CN114196732A

CN114196732A - 用于核酸检测的被编码的双链探针及其用途

Info

Publication number: CN114196732A
Application number: CN202110510349.XA
Authority: CN
Inventors: 雷小军; 袁元; 余国良; ***
Original assignee: QUANDX Inc
Current assignee: QUANDX Inc
Priority date: 2015-03-19
Filing date: 2016-03-20
Publication date: 2022-03-18
Also published as: WO2016149694A1; US20200283831A1; US20180320223A1; CN108026580A

Abstract

本公开提供了使用多个被编码的(IDed)双链探针检测样品中多重目标核酸序列的方法。每个被编码的双链探针包含一段与编码物质连接的双链核酸杂交探针。还提供了使用多个被编码的双链探针测定核酸序列的方法。

Description

用于核酸检测的被编码的双链探针及其用途

本申请是申请号为201680029043.X、申请日为2016年3月20日、发明名称为“用于核酸检测的被编码的双链探针及其用途”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2016/023333的国家阶段申请，该国际申请要求2015年3月19日提交的美国临时专利申请系列第62/135,644号的权益，所述申请中的每个在此通过引用全部并入本文。

技术领域

本发明通常涉及用于核酸检测的探针。

背景技术

杂交探针是带有分子标记(例如放射性或荧光基团)的DNA或RNA片段，可以用于检测DNA或RNA样品中与探针序列互补的核酸序列的存在。传统上，使用杂交探针检测核酸序列是否存在(例如Southern或Northern印迹)需要分离杂化和非杂化的探针，这是复杂且耗时的。最近，一系列新型杂化探针被开发，例如5端-核酸外切酶(TaqMan TM)探针，分子信标，荧光能量转移探针，Scorpion探针，以提供更快速，简单和定量的检测。然而，上述探针难以设计和合成，并且特异性有限。另一方面，虽然长期以来的愿望是通过使用多个杂交探针来开发多重检测方法以检测一个反应中的多个核酸序列的存在，但是该方法受限于可以共同使用的分子标记的数量。

因此，需要继续开发新的杂交探针和方法以用于多重核酸序列的检测。

发明内容概述

一方面，本公开提供了包含与被编码底物相关联的双链核酸杂交探针的组合物。在某些实施方案中，所述双链核酸杂交探针包含(i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含与所述第一目标序列互补的第一序列包含与目标序列互补的第一序列的第一寡核苷酸组成；(ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含与所述第一序列互补但比所述第一序列短至多10个核酸的第二序列；(iii)连接所述第一个或第二个寡核苷酸之一的荧光基团；和(iv)连接在不与所述荧光基团相连的所述第一或第二寡核苷酸的第一荧光淬灭基团，其中当所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸杂化时，所述第一荧光淬灭基团可以淬灭所述第一荧光基团；和(b)和所述双链核酸杂交探针连接的被编码底物。

在某些实施方案中，所述第一寡核苷酸可以在所述第二寡核苷酸存在的情况下，自动的与目标序列杂化。在某些实施方案中，所述第一寡核苷酸不能够自动的与同所述目标序列之间存在一个核苷酸差别的错配序列杂化。在某些实施方案中，通过第一和第二寡核苷酸的杂交释放的自由能小于通过第一寡核苷酸与目标序列杂化释放的自由能，但大于通过第一寡核苷酸与错配序列的杂化而释放的自由能，所述错配序列与同所述目标序列之间存在一个核苷酸差别。

在某些实施方案中，上述寡核苷酸可以包含一个或多个核苷酸类似物(例如改变的主链，糖或核碱基)。在某些实施方案中，核苷酸类似物可以选自以下范围，5-溴尿嘧啶，肽核酸核苷酸，异种核酸核苷酸，吗啉基核苷酸，锁定的核酸核苷酸，二醇核酸核苷酸，苏糖核苷酸核苷酸，双脱氧核苷酸，虫草素，7-脱氮-GTP，荧光基团(例如与糖连接的罗丹明或氟替卡松)，含硫醇的核苷酸，生物素连接的核苷酸，荧光碱基类似物，甲基-7-鸟苷，甲基化核苷酸，肌苷，硫嘌呤，假乙二胺，二氢尿苷，奎宁和鸟苷。在某些实施方案中，核苷酸类似物是锁定的核酸核苷酸。

