CN114214337A

CN114214337A - 一种猪圆环病毒2a型Cap蛋白的制备方法与应用

Info

Publication number: CN114214337A
Application number: CN202111646582.7A
Authority: CN
Inventors: 魏平华
Original assignee: Guangzhou Great Biological Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Great Biological Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-03-22

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2a型Cap蛋白的制备方法与应用，本发明通过培养含有SEQ ID NO.3所示核酸分子的重组菌，使用异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导表达猪圆环病毒2a型Cap蛋白。SEQ ID NO.3所示核酸分子与其他猪圆环病毒血清型的编码猪圆环病毒2a型Cap蛋白的核酸分子存在显著差异，可用于区分PCV2b和PCV2a，并有望应用于作为PCV2a抗原或制备抗体等相关方面。

Description

一种猪圆环病毒2a型Cap蛋白的制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种猪圆环病毒2a型Cap蛋白的制备方法与应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)会侵染猪的免疫器官，容易引发与其他病原体的混合感染或继发感染，从而导致猪死亡率升高，严重威胁养猪业的健康发展。

PCV2有PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e共5种血清亚型，目前优势流行毒株以PCV2d为主，但PCV2a等其他亚型也时有爆发。PCV尚无特效治疗药物，以疫苗免疫防控为主。

因此，开发一种能够准确的定性PCV2的具体亚型的检测方法，对于PCV的防控具有极为重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种猪圆环病毒2a型Cap蛋白的制备方法与应用，本发明通过特定的引物获得了猪圆环病毒2a型Cap蛋白基因，在克隆至pET28a载体中后能够高效表达猪圆环病毒2a型Cap蛋白，从而有助于相关猪圆环病毒2a型抗原抗体的制备。

本发明的第一个方面，提供一种编码猪圆环病毒2a型Cap蛋白的分离的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述核酸分子的核苷酸序列具体为：5'-ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTCCGCAGTCGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCCTCCAACCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTGTCAAGGCTACCACAGTCAGAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTTAAAATTGACGACTTTGTACCCCCGGGAGGGGGGACCAACAAAATCTCTATACCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCAATCACCCAGGGTGATAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTTTTCCAAAGTCCACAGCCCTAACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATACCCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGGTACTTTACCCCCAAACCTGTTCTTGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAATAACAAAAGGAATCAGCTTTGGCTGAGGCTACAAACCTCTGCAAATGTGGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCCTTCGAAAACAGTAAATACGACCAGGACTACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAAACCCTAA-3'(SEQ ID NO.3)。

所述核酸分子扩增产物大小为702bp。

发明人发现，不同血清型的猪圆环病毒的Cap蛋白的编码基因存在差异，而Cap蛋白作为PCV的结构蛋白和主要免疫蛋白，具备良好的免疫原性与安全性，这种差异性可以很好的作为开发不同血清型的针对性新型疫苗的研发重点，从而有效提高PCV2的防控效果。

本发明的第二个方面，提供含有本发明第一个方面所述核酸分子的载体。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述载体包括重组表达载体和/或重组克隆载体。

在本发明的一些优选实施方式中，所述载体为重组表达载体pET28a-Cap，所述重组表达载体pET28a-Cap中依次含T7启动子、BamHⅠ、SEQ ID NO.3和SalⅠ，质粒长度为6052bp。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述载体为所述核酸分子替换pET28a的SalⅠ和BamHⅠ双酶切片段得到的。

本发明的第三个方面，提供含有本发明第三个方面所述核酸分子的重组菌。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述重组菌由本发明第二个方面所述的载体转化大肠杆菌得到。

在本发明的一些优选实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第四个方面，提供一种猪圆环病毒2a型Cap蛋白的制备方法，包括如下步骤：

培养本发明第三个方面所述的重组菌，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达猪圆环病毒2a型Cap蛋白。

本发明的第五个方面，提供检测本发明第一个方面所述的核酸分子的试剂在制备猪圆环病毒2a型Cap蛋白提取试剂的应用。

根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测本发明第一个方面所述的核酸分子的试剂包括猪圆环病毒2a型Cap基因检测引物。

