免疫法和点击反应一步信号放大为例进行说明，以一定粒径的高分子绝缘微球作为载体并偶联不同种类抗生素抗体，在不同种类抗生素抗原上偶联不同种类的点击反应试剂Ⅰ并形成偶联物，在不同粒径大小的高分子微球信号探针上偶联与不同种类的点击反应试剂Ⅰ对应的点击反应试剂Ⅱ并形成偶联物，竞争免疫反应和点击反应后形成一定粒径高分子微球载体-抗体-抗生素分子-抗原-点击反应试剂Ⅰ-点击反应试剂Ⅱ-不同粒径高分子微球信号探针免疫反应复合物，最后通过机器视觉微球识别软件对复合物上的信号探针微球进行计数并推算目标物含量。
为了克服传统光学显微镜造价成本高、携带不便等缺点，本发明提供了一种操作简单、成本低廉的自动化对焦成像装置，见图2，一种自动化对焦成像装置，竖直方向和水平方向分别设置第一导轨和第二导轨，第一导轨和第二导轨呈90°角交错，第一导轨通过支架固定在机架上，第一导轨和第二导轨均以步进电机作为动力装置通过可编程控制器控制，以实现竖直方向和水平方向的定向移动。
优选地，第二导轨上设有滑块，滑块上连接有伸缩杆，伸缩杆与可伸缩推杆连接，成像目镜通过阶梯轴轴套固定在可伸缩推杆上，成像目镜正上方设置CMOS工业相机，用于拍摄待测微球图像和与计算机通过数据交换机通讯，成像目镜正下方设置可更换成像物镜，机架上设置可调节成像光源，用于计数板补光。自动化对焦成像装置通过编程控制器配合CMOS工业相机软件可实现自动调焦、空间定点平移等功能。
参见图3所示，一种微流控芯片，微流控芯片设置第一进样口、第二进样口、反映区域、计数空腔区域；废液收集区域和混合出液口。
优选地，反映区域包括依次串联的一级反应区域、二级反应区域、三级反应区域；一级反应区域、二级反应区域和三级反应区域串联连通，一级反应区域、二级反应区域和三级反应区域包括至少一组反应通道，一级反应区域、二级反应区域和三级反应区域的反应通道数量逐级递增。
进一步优选地，一级反应区域设置1个14层的波浪形递增式塔式反应区域，二级反应区域设置2个并列的波浪形递增式14层的塔式反应区域，三级反应区域设置 3个并列的波浪形递增式14层的塔式反应区域，反应液在多级微通道内反应后生成均相反应复合物并汇聚于计数空腔区域，计数区域设置12个同等大小的计数空腔，为防止微球发生粘连和吸附，故计数空腔区域设置为圆角矩形。
其中，偶联生物识别分子的一定粒径和/或颜色的高分子微球载体与含有目标物的待测液混合后通过微量注射泵注入第一进样口，修饰点击试剂Ⅰ的检测抗体与修饰了点击试剂Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针通过微量注射泵注入第二进样口，注入前高分子微球均震荡涡旋或超声处理1min使其充分混匀；一定粒径和/ 或颜色的高分子微球载体、不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针和含有目标物的待测液在微通道内注射泵液体驱动力作用下分别进入一级反应区域，二级反应区域和三级反应区域，为加速均相反应进行和防止微球堵塞反应通道，故反应通道设置为多级波浪形通道，在离心力和驱动力作用下反应液在多级反应区域内充分混匀完成均相反应，每一级反应区域内的反应通道数量为多级递增。其中，第一反应区域设置1 个14层的波浪形递增式塔式反应区域，第二反应区域设置2个并列的波浪形递增式 14层的塔式反应区域，第三反应区域设置3个并列的波浪形递增式14层的塔式反应区域，反应液在多级微通道内反应后生成均相反应复合物并汇聚于计数空腔区域，计数区域设置12个同等大小的计数空腔，为防止微球发生粘连和吸附，故计数区域设置为圆角矩形，并将芯片的计数空腔区域置于CMOS相机下拍照成像；随后多余的反应液流入废液收集区域并通过混合出液口排出微流控芯片。
所述微流控芯片用于基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法，计数原理如下：假设待测反应液的总体积为V1，单个计数空腔长为a，宽为b，空腔圆角半径为r，空腔深度为h，则计数空腔体积V2＝[ab-(4r2-πr2)]h，自动化成像装置对单个空腔内的待计数微球进行对焦依次拍照5次成像后传送至计算机，机器视觉识别微球图像并计算免疫复合物上平均不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针数量为
Figure BDA0003343016050000091
若待测反应液内微球分布均匀，则可估算反应液免疫复合物中不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针总数量
Figure BDA0003343016050000092
依此计数方法可估算待测反应液中其余种类微球数量，从而可间接计算待测目标物含量，不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针即代表不同种类目标物，实现多目标物同时检测。
参见图4所示，为本发明可视化检测多目标物实现形式结构框图。本发明实现形式整体分为3部分，具体包括生化反应部分、可视化成像部分和机器视觉识别部分。首先，将不同目标物对应的生物识别分子与粒径和/或颜色不同的高分子微球偶联，并将偶联不同生物识别分子的不同粒径和/或颜色的高分子微球与不同种类目标物进行均相反应和点击反应信号放大。随后，将微流控芯片反应计数板放置于成像光源上方，通过可编程三轴控制器控制高精度线性导轨与电动伸缩杆带动CMOS相机可视化成像模块平移对焦，直至计算机中CMOS相机成像软件所成图像清晰可见，CMOS 相机对每个计数空腔内微球拍照5次后，自动平移至下一个计数空腔重复过程，直至完成所有计数空腔拍照，其中CMOS相机通过千兆数据交换器与计算机通讯，将所拍图像传送至计算机并保存。最后，基于Python的机器视觉识别软件对导入计算机的图像进行筛选预处理、微球特征提取、识别载体上的不同粒径/颜色高分子微球信号探针并完成计数等操作，将所得函数值反馈至计算机输出，全过程实验耗材均为免洗一次性使用。
参见图5所示，为不同粒径/颜色微球编码组合均相反应后形成的免疫复合物图。当CMOS相机完成微球成像拍照后，将生成的照片通过千兆数据交换机直接传送至计算机，由机器视觉软件对微球的粒径、颜色和数量进行识别，随后函数反馈识别结果。图5A为DNA分子杂交检测沙门氏菌反应液成像图，免疫反应后偶联生物识别分子的6μm高分子微球载体与1μm高分子微球信号探针结合，生成6μm高分子微球载体-沙门氏菌捕获探针-待测物-沙门氏菌检测探针-1μm高分子微球信号探针DNA 杂交复合物，待测目标物数量和免疫复合物1μm高分子微球信号探针数量呈正相关，由此对免疫复合物上1μm高分子微球信号探针数量计数可间接计算待测目标物含量。图5B为3μm不同颜色(白、黄、蓝)的高分子微球在放大200X下所成图像，当选用不同颜色3μm的高分子微球作为信号探针偶联不同目标物的生物识别分子时，则一种颜色即可代表一种检测目标物，以实现多目标物同时检测。图5C以6μm白色高分子微球作为载体3μm黄色与蓝色高分子微球作为信号探针，免疫反应后形成的免疫复合物在放大200X下所成的图像，其中黄色与蓝色高分子微球分别代表2种不同的生物标志物。图5D以6μm黄色高分子微球作为载体3μm黄色与蓝色高分子微球作为信号探针，免疫反应后形成的免疫复合物在放大200X下所成的图像，其中黄色与蓝色高分子微球分别代表2种不同的抗生素。
