CN114214231B - 一株水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75及其应用。该菌株分类命名为：灰褐色链霉菌(Streptomyces griseobrunneus)，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019890。本发明的灰褐色链霉菌Ahn75在体外能高效抑制12个不同生理小种稻瘟病病原菌的生长。该菌株的发酵滤液能同时抑制稻瘟病菌的菌丝生长和孢子萌发，且含有较多种类的活性化合物，大小分布在3kD以下和10kD‑30kD，30kD以上，小分子活性化合物包含有缬氨霉素。同时，该菌株具有产铁载体、解钾、固氮等促生长性能。这些结果表明该菌具有开发广谱且绿色环保的新型水稻药肥的潜力。

Description

一株水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及到一株水稻内生灰褐色链霉菌及其在抗稻瘟病和促进水稻生长等方面的应用。

背景技术

水稻稻瘟病由真菌稻梨孢菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起，是全世界稻区危害最严重的水稻病害之一。稻瘟病从侵染、形成病斑到扩散新的孢子仅需20天左右，能够侵染水稻大多数组织，在全球水稻种植区均有发生。每年因稻瘟病导致的水稻产量损失，约占总产量的10％-30％，可以养活近六千万的人口。目前，培育抗病新品种和喷施化学农药是防治稻瘟病的主要手段，但是抗病新品种的选育不仅周期长，而且存在抗性易丢失的问题，而大量使用化学农药不但会污染环境，还会导致有害物质残留在稻米中，影响人类健康。因此，探索开发新的方法来控制稻瘟病越来越受到人们重视，其中，生物防治成为重要的研究领域。

内生菌是可以在植物的整个或部分生长周期中稳定定殖在植物内部的微生物菌群。与根际和土壤微生物相比，内生菌生长在植物内部而不会与土壤菌产生生存竞争。而且，内生菌能在植物体内存活而不对寄主植物产生明显不利影响，在长期的协同进化过程中，与植物形成了互利互惠的关系。近年来的研究显示，水稻植株自身也存在一些能抑制稻瘟病菌的内生菌。作为目前抗生素最大生产类群的组成部分之一，内生链霉菌显然更具有生物防治的潜力。

发明内容

本发明首要目的是提供一种防治水稻稻瘟病的内生链霉菌，该菌株能高效抑制12种不同生理小种的稻瘟病菌，其发酵液中抗菌活性化合物种类多，大小不一。该菌属于植物内生菌，从海南水稻稻瘟病发病区的未发病水稻茎组织中筛选获得。

本发明所得菌株结合菌落菌体形态特征和基于16S rRNA、gyrB、atpD、recA、rpoB和trpB基因序列的***发育树，鉴定为灰褐色链霉菌(Streptomyces griseobrunneus)Ahn75。该菌株已于2019年11月4日由中国典型培养物保藏中心(保藏地址：武汉大学)所保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2019890。

本发明的第二个目的是提供所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75在防治水稻稻瘟病中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75发酵液在防治水稻稻瘟病中的应用。

进一步地，所述的发酵液抑制稻瘟病菌的菌丝生长和/或孢子萌发。

本发明所得菌株能高效抑制12种不同生理小种的稻瘟病病原菌，对稻瘟病菌42号的抑菌率最高达61.93％。

进一步研究发现：所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75在初始pH7-9的ISP2培养基中生物量和发酵液抑菌活性高于初始pH4-6。最高生物量1190.63mg/50mL，100μL发酵液对稻梨孢菌丝生长最高抑菌率为72.83％。

所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75发酵液在50℃以下活性稳定，在80℃以上处理后活性逐渐降低，同时对蛋白酶K稳定。

本发明的第四个目的是提供所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75发酵液中的活性物质在防治水稻稻瘟病中的应用。

进一步地，所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75发酵液中的活性物质大小分布在3kD以下和10kD-30kD，30kD以上，3kD以下活性物质包含有缬氨霉素。

缬氨霉素在浓度15μg/mL时对稻瘟病菌丝抑制率达52.27％。

本发明的第五个目的是提供所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75在促进水稻生长中的应用。

进一步地，所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75具有产铁载体、解钾、固氮中的至少一种的作用。

