CN114214211A - 一株金花菌-谢瓦氏曲霉菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

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马存强
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Abstract

本发明公开了一株金花菌‑谢瓦氏曲霉菌株及其制备方法和应用。本发明的一株金花菌‑谢瓦氏曲霉菌株，该菌株为谢瓦氏曲霉JH1；保藏名称为谢瓦氏曲霉JH1Aspergillus chevalier JH1；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年09月30日；保藏编号:CCTCC NO.20211180。本发明将具有保健功效谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)JH1等金花菌人工接种至晒青毛茶、普洱熟茶、黑毛茶、黑毛茶、白茶、红茶散茶等不同类型的茶叶中，促进茶砖/茶饼内部产生茂盛的“金花”，改善茶叶品质，提升茶叶的保健功效。

Description

一株金花菌-谢瓦氏曲霉菌株及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株金花菌-谢瓦氏曲霉菌株及其制备方法和应用。
背景技术
茯砖茶是黑茶在加工过程中通过特殊工艺促使特定的微生物在砖茶中生长、发酵转化，并在茶砖内部产生的黄色闭囊壳，民间谓之“金花”。金花普遍、茂盛、色泽鲜艳、呈金黄色，不含杂菌，是评价茯砖茶质量的重要标准。现确定茯砖茶中产生金黄色闭囊壳的优势菌株为冠突曲霉(Aspergillus cristatus)，原名冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。现代研究显示冠突曲霉等金花菌具有预防心脑血管疾病、降血脂、降胆固醇、调整血糖、血压等功效以及消脂减肥作用。在茯砖茶发花工序中，金花菌能分泌产生α-淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等水解酶促进纤维素、淀粉等水不溶性多糖水解产生水溶性单糖、双糖、多糖；并催化多酚类化合物的氧化，产生茶黄素茶红素茶褐素等色素，进而改善茶叶的色泽、滋味和香气等品质。本发明借助金花普洱生茶中分离纯化的金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergilluschevalieri JH1菌株，通过现代生物工程技术，并参照古代文献中普洱茶等黑茶茶饼/茶砖的制作工艺，完成谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌株在黑茶茶砖/茶饼蒸压以及普洱茶等黑茶散茶渥堆发酵中的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，本发明的目的是提供一株抑菌率高的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株及其应用。
本发明的技术方案如下：本发明提供了如下技术方案：本发明的一株金花菌-谢瓦氏曲霉菌株，该菌株为谢瓦氏曲霉JH1；保藏名称为谢瓦氏曲霉JH1Aspergillus chevalierJH1；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年09月30日；保藏编号:CCTCC NO.20211180。
进一步地，所述的谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌株的ITS碱基序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌株的β-tubulin碱基序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述的谢瓦氏曲霉Aspergilluschevalieri JH1菌株的Calmodulin碱基序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
进一步地，该菌株谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基上菌落生长缓慢，30℃7天直径为9-16mm，正面：绒粉状、黄色至金黄色；背面为土黄色至黄褐色，金黄色闭囊壳较少。
本发明所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株制备的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株的发酵培养物；
(b)所得金花菌-谢瓦氏曲霉菌株细胞的超声裂解上清；
(c)所得金花菌-谢瓦氏曲霉菌株细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株菌剂的制备方法，包括如下步骤：瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基或PDA培养基上于30℃温度下培养7天后，用于谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备；在无菌环境下，提取谢瓦氏曲霉JH1群落与无菌水混合，调整菌悬液中谢瓦氏曲霉JH1数量在1×104CFU/mL以上，制得金花菌-谢瓦氏曲霉菌株菌剂。
本发明所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株在制备普洱茶、黑茶、白茶、红茶茶砖/饼蒸压干燥中的应用。
进一步地，普洱茶、黑茶、白茶、红茶茶砖/饼的制备方法：(1)金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备：
谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1转植于察氏培养基或PDA培养基上30℃温度下培养7天后，用于谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备；在无菌环境下，提取谢瓦氏曲霉JH1群落与无菌水混合，调整菌悬液中谢瓦氏曲霉JH1数量在1×104CFU/mL以上；
