CN114230541A - 一种柚皮素手性拆分方法、绝对构型确定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于手性拆分技术领域，公开了一种柚皮素手性拆分方法、绝对构型确定方法，包括：采用高效液相色谱‑串联质谱法(HPLC‑MS/MS)对柚皮素进行手性拆分；高效液相色谱‑串联质谱法的条件包括：液相条件：采用键合型手性色谱柱，以甲醇‑甲酸水为流动相，等度洗脱；质谱条件：采用ESI离子源，以多反应监测的负离子扫描方式进行手性柚皮素的质谱检测。本发明采用绿色高效的超声波协同技术，对柑橘果皮、果肉和全果中的柚皮素进行分类提取，更好地优化柑橘样品包括果皮、果肉、全果的前处理条件，降低目标功能性成分的损失。本发明不仅能够实现柚皮素手性拆分，同时还明确了R‑柚皮素和S‑柚皮素的绝对构型。

Description

一种柚皮素手性拆分方法、绝对构型确定方法
技术领域
本发明属于手性拆分技术领域，尤其涉及一种柚皮素手性拆分方法、绝对构型确定方法。
背景技术
目前，柚皮素(Naringenin，NAR)，属于二氢黄酮类化合物，是柚皮苷的苷元，主要存在于芸香科柑橘类植物如葡萄柚、橙子、佛手柑等水果中。柚皮素常温下为白色针状结晶，溶于乙醇、***和苯，几乎不溶于水。柚皮素具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗肿瘤、解痉和利胆、预防和治疗肝病、抑制血小板凝结、抗粥样动脉硬化等多种药理活性，可被广泛地应用于医药、食品等领域。
柚皮素为手性化合物，有两个对映异构体(R-和S-柚皮素)，手性对映体有相同的分子量、熔点、溶解度等，但也存在一些理化性质的差异。手性柚皮素与其他手性物质相互作用极有可能产生不同的产物或功效，特别是许多与生物体密切相关的生化反应均和物质的手性相关联。
手性柚皮素的仪器拆分方法主要为液相色谱和液相色谱质谱联用，目前研究进展仅处于对映体的拆分，尚未确定柚皮素R和S的绝对构型，作为一个完整的检测方法，均还有待完善。现有技术1采用高效液相色谱分离了几种果汁柚皮素，最终确认在手性柱Chiralpak AD-H用纯甲醇(不含酸性或碱性添加剂)洗脱，分离度高，但该方法分离时间长，未做绝对构型和方法学确认。现有技术2使用苯基氨基甲酸酯-丙基-β-环糊精手性固定相的纳米液相色谱分离了柚皮素，该方法只保证了两个单体的分离，同样未做绝对构型和方法学确认；现有技术3开发的高速逆流色谱(HSCCC)结合铜(I)-手性离子液体配合物和羟丙基-环糊精，重点做了两个单体的分离，绝对构型和方法学均未做确认，且分离时间长，流动相复杂；现有技术4公开了一种采用RP-UHPLC-DAD的手性柚皮素分析方法，该研究中出现了质谱的方法和参数，有点混乱，在没有对映体单体标准品的情况下，用质谱确认了绝对构型，这个在理论上不符。因为质谱是一种测量离子质荷比(质量-电荷比)的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。也就是说，质谱是没办法确认立体结构的，只能确定质量，故现有技术4的适用性有待商榷。因此，建立完善的手性柚皮素拆分方法具有非常大的必要性和紧迫性。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术并不能实现柚皮素的快速手性拆分，同时也未确定柚皮素R和S的绝对构型。因此无法开展手性柚皮素单体的提取制备和单体的生物学功效分析。
解决以上问题及缺陷的难度为：柚皮素是属于类黄酮的一种功能性物质，功能性物质的手性拆分目前研究较少，拆分过程需要不断地摸索质谱响应条件和液相拆分条件，最终确定最优方法。绝对构型的确定需要涉及到柚皮素异构体的制备，Gaussian-含时密度泛函理论计算与实验圆二色谱(ECD)的拟合，属于多学科多领域的交叉应用。解决以上问题及缺陷的意义为：本发明的方法采用键合型手性色谱柱，即硅胶表面共价键合有直链淀粉-三(3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯)，快速拆分手性柚皮素，有利于多学科间的研究合作、创先建立检测分析服务平台，实现成果转化和创收。该方法的建立为柑橘特色品种的选育、优质栽培技术的开发提供技术支撑，同时提升果实附加值，有利于柑橘功能性消费市场的拓展和产业链的延伸。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种柚皮素手性拆分方法、绝对构型确定方法。