本发明所得菌株能稳定地定殖于水稻根、茎和叶组织中，不仅能有效抑制稻瘟病菌的生长，还可固氮、解钾、产铁载体，具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1：菌株Ahn75的菌落和菌株形态；

图2：菌株Ahn75基于16S rRNA和gyrB等5个管家基因的***发育树；

A:16S rRNA；B:5基因；

图3：菌株Ahn75在不同pH值的ISP2培养基中的生长情况；

图4：菌株Ahn75发酵液对稻梨孢菌丝生长和孢子萌发的抑制；

A.菌丝在含有不同浓度发酵滤液平板上的生长状态；B.发酵滤液对稻梨孢菌丝生长的抑制水平；C.发酵滤液对稻梨孢孢子萌发的抑制水平。

图5：菌株Ahn75发酵液对温度和蛋白酶K的稳定性；

A:热处理；B:蛋白酶K处理。

图6：菌株Ahn75发酵液中缬氨霉素的质谱鉴定；

图7：菌株Ahn75在水稻根、茎、叶组织中的定殖分析。

A.经台盼蓝染色处理的对照水稻根和喷施了Ahn75-GFP的水稻根；

B.Ahn75在水稻不同组织中的定殖量。

具体实施方式：

以下将结合实施例对本发明做进一步说明，而不会形成对本发明的限制。

实施例1Ahn75菌株的筛选和纯化

从海南三亚市水稻田中采集轻度发病和未发病的水稻组织，清洗、表面消毒，然后将茎剪成1cm左右长的小段，放置于TWYE培养基中，于37℃培养，待内生放线菌从组织中析出，将其挑出转移到1/2PDA培养基中划线进行分离纯化，从而获得该菌的纯培养物。纯化后的菌株用25％的甘油悬浮储存至-80℃冰箱。

在直径为90mm的ISP2培养基中心位置接种不同生理小种稻瘟病菌的新鲜菌饼，然后在距离菌饼中心3cm处呈120°用无菌牙签接种放线菌菌株，设无菌株处理为对照，每处理重复3次，28℃恒温培养7d，测量病原菌菌落半径，并计算抑菌率。拮抗菌株抑菌率(％)＝(对照组菌落半径－处理组菌落半径)/(对照组菌落半径－菌饼半径)×100。

所用TWYE培养基组成：酵母提取物0.25g，磷酸氢二钾0.5g，琼脂粉18g，纯水1000mL，pH值7.2±0.2，121℃高温高压灭菌25min。待培养基冷却至55℃左右时，在无菌条件下加入终浓度为50μg/mL的苯菌灵和25μg/mL的萘啶酮酸充分混匀后倒板。1/2PDA培养基组成：土豆100g，葡萄糖10g，琼脂18g，pH自然，水1000mL，121℃高温高压灭菌25min。所用ISP2培养基组成：麦芽提取物10g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，pH 7.2，水1000mL，115℃高温高压灭菌30min。

实施例2Ahn75菌株的鉴定

1.菌株形态观察：菌株在ISP2培养基上培养，初期菌落圆形，气丝黄白，早期孢子成灰绿色，后期孢子为土黄色，基丝浅黄褐，日久产生红褐色素。取在ISP2培养基上插片培养的菌株，在相差显微镜下观察，孢子丝直或波曲，分生孢子为球形至椭圆形，孢子表面光滑。Ahn75菌株的菌落早期和晚期形态及菌丝和孢子形态见图1。

2.菌株鉴定：

采用上海生物工程有限公司细菌总DNA提取试剂盒提取放线菌Ahn75的基因组DNA，以其为模板，分别以27F/765R和704F/1492R为引物(引物序列见表1)，扩增Ahn75菌株的16s rRNA序列，同时，通过PCR扩增获得Ahn75菌株的gyrB、atpD、recA、rpoB和trpB基因的保守序列(引物见表1)，并进行测序。对5个保守基因序列按首尾相接方式连接成一个序列，以此为基础，运用软件Culstal W2和Mega7.0采用邻接法(Neighbor-Joining method，NJ)构建***发育树(图2)。基于16s rRNA的进化树显示，Ahn75菌株与灰褐色链霉菌(S.griseobrunneus)标准菌株ATCC 4.1838的同源性最高，为99.48％。5基因的进化树显示Ahn75与灰褐色链霉菌ATCC 4.1838和杆状链霉菌(S.bacillaris)CGMCC 4.1584属于同一个。有研究显示灰褐色链霉菌和杆状链霉菌是同一个种。该菌株于2019年11月4号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019890，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学。