与传统离心管内反应相比，本发明集成度更高，将均相反应集成在微流控芯片内部一次性完成，微反应器内反应所需样品量少，检测精度更高，所用检测时间更短；与传统库尔特颗粒计数装置相比，本发明装置具有造价成本低廉、实验耗材一次性使用免洗涤、精准控制等优点；与传统光学显微镜成像相比，本发明装置完美的保留了对焦、成像、拍照、与计算机数据通讯等功能，结构更加简单，自动化程度更高；与磁分离免疫分析法相比，本专利将点击反应信号放大与可视化成像有机结合，无需使用价格昂贵的纳米磁颗粒，操作更加简单，免洗涤一步法反应完成后直接取反应液即可用于计数，不同粒径/颜色的高分子微球组合可实现多目标物同时检测，是一个“样品进，结果出”多目标物同时检测的模式。相比申请人前期的显微镜成像方法(CN 112964868A和CN 112852925A)，本发明所述方法可以实现整个反应一步完成，无需磁分离或者膜过滤，且融合了点击反应进行了信号放大，可根据实际需求应用于多种场景的快速检测，如食品安全快速检测、体外诊断、环境监测等。另外，该发明专利的另外一个优势是多目标物同时检测的能力更强。因为前期申请人构建的基于PS 微球信号探针的显微镜成像方法是基于PS微球信号探针的粒径与颜色的不同，实现了多个目标物的检测，而其载体是磁颗粒，没有信号编码能力。而本专利中，载体换成了不同粒径/颜色的PS微球，其信息可以和后续的PS信号探针进行组合，因此其多目标物同时检测的能力呈指数增大。
所述多目标物同时检测的具体实现形式为不同粒径/颜色的高分子微球载体与信号探针相互组合，不同粒径/颜色的高分子微球信号探针即代表不同种类的目标物，当载体的粒径/颜色发生改变时，所代表目标物的种类也发生改变，本质上为颜色与粒径二维信息的相互组合，但不仅限于此类组合形式。
当生物识别分子为捕获抗体/检测抗体、或DNA捕获探针/DNA检测探针时，检测原理与上述方法类似，区别在于所发生的反应为免疫夹心反应或DNA分子杂交反应，复合物中的高分子微球信号探针数量与待测样品中目标物的含量呈正相关。
本发明有益效果如下：
(1)基于高分子微球载体与信号探针的粒径和颜色相互编码，多目标物同时检测的能力强且种类多。传统的检测方法为了实现多个目标物的检测，一般采用荧光微球、量子点、上转换材料或者在不同空间位置上实现多个目标物产生的信号位置不同加以区分。而本发明只需要改变高分子微球的粒径或者颜色，即可通过特异性免疫反应或者DNA分子杂交反应和微球成像计数实现多目标物同时检测。高分子微球的粒径大小可控，悬浮稳定性很好，不同粒径的高分子微球不会发生信号重叠，更为重要的是不同粒径和颜色的微球可以进行组合编码，可供选择的编码组合可以呈指数扩大。例如：3种同一粒径不同颜色的高分子微球载体，与3种不同粒径的高分子微球信号探针进行排列组合编码，则每一种颜色的高分子微球载体可以偶联3种不同粒径的高分子微球信号探针，则该情况下可以检测9种目标物；当改变3种不同粒径的高分子微球信号探针颜色时，则检测目标物的种类数可以达到27种；若同时改变高分子微球载体的粒径(假设高分子微球载体粒径有2种)，则检测目标物的种类数可以达到 54种。因此，可根据实际检测需求，选取不同颜色和/或不同粒径的高分子微球进行组合编码，实现多目标物同时检测。相比于申请人前面申请的一种基于磁分离同时检测多种目标物的分析方法(CN112964868A)，本专利具有更高的检测通量，因为可以改变载体的粒径及颜色，其检测目标物的种类是前面专利的3-5倍。
(2)检测成本低，操作步骤少。与磁分离检测方法相比，本发明检测方法可实现免洗涤一步法检测、无需反复洗涤和磁分离提取免疫复合物等步骤，直接对含有复合物的反应液进行成像拍照即可。本发明中复合物中高分子微球信号探针的数量直接与目标物的含量相关，整个信号转换一步完成，无需多余的信号放大步骤，从而进一步简化了操作步骤并提高了检测效率。
(3)配套装置与耗材结构简单可靠、自动化程度高，计数过程可视化。本发明设计了一套自动化对焦成像装置可精准快速地对高分子微球信号探针进行可视化成像，与传统光学显微镜相比保留了成像、对焦、拍照与计算机数据通讯等功能，但结构更简单可靠，成本更低且适用性更好。可视化计数方法与传统库尔特计数法相比，计数方式更加直观准确，与微流控芯片配合使用，将均相反应过程集成在芯片内部，仅需少量样品(～20μL)短时间内即可完成反应，与传统方法相比提高了检测灵敏度和准确性。
(4)稳定性好，识别准确度高。相比于其他微球，例如荧光微球等，高分子微球无需避光保存，在室温下可以长时间存储，稳定性更好。高分子微球价格低廉，实验耗材***格较低，具有一次性使用免洗涤、随用随换、购买便利等优点。基于 Python的机器视觉微球识别软件直接提取免疫复合物中微球特征，识别速度更快准确度更高，颗粒识别度可达99％，高程度的自动化作业减少了人力物力，提高了检测效率，可更便捷高效地实现多样本检测。
(5)灵敏度高，可选择性强。与传统的均相反应相比，本发明将点击反应信号放大和免疫反应/DNA分子杂交相组合，针对检测不同种类的目标物可以选择不同的检测形式，如检测痕量目标物时可选择与点击反应相组合进行信号放大提高检测灵敏度，当检测中等浓度目标物时可选用传统的免疫反应/DNA分子杂交从而节省成本，检测不同种类的多目标物时可以选择不同类型的点击反应功能团组合，避免相互产生干扰，提高检测的准确度与可选择性。
附图说明
图1为点击反应多步信号放大与点击反应信号放大检测多目标物原理图。
图2为本发明提供配套的自动化对焦成像装置。
图3为微流控芯片反应计数板结构图。
图4为本发明可视化检测多目标物实现形式结构框图。
图5为不同粒径和/或颜色微球编码组合均相反应后形成的免疫复合物图。
图6为实施例1不同粒径大小的高分子微球下得到的信号探针数量与沙门氏菌浓度关系变化。
图7为实施例2竞争法检测不同抗生素(氯霉素、阿莫西林和新霉素)的标准曲线。
图8为实施例3双抗夹心法检测不同种类生物标志物(PSA、CEA和AFP)的标准曲线。
图9为实施例3本发明方法与基于磁分离的离心管反应法检测***特异抗原(PSA) 的标准曲线对比图。
图10为实施例3本发明不同方案的信号放大模式检测***特异抗原(PSA)的灵敏度对比图。
图中：第一导轨(1)，第二导轨(2)，支架(4)，机架(5)，伸缩杆(3)，可伸缩推杆(7)，成像目镜(8)，CMOS工业相机(6)，物镜(9)，光源(10)，第一进样口(1-1)，第二进样口(1-2)，一级反应区域(1-3)，二级反应区域(1-4)，三级反应区域(1-5)，计数空腔区域(1-6)，废液收集区域(1-7)，混合出液口(1-8)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实验所用试剂及相关术语说明：
羧基化聚苯乙烯微球：粒径1μm、2μm、3μm、4μm、5μm和6μm；3μm聚苯乙烯微球颜色包括白色、黄色和蓝色；购自Bangs Laboratories,Inc.