(2)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液(250g)与云南大叶种晒青毛茶(1000g)按照所述的茶与金花菌悬液的质量比为100:25混合，30min后在常压高温蒸汽下蒸制4min后，放入已灭菌的发酵罐内进行以晒青毛茶为基质的金花菌的纯培养。或将晒青毛茶高温高压灭菌后，进行金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的接种，置于温度30℃，湿度低于75％的恒温培养箱内进行谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养，培养7天后，自然状态下进行干燥；
(3)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种的制备：
将以晒青毛茶等茶叶为基质纯培养获得的金花菌按照5％(w/w)接种量与云南大叶种晒青绿茶混合。潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制3-5min后，转移至已灭菌的发酵罐内进行半厌氧固态发酵。整个发酵过程中不再添加水分，发酵环境温度要求在18℃之间；发酵5天时，茶叶内部开始出现“金花”，且大量繁殖；固态发酵14天时，谢瓦氏曲霉群落数量已达1.5×107CFU/g；在固态发酵和干燥过程中应避免黑霉、青霉、白霉红霉等杂菌的污染；干燥后即可大量获得金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种，可用于金花普洱茶茶砖/茶饼的制作和金花普洱茶熟茶散茶的自然渥堆发酵；
(4)普洱茶等茶叶茶砖/茶饼的蒸压：
金花菌的产生要求茶饼有一定的含水量，并需要合适的温湿度；将扩大培养获得的金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种按照1％至3％质量比与云南大叶种晒青毛茶进行混合，并添加适量的饮用水进行潮水，潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制；蒸汽温度在100℃之间；蒸制时间在2-3min；
(5)普洱茶茶砖/茶饼的发花干燥：发花是指在一定的水热作用下，金花菌大量繁殖的过程，并通过相应的胞外酶对茶叶中的茶多酚、氨基酸等品质成分产生水解、氧化、聚合作用，将蒸压而成的茶饼或茶砖按照一定的顺序排列排放在烘房内；当发花7天后，进入干燥阶段，逐渐提高烘房温度至40℃，干燥3天后，制得普洱茶、黑茶、白茶、红茶茶砖/饼。
本发明所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株在金花普洱熟茶散茶成品中的应用。
进一步地，金花普洱熟茶散茶成品的制备方法：(1)金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备：
谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基或PDA培养基上于30℃温度下培养7天后，用于谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备；在无菌环境下，提取谢瓦氏曲霉JH1群落与无菌水混合，调整菌悬液中谢瓦氏曲霉JH1数量在1×104CFU/mL以上；
(2)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液与云南大叶种晒青毛茶按照所述的茶与金花菌悬液的质量比为100:25混合，30min后在常压高温蒸汽下蒸制2min后，放入已灭菌的发酵罐内进行以晒青毛茶为基质的金花菌-谢瓦氏曲霉JH1的纯培养。或将晒青毛茶高温高压灭菌后，进行金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的接种；在温度30℃，湿度低于75％的恒温培养箱内进行纯培养，培养7天后取出，在自然状态下干燥；
(3)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种的制备：
将以晒青毛茶等茶叶为基质纯培养获得的金花菌按照质量百分比为5％接种量与云南大叶种晒青绿茶混合，潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制5min后，转移至已灭菌的发酵罐内进行半厌氧固态发酵；发酵5天时，茶叶内部开始出现金花，固态发酵14天时，谢瓦氏曲霉群落数量已达1.5×107CFU/g，干燥后即可大量获得金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种，可用于金花普洱茶茶砖/茶饼的制作和金花普洱茶熟茶散茶的自然渥堆发酵；
(4)普洱熟茶的外源接种自然渥堆发酵：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌种按照质量百分比为1％至3％的接种量与云南大叶种晒青毛茶进行混合，并添加适量的饮用水，渥堆所用晒青毛茶为2000kg以上，渥堆堆高度在70厘米至80厘米，上覆盖蒸汽灭菌处理后的麻布；
(5)在渥堆发酵结束后进行自然干燥-仓储陈化-筛分拣剔，制得金花普洱熟茶散茶成品。
有益效果：本发明将具有保健功效谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)JH1等金花菌人工接种至晒青毛茶、普洱熟茶、黑毛茶、白茶、红茶散茶等不同类型的茶叶中，蒸压成一定规格的茶砖/茶砖，并在特定的温湿度控制条件下促进茶砖/茶饼内部产生茂盛的“金花”，完成金花茶砖/茶饼的生产，进而改善茶叶品质，提升茶叶的保健功效。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例1
本发明的一株金花菌-谢瓦氏曲霉菌株，该菌株为谢瓦氏曲霉JH1；保藏名称为谢瓦氏曲霉JH1Aspergillus chevalier JH1；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年09月30日；保藏编号:CCTCC NO.20211180。
所述的谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌株的ITS碱基序列为SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列；所述的谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌株的β-tubulin碱基序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述的谢瓦氏曲霉Aspergilluschevalieri JH1菌株的Calmodulin碱基序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