表1 PCR扩增所需引物序列

实施例3菌株对不同稻瘟病生理小种的抑菌率

采用平板对峙试验(操作过程同实施例1)检测Ahn75菌株对多种来源不同的稻瘟病生理小种的抑菌活性，结果见表2。Ahn75对40个不同生理小种的稻瘟病病原菌均表现出较高的抑菌活性，对其中10种稻梨孢菌株的抑菌率超过50％。

表2 Ahn75对不同生理小种稻梨孢菌丝生长的抑制活性

实施例4菌株在不同pH条件下的生长性能

将Ahn75菌株接入ISP2固体培养基中培养3-5天产孢，刮取孢子粉悬浮至0.5％吐温水溶液中，配制成1×10⁸CFU/mL的孢子悬浮液，按2％的接种量接入pH4-9的ISP2培养液中，每个pH重复3次，28℃，180rpm培养7天。收集发酵液，10000rpm离心10min，沉淀在超净工作台吹干水分，称量测生物量，上清液经过0.22μm无菌微孔滤膜过滤，取100μL无菌滤液加入ISP2固体培养基上离稻梨孢菌饼中心2.5cm处的牛津杯中，进行抑菌试验。抑菌率按实施例1公式计算，结果见图3。Ahn75在pH4-5的酸性条件下不能生长，在pH6的培养基中能缓慢生长，抑菌活性也较低，而在pH7-9的条件下能快速生长，pH9条件下获得的生物量最大，而pH8条件下的发酵液活性最高。但该菌株在pH7-9的条件下的生物量和抑菌活性经SPSS19.0单因素Duncan(D)分析，无显著性差异。

实施例5菌株发酵液活性及稳定性

1.Ahn75菌株的无菌发酵滤液对稻瘟病病菌菌丝生长的影响

按实施例4的方法在pH7的ISP2培养液中培养Ahn75,7天后收集发酵滤液。将无菌发酵液稀释2、4、10、50、100倍，分别取原液和不同浓度稀释液各1mL与9mL冷却至50℃的ISP2培养液混合，配置分别含无菌发酵液10％、5％、2％、1％、0％浓度的培养基平板，然后在平板中央接种稻瘟病新鲜菌饼，每处理重复3次，以无菌水代替无菌发酵液为对照，28℃恒温培养7d，用十字交叉法测量病原菌菌落直径，计算菌丝生长抑制率(抑菌率(％)＝(对照组菌落直径－处理组菌落直径)/(对照组菌落直径－菌饼直径)×100)。Ahn75菌株发酵液对稻梨孢菌丝的抑制呈现浓度依赖性，当其浓度从1％上升至10％时，其抑菌率从25.05％±0.22％上升至80.88％±1.54％，结果见图4A，4B。

2.Ahn75菌株的无菌发酵滤液对稻瘟病孢子萌发的影响

稻瘟病孢子悬浮液的制备：采用无菌水将保存在高粱粒上的稻梨孢孢子洗下来，取100μL涂布在新鲜ISP2平板上，28℃培养3d后，挑取单菌落接种至另一新鲜ISP2平板，28℃培养6d后，挑取菌丝接种到燕麦培养基(30g燕麦片用纯水煮沸1h，四层纱布过滤除去沉淀，加入榨取的新鲜西红柿汁100mL，琼脂粉15g，纯水定容至1000mL，pH 7.2，121℃20min)上，待平板上菌丝长满后(约7～10d)，无菌条件下用刷子刷掉气生菌丝，将平板置于28℃人工气候培养箱光暗交替(14∶10h)培养。待充分产孢(约3～4d)后，每皿用5mL无菌水洗下孢子，用灭菌的擦镜纸过滤后制成10⁵个/mL的稻梨孢孢子悬浮液。

在1.5mL Ep管中将Ahn75的无菌发酵液按比例与稻瘟病菌孢子悬浮液(10⁵个/mL)和无菌水混合，配制成5％、10％、20％、50％浓度的无菌发酵液，每个处理重复5次，设置无菌水与稻梨孢孢子悬浮液混合为对照，于28℃培养箱中静置培养16h，采用显微镜在10×20倍镜头下检测孢子萌发情况，统计各处理孢子萌发率，按以下公式计算孢子萌发抑制率，结果见图4C。结果显示，当Ahn75滤液浓度为50％，其对孢子萌发抑制率为79.15％±7.18％。