点击反应试剂：反式环辛烯(TCO-PEG4-NHS Ester，TCO)和四嗪功能团(Tetrazine-PEG4-NHS Ester，TZ)；二苯并环辛炔(DBCO-PEG4-NHS Ester，DBCO) 与叠氮(Azide-PEG4-NHS Ester，Azide)；半胱氨酸(Cys-PEG4-NHS Ester，Cys) 氰基苯并噻唑(CBT-PEG4-NHS Ester，CBT)均购自Click Chemistry Tools。
沙门氏菌捕获探针和检测探针由生工生物工程(上海)有限公司设计并合成；氯霉素、阿莫西林、新霉素及其对应的完全抗原和抗体购自上海羽朵生物科技有限公司；***特异抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)及其对应的捕获抗体和检测抗体购自abcam公司。
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺活泼酯(sulfo-NHS)：购自上海阿拉丁均相科技股份有限公司。Tween-20、牛血清白蛋白(BSA)：购自Amresco公司。
PBS缓冲液(10mM，pH＝7.4)：取8.00g NaCl,0.20g KCl,0.20g KH2PO4和 2.90gNa2HPO4·12H2O于1000mL容量瓶中定容，摇匀。
MES缓冲液(0.1M，pH＝6.0)：取21.325g MES溶于去离子水中定容至1000 mL，为A液；取4g NaOH溶于去离子水中定容至1000mL，为B液；取1000mL A 液和400mL B液混合，摇匀。
PBST、MEST：在配制好的1000mL PBS或MES缓冲液中加入0.5mLTween-20，摇匀。
以下实施例中采用的自动化对焦成像装置，竖直方向和水平方向分别设置第一导轨(1)和第二导轨(2)，第一导轨(1)和第二导轨(2)呈90°角交错，第一导轨(1)通过支架(4)固定在机架(5)上，第一导轨(1)和第二导轨(2)均以步进电机作为动力装置通过可编程控制器控制，以实现竖直方向和水平方向的定向移动。
优选地，第二导轨(2)上设有滑块，滑块上连接有伸缩杆(3)，伸缩杆(3) 与可伸缩推杆(7)连接，成像目镜(8)通过阶梯轴轴套固定在可伸缩推杆(7)上，成像目镜(8)正上方设置CMOS工业相机(6)，用于拍摄待测微球图像和与计算机通过数据交换机通讯，成像目镜(8)正下方设置可更换成像物镜(9)，机架(5) 上设置可调节成像光源(10)，用于计数板补光。自动化对焦成像装置通过编程控制器配合CMOS工业相机软件可实现自动调焦、空间定点平移等功能。
以下实施例中采用的微流控芯片，微流控芯片设置第一进样口(1-1)、第二进样口(1-2)、反映区域、计数空腔区域(1-6)；废液收集区域(1-7)和混合出液口 (1-8)。
优选地，反映区域包括依次串联的一级反应区域(1-3)、二级反应区域(1-4)、三级反应区域(1-5)；一级反应区域(1-3)、二级反应区域(1-4)和三级反应区域 (1-5)串联连通，一级反应区域(1-3)、二级反应区域(1-4)和三级反应区域(1-5) 包括至少一组反应通道，一级反应区域(1-3)、二级反应区域(1-4)和三级反应区域(1-5)的反应通道数量逐级递增。进一步优选地，一级反应区域(1-3)设置1个 14层的波浪形递增式塔式反应区域，二级反应区域(1-4)设置2个并列的波浪形递增式14层的塔式反应区域，三级反应区域(1-5)设置3个并列的波浪形递增式14 层的塔式反应区域，反应液在多级微通道内反应后生成均相反应复合物并汇聚于计数空腔区域(1-6)，计数区域设置12个同等大小的计数空腔，为防止微球发生粘连和吸附，故计数空腔区域(1-6)设置为圆角矩形。
①基于现代数学分形原理将原有的一级反应区域进行多级发散处理，通过设置三级反应区域，降低了PS微球因偶联生物识别分子而聚集堵塞反应通道的可能性；②与传统的单通道环形微流控芯片、单通道条形微流控反应芯片等相比，本发明中逐级递增的芯片与波浪形递增式塔式反应区域设计使得均相反应速度更快，PS微球随着反应液进入波浪形微通道后，在注射泵推动力与波浪微通道内离心力共同作用下加速混匀，高分子微球载体与高分子微球信号探针产生碰撞结合的概率更大；③且多级塔式反应区域内含有PS微球的反应液会形成多次的“分散-汇聚”的混匀过程，反应液在每次流出与流入波浪形反应通道都是一次混匀过程，解决了微球注入通道内由于自身重力等因素影响导致的分散不均匀的问题；④计数区域设计12个圆角矩形的计数空腔，多个计数空腔可以为同一个样本进行多个平行实验，每一个计数空腔即为一次计数，单个样本测量可重复12次拍照技术，且圆角设计避免了微球发生粘连和吸附在微流控芯片技术区域内发生边角聚集现象以影响检测准确度；
实施例1 DNA分子杂交定量检测沙门氏菌
(1)均相反应试剂制备
选取6μm的聚苯乙烯微球作为捕获探针偶联载体，制备6μm聚苯乙烯微球-沙门氏菌捕获探针物偶联物；选取3μm的聚苯乙烯微球作为检测探针信号探针，制备 3μm聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物；同时制备沙门氏菌检测探针-点击试剂Ⅰ偶联物，微球偶联物制备方法和点击试剂偶联物制备方法均为本领域熟知的常规方法，具体如下：
制备聚苯乙烯微球载体-沙门氏菌捕获探针物偶联物：取2mg羧基修饰的聚苯乙烯微球(6μm，100mg/mL)，用MEST缓冲液(pH＝6.0含0.05％Tween 20)洗涤两次，用MES缓冲液重悬后加入100μL EDC(10mg/mL)和50μL NHS(10mg/mL) 至500mL，混匀后在室温下活化15min。活化完成后用PBS缓冲液洗涤两次后离心分离，用PBS缓冲液重悬后加入0.2mg沙门氏菌捕获探针，室温下反应2-4h；反应结束后，用PBST缓冲液洗涤2次，聚苯乙烯微球-沙门氏菌捕获探针物偶联物用PBS 缓冲液重悬后保存于4℃待用。
制备沙门氏菌检测探针-点击试剂Ⅰ偶联物制备(信号放大载体)：点击反应选用点击试剂Ⅰ为反式环辛烯TCO，相对应的点击试剂Ⅱ为四嗪功能团TZ，取10μL TCO(2mg/mL)溶解于DMF中；取100μL沙门氏菌检测探针(3.5mg/mL，包含氨基)至10mM PBS(PH＝7.4)；将两者按照摩尔比20:1(TCO与沙门氏菌检测探针)室温下混合搅拌1h；反应完成后，在上述混合液中加入100μL Tris-HCl(50mM) 终止反应10min；将上述混合液加入透析袋中4℃透析12h；最后，将制备好的沙门氏菌检测探针-TCO偶联物稀释后，保存于-20℃。
制备聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物制备：使用DMF将10μL TZ(10 mg/mL)稀释至1mg/mL；将上述溶液与200μL聚苯乙烯微球(3μm，100mg/mL) 在室温下混合搅拌1h；使用离心将上述混合溶液在4℃条件下分离，将PS-TZ偶联物用PBST清洗三次，随后将制备好的200nm聚苯乙烯微球信号探针-TZ偶联物重悬于100μL PBST溶液(pH＝7.4，10mM)中，并保存于4℃以便后续使用。
(2)致病菌核酸的提取和PCR扩增
首先，用PBS缓冲液将沙门氏菌标准品分别稀释至102、103、104、105、106、 107CFU/mL。按照试剂盒标准方法对稀释后的沙门氏菌基因组DNA进行提取，并按下述体系进行扩增：10×PCR缓冲液2.0μL，5.0μL上述基因组DNA清液，上、下游引物各1.0μL(0.3μM)，1.0μLDNA聚合酶(5CFU/μL)，1.0μL dNTP(10mM)， 3.0μL MgCl2(2.25mM)和33μL超纯水。反应条件如下：95℃预变性10min，95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸50s，扩增35个循环；72℃延伸10min。将聚苯乙烯微球-沙门氏菌捕获探针偶联物用PBS稀释2倍，将聚苯乙烯微球信号探针- 点击试剂Ⅱ偶联物用PBS稀释50倍。