本发明的菌株谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基上菌落生长缓慢，30℃7天直径为12mm，正面：绒粉状、黄色至金黄色；背面为土黄色至黄褐色，金黄色闭囊壳较少。
本发明所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株制备的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株菌剂。其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株的发酵培养物；
(b)所得金花菌-谢瓦氏曲霉菌株细胞的超声裂解上清；
(c)所得金花菌-谢瓦氏曲霉菌株细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株菌剂的制备方法，包括如下步骤：瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基或PDA培养基上于30℃温度下培养7天后，用于谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备；在无菌环境下，提取谢瓦氏曲霉JH1群落与无菌水混合，调整菌悬液中谢瓦氏曲霉JH1数量在1×104CFU/mL以上，制得金花菌-谢瓦氏曲霉菌株菌剂。
本发明所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株在制备普洱茶、黑茶、白茶、红茶茶砖/饼蒸压干燥中的应用。
本发明所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株在金花普洱熟茶散茶成品中的应用。
实施例2
本发明的菌株谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基上菌落生长缓慢，30℃7天直径为9mm，正面：绒粉状、黄色至金黄色；背面为土黄色至黄褐色，金黄色闭囊壳较少。
本发明所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株在制备普洱茶、黑茶、白茶、红茶茶砖/饼蒸压干燥中的应用。
1.材料
符合GB/T 22111-2008普洱茶国家地理标志产品要求的云南大叶晒青毛茶为原料。谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1保藏编号为CCTCC NO:M20211180。察氏培养基等。
2.试验仪器
JR-1003型电子天平(上海新诺仪器厂)；HH-S28s型数显恒温水浴锅(金坛市环保仪器厂)；DFZ-O1型电热真空干燥箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司)；JH-752型紫外可见分光亮度计(上海菁华科技仪器有限公司)；Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；低温冰箱(日本SANYO公司)；FZ-102型微型植物试样粉碎机(北京市光明医疗仪器厂)；Labonce-150TH恒温恒湿试验箱(北京兰贝石恒温技术有限公司)；SFG型固态发酵罐(镇江江工生物工程设备公司)。
普洱茶、黑茶、白茶、红茶茶砖/饼的制备方法：
(1)金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备：
谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1转植于察氏培养基或PDA培养基上30℃温度下培养7天后，用于谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备；在无菌环境下，提取谢瓦氏曲霉JH1群落与无菌水混合，调整菌悬液中谢瓦氏曲霉JH1数量在1×104CFU/mL以上。
(2)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液(250g)与云南大叶种晒青毛茶(1000g)按照所述的茶与金花菌悬液的质量比为100:25混合，30min后在常压高温蒸汽下蒸制4min后，放入已灭菌的发酵罐内进行以晒青毛茶为基质的金花菌的纯培养。或将晒青毛茶高温高压灭菌后，进行金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的接种，置于温度30℃，湿度低于75％的恒温培养箱内进行谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养。培养7天后，自然状态下进行干燥。观察金花菌菌落的生长状况，并按照GB 4789.15—2010食品安全国家标准《食品微生物学检验霉菌和酵母计数中的测定方法》测定谢瓦氏曲霉的数量。
形态观察得知纯培养7天后，茶叶内部出现茂盛、致密、色泽艳丽的金黄色闭囊壳，即为“金花”，未出现黑霉、白霉、青霉、红霉等杂菌菌落。发酵罐中金花菌长势较培养箱中金花菌长势良好。基于谢瓦氏曲霉耐高温的性质，常压高温蒸制5min之内，可达到茶叶中黑曲霉、烟曲霉等杂菌灭菌的目的，同时保留较高的谢瓦氏曲霉生物学活性。在30℃下，茶叶中谢瓦氏曲霉JH1大量繁殖，7天后数量在1×106CFU/g以上。
(3)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种的制备：
将以晒青毛茶等茶叶为基质纯培养获得的金花菌按照5％(w/w)接种量与云南大叶种晒青毛茶混合。潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制3-5min后，转移至已灭菌的发酵罐内进行半厌氧固态发酵。整个发酵过程中不再添加水分，发酵环境温度要求在18℃之间。发酵5天时，茶叶内部开始出现“金花”，且大量繁殖。固态发酵14天时，谢瓦氏曲霉群落数量已达1.5×107CFU/g，在固态发酵和干燥过程中应避免黑霉、青霉、白霉红霉等杂菌的污染。干燥后即可大量获得金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种，可用于金花普洱茶茶砖/茶饼的制作和金花普洱茶熟茶散茶的自然渥堆发酵。
(4)普洱茶等茶叶茶砖/茶饼的蒸压：