本发明是这样实现的，一种柚皮素手性拆分方法，所述柚皮素手性拆分方法包括：
采用高效液相色谱-串联质谱法对柚皮素进行手性拆分；
所述高效液相色谱-串联质谱法的条件包括：
液相条件：采用键合型手性色谱柱(硅胶表面共价键合有直链淀粉-三(3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯))，以甲醇-甲酸水为流动相，等度洗脱；
质谱条件：采用ESI离子源，以多反应监测的负离子扫描方式进行手性柚皮素的质谱检测。开发的最优质谱和液相条件，是柚皮素能获得较高质谱响应和快速手性分离的保障。
进一步，所述流动相包括：85％甲醇与15％的甲酸水。
进一步，所述甲酸浓度为0.1％。
进一步，所述高效液相色谱的柱温为40℃。
进一步，所述高效液相色谱的流速为0.6mL/min。
本发明的这些参数拆分用最优的液相条件的详述，保证手性柚皮素的快速分离。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述柚皮素手性拆分方法的柚皮素绝对构型确定方法，所述柚皮素绝对构型确定方法包括：
步骤一，柚皮素对映体通过圆二色光谱表征获取实验电子圆二色谱ECD；
步骤二，经Gaussian-含时密度泛函理论，获取计算ECD光谱，确定柚皮素绝对构型；
步骤三，通过制备的柚皮素单体进样，确定R,S-柚皮素在HPLC-MS/MS图谱中的洗脱顺序。
进一步，所述柚皮素绝对构型包括：R-柚皮素和S-柚皮素的绝对构型。
进一步，所述R-柚皮素结构式如下：
Figure BDA0003417474740000041
进一步，所述S-柚皮素结构式如下：
Figure BDA0003417474740000042
本发明的另一目的在于提供一种所述柚皮素手性拆分方法在柑橘类水果柚皮素分类提取中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明采用绿色高效的超声波协同技术，对柑橘果皮、果肉和全果中的柚皮素进行分类提取，更好地优化柑橘样品包括果皮、果肉、全果的前处理条件，降低目标功能性成分的损失。已应用于实际样品的检测中，为委托客户提供详实的科研数据。本发明提供了一种基于HPLC-MS/MS技术的柚皮素手性拆分及其绝对构型确定方法，不仅能够实现柚皮素手性拆分，同时还明确了R-柚皮素和S-柚皮素的绝对构型。
附图说明
图1是本发明实施例提供的柚皮素绝对构型确定方法流程图。
图2是本发明实施例提供的手性柚皮素实验ECD图谱。
图3是本发明实施例提供的手性柚皮素理论计算ECD图谱。
图4是本发明实施例提供的R-柚皮素单体的典型图谱。
图5是本发明实施例提供的S-柚皮素单体的典型图谱。
图6是本发明实施例提供的R-和S-柚皮素标准品的典型图谱。
图7是本发明实施例提供的R-和S-柚皮素实际样品的典型图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种柚皮素手性拆分方法、绝对构型确定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的柚皮素手性拆分方法包括：
采用高效液相色谱-串联质谱法对柚皮素进行手性拆分。
本发明实施例提供的高效液相色谱-串联质谱法的条件包括：
液相条件：采用键合型手性色谱柱，以85％甲醇与15％的甲酸水为流动相，等度洗脱；
质谱条件：采用ESI离子源，以多反应监测的负离子扫描方式进行手性柚皮素的质谱检测。
本发明实施例提供的甲酸浓度为0.1％。
本发明实施例提供的高效液相色谱的柱温为40℃。
本发明实施例提供的高效液相色谱的流速为0.6mL/min。
如图1所示，本发明实施例提供的柚皮素绝对构型确定方法包括：
S101，柚皮素对映体通过圆二色光谱表征获取实验电子圆二色谱ECD；
S102，经Gaussian-含时密度泛函理论，获取计算ECD光谱，确定柚皮素绝对构型；