(3)DNA分子杂交+点击反应一步信号放大
在微量注射泵1中分别加入不同浓度沙门氏菌PCR扩增产物15μL与沙门氏菌捕获探针修饰的聚苯乙烯微球载体各15μL(6μm，50μg/mL)混合通过进样口1注入，在微量注射泵2中加入沙门氏菌检测探针-点击试剂Ⅰ偶联物15μL与3μm聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物15μL(3μm，150μg/mL)混合通过进样口2注入，含有微球的反应液加入前均震荡涡旋或者超声处理5min使其充分混合。聚苯乙烯微球载体，聚苯乙烯微球信号探针与待测目标物在微流控芯片微通道内充分混匀反应生成DNA杂交反应复合物，反应结束后含有该反应复合物的反应液通过计数空腔并将其充满，单个样本重复实验4次。
(4)自动化对焦成像装置拍照
将微流控芯片的计数空腔区域放置于自动对焦成像装置成像光源上方指定位置，通过可编程控制器控制高精度线性导轨和电动伸缩杆，使其携带成像物镜(20X)、成像目镜(10X)和CMOS工业相机至计数空腔正上方，调节成像物镜位置和成像光源亮度，直至CMOS成像软件处出现清晰可见微球图像且成像视野覆盖整个计数空腔区域；随后，CMOS工业相机对第1计数空腔快速拍照5次后，可编程控制器控制高精度线性导轨移动CMOS相机至第2成像区，依次对第2成像区、第3成像区和第4成像区完成拍照，并将成像图像通过千兆数据交换机输送至计算机保存。
(5)图像处理与机器视觉识别
微球识别模型选用Windows 10 64bit操作***下Python环境，处理器选用InterCore i9 10900K，独立显卡选用Nvidia GeForce RTX 3080，深度学习框架选用Pytorch。首先对导入计算机待进行微球识别的图片进行自动分割处理，对每一个微球所在区域进行单独的切割划分成尺寸为227*227的图像，设置不同数量的像素点阈值，识别成像微球不同像素点的数量和设置微球阈值即可实现微球的粒径识别和数量统计。
首先计算机对反应液中的DNA分子杂交复合物进行特征识别，分别识别并设置单个6μm和3μm微球在显微镜下放大100倍所占用像素点数量为阈值A和阈值B (A>B)。以识别6μm微球为例，当待测微球像素点数量接近设置阈值A范围(A ±5％)内时即判定为1个6μm微球，同理对3μm微球进行识别；随后识别DNA分子杂交复合物特征，若计算机识别阈值A与阈值B存在像素点交叉，则分别识别与阈值A交叉的阈值B，并对满足条件的3μm微球进行计数，并将计数值反馈至计算机并输出。依次对每一个切割划分的图像进行识别计数并统计，对计数网格拍照的多张微球图像进行处理识别，同时基于Pytorch的卷积神经网络训练微球进行深度学习建立微球模型并记忆误差允许范围内的微球形状。最后对所有图像识别数据进行整合对比处理，当图像微球识别误差≤1％时***判断计数有效。
(6)可视化检测沙门氏菌
通过DNA分子杂交法检测沙门原理如下：将沙门氏菌基因组DNA、6μm聚苯乙烯微球-沙门氏菌捕获探针物偶联物、沙门氏菌检测探针-点击试剂Ⅰ和偶联物聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物同时注入微流控芯片中充分混合反应生成 DNA杂交复合物，随后保留反应液并对计数空腔内DNA杂交复合物6μm聚苯乙烯微球载体上的3μm聚苯乙烯微球信号探针进行成像拍照并计数，从而直接得出待测目标物沙门氏菌的含量，DNA杂交反应生成的复合物越多，则待测物中的目标物含量越高。因此，沙门氏菌的含量浓度与复合物中3μm聚苯乙烯微球信号探针数量呈现正相关，从而直接计算得出沙门氏菌的含量。
本实施例中对偶联沙门氏菌检测探针的聚苯乙烯微球信号探针粒径大小进行了优化，选取粒径大小分别为1μm、3μm和5μm的PS球偶联沙门氏菌检测探针，选取了粒径大小为6μm的PS球偶联沙门氏菌检测捕获探针，其他条件与上述实验条件相同。如图6所示，实验结果表明不同粒径大小偶联沙门氏菌检测探针的聚苯乙烯微球对实验结果有着显著影响。实验结果表明，当聚苯乙烯微球偶联沙门氏菌检测探针为1μm时，即当选取偶联沙门氏菌检测探针微球粒径与偶联沙门氏菌捕获探针微球粒径之比过大时，在同一放大倍数下成像结果对机器视觉识别微球有着显著影响，所选信号探针微球粒径过小导致软件识别复合物时产生识别误差，导致识别微球数目会偏离实际值；当聚苯乙烯微球偶联沙门氏菌检测探针为5μm时，即当选取偶联沙门氏菌检测探针微球粒径与偶联沙门氏菌捕获探针微球粒径之比越接近1:1时，则会对均相杂交反应结果产生影响，导致均相杂交反应时聚苯乙烯微球信号探针与聚苯乙烯微球载体结合时空间位点不够，使部分信号探针无法与载体结合，使得检测值与实际值相比偏小；而3μm微球既不会影响机器视觉微球识别，也不会影响均相杂交反应微球结合，更有利于检测结果的准确性。
因此，选取杂交复合物中的3μm聚苯乙烯微球个数为纵坐标，沙门氏菌浓度的对数值为横坐标，得到两者之间的相互关系可用于沙门氏菌的定量检测。如图6所示，在103～107CFU/mL范围内，3μm微球个数与沙门氏菌浓度之间具有良好的线性关系，线性方程为Y＝151.88X+716.92(X为沙门氏菌浓度的对数值)，R2＝0.997。
实施例2定量检测抗生素分子氯霉素、阿莫西林和新霉素
(1)均相反应试剂制备
选取6μm的聚苯乙烯微球作为聚苯乙烯微球-抗体偶联载体，分别制备聚苯乙烯微球-氯霉素抗体偶联物载体、聚苯乙烯微球-阿莫西林抗体偶联物载体和聚苯乙烯微球-新霉素抗体偶联物载体；选取2μm，3μm和4μm的聚苯乙烯微球作为信号探针并制备聚苯乙烯微球信号探针-不同种类抗生素完全抗原偶联物，分别制备2μm聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物、3μm聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物和4μm聚苯乙烯微球-点击试剂Ⅱ偶联物；同时制备氯霉素完全抗原-点击试剂Ⅰ偶联物、阿莫西林完全抗原-点击试剂Ⅰ偶联物和新霉素完全抗原-点击试剂Ⅰ偶联物，微球偶联物制备方法和点击试剂偶联物制备方法均为本领域熟知的常规方法，具体如下：
制备聚苯乙烯微球载体-抗生素抗体偶联物：取6mg羧基修饰的聚苯乙烯微球 (6μm，100mg/mL)分为3份每份2mg，分别用MEST缓冲液(pH＝6.0含0.05％Tween 20)洗涤两次，分别用MES缓冲液重悬后加入100μL EDC(10mg/mL)和50μL NHS (10mg/mL)至500mL，混匀后在室温下活化15min。活化完成后用PBS缓冲液洗涤两次后离心分离，用PBS缓冲液重悬后分别加入0.2mg氯霉素抗体，0.2mg阿莫西林抗体和0.2mg新霉素抗体，室温下反应2-4h；反应结束后，分别用1％BSA溶液(PBS稀释)封闭30min，封闭完成后用PBST缓冲液洗涤2次，聚苯乙烯微球- 不同种类抗生素抗体物偶联物载体用PBS缓冲液重悬后保存于4℃待用。
制备不同种类抗生素完全抗原-点击试剂Ⅰ偶联物制备(信号放大载体)：以氯霉素为例，点击反应选用点击试剂Ⅰ为反式环辛烯TCO，取10μL TCO(2mg/mL) 溶解于DMF中；取100μL氯霉素完全抗原(3.5mg/mL)至10mM PBS(PH＝7.4)；将两者按照摩尔比20:1(TCO与氯霉素完全抗原)室温下混合搅拌1h；反应完成后，在上述混合液中加入100μL Tris-HCl(50mM)终止反应10min；将上述混合液加入透析袋中4℃透析12h；最后，将制备好的氯霉素完全抗原-TCO偶联物稀释后，保存于-20℃。阿莫西林和新霉素完全抗原-点击试剂Ⅰ偶联物制备采用同样方法，点击试剂Ⅰ分别选用DBCO和Cys，制备阿莫西林完全抗原-DBCO偶联物和新霉素完全抗原-Cys偶联物。