金花菌的产生要求茶饼(茶砖)有一定的含水量，并需要合适的温湿度。将扩大培养获得的金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种按照1％至3％质量比与云南大叶种晒青毛茶进行混合，并添加适量的饮用水进行潮水，潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制。蒸汽温度在100℃之间。蒸制时间在2-3min。若采用高压蒸汽设备，蒸制时间适当缩短，保证在保留部分谢瓦氏曲霉JH1活性的前提下，能完成对茶叶中黑曲霉、烟曲霉等杂菌灭菌的目的。按照现有的普洱茶蒸压工艺，最大应力为100-150Mpa。茶饼中心厚度为2.5cm，根据模具差异可用于压制357克、400克、500克、1000克等不同规格的茶饼。茶砖厚度为4-4.5cm，根据模具差异可用于压制500克、800克、1000克、2000克四种不同规格的茶砖。经过多次试验，茶饼的初始含水量在30％为宜；茶砖的初始含水量在28％为宜。
(5)普洱茶茶砖/茶饼的发花干燥：
发花是指在一定的水热作用下，金花菌大量繁殖的过程，并通过相应的胞外酶对茶叶中的茶多酚、氨基酸等品质成分产生水解、氧化、聚合等作用，进行改善茶叶原有的色泽、滋味和香气。将蒸压而成的茶饼或茶砖按照一定的顺序排列排放在4m×4m的烘房内。两排之间，两列之间的间隔不得低于5cm，以便于空气的流通。在发花阶段，烘房温度控制在26-30℃之间，并逐步提高温度；湿度控制在75％以下，当湿度超过75％时，要通风排湿。当发花7天后，进入干燥阶段，逐渐提高烘房温度至40℃，干燥3天后，当茶饼或茶砖含水量低于13％即为干燥结束。当发花干燥期间气温最低温度在16℃以上，最高温度为32℃，空气湿度在65％以下时，可不借助烘房的温度控制亦可以实现普洱茶茶饼或茶砖的发花与干燥。感官审评显示，金花普洱生茶茶饼或茶砖的成品茶色泽墨绿显毫，发花茂盛，干嗅菌香明显，茶汤花蜜香显著，汤色橙黄透亮，滋味甘醇鲜纯，生津明显持久，无苦涩味。茶饼中谢瓦氏曲霉数量在20×104CFU/g，金花茶砖中谢瓦氏曲霉数量在50×104CFU/g。
实施例3
实施例3与实施例2的区别在于：该菌株谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基上菌落生长缓慢，30℃7天直径为16mm，正面：绒粉状、黄色至金黄色；背面为土黄色至黄褐色，金黄色闭囊壳较少。
在步骤(3)中，金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种的制备：
将以晒青毛茶等茶叶为基质纯培养获得的金花菌按照5％(w/w)接种量与云南大叶种晒青毛茶混合。潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制3-5min后，转移至已灭菌的发酵罐内进行半厌氧固态发酵。整个发酵过程中不再添加水分，发酵环境温度要求在18℃之间。发酵5天时，茶叶内部开始出现“金花”，且大量繁殖。固态发酵14天时，谢瓦氏曲霉群落数量已达1.5×107CFU/g，在固态发酵和干燥过程中应避免黑霉、青霉、白霉红霉等杂菌的污染。干燥后即可大量获得金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种，可用于金花普洱茶茶砖/茶饼的制作和金花普洱茶熟茶散茶的自然渥堆发酵。
在步骤(4)中，普洱茶等茶叶茶砖/茶饼的蒸压：
金花菌的产生要求茶饼(茶砖)有一定的含水量，并需要合适的温湿度。将扩大培养获得的金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种按照1％至3％质量比与云南大叶种晒青毛茶进行混合，并添加适量的饮用水进行潮水，潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制。蒸汽温度在100-121℃之间。蒸制时间在3min。若采用高压蒸汽设备，蒸制时间适当缩短，保证在保留部分谢瓦氏曲霉JH1活性的前提下，能完成对茶叶中黑曲霉、烟曲霉等杂菌灭菌的目的。按照现有的普洱茶蒸压工艺，最大应力为100-150Mpa。茶饼中心厚度为2.5-3.5cm，根据模具差异可用于压制357克、400克、500克、1000克等不同规格的茶饼。茶砖厚度为4cm，根据模具差异可用于压制500克、800克、1000克、2000克四种不同规格的茶砖。经过多次试验，茶饼的初始含水量在27-30％为宜；茶砖的初始含水量在26％-28％为宜。
在步骤(5)中，普洱茶茶砖/茶饼的发花干燥：
发花是指在一定的水热作用下，金花菌大量繁殖的过程，并通过相应的胞外酶对茶叶中的茶多酚、氨基酸等品质成分产生水解、氧化、聚合等作用，进行改善茶叶原有的色泽、滋味和香气。将蒸压而成的茶饼或茶砖按照一定的顺序排列排放在4m×4m的烘房内。两排之间，两列之间的间隔不得低于5cm，以便于空气的流通。在发花阶段，烘房温度控制在26-30℃之间，并逐步提高温度；湿度控制在75％以下，当湿度超过75％时，要通风排湿。当发花7天后，进入干燥阶段，逐渐提高烘房温度至40℃，干燥3天后，当茶饼或茶砖含水量低于13％即为干燥结束。当发花干燥期间气温最低温度在16℃以上，最高温度为28-32℃，空气湿度在65％以下时，可不借助烘房的温度控制亦可以实现普洱茶茶饼或茶砖的发花与干燥。感官审评显示，金花普洱生茶茶饼或茶砖的成品茶色泽墨绿显毫，发花茂盛，干嗅菌香明显，茶汤花蜜香显著，汤色橙黄透亮，滋味甘醇鲜纯，生津明显持久，无苦涩味。茶饼中谢瓦氏曲霉数量在20×104CFU/g，金花茶砖中谢瓦氏曲霉数量在50×104CFU/g。
实施例4
实施例4与实施例2的区别在于：在步骤(3)中，金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergilluschevalieri JH1菌种的制备：
将以晒青毛茶等茶叶为基质纯培养获得的金花菌按照5％(w/w)接种量与云南大叶种晒青毛茶混合。潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制3-5min后，转移至已灭菌的发酵罐内进行半厌氧固态发酵。整个发酵过程中不再添加水分，发酵环境温度要求在30℃之间。发酵5天时，茶叶内部开始出现“金花”，且大量繁殖。固态发酵14天时，谢瓦氏曲霉群落数量已达1.5×107CFU/g，在固态发酵和干燥过程中应避免黑霉、青霉、白霉红霉等杂菌的污染。干燥后即可大量获得金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种，可用于金花普洱茶茶砖/茶饼的制作和金花普洱茶熟茶散茶的自然渥堆发酵。
在步骤(4)中，普洱茶等茶叶茶砖/茶饼的蒸压：