在某些实施方案中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸杂化产生双链平端，所述第一荧光基团和所述第一荧光淬灭基团连接在所述平端。

在某些实施方案中，目标序列长度为5～20个核苷酸。在某些实施方案中，第二寡核苷酸比第一序列短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在某些实施方案中，第二寡核苷酸比第一序列短1至5个核苷酸。在某些实施方案中，第二寡核苷酸比第一序列短2至7个核苷酸。在某些实施方案中，第二寡核苷酸比第一序列短3至8个核苷酸。在某些实施方案中，第二寡核苷酸比第一序列短4至9个核苷酸。在某些实施方案中，第二寡核苷酸比第一序列短5至10个核苷酸。在某些实施方案中，第一序列与目标序列100％互补。

在某些实施方案中，被编码的底物与连有荧光基团的寡核苷酸相连接。在某些实施方案中，被编码的底物与连有荧光淬灭基团的寡核苷酸相连接。在某些实施方案中，被编码的底物与荧光基团或荧光淬灭基团相连接。

在某些实施方案中，被编码的底物是数字编码珠。在某些实施方案中，被编码的底物是有规律的阵列。在某些实施方案中，被编码的底物是彩色量子点。

另一方面，本公开提供了一种用于检测样品中多重目标核酸序列的方法。在某些实施方案中，所述多重目标核酸序列至少包含第一目标序列和第二目标序列。在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使待测样品至少与如本文所述的第一和第二被编码双链探针接触，其中所述第一被编码双链探针包含与第一目标序列互补的序列，并且所述第二被编码双链探针包含与第二目标序列互补的序列，其中所述第一被编码双链探针包含第一被编码底物，所述第二被编码双链探针包含第二被编码底物；(b)检测由所述第一被编码双链探针发射出的第一荧光信号和由所述第二被编码双链探针发射出的第二荧光信号；并且(c)分析所述第一被编码底物和所述第二被编码底物从而确定所述第一和第二目标序列是否存在于样品中。在某些实施方案中，该方法还包括以下步骤：(d)分析第一和第二荧光信号的强度，从而确定第一和第二目标序列的丰度。

在某些实施方案中，第一目标序列和第二目标序列位于单个核酸上。在某些实施方案中，第一目标序列和第二目标序列位于两个分开的核酸上。

在某些实施方案中，杂化温度的范围在4℃～80℃。在某些实施方案中，杂化温度的范围在4℃～70℃。在某些实施方案中，杂化温度的范围在20℃～70℃。在某些实施方案中，杂化温度的范围在20℃～50℃。在某些实施方案中，杂化温度的范围在20℃～35℃。在某些实施方案中，杂化温度的范围在20℃～30℃。在某些实施方案中，杂化温度为4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。

另一方面，本公开提供了使用本文所述的多个被编码的双链探针来测定核酸序列的方法。在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：(a)使核酸至少与如本文所述的第一和第二被编码双链探针接触，其中所述第一被编码双链探针包含与第一目标序列互补的序列，并且所述第二被编码双链探针包含与第二目标序列互补的序列，所述第一被编码双链探针包含第一被编码底物，所述第二被编码双链探针包含第二被编码底物，其中第一目标序列与第二目标序列重叠；(b)b)检测由所述第一被编码双链探针发射出的第一荧光信号和由所述第二被编码双链探针发射出的第二荧光信号；并且(c)c)分析所述第一被编码底物和所述第二被编码底物从而确定所述第一和第二目标序列；和(d)组装所述第一和第二目标序列。