制备不同粒径聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物制备：以氯霉素为例，点击试剂Ⅱ为四嗪功能团TZ，使用DMF将10μL TZ(10mg/mL)稀释至1mg/mL；将上述溶液与200μL聚苯乙烯微球(2μm，100mg/mL)在室温下混合搅拌1h；使用离心将上述混合溶液在4℃条件下分离，将聚苯乙烯微球信号探针-TZ偶联物用 PBST清洗三次，随后将制备好的2μm聚苯乙烯微球信号探针-TZ偶联物重悬于100 μL PBST溶液(pH＝7.4，10mM)中，并保存于4℃以便后续使用。阿莫西林和新霉素聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅰ偶联物制备采用同样方法，点击试剂Ⅱ分别选用Azide和CBT，制备3μm聚苯乙烯微球信号探针-Azide偶联物和制备4μm聚苯乙烯微球信号探针-CBT偶联物。
(2)竞争均相免疫反应+点击反应一步信号放大
将偶联氯霉素抗体、阿莫西林抗体和新霉素抗体的6μm聚苯乙烯微球载体和含有氯霉素、阿莫西林和新霉素的待测物样本各15μL混合通过微量注射泵缓慢注入进样口1-1；不同种类抗生素完全抗原-点击试剂Ⅰ偶联物与聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物15μL(2μm、3μm和4μm，150μg/mL)混合通过进样口1-2注入，含有微球的反应液加入前均震荡涡旋或者超声处理5min使其充分混合。聚苯乙烯微球载体，不同粒径的聚苯乙烯微球信号探针与待测目标物在微流控芯片微通道内充分混匀反应生成免疫复合物，反应结束后含有该反应复合物的反应液通过计数空腔并将其充满，单个样本重复实验4次。
(3)自动化对焦成像装置拍照
将微流控芯片的计数空腔区域放置于自动对焦成像装置成像光源上方指定位置，通过可编程控制器控制高精度线性导轨和电动伸缩杆，使其携带成像物镜(20X)、成像目镜(10X)和CMOS工业相机至计数空腔正上方，调节成像物镜位置和成像光源亮度，直至CMOS成像软件处出现清晰可见微球图像且成像视野覆盖整个计数空腔区域；随后，CMOS工业相机对第1计数空腔快速拍照5次后，可编程控制器控制高精度线性导轨移动CMOS相机依次对第2成像区、第3成像区和第4成像区完成拍照，并将成像图像通过千兆数据交换机输送至计算机保存。
(4)图像处理与机器视觉识别
微球识别模型选用Windows 10 64bit操作***下Python环境，处理器选用InterCore i9 10900K，独立显卡选用Nvidia GeForce RTX 3080，深度学习框架选用Pytorch 的卷积神经网络。首先对导入计算机待进行微球识别的图片进行自动分割处理，对每一个微球所在区域进行单独的切割划分成尺寸为227*227的图像，设置不同数量的像素点阈值，识别成像微球不同像素点的数量和设置微球阈值即可实现微球的粒径识别和数量统计。
首先计算机对反应液中的免疫复合物进行特征识别，识别并分别设置单个6μm、 2μm，3μm，4μm微球在显微镜下放大100倍所占用像素点数量为阈值A、阈值B、阈值C和阈值D(B＜C＜D＜A)。以识别6μm微球为例，当待测微球像素点数量接近设置阈值A范围(A±5％)内时即判定为1个6μm微球，同理对2μm，3μm和 4μm微球进行识别；随后识别免疫复合物特征，若计算机识别阈值A与阈值B存在像素点交叉，则分别识别与阈值A交叉的阈值B，并对满足条件的2μm微球进行计数，并将计数值反馈至计算机并输出，同理对满足条件的3μm和4μm微球进行计数。依次对每一个切割划分的图像进行识别计数并统计，对计数网格拍照的多张微球图像进行处理识别，同时基于Pytorch的卷积神经网络训练微球进行深度学习建立微球模型并记忆误差允许范围内的微球形状。最后对所有图像识别数据进行整合对比处理，当图像微球识别误差≤1％时***判断计数有效。
(5)可视化检测不同种类抗生素
通过均相反应检测氯霉素、阿莫西林和新霉素原理如下：将聚苯乙烯微球-氯霉素抗体偶联物载体(6μm，50μg/mL)、聚苯乙烯微球-阿莫西林抗体偶联物载体(6μm， 50μg/mL)、聚苯乙烯微球-新霉素抗体偶联物载体(6μm，50μg/mL)、氯霉素完全抗原-TCO偶联物、阿莫西林完全抗原-DBCO偶联物、新霉素完全抗原-Cys偶联物、聚苯乙烯微球-TZ偶联物(2μm，150μg/mL)、聚苯乙烯微球-Azide偶联物(3μm， 150μg/mL)、聚苯乙烯微球CBT偶联物(4μm，150μg/mL)和一系列浓度的氯霉素、阿莫西林和新霉素混合注入微流控芯片，直至充分混匀反应。随后保留反应液并对复合物载体上的信号探针进行成像拍照并计数，从而间接得出待测目标物氯霉素、阿莫西林和新霉素浓度含量，均相反应生成的免疫复合物越多，则待测物中的目标物含量越低。
因此，不同种类抗生素含量浓度与复合物中聚苯乙烯微球信号探针数量呈现负相关，从而间接计算得出不同种类抗生素的含量浓度。以免疫复合物中的聚苯乙烯微球信号探针数量个数为纵坐标，不同种类抗生素含量浓度的对数值为横坐标，得到两者之间的相互关系可用于不同种类抗生素含量浓度的定量检测。如图7所示，在10-2～105 ng/mL范围内，聚苯乙烯微球信号探针数量个数与不同种类抗生素之间具有良好的线性关系，氯霉素、阿莫西林和新霉素线性方程分别为Y＝-116.89X+1210(X为氯霉素浓度的对数值)、Y＝-119.88+1325.5(X为阿莫西林浓度的对数值)和Y＝-114.93+1554.7 (X为新霉素浓度的对数值)，R2分别为0.979、0.949和0.983。
实施例3定量检测血清中的***特异抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)
(1)均相反应试剂制备
选取6μm的聚苯乙烯微球作为聚苯乙烯微球-检测抗体偶联载体，分别制备聚苯乙烯微球-***特异抗原(PSA)检测抗体偶联物载体、聚苯乙烯微球-癌胚抗原(CEA) 检测抗体偶联物载体和聚苯乙烯微球-甲胎蛋白(AFP)检测抗体偶联物载体；选取3 μm不同颜色的聚苯乙烯微球制备聚苯乙烯微球信号探针-不同种类炎症标志物捕获抗体偶联物，分别制备3μm白色聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物、3μm 白色聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物和3μm黄色聚苯乙烯微球信号探针- 点击试剂Ⅱ偶联物；同时制备PSA捕获抗体-点击试剂Ⅰ偶联物、CEA捕获抗体-点击试剂Ⅰ偶联物和AFP捕获抗体-点击试剂Ⅰ偶联物，微球偶联物制备方法和点击试剂偶联物制备方法均为本领域熟知的常规方法，具体如下：
制备聚苯乙烯微球载体-炎症标志物检测抗体偶联物：取6mg羧基修饰的聚苯乙烯微球(6μm，100mg/mL)分为3份每份2mg，分别用MEST缓冲液(pH＝6.0 含0.05％Tween 20)洗涤两次，分别用MES缓冲液重悬后加入100μL EDC(10mg/mL) 和50μL NHS(10mg/mL)至500mL，混匀后在室温下活化15min。活化完成后用 PBS缓冲液洗涤两次后离心分离，用PBS缓冲液重悬后分别加入0.2mg***特异抗原(PSA)检测抗体，0.2mg癌胚抗原(CEA)检测抗体和0.2mg甲胎蛋白(AFP) 检测抗体，室温下反应2-4h；反应结束后，分别用1％BSA溶液(PBS稀释)封闭 30min，封闭完成后用PBST缓冲液洗涤2次，聚苯乙烯微球-不同种类生物标志物检测抗体偶联物载体用PBS缓冲液重悬后保存于4℃待用。