金花菌的产生要求茶饼(茶砖)有一定的含水量，并需要合适的温湿度。将扩大培养获得的金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种按照1％至3％质量比与云南大叶种晒青毛茶进行混合，并添加适量的饮用水进行潮水，潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制。蒸汽温度在100-121℃之间。蒸制时间在2-3min。若采用高压蒸汽设备，蒸制时间适当缩短，保证在保留部分谢瓦氏曲霉JH1活性的前提下，能完成对茶叶中黑曲霉、烟曲霉等杂菌灭菌的目的。按照现有的普洱茶蒸压工艺，最大应力为100-150Mpa。茶饼中心厚度为2.5-3.5cm，根据模具差异可用于压制357克、400克、500克、1000克等不同规格的茶饼。茶砖厚度为4.5cm，根据模具差异可用于压制500克、800克、1000克、2000克四种不同规格的茶砖。经过多次试验，茶饼的初始含水量在27-30％为宜；茶砖的初始含水量在26％-28％为宜。
在步骤(5)中，普洱茶茶砖/茶饼的发花干燥：
发花是指在一定的水热作用下，金花菌大量繁殖的过程，并通过相应的胞外酶对茶叶中的茶多酚、氨基酸等品质成分产生水解、氧化、聚合等作用，进行改善茶叶原有的色泽、滋味和香气。将蒸压而成的茶饼或茶砖按照一定的顺序排列排放在4m×4m的烘房内。两排之间，两列之间的间隔不得低于5cm，以便于空气的流通。在发花阶段，烘房温度控制在26-30℃之间，并逐步提高温度；湿度控制在75％以下，当湿度超过75％时，要通风排湿。当发花7天后，进入干燥阶段，逐渐提高烘房温度至40℃，干燥3天后，当茶饼或茶砖含水量低于13％即为干燥结束。当发花干燥期间气温最低温度在16℃以上，最高温度为28-32℃，空气湿度在65％以下时，可不借助烘房的温度控制亦可以实现普洱茶茶饼或茶砖的发花与干燥。感官审评显示，金花普洱生茶茶饼或茶砖的成品茶色泽墨绿显毫，发花茂盛，干嗅菌香明显，茶汤花蜜香显著，汤色橙黄透亮，滋味甘醇鲜纯，生津明显持久，无苦涩味。茶饼中谢瓦氏曲霉数量在20×104CFU/g，金花茶砖中谢瓦氏曲霉数量在50×104CFU/g。
实施例5
本发明所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株在金花普洱熟茶散茶成品中的应用。
本发明的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株在金花普洱熟茶散茶成品的制备方法，包括如下：
(1)金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备：
谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基或PDA培养基上于30℃温度下培养7天后，用于谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备；在无菌环境下，提取谢瓦氏曲霉JH1群落与无菌水混合，调整菌悬液中谢瓦氏曲霉JH1数量在1×104CFU/mL以上。
(2)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液(250g)与云南大叶种晒青毛茶(1000g)按照所述的茶与金花菌悬液的质量比为100:25混合，30min后在常压高温蒸汽下蒸制2min后，放入已灭菌的发酵罐内进行以晒青毛茶为基质的金花菌-谢瓦氏曲霉JH1的纯培养。或将晒青毛茶高温高压灭菌后，进行金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的接种。在温度30℃，湿度低于75％的恒温培养箱内进行纯培养。培养7天后取出，在自然状态下干燥。观察金花菌菌落的生长状况，并按照GB 4789.15—2010食品安全国家标准《食品微生物学检验霉菌和酵母计数中的测定方法》测定谢瓦氏曲霉的数量。
形态观察得知在纯培养7天后，茶叶内部出现茂盛、致密、色泽艳丽的金黄色闭囊壳，即为“金花”，未出现黑霉、白霉、青霉、红霉等杂菌菌落。发酵罐中金花菌长势较培养箱中金花菌长势良好。基于谢瓦氏曲霉耐高温的性质，常压高温蒸制5min之内，可达到茶叶中黑曲霉、烟曲霉等杂菌灭菌的目的，同时保留较高的谢瓦氏曲霉生物活性。在30℃下，茶叶中谢瓦氏曲霉JH1大量繁殖，7天后数量在1×106CFU/g以上。
(3)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种的制备：
将以晒青毛茶等茶叶为基质纯培养获得的金花菌按照5％(w/w)接种量与云南大叶种晒青毛茶混合。潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制5min后，转移至已灭菌的发酵罐内进行半厌氧固态发酵。整个发酵过程中不再添加水分，发酵环境温度要求在35℃之间。发酵5天时，茶叶内部开始出现“金花”，且大量繁殖。固态发酵14天时，谢瓦氏曲霉群落数量已达1.5×107CFU/g，在固态发酵和干燥过程中应避免黑霉、青霉、白霉红霉等杂菌的污染。干燥后即可大量获得金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种，可用于金花普洱茶茶砖/茶饼的制作和金花普洱茶熟茶散茶的自然渥堆发酵。
(4)普洱熟茶的外源接种自然渥堆发酵：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌种按照1％至3％(w/w)的接种量与云南大叶种晒青毛茶进行混合，并添加适量的饮用水，使茶叶的初始潮水量(含水量)维持在37-48％之间。渥堆所用晒青毛茶为2000kg以上，渥堆堆高度在70厘米至80厘米，上覆盖蒸汽灭菌处理后的麻布。
渥堆发酵过程中堆芯温度控制在35℃-60℃之间，整个渥堆发酵时间在35天。每隔5天翻堆一次，并在第一次或第二次翻堆时进行解块。翻堆时取样并观察金花菌生长状况。普洱熟茶外源接种自然渥堆发酵过程中谢瓦氏曲霉数量及“金花”现象的详情见表1。
表1
Figure BDA0003438055010000121
Figure BDA0003438055010000131
在渥堆发酵结束后进行自然干燥-仓储陈化-筛分拣剔等加工工序，以完成普洱熟茶散茶成品的加工。在渥堆发酵过程中出现明显发花现象，并一直持续到渥堆发酵结束。金花菌-谢瓦氏曲霉外源接种自然渥堆发酵的普洱熟茶在蒸压成砖/饼后，依旧保留较高的谢瓦氏曲霉生物学活性，在仓储陈化中会出现持续发花现象。
实施例6
实施例6与实施例5的区别在于：
本发明的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株在金花普洱熟茶散茶成品的制备方法，包括如下步骤：