根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述猪圆环病毒2a型Cap基因检测引物的核苷酸序列为：

上游引物F：5'-GCGGATCCGTGACGTATCCAAG-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5'-CACTAGTATAGGGGTTAAGTGGGG-3'(SEQ ID NO.2)。

其中，上游引物5’端还依次连接有酶切位点(GTCGAC，下文斜体部分)和HIS标签序列(CATCATCACCATCACCAT，下位下划线部分)。具体为：5'-GTCGACATCATCACCATCACCATCGCGGATCCGTGACGTATCCAAG-3'。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种编码猪圆环病毒2a型Cap蛋白的核酸分子，该核酸分子与其他猪圆环病毒血清型的编码猪圆环病毒2a型Cap蛋白的核酸分子存在显著差异，可用于区分PCV2b和PCV2a，并有望应用于作为PCV2a抗原或制备抗体等相关方面。

2.本发明提供了一种猪圆环病毒2a型Cap蛋白的制备方法，其基于含有SEQ IDNO.3所示的编码猪圆环病毒2a型Cap蛋白的核酸分子的重组表达载体，通过IPTG诱导能够稳定表达猪圆环病毒2a型Cap蛋白，为猪圆环病毒2a型Cap蛋白的应用提供了有利的方法支持。

附图说明

图1为本发明实施例中接种PCV2a的PK15细胞(A)与正常PK15细胞(B)的对比图，视野倍数100×；

图2为本发明实施例中的PCV2a的电镜图；

图3为本发明实施例中扩增得到的扩增产物(Cap基因)的电泳图；

图4为本发明实施例中的PCV2a的Cap基因进化分析对比图；

图5为本发明实施例中的重组表达载体pET28a-Cap的双酶切鉴定结果；

图6为本发明实施例中纯化前后得到的Cap蛋白表达后的考马斯亮蓝染色结果。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

猪圆环病毒2a型病毒材料的制备

在本实施例中，发明人以湖南某发病猪场采集的疑似猪圆环病毒感染猪的腹股沟***为样品分离猪圆环病毒2a型病毒用于后续试验。

具体分离步骤如下：

在无菌条件下，取适量采集的腹股沟***样品于高压灭菌后的研钵中研磨，研磨后加入2mL无菌PBS液，收集研磨液于2mL离心管中，置于-20℃反复冻融3次后离心取上清液，将上清液经0.22μm过滤器过滤后，得到病毒液。病毒液可置于-70℃冰箱备用。

将得到的病毒液接种于长至单层80％左右细胞密度的PK15细胞(猪肾细胞)中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，传代培养3次，待细胞出现病变后收集细胞沉淀，以用于后续检测。

猪圆环病毒2a型的鉴定

为了进一步验证病毒液中是否含有猪圆环病毒2a型，发明人使用下述方法进行验证。

(1)过氧化物酶免疫染色法(IPMA)：

将得到的病毒液接种于长至单层80％左右细胞密度的PK15细胞中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，孵育72小时后分别用含有33％(v/v)丙酮的PBS缓冲液进行固定，用PCV2阳性血清进行IPMA试验(IPMA染色采用过氧化物酶活性检测试剂盒(购自Sigma-Aldrich)，按照使用说明书进行染色操作)，测定病毒感染情况。

以未接种病毒液的正常PK15细胞作为阴性对照。

结果如图1所示。

可以发现，将分离的病毒液接种PK15细胞后，经传代培养后，使用过氧化物酶免疫染色法(IPMA)进行检测，细胞核会被染成棕红色，符合PCV2的检测特征，而健康PK15细胞则无着色，表明所分离的病毒液中的病毒为PCV2。

(2)病毒形态学观察：

取上述实施例中接种了病毒液的PK15细胞，反复冻融3次后使用超声波破碎，在4℃、10000r/min离心5min。取上清液，加入2％磷钨酸负染2min，收集负染上清液，用投射电镜观察病毒粒子形态。