制备不同种类炎症标志物捕获抗体-点击试剂Ⅰ偶联物制备(信号放大载体)：以PSA击反应选用点击试剂Ⅰ为反式环辛烯TCO，取10μL TCO(2mg/mL)溶解于DMF中；取100μLPSA捕获抗体(3.5mg/mL)至10mM PBS(PH＝7.4)；将两者按照摩尔比20:1(TCO与PSA捕获抗体)室温下混合搅拌1h；反应完成后，在上述混合液中加入100μL Tris-HCl(50mM)终止反应10min；将上述混合液加入透析袋中4℃透析12h；最后，将制备好的PSA捕获抗体-TCO偶联物稀释后，保存于-20℃。 CEA和AFP捕获抗体-点击试剂Ⅰ偶联物制备采用同样方法，点击试剂Ⅰ分别选用 DBCO和Cys，制备CEA捕获抗体-DBCO偶联物和AFP捕获抗体-Cys偶联物。
制备不同颜色聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物制备：以PSA为例，点击试剂Ⅱ为四嗪功能团TZ，使用DMF将10μL TZ(10mg/mL)稀释至1mg/mL；将上述溶液与200μL聚苯乙烯微球(3μm，白色，100mg/mL)在室温下混合搅拌1 h；使用离心将上述混合溶液在4℃条件下分离，将聚苯乙烯微球信号探针-TZ偶联物用PBST清洗三次，随后将制备好的2μm聚苯乙烯微球信号探针-TZ偶联物重悬于 100μL PBST溶液(pH＝7.4，10mM)中，并保存于4℃以便后续使用。CEA和AFP 聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅰ偶联物制备采用同样方法，点击试剂Ⅱ分别选用 Azide和CBT，制备3μm黄色聚苯乙烯微球信号探针-Azide偶联物和制备3μm蓝色聚苯乙烯微球信号探针-CBT偶联物。
(2)双抗夹心均相免疫反应+点击反应一步信号放大
将偶联PSA检测抗体、CEA检测抗体和AFP检测抗体的聚苯乙烯微球载体和含有PSA、CEA和AFP的待测物样本各15μL混合通过微量注射泵缓慢注入进样口 1-1；不同种类炎症标志物捕获抗体-点击试剂Ⅰ偶联物与不同颜色聚苯乙烯微球信号探针-点击试剂Ⅱ偶联物15μL(3μm，白色，黄色，蓝色，150μg/mL)混合通过进样口1-2注入，含有微球的反应液加入前均震荡涡旋或者超声处理5min使其充分混合。聚苯乙烯微球载体，不同颜色聚苯乙烯微球信号探针与待测目标物在微流控芯片微通道内充分混匀反应生成双抗夹心免疫复合物，反应结束后含有该反应复合物的反应液通过计数空腔并将其充满，单个样本重复实验4次。
(3)自动化对焦成像装置拍照
将微流控芯片的计数空腔区域放置于自动对焦成像装置成像光源上方指定位置，通过可编程控制器控制高精度线性导轨和电动伸缩杆，使其携带成像物镜(20X)、成像目镜(10X)和CMOS工业相机至计数空腔正上方，调节成像物镜位置和成像光源亮度，直至CMOS成像软件处出现清晰可见微球图像且成像视野覆盖整个计数空腔区域；随后，CMOS工业相机对第1计数空腔快速拍照5次后，可编程控制器控制高精度线性导轨移动CMOS相机依次对第2成像区、第3成像区和第4成像区完成拍照，并将成像图像通过千兆数据交换机输送至计算机保存。
(4)图像处理与机器视觉识别
微球识别模型选用Windows 10 64bit操作***(版本号1909)下Python环境，处理器选用Inter Core i9 10900K，独立显卡选用Nvidia GeForce RTX 3080，深度学习框架选用基于Pytorch的卷积神经网络。首先对导入计算机待进行微球识别的图片进行自动分割处理，对每一个微球所在区域进行单独的切割划分成尺寸为227*227的图像，设置不同数量的像素点阈值，识别成像微球不同像素点的数量和设置微球阈值即可实现微球的粒径识别和数量统计；由于不同颜色所对应的RGB值不同，如：红色 RGB(255，0，0)、黄色RGB(255，255，0)、蓝色RGB(0，0，255)等，通过计算机识别微球RGB值即可判断微球颜色
对不同颜色的高分子微球进行识别时，计算机首先对微球的颜色进行识别分类，随后再对不同颜色下的粒径进行识别分类并计数。识别并分别设置单个6μm和3μm 微球在显微镜下放大1000倍所占用像素点为阈值A和阈值B(B<A)，设置红色微球颜色阈值C1、黄色微球颜色阈值C2和蓝色微球颜色阈值C3。以3μm红色微球识别为例，先将待测微球像素点颜色RGB值与红色微球颜色阈值C1进行识别比对，当待测微球像素点颜色接近设置阈值C1范围(C1±20％)内时即判定为1个红色微球并归类，若不满足红色颜色阈值条件则再与颜色阈值C2和颜色阈值C3进行对比，均不满足则单独归类，确定待测微球颜色；随后确定待测微球粒径，当待测微球像素点数量接近设置阈值B范围(B±5％)内时即判定为1个3μm微球，当待测微球像素点与设置阈值A偏离过大则对该微球单独计数。随后识别免疫复合物特征，若计算机识别阈值A与阈值B存在像素点交叉，则分别识别与阈值A交叉的阈值B，并对满足条件的不同颜色的3μm微球进行分类并计数，并将计数值反馈至计算机并输出。依次对每一个切割划分的图像进行识别计数并统计，对计数网格拍照的多张微球图像进行处理识别，同时基于Pytorch的卷积神经网络训练微球进行深度学习建立微球模型并记忆误差允许范围内的微球形状。最后对所有图像识别数据进行整合对比处理，当图像微球识别误差≤1％时***判断计数有效。
(5)可视化检测不同种类生物标志物
通过均相反应检测PSA、CEA和AFP原理如下：将聚苯乙烯微球-PSA检测抗体偶联物载体(6μm，50μg/mL)、聚苯乙烯微球-CEA检测抗体偶联物载体(6μm， 50μg/mL)、聚苯乙烯微球-AFP检测抗体偶联物载体(6μm，50μg/mL)、PSA捕获抗体-TCO偶联物、CEA捕获抗体-DBCO偶联物、AFP捕获抗体-Cys偶联物、白色聚苯乙烯微球-TZ偶联物(3μm，150μg/mL)、黄色聚苯乙烯微球-Azide偶联物(3 μm，150μg/mL)、蓝色聚苯乙烯微球CBT偶联物(3μm，150μg/mL)和一系列浓度的PSA、CEA和AFP混合注入微流控芯片，直至充分混匀反应。随后保留反应液并对免疫复合物微球载体上的微球进行成像拍照并计数，从而间接得出待测目标物 PSA、CEA和AFP原理的含量，均相反应生成的免疫复合物越多，则待测物中的目标物含量越高。
因此，不同种类生物标志物含量浓度与复合物中不同颜色聚苯乙烯微球信号探针数量呈现正相关，从而间接计算得出不同种类生物标志物的含量浓度。以免疫复合物中的不同颜色聚苯乙烯微球信号探针个数为纵坐标，不同种类生物标志物含量浓度的对数值为横坐标，得到两者之间的相互关系可用于不同种类生物标志物含量浓度的定量检测。如图8所示，在10-1～103ng/mL范围内，聚苯乙烯微球信号探针个数与不同种类生物标志物之间具有良好的线性关系，PSA、CEA和AFP线性方程分别为 Y＝99.02X+1421.83(X为PSA浓度的对数值)、Y＝124.49X+1293.32(X为CEA浓度的对数值)和Y＝105.28X+1149.89(X为AFP浓度的对数值)，R2分别为0.989、 0.987和0.994。如表1所示，为采用标准加入法对血清中的***特异抗原(PSA) 进行检测的结果，实验结果表明对血清中不同浓度的***特异抗原(PSA)检测均具有较好的准确性和回收率。
表1采用标准加入法对血清中的***特异抗原(PSA)检测的结果
Figure BDA0003343016050000251