(2)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液(250g)与云南大叶种晒青毛茶(1000g)按照所述的茶与金花菌悬液的质量比为100:25混合，30min后在常压高温蒸汽下蒸制3min后，放入已灭菌的发酵罐内进行以晒青毛茶为基质的金花菌-谢瓦氏曲霉JH1的纯培养。或将晒青毛茶高温高压灭菌后，进行金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的接种。在温度30℃，湿度低于75％的恒温培养箱内进行纯培养。培养7天后取出，在自然状态下干燥。观察金花菌菌落的生长状况，并按照GB 4789.15—2010食品安全国家标准《食品微生物学检验霉菌和酵母计数中的测定方法》测定谢瓦氏曲霉的数量。
形态观察得知在纯培养7天后，茶叶内部出现茂盛、致密、色泽艳丽的金黄色闭囊壳，即为“金花”，未出现黑霉、白霉、青霉、红霉等杂菌菌落。发酵罐中金花菌长势较培养箱中金花菌长势良好。基于谢瓦氏曲霉耐高温的性质，常压高温蒸制5min之内，可达到茶叶中黑曲霉、烟曲霉等杂菌灭菌的目的，同时保留较高的谢瓦氏曲霉生物活性。在30℃下，茶叶中谢瓦氏曲霉JH1大量繁殖，7天后数量在1×106CFU/g以上。
(3)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种的制备：
将以晒青毛茶等茶叶为基质纯培养获得的金花菌按照5％(w/w)接种量与云南大叶种晒青毛茶混合。潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制4min后，转移至已灭菌的发酵罐内进行半厌氧固态发酵。整个发酵过程中不再添加水分，发酵环境温度要求在33℃之间。发酵5天时，茶叶内部开始出现“金花”，且大量繁殖。固态发酵14天时，谢瓦氏曲霉群落数量已达1.5×107CFU/g，在固态发酵和干燥过程中应避免黑霉、青霉、白霉红霉等杂菌的污染。干燥后即可大量获得金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种，可用于金花普洱茶茶砖/茶饼的制作和金花普洱茶熟茶散茶的自然渥堆发酵。
(4)普洱熟茶的外源接种自然渥堆发酵：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌种按照1％至3％(w/w)的接种量与云南大叶种晒青毛茶进行混合，并添加适量的饮用水，使茶叶的初始潮水量(含水量)维持在37-48％之间。渥堆所用晒青毛茶为2000kg以上，渥堆堆高度在70厘米至80厘米，上覆盖蒸汽灭菌处理后的麻布。
实施例7
实施例7与实施例5的区别在于：
(2)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液(250g)与云南大叶种晒青毛茶(1000g)按照所述的茶与金花菌悬液的质量比为100:25混合，30min后在常压高温蒸汽下蒸制4min后，放入已灭菌的发酵罐内进行以晒青毛茶为基质的金花菌-谢瓦氏曲霉JH1的纯培养。或将晒青毛茶高温高压灭菌后，进行金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的接种。在温度30℃，湿度低于75％的恒温培养箱内进行纯培养。培养7天后取出，在自然状态下干燥。观察金花菌菌落的生长状况，并按照GB 4789.15—2010食品安全国家标准《食品微生物学检验霉菌和酵母计数中的测定方法》测定谢瓦氏曲霉的数量。
形态观察得知在纯培养7天后，茶叶内部出现茂盛、致密、色泽艳丽的金黄色闭囊壳，即为“金花”，未出现黑霉、白霉、青霉、红霉等杂菌菌落。发酵罐中金花菌长势较培养箱中金花菌长势良好。基于谢瓦氏曲霉耐高温的性质，常压高温蒸制5min之内，可达到茶叶中黑曲霉、烟曲霉等杂菌灭菌的目的，同时保留较高的谢瓦氏曲霉生物活性。在30℃下，茶叶中谢瓦氏曲霉JH1大量繁殖，7天后数量在1×106CFU/g以上。
(3)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种的制备：
将以晒青毛茶等茶叶为基质纯培养获得的金花菌按照5％(w/w)接种量与云南大叶种晒青毛茶混合。潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制3min后，转移至已灭菌的发酵罐内进行半厌氧固态发酵。整个发酵过程中不再添加水分，发酵环境温度要求在18℃之间。发酵5天时，茶叶内部开始出现“金花”，且大量繁殖。固态发酵14天时，谢瓦氏曲霉群落数量已达1.5×107CFU/g，在固态发酵和干燥过程中应避免黑霉、青霉、白霉红霉等杂菌的污染。干燥后即可大量获得金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种，可用于金花普洱茶茶砖/茶饼的制作和金花普洱茶熟茶散茶的自然渥堆发酵。
(4)普洱熟茶的外源接种自然渥堆发酵：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌种按照1％至3％(w/w)的接种量与云南大叶种晒青毛茶进行混合，并添加适量的饮用水，使茶叶的初始潮水量(含水量)维持在37-48％之间。渥堆所用晒青毛茶为2000kg以上，渥堆堆高度在70厘米至80厘米，上覆盖蒸汽灭菌处理后的麻布。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 云南农业大学 马存强
<120> 一株金花菌-谢瓦氏曲霉菌株及其制备方法和应用
<130> 2021
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 482
<212> DNA
<213> 人工序列(谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌株的ITS碱基序列)
<400> 1
cctggttaaa aagattggtt gcgaggctag ctgccagctg gacctacggg agcgggtgac 60
aaagccccat acgctcgagg accagacatg gtgccgccac tgccttttgg gcccgtcccc 120
gttgccaggg acggaagccc aacacacaag ccgtgcttga gggcagcaat gacgctcgga 180
caggcatgcc ccccggaata ccagggggcg caatgtgcgt tcaaagactc gatgattcac 240