结果如图2所示。

从图2中可以发现，负染后经投射电镜观察可看到直径约17～20nm的病毒粒子，符合PCV2的特征，说明上述实施例中分离的病毒为PCV2。

猪圆环病毒2a型Cap蛋白基因的扩增

取上述病变细胞，使用DNA提取试剂盒(购自OMEGA公司)提取细胞中的DNA，使用下述引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。

其中，PCV2a Cap蛋白基因扩增引物的核苷酸序列为：

上游引物F：5'-GCGGATCCGTGACGTATCCAAG-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5'-CACTAGTATAGGGGTTAAGTGGGG-3'(SEQ ID NO.2)。

扩增体系为：

10nM上游引物F	0.5μL
		10nM下游引物R	0.5μL
Extaq酶	8μL
		病变细胞DNA	2μL
水	补至20μL

反应程序为：预变性94℃2min，变性94℃45s，退火55℃45s，延伸72℃1min，35个循环扩增，延伸72℃7min。

跑胶验证扩增产物是否为猪圆环病毒2a型Cap蛋白。

判断标准为：

当扩增产物大小为702bp时，说明扩增产物中含有PCV2a Cap蛋白；

当扩增产物大小不为702bp时，说明扩增产物中不含PCV2a Cap蛋白。

电泳图如图3所示。

可以发现，跑胶验证扩增产物大小为702bp(重复2次)，符合预期结果。

对扩增产物进行基因测序，发现扩增产物的核苷酸序列为：5'-ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTCCGCAGTCGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCCTCCAACCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTGTCAAGGCTACCACAGTCAGAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTTAAAATTGACGACTTTGTACCCCCGGGAGGGGGGACCAACAAAATCTCTATACCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCAATCACCCAGGGTGATAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTTTTCCAAAGTCCACAGCCCTAACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATACCCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGGTACTTTACCCCCAAACCTGTTCTTGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAATAACAAAAGGAATCAGCTTTGGCTGAGGCTACAAACCTCTGCAAATGTGGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCCTTCGAAAACAGTAAATACGACCAGGACTACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAAACCCTAA-3'(SEQ ID NO.3)。

经基因进化分析对比后显示为PCV2a(图4)。

上述结果说明，成功扩增得到PCV2a Cap蛋白基因。

为了进一步体现扩增产物的特异性，发明人采用上述引物对PCV2b DNA样品在同等条件下进行扩增，跑胶后发现扩增产物大小为708bp，对扩增产物进行测序发现其核苷酸序列为：5'-ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTACACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAACGAAAAATGGCATCTTCAACGCCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAGCCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGAGCTGCTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAACCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGGCTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCTTAATGAATAA-3'(SEQ ID NO.4)。

可以发现，PCV2b的扩增产物与PCV2a的扩增产物存在明显不同，序列同一性低，说明其可以作为有效的特异性靶标，用于区分PCV2b和PCV2a，并有望应用于作为PCV2a抗原或制备抗体等相关方面。

猪圆环病毒2a型Cap蛋白的表达

将上述实施例中得到的扩增产物(猪圆环病毒2a型Cap蛋白基因，SEQ ID NO.3)克隆至表达载体pET28a中，具体操作为：

将表达载体pET28a(购自优宝生物公司)和扩增的Cap蛋白基因分别使用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切，酶切体系(50μL)为：1μg DNA，2μL SalⅠ，2μL BamHⅠ，5μLbuffer，补水至50μL。

37℃恒温水浴酶切4h，1％凝胶电泳纯化后回收载体片段(如图5所示，重复4次)。

使用T4连接酶(购自NEB)连接，连接体系为：1μL T4连接酶，1μL T4连接酶buffer，1μL pET28a载体酶切片段和7μL SEQ ID NO.3。