将本实验方法与传统的小孔颗粒计数法对比，对比结果如表2所示，结果表明本实验方法与传统的小孔计数法相比灵敏度高且相对标准偏差(RSD)小。传统的小孔颗粒计数法准确度与小孔和待测微球之间宽径比相关，待检测微球的直径与小孔孔径越接近准确度越高。但当高分子微球偶联生物识别分子时会出现聚集现象，导致传统的小孔颗粒计数法所测得的微球数值与实际值偏小。而本方法采用光学显微镜可视化拍照的形式将待测高分子微球探针直接成像，机器视觉微球识别软件对微球数量识别度可达99％，检测结果更加准确可靠，通过对载体微球上偶联的信号探针微球直接进行计数。且本方法自动化程度高使检测时间大幅缩短，免洗涤的可视化拍照与机器视觉微球识别结合，1s内即可完成一个待测样的检测并估算出总体待测物含量。
表2本方法和和基于磁分离的小孔颗粒计数法对血清中***特异抗(PSA) 检测分析性能对比
Figure BDA0003343016050000252
将本发明方法与基于磁分离的离心管反应法对检测血清中***特异抗原(PSA)进行检测分析性能对比，不同浓度下检测标准曲线对比图如图9所示，实验对比结果如表3所示，结果表明本发明方法与基于磁分离的离心管反应法具有更好的检测效果和检测灵敏度。以微流控芯片为基础的微反应体系与传统的离心管内反应体系相比，所需要的反应液体积更少仅为离心管反应体系的1/25，相比基于磁分离的离心管反应法，微流控芯片中的反应可以增加微球之间的碰撞频率，加快反应的进行，极大地提高了稳定性和加快了反应速度。当高分子绝缘微球载体与信号探针微流控芯片管道中内充分混匀随后发生反应，解决了传统离心管内反应高分子微球易发生沉降分层难混匀的难题。
表3本方法和基于离心管反应法的磁分离-显微成像法对血清中***特异抗原(PSA)检测分析性能对比
Figure BDA0003343016050000261
如图10为本发明不同方案的信号放大检测***特异抗原(PSA)的灵敏度对比图。检测结果表明，本发明所述的三种检测方案(均相免疫反应无需信号放大、一次信号放大检测和二次信号放大检测)对不同浓度的***特异抗原(PSA)都具有良好的线性关系，信号放大的次数越多，高分子微球信号探针所检测到的PSA的含量也就越低，方法灵敏度也就越高。该结果说明采用不同点击反应的步骤可以提高方法的灵敏度，进而实现对不同浓度目标物的精准检测。
通过上述实施例来解释本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述具体实施例才能实施。所属领域的技术人员在本发明基础上进行的任何改进，或者对本发明所选用的材料的等效替换等，均落在专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法，其特征在于：所述方法包括均相反应部分、可视化成像部分、机器视觉识别部分，其中均相反应部分根据待测物灵敏度的要求，选择从以下方案中进行反应得的反应复合物；
S1-A方案1：当待测目标物的浓度为ng/mL-μg/mL时，选用方案1作为检测方案，包括以下步骤：
S1-A.1在不同粒径和/或颜色的高分子微球载体表面分别偶联不同目标物的生物识别分子A得到偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体；
S1-A.2在不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针表面偶联不同目标物的生物识别分子B得到偶联生物识别分子B的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针，生物识别分子A与生物识别分子B匹配；
S1-A.3偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体、偶联生物识别分子B的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针和含有目标物的待测液混合注入微流控芯片中进行均相反应，得到不同粒径和/或颜色的反应复合物；
S1-B方案2：当待测目标物的浓度为pg/mL-ng/mL时，选用方案2作为检测方案，包括以下步骤：
S1-B.1在不同粒径和/或颜色的高分子微球载体表面分别偶联不同目标物的生物识别分子A得到偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体，每一种粒径和/或颜色对应一种目标物，同时将多种目标物对应的生物识别分子B上修饰点击试剂Ⅰ，生物识别分子A与生物识别分子B匹配；
S1-B.2在不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针表面修饰与试剂Ⅰ配对的点击试剂Ⅱ得到修饰了点击试剂Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针，其中每一种不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针即代表一种目标物；
S1-B.3将偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体、修饰点击试剂Ⅰ的生物识别分子B、修饰了点击试剂Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针和含有目标物的待测液混合注入微流控芯片中进行均相反应，得到不同粒径和/或颜色的反应复合物；
S1-C方案3：当待测目标物的浓度为pg/mL或者低于pg/mL时，选用方案3作为检测方案，包括以下步骤：
S1-C.1在不同粒径和/或颜色的高分子微球载体表面分别偶联不同目标物的生物识别分子A得到偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体，每一种粒径和/或颜色对应一种目标物，同时将多种目标物对应的生物识别分子B上修饰点击试剂Ⅰ，生物识别分子A与生物识别分子B匹配；
S1-C.2在不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针表面修饰与试剂Ⅰ配对的点击试剂Ⅱ得到修饰了点击试剂Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针，其中每一种不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针即代表一种目标物；
S1-C.3在不同粒径和/或颜色高分子绝缘微球信号探针表面修饰试剂Ⅰ得到修饰了点击试剂Ⅰ或Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针，其中每一种不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针即代表一种目标物；
S1-C.4：将偶联生物识别分子A的不同粒径和/或颜色的高分子微球载体、修饰点击试剂Ⅰ的生物识别分子B、修饰了点击试剂Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针、修饰了点击试剂Ⅰ或Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针和含有目标物的待测液混合注入微流控芯片中进行均相反应，得到不同粒径和/或颜色的反应复合物；
均相反应得到的反应复合物进行S2可视化成像部分、S3机器视觉识别部分，具体如下：
S2可视化成像部分：
将反应复合物汇聚于微流控芯片内的计数空腔中，将微流控芯片的计数空腔置于成像装置处，可编程自动对焦成像装置完成对焦后对微流控芯片计数板中各个计数空腔依次拍照成微球图像，微球图像传输至计算机；
S3机器视觉识别部分：