tgaattctgc aattcacatt aattatcgca tttcgctgcg ttcttcatcg atgccggaac 300
caagagatcc gttgttgaaa gttttaacga ttgtttaact aaaaactcag actgcaaact 360
tcagacagcg ttcaaatgtt agtctccggc gggccgtggc cacgccgaag caacagggta 420
cagatagaca cggatgggag gttggaccca gagggcccgc actcggtaat gatccttccg 480
ca 482
<210> 2
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(β-tubulin碱基序列)
<400> 2
ccagttgtta ccggcaccgg actgaccgaa aacgaagtta tcgggacgga agagctggcc 60
gaagggaccg gcacggacgg cgtccatggt accgggctca aggtcgacga ggacggcacg 120
ggggacatat ttgttgttgg aggcctgtca ctgtcagaac tgtttcccac acagacacga 180
atgaattagg caaacctcgt tgaagtagac gttcatacgc tccaactgga ggtcggagga 240
gccattgtag ctgcaatcca tttagatatc catatccgat acgcgtccat ctcggagacc 300
cgactgtact tacacaccag agccgtcgag accgtgctcg ccggagatag tctgcctgtg 360
atactgttag tatatcaccc aatctggact ctgattataa tgcggacata ccagaaagca 420
gca 423
<210> 3
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列(Calmodulin碱基序列)
<400> 3
gagcaagtct ccgagtacaa ggaggcgttc tccctcttcg taagtgcgct ggccatctcc 60
atgtggcatt ttccccgtcg gcgttgaggg cagtaaactg accacgattt ctgcatttct 120
acaggacaag gatggcgatg gttagtgatc ccgctctact ctgcatcaaa tgcctctttt 180
actccaccat tcgattggtt ccgaccgtga tatcatattc gctgttgaaa taatatcttt 240
ccggttaacg acataatact gatggatctc tgcgattaca ggccagatca ccaccaagga 300
gctgggtacc gttatgcgct cgctgggcca gaacccctcc gagtcggagt tgcaggacat 360
gatcaacgag gttgacgctg acaacaacgg caccattgat ttccctggta tgcgatcgtc 420
ccgacatgaa aggtcacgta acaagatagg cgattctgac catactagaa ttccttacca 480
tgatggcacg gaagatgaag gacaccgatt ccgaggaaga gatccgggaa gctttcaagg 540
tcttcgatcg cgacaacaac ggtttcattt ccgctgcgga gctgcgccac gttatgacct 600
ccattggcga gaagcttacc gatgacgaag ttgacgagat gattcgtgag gctgaccagg 660
acggtgatgg ccgtattgac tgtatgtgaa cctttttctc ggtcgtatgt gaagaagcta 720
atcgttacca gacaacgaat t 741

Claims (10)

1.一株金花菌-谢瓦氏曲霉菌株，其特征在于：该菌株为谢瓦氏曲霉JH1；保藏名称为谢瓦氏曲霉JH1Aspergillus chevalier JH1；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年09月30日；保藏编号:CCTCC NO.20211180。
2.根据权利要求1所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株，其特征在于：所述的谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌株的ITS碱基序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieriJH1菌株的β-tubulin碱基序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述的谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌株的Calmodulin碱基序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株，其特征在于：该菌株谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基上菌落生长缓慢，30℃的温度下，7天直径为9-16mm，正面：绒粉状、黄色至金黄色；背面为土黄色至黄褐色，金黄色闭囊壳较少。
4.权利要求1所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株制备的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株菌剂。
5.根据权利要求4所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株的发酵培养物；
(b)权利要求1所得金花菌-谢瓦氏曲霉菌株细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所得金花菌-谢瓦氏曲霉菌株细胞的超声裂解沉淀。