孢子萌发抑制率(％)＝(对照孢子萌发率－处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100

3.Ahn75菌株的无菌发酵滤液对温度和蛋白酶的稳定性

将Ahn75无菌发酵滤液分别在不同温度下处理30min，同时在分装好的Ahn75无菌发酵滤液中加入蛋白酶K，分别在50℃处理30-120min，获得的处理液按上面方法分别检测其对稻梨孢菌丝生长的抑制活性，结果显示，Ahn75发酵滤液经40℃、50℃处理30min后，活性与未处理的滤液基本没变化，随着处理温度的升高，发酵滤液的抑菌活性逐步下降，经121℃处理30min，抑菌活性基本全部丧失，说明该菌株产生的活性物质在80℃以上的高温下不稳定，而在50℃以下是稳定的(图5A)。Ahn75发酵液经蛋白酶K分别处理30-120min后，抑菌活性依然在93.99％-105.35％之间，与对照没有显著性差别(图5B)。

实施例6Ahn75菌株发酵液中抗菌活性成分的分析和鉴定

1.活性化合物大小分析

分别采用3kD、10kD、30kD超滤管对Ahn75发酵滤液进行超滤，收集超滤管滤液和上清液，按实施例4检测处理液对稻梨孢菌丝生长的抑菌活性，结果见表3，Ahn75合成的抗菌活性物质大小主要集中在3kD以上，其化合物的抑菌活性是3kD以下化合物的6.5倍，且其大小在3-10kD，10-30kD和30kD以上均有分布，而且3kD以下的滤液也表现有7.45％的抑菌率，说明该菌株同样合成了分子量小于3kD的抗菌化合物。

表3 Ahn75菌株发酵滤液经超滤膜处理后的抑菌活性

2.活性化合物的鉴定

采用正丁醇等体积萃取无菌Ahn75发酵滤液，有机相进行旋蒸，浓缩获得的抗菌粗提物用无菌超纯水复溶后，经液质连用质谱仪(Agilent Poroshell 120HILIC-Z连接Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪)进行分析。在GNPS:Global Natural Product数据库(http://gnps.ucsd.edu)中对获得的二级质谱谱图进行比对。结果显示，m/z 1149.59、1133.63质量与数据库NIST14中缬氨霉素(Valinomycin)的[M+K]+,[M+Na]+的质荷比吻合，且两个前体离子的MS2图谱也与缬氨霉素的二级质谱图匹配(图6)。缬氨霉素的分子量为1kD左右，通过分析购买的标准缬氨霉素对稻梨孢菌丝的抑制活性(方法按实施例5进行)，发现缬氨霉素确实对稻瘟病有抑菌活性。由此可以推测，Ahn75菌株合成了对稻瘟病有活性的缬氨霉素。

3.Ahn75菌株基因组中次级代谢产物生物合成基因簇的分析

按实施例2提取Ahn75菌株基因组DNA，对基因组DNA进行片段化，构建了IlluminaPE文库(400bp文库)，通过桥式PCR对文库进行Illumina Hiseq测序，在对获得的测序数据进行质控后利用生物信息学分析手段对序列剪切和拼接，获得菌株的全基因组扫描序列，再利用各大数据中心对基因组序列进行基因预测和注释。采用antismash软件对该基因组的次级代谢产物生物合成基因簇进行预测，发现该菌株基因组上可能含有40个次级代谢产物生物的生物合成基因簇，包括3个内酯类抗生素(lactones),7个非核糖体多肽(non-ribosomal peptide synthetases,NRPS),2个类似非核糖体多肽(Nrps-like),3个非核糖体多肽-聚酮化合物(Nrps-pks),4个铁载体(siderophores),8个聚酮类抗生素(polyketide antibiotics，PKS),5个萜类化合物(terpene),6个抗菌肽和2个其他化合物(表4)。