基于Python的机器视觉识别软件对导入计算机的图像进行筛选预处理、微球特征提取、识别载体上的不同粒径和/或颜色高分子微球信号探针并完成计数等操作，将所得函数值反馈至计算机输出；实现可视化检测多目标物的均相免疫分析。
2.根据权利要求1所述的基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法，所述高分子微球载体和高分子微球载体与信号探针的粒径为1～50μm；
所述不同颜色的高分子微球，它们的颜色分别为紫色、红色、橙色、黑色、蓝色、绿色、黄色或白色或其他；
所述高分子微球为聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、聚丁二烯微球、聚异戊二烯微球或其他；
所述目标物包括病毒、生物标志物、抗生素分子、农药分子、兽药分子、生物毒素、细菌或其他；还包括各种基质成分的检测对象，例如血清、牛奶、饮料等，且不仅限于这些检测对象；
所述生物识别分子A和生物识别分子B为捕获抗体和检测抗体、检测抗体和捕获抗体、抗体和抗原、抗原和抗体、DNA捕获探针和DNA检测探针、DNA检测探针和DNA捕获探针；
所述微流控芯片反应计数板基板材料为石英玻璃、聚丙乙烯、聚氯乙烯中的任意一种；与基板键合的计数空腔材料为HTL高精度光敏树脂、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、石英玻璃中任意一种；计数空腔形状为多边形组合但不仅限于此类形状；
所述步骤S3中，首先进行特征识别，先定位图像中的一定粒径和/或颜色的高分子微球载体，然后识别在一定粒径的高分子微球载体表面偶联的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针并分类计数，整个过程无需洗涤，根据软件统计不同粒径和/或颜色高分子微球信号探针数量直接推算相对应的不同种类待测目标物含量。
3.根据权利要求1所述的基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法，所述步骤S1-A.3、S1-B.3、S1-C.4中的均相反应包括竞争免疫反应、双抗夹心免疫反应、DNA分子杂交反应或点击反应。
4.根据权利要求3所述的基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法，所述点击反应的功能团包括叠氮-炔、四嗪(TZ)-反式环辛烯(TCO)、二苯并环辛炔(DBCO)-叠氮(Azide)、半胱氨酸(Cys)-氰基苯并噻唑(CBT)或其他。
5.一种自动化对焦成像装置，其特征在于，竖直方向和水平方向分别设置第一导轨(1)和第二导轨(2)，第一导轨(1)和第二导轨(2)呈90°角交错，第一导轨(1)通过支架(4)固定在机架(5)上，第一导轨(1)和第二导轨(2)均以步进电机作为动力装置通过可编程控制器控制，以实现竖直方向和水平方向的定向移动。
6.根据权利要求5所述的一种自动化对焦成像装置，其特征在于，第二导轨(2)上设有滑块，滑块上连接有伸缩杆(3)，伸缩杆(3)与可伸缩推杆(7)连接，成像目镜(8)通过阶梯轴轴套固定在可伸缩推杆(7)上，成像目镜(8)正上方设置CMOS工业相机(6)，用于拍摄待测微球图像和与计算机通过数据交换机通讯，成像目镜(8)正下方设置可更换成像物镜(9)，机架(5)上设置可调节成像光源(10)，用于计数板补光。自动化对焦成像装置通过编程控制器配合CMOS工业相机软件可实现自动调焦、空间定点平移等功能。
7.一种微流控芯片，其特征在于，其特征在于，微流控芯片设置第一进样口(1-1)、第二进样口(1-2)、反映区域、计数空腔区域(1-6)；废液收集区域(1-7)和混合出液口(1-8)。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于，反映区域包括依次串联的一级反应区域(1-3)、二级反应区域(1-4)、三级反应区域(1-5)；一级反应区域(1-3)、二级反应区域(1-4)和三级反应区域(1-5)串联连通，一级反应区域(1-3)、二级反应区域(1-4)和三级反应区域(1-5)包括至少一组反应通道，一级反应区域(1-3)、二级反应区域(1-4)和三级反应区域(1-5)的反应通道数量逐级递增。
9.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，一级反应区域(1-3)设置1个14层的波浪形递增式塔式反应区域，二级反应区域(1-4)设置2个并列的波浪形递增式14层的塔式反应区域，三级反应区域(1-5)设置3个并列的波浪形递增式14层的塔式反应区域，反应液在多级微通道内反应后生成均相反应复合物并汇聚于计数空腔区域(1-6)，计数区域设置12个同等大小的计数空腔，为防止微球发生粘连和吸附，故计数空腔区域(1-6)设置为圆角矩形。
其中，偶联生物识别分子的一定粒径和/或颜色的高分子微球载体与含有目标物的待测液混合后通过微量注射泵注入第一进样口(1-1)，修饰点击试剂Ⅰ的检测抗体与修饰了点击试剂Ⅱ的不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针通过微量注射泵注入第二进样口(1-2)，注入前高分子微球均震荡涡旋或超声处理1min使其充分混匀；一定粒径和/或颜色的高分子微球载体、不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针和含有目标物的待测液在微通道内注射泵液体驱动力作用下分别进入一级反应区域(1-3)，二级反应区域(1-4)和三级反应区域(1-5)，为加速均相反应进行和防止微球堵塞反应通道，故反应通道设置为多级波浪形通道，在离心力和驱动力作用下反应液在多级反应区域内充分混匀完成均相反应，每一级反应区域内的反应通道数量为多级递增。其中，第一反应区域设置1个14层的波浪形递增式塔式反应区域，第二反应区域设置2个并列的波浪形递增式14层的塔式反应区域，第三反应区域设置3个并列的波浪形递增式14层的塔式反应区域，反应液在多级微通道内反应后生成均相反应复合物并汇聚于计数空腔区域(1-6)，计数区域设置12个同等大小的计数空腔，为防止微球发生粘连和吸附，故计数区域设置为圆角矩形，并将芯片的计数空腔区域置于CMOS相机下拍照成像；随后多余的反应液流入废液收集区域(1-7)并通过混合出液口(1-8)排出微流控芯片。
10.根据权利要求7-8任意一项所述微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片用于基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法，计数原理如下：假设待测反应液的总体积为V1，单个计数空腔长为a，宽为b，空腔圆角半径为r，空腔深度为h，则计数空腔体积V2＝[ab-(4r2-πr2)]h，自动化成像装置对单个空腔内的待计数微球进行对焦依次拍照5次成像后传送至计算机，机器视觉识别微球图像并计算免疫复合物上平均不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针数量为
Figure FDA0003343016040000052
若待测反应液内微球分布均匀，则可估算反应液免疫复合物中不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针总数量
Figure FDA0003343016040000051
依此计数方法可估算待测反应液中其余种类微球数量，从而可间接计算待测目标物含量，不同粒径和/或颜色的高分子微球信号探针即代表不同种类目标物，实现多目标物同时检测。
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