S103，通过制备的柚皮素单体进样，确定R,S-柚皮素在HPLC-MS/MS图谱中的洗脱顺序。
本发明实施例提供的柚皮素绝对构型包括：R-柚皮素和S-柚皮素的绝对构型。
本发明实施例提供的R-柚皮素结构式如下：
Figure BDA0003417474740000061
本发明实施例提供的S-柚皮素结构式如下：
Figure BDA0003417474740000062
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
1、液相条件
色谱柱
Chiralpak IG-3，2.1mm×150mm，粒径：3μm
键合型手性色谱柱：硅胶表面共价键合有直链淀粉-三(3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯)
厂家、产品型号：大赛璐，Lot No.IG30CT-WK001；Part No.87594
流动相：85％甲醇：15％(含0.1％甲酸)水；
柱温 40℃；
流速 0.6mL/min。
2、质谱条件
表1离子对信息
Q1 Q3 Dwell time(msec) DP CE ID
271.0 151.0 10 -110 -25 naringenin 1
271.0 119.0 10 -100 -38 naringenin 2
负离子模式：
Source/Gas(CUR)：35.0
Collision Gas(CAD)：9
IonSpray Voltage(IS)：-4500.0
Temperature(TEM)：550.0
Ion Source Gas 1(GS1)：50.0
Ion Source Gas 2(GS2)：55.0
Entrance Potential(EP)：-10.0
Collision Cell Exit Potential(CXP)：-12.0。
柚皮素手性单体流出顺序依次为：S-柚皮素，R-柚皮素。将该方法应用在实际样品中，测得含量如下：
表2柑橘实际样品中的手性柚皮素含量
Figure BDA0003417474740000071
柚皮素的两个对映异构体如下：
Figure BDA0003417474740000081
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种柚皮素手性拆分方法，其特征在于，所述柚皮素手性拆分方法包括：
采用高效液相色谱-串联质谱法对柚皮素进行手性拆分；
所述高效液相色谱-串联质谱法的条件包括：
液相条件：采用键合型手性色谱柱，以甲醇-甲酸水为流动相，等度洗脱；
质谱条件：采用ESI离子源，以多反应监测的负离子扫描方式进行手性柚皮素的质谱检测。
2.如权利要求1所述柚皮素手性拆分方法，其特征在于，所述流动相包括：85％甲醇与15％的甲酸水。
3.如权利要求2所述柚皮素手性拆分方法，其特征在于，所述甲酸浓度为0.1％。
4.如权利要求1所述柚皮素手性拆分方法，其特征在于，所述高效液相色谱的柱温为40℃。
5.如权利要求1所述柚皮素手性拆分方法，其特征在于，所述高效液相色谱的流速为0.6mL/min。
6.一种如权利要求1-5任意一项所述柚皮素手性拆分方法的柚皮素绝对构型确定方法，其特征在于，所述柚皮素绝对构型确定方法包括：
步骤一，柚皮素对映体通过圆二色光谱表征获取实验电子圆二色谱ECD；
步骤二，经Gaussian-含时密度泛函理论，获取计算ECD光谱，确定柚皮素绝对构型；
步骤三，通过制备的柚皮素单体进样，确定R,S-柚皮素在HPLC-MS/MS图谱中的洗脱顺序。
7.如权利要求6所述柚皮素绝对构型确定方法，其特征在于，所述柚皮素绝对构型包括：R-柚皮素和S-柚皮素的绝对构型。
8.如权利要求7所述柚皮素绝对构型确定方法，其特征在于，所述R-柚皮素结构式如下：
Figure FDA0003417474730000021
9.如权利要求7所述柚皮素绝对构型确定方法，其特征在于，所述S-柚皮素结构式如下：
Figure FDA0003417474730000022
10.一种如权利要求1-5任意一项所述柚皮素手性拆分方法在柑橘类水果柚皮素分类提取中的应用。
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