6.权利要求1所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基或PDA培养基上于30℃温度下培养7天后，用于谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备；在无菌环境下，提取谢瓦氏曲霉JH1群落与无菌水混合，调整菌悬液中谢瓦氏曲霉JH1数量在1×104CFU/mL以上，制得金花菌-谢瓦氏曲霉菌株菌剂。
7.权利要求1至6任一项所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株在制备普洱茶、黑茶、白茶、红茶茶砖/饼蒸压干燥中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：普洱茶、黑茶、白茶、红茶茶砖/饼的制备方法：(1)金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备：
谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1转植于察氏培养基或PDA培养基上30℃温度下培养7天后，用于谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备；在无菌环境下，提取谢瓦氏曲霉JH1群落与无菌水混合，调整菌悬液中谢瓦氏曲霉JH1数量在1×104CFU/mL以上；
(2)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液(250g)与云南大叶种晒青毛茶(1000g)按照所述的茶与金花菌悬液的质量比为100:25混合，30min后在常压高温蒸汽下蒸制4min后，放入已灭菌的发酵罐内进行以晒青毛茶为基质的金花菌的纯培养。或将晒青毛茶高温高压灭菌后，进行金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的接种，置于温度30℃，湿度低于75％的恒温培养箱内进行谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养，培养7天后，自然状态下进行干燥；
(3)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种的制备：
将以晒青毛茶等茶叶为基质纯培养获得的金花菌按照5％(w/w)接种量与云南大叶种晒青绿茶混合。潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制3-5min后，转移至已灭菌的发酵罐内进行半厌氧固态发酵。整个发酵过程中不再添加水分，发酵环境温度要求在18℃之间；发酵5天时，茶叶内部开始出现“金花”，且大量繁殖；固态发酵14天时，谢瓦氏曲霉群落数量已达1.5×107CFU/g；在固态发酵和干燥过程中应避免黑霉、青霉、白霉红霉等杂菌的污染；干燥后即可大量获得金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种，可用于金花普洱茶茶砖/茶饼的制作和金花普洱茶熟茶散茶的自然渥堆发酵；
(4)普洱茶等茶叶茶砖/茶饼的蒸压：
金花菌的产生要求茶饼有一定的含水量，并需要合适的温湿度；将扩大培养获得的金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种按照1％至3％质量比与云南大叶种晒青毛茶进行混合，并添加适量的饮用水进行潮水，潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制；蒸汽温度在100℃之间；蒸制时间在2-3min；
(5)普洱茶茶砖/茶饼的发花干燥：发花是指在一定的水热作用下，金花菌大量繁殖的过程，并通过相应的胞外酶对茶叶中的茶多酚、氨基酸等品质成分产生水解、氧化、聚合作用，将蒸压而成的茶饼或茶砖按照一定的顺序排列排放在烘房内；当发花7天后，进入干燥阶段，逐渐提高烘房温度至40℃，干燥3天后，制得普洱茶、黑茶、白茶、红茶茶砖/饼。
9.权利要求1至6任一项所述的金花菌-谢瓦氏曲霉菌株在金花普洱熟茶散茶成品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：金花普洱熟茶散茶成品的制备方法：(1)金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备：
谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1在察氏培养基或PDA培养基上于30℃温度下培养7天后，用于谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的制备；在无菌环境下，提取谢瓦氏曲霉JH1群落与无菌水混合，调整菌悬液中谢瓦氏曲霉JH1数量在1×104CFU/mL以上；
(2)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1的纯培养：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液与云南大叶种晒青毛茶按照所述的茶与金花菌悬液的质量比为100:25混合，30min后在常压高温蒸汽下蒸制2min后，放入已灭菌的发酵罐内进行以晒青毛茶为基质的金花菌-谢瓦氏曲霉JH1的纯培养。或将晒青毛茶高温高压灭菌后，进行金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌悬液的接种；在温度30℃，湿度低于75％的恒温培养箱内进行纯培养，培养7天后取出，在自然状态下干燥；
(3)金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种的制备：
将以晒青毛茶等茶叶为基质纯培养获得的金花菌按照质量百分比为5％接种量与云南大叶种晒青绿茶混合，潮水30min至1小时后，在常压高温蒸汽下蒸制5min后，转移至已灭菌的发酵罐内进行半厌氧固态发酵；发酵5天时，茶叶内部开始出现金花，固态发酵14天时，谢瓦氏曲霉群落数量已达1.5×107CFU/g，干燥后即可大量获得金花菌-谢瓦氏曲霉Aspergillus chevalieri JH1菌种，可用于金花普洱茶茶砖/茶饼的制作和金花普洱茶熟茶散茶的自然渥堆发酵；
(4)普洱熟茶的外源接种自然渥堆发酵：
将金花菌-谢瓦氏曲霉JH1菌种按照质量百分比为1％至3％的接种量与云南大叶种晒青毛茶进行混合，并添加适量的饮用水，渥堆所用晒青毛茶为2000kg以上，渥堆堆高度在70厘米至80厘米，上覆盖蒸汽灭菌处理后的麻布；
(5)在渥堆发酵结束后进行自然干燥-仓储陈化-筛分拣剔，制得金花普洱熟茶散茶成品。
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