表4菌株Ahn75的次生代谢产物生物合成基因簇

实施例7Ahn75的促生长因子及合成基因(基因簇)检测

将Ahn75菌株的孢子粉点接在阿须贝(Ashby)无氮固体培养基、解无机磷和有机磷培养基(PKO和蒙金娜培养基)、解钾培养基(亚历山鲍罗夫培养基)、铁载体显色培养基(CAS培养基)上，28℃培养7d，检测菌落生长情况，采用十字交叉法测量菌落和相应水解圈的直径，结果显示，Ahn75菌株具有固氮、解钾和产铁载体能力(表5)。对Ahn75菌株基因组进行分析，发现该菌株含有铁载体、固氮和海藻糖、IAA和精氨酸、钾等促生因子合成相关基因(簇)(表6)。

表5菌株Ahn75的促生长因子水平

所用阿须贝(Ashby)无氮固体培养基：葡萄糖10g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaSO₄·2H₂O 0.1g，CaCO₃ 5g，NaCl 0.2g，琼脂18.0g，去离子水1000mL，pH 7.0。

PKO培养基：磷酸三钙5.0g，蔗糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g酵母粉0.5g，NaCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，KCl 0.2g，1％硫酸锰3.0mL，1％硫酸亚铁3.0mL，pH7.0，琼脂18.0g，去离子水1000mL。

蒙金娜培养基：葡萄糖20.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，CaCO₃ 5.0g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，(NH₄)₃PO₄ 0.5g，加蛋黄液10mL(蛋黄液为无菌生理盐水与鸡蛋黄1:1配制)，pH 7.0～7.5，去离子水1000mL。

亚历山鲍罗夫培养基：蔗糖5.0g，Na₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeCl₃ 5.0mg，CaCO₃ 0.1g，钾长石粉1.0g，pH 7.0～7.5，琼脂18.0g，去离子水1000mL。

CAS培养基：20％葡萄糖溶液1mL，10％酪蛋白氨基酸3mL，1mmol/L CaCl₂ 0.1mL，1mmol/L MgSO₄ 2mL，CAS染液10mL，磷酸盐缓冲液10mL，琼脂1.8g，去离子水74mL。

CAS染液的配制(200ml)：A液：铬天青(CAS)0.12g溶于100mL双蒸水中，并与1mmol/L FeCl₃溶液20mL混匀，得A液120mL。B液：十六烷基三甲基溴化铵0.15g溶于80mL双蒸水中得溶液B。将A液缓慢加入B液中，充分混匀即得CAS染液。

磷酸盐缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O 2.427g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.590g，KH₂PO₄ 0.075g，NH₄Cl 0.250g，NaCl 0.125g，去离子水100.0mL，pH 6.8。

表6菌株Ahn75促生长相关基因(簇)

实施例8Ahn75在水稻中的定殖

在水稻3-4叶期喷施Ahn75孢子悬浮液，对照喷施无菌水，1-3天后收集、清洗水稻根并采用台盼蓝染色法对其进行处理和染色，在相差显微镜下观察内生菌的定殖情况，发现放线菌能在水稻根部很好的生长，而未喷施Ahn75的对照根部没有任何菌丝的生长(图7A)。分别在喷施Ahn75孢子悬浮液后的第1-27天收集水稻的不同组织，采用内生放线菌分离方法对定殖的Ahn75进行重分离和计数，统计Ahn75在水稻不同组织不同时间的定殖量，发现Ahn75在水稻各组织中的定殖量都呈现喷施后先快速增长，而后随着时间的推移，逐渐下降直至平缓状态。其中，根组织内的定殖量在第3天最大，而茎和叶中的定殖量在第5天达到峰值。相较于根和叶而言，Ahn-75在茎组织中的定殖能力更强，从第5至27天，定殖量一直高于根和叶(图7B)。

Claims (5)

1.一株水稻内生灰褐色链霉菌（Streptomyces griseobrunneus）Ahn75，保藏编号为CCTCC NO: M 2019890。

2.权利要求1所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75在防治水稻稻瘟病中的应用。

3.权利要求1所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75发酵液在防治水稻稻瘟病中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵液抑制稻瘟病菌的菌丝生长和/或孢子萌发。

5.权利要求1所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75在促进水稻生长中的应用；所述的水稻内生灰褐色链霉菌Ahn75具有产铁载体、解钾、固氮中的至少一种的作用。

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