16℃孵育24h，得到重组表达质粒pET28a-Cap(依次含T7启动子、BamHⅠ、SEQIDNO.3和SalⅠ，质粒长度为6052bp)。

取大肠杆菌BL21(DE3)，加入上述实施例制备得到的重组表达质粒pET28a-Cap，冰浴30min后，42℃热激90s，立即放回冰上，冰浴2min。加入LB培养基，于37C摇床慢摇振荡培养45-60min；使用含有氨苄青霉素(100pg/mL)的LB固体培养基培养过夜，以筛选转化成功的重组菌。

使用1mM浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导20小时，超声破碎提取目的蛋白后，使用Ni-Agarose HIS标签蛋白纯化试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)纯化表达的Cap蛋白，采用200mM浓度的咪唑洗脱蛋白并进行鉴定。

鉴定方法采用考马斯亮蓝染色，具体为：将纯化前后得到的Cap蛋白分别煮沸10min，经SDS-PAGE分离后进行考马斯亮蓝染色。

结果如图6所示，纯化前后得到的Cap蛋白一致，说明Cap蛋白成功表达且纯化效果良好。

综上所述，基于上述实施例中的方法，能够获得蛋白表达量大且表达稳定的重组质粒，且所获蛋白易纯化，制备成本低，为进一步研究该PCV-2a新型疫苗提供有效的物质基础。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州格雷特生物科技有限公司

<120> 一种猪圆环病毒2a型Cap蛋白的制备方法与应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcggatccgt gacgtatcca ag 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cactagtata ggggttaagt gggg 24

<210> 3

<211> 702

<212> DNA

<213> PCV2

<400> 3

atgacgtatc caaggaggcg tttccgcagt cgaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60

cagatcctcc gccgccgccc ctggctcctc caaccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120

aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caaggctacc 180

acagtcagaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat ttaaaattga cgactttgta 240

cccccgggag gggggaccaa caaaatctct ataccctttg aatactacag aataagaaag 300

gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgatagggg agtgggctcc 360

actgctgtta ttctagatga taactttttt ccaaagtcca cagccctaac ctatgacccc 420

tatgtaaact actcctcccg ccataccata ccccagccct tctcctacca ctcccggtac 480

tttaccccca aacctgttct tgattccact attgattact tccaaccaaa taacaaaagg 540

aatcagcttt ggctgaggct acaaacctct gcaaatgtgg accacgtagg cctcggcact 600

gccttcgaaa acagtaaata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660

ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaaccct aa 702

<210> 4

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60

cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgta cacccccgcc accgttaccg ctggagaacg 120

aaaaatggca tcttcaacgc ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactat caagcgagcc 180

acagtcaaaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat tcaatattaa tgactttctt 240

cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccctttg aatactacag aataagaaag 300

gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360

agagctgcta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc 420

tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccaaccct tctcctacca ctcccgctac 480

tttaccccca aacctgtcct agattccact attgattact tccaaccaaa caacaaaaga 540

aatcagctgt ggctgaggct acaaactgct ggaaatgtag accacgtagg cctcggcact 600

gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggaa tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660

ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaacctta atgaataa 708

Claims

1.一种编码猪圆环病毒2a型Cap蛋白的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.含有权利要求1所述核酸分子的载体。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体包括重组表达载体和/或重组克隆载体。

4.根据权利要求2或3所述的载体，其特征在于，所述载体为所述核酸分子替换pET28a的SalⅠ和BamHⅠ双酶切片段得到的。

5.含有权利要求1所述核酸分子的重组菌。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌有权利要求2～4任一项所述的载体转化大肠杆菌得到。

7.一种猪圆环病毒2a型Cap蛋白的制备方法，包括如下步骤：

培养权利要求5或6所述的重组菌，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达猪圆环病毒2a型Cap蛋白。

8.检测权利要求1所述的核酸分子的试剂在制备猪圆环病毒2a型Cap蛋白提取试剂的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测权利要求1所述的核酸分子的试剂包括猪圆环病毒2a型Cap基因检测引物。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述猪圆环病毒2a型Cap基因检测引物的核苷酸序列为：

上游引物F：5'-GCGGATCCGTGACGTATCCAAG-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5'-CACTAGTATAGGGGTTAAGTGGGG-3'(SEQ ID NO.2)。