在另一方面，本公开还提供了用于检测受试者状况的方法，包括以下步骤：(a)从受试者获得待测试的样品；(b)使样品与如本文所述的多个被编码的双链探针接触；(c)检测发射荧光的被编码双链探针；并且(d)分析所述检测到的被编码双链探针对应的被编码底物以确定受试者中状况的存在。

在某些实施方案中，病症选自病毒感染，癌症，心脏病，肝病，遗传疾病和免疫疾病。

在某些实施方案中，受试者是人。

在某些实施方案中，样品选自唾液，眼泪，血液，血清，尿液，细胞和组织活检样品。

附图说明

图1A-1B是被编码双链探针的示意图。如图1A所示，被编码底物与核苷酸相连接。如图1B所示，被编码底物与荧光基团相连接。

图2A-2B是被编码双链探针的工作原理示意图。图2A示出了被编码双链探针与其单链目标之间的自发反应的工作原理。图2B说明了在变性和退火阶段，被编码双链探针与其双链目标之间的反应的工作原理。

图3是使用被编码双链探针进行多重分析的工作原理示意图。

图4A-4是利用被编码双链探针测定核酸序列的工作原理示意图。

具体实施方式

在上述发明内容概述和发明详述，以及下述权利要求和附图中，都提及本发明的特定特征(包括方法步骤)。应当理解，本公开中相关发明的内容包含这些特定特征的所有可能的组合。例如，在本发明的特定方面或实施例或特定权利要求的上下文中公开特定特征的情况下，该特征也可以在可能的范围内与/或在其他特定的上下文中使用本发明的方面和实施例以及本发明的一般方面。

术语“包括”及其语法等同物在本公开中用于表示其它组分，成分，步骤等都是可选择性的存在。例如，一个含有(或“包括”)组分A，B和C的组合可以由(有且仅有)组分A，B和C组成，或者不仅可以含有组分A，B和C，而且还有一个或多个其他组分。

在本公开中提及的方法包括两个或更多个限定步骤的情况时，所定义的步骤可以以任何顺序或同时进行(除非上下文排除该可能性)，并且该方法可以包括一个或多个其他步骤，所述步骤可以在任何定义的步骤之前，在两个定义的步骤之间或在所有定义的步骤之后执行(除非上下文排除了该可能性)。

在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则每个中间值至该下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限之间以及任何其他所述或在该规定的范围内的中间值，都包含在本公开内容中，并且需要受规定范围内的任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除这些限制中的一个或两个的范围也包括在本公开中。

术语“至少”以及后跟的数字在本文中用于表示一个以该数字为开始的范围的开端(其可以是具有上限或没有上限的范围，这取决于所定义的变量)。例如，“至少1”表示1或者大于1。术语“至多”以及后跟的数字在本文中用于表示一个以该数字为结尾的范围的结束(其可以是以1或0作为下限的范围，或没有下限的范围，这取决于所定义的变量)。例如，“至多4”表示4或者小于4，“至多40％”表示40％或者小于40％。在本公开中，当将范围设为“(第一个数字)至(第二个数字)”或“(第一个数字)-(第二个数字)”时，这意味着所述范围下限是第一个数字，其上限是第二个数字。例如，

个核苷酸是指下限为2个核苷酸，上限为10个核苷酸的范围。

应当理解，为了简单和清楚说明的目的，在适当的情况下，在不同的附图中重复了数字标记以指示对应的或类似的元件。此外，本公开中阐述了许多具体细节，从而能提供对所述实施例的透彻理解。然而，可以在没有这些具体细节的情况下实施本公开所描述的实施例。在其他情况下，方法，过程和组件并没有被详细描述，以免模糊所描述的相关功能。并且，描述不被理解为是限制本公开描述的实现的范围。应当理解，除非另有说明，本公开中阐述的实施例的描述和表征不应被认为是相互排斥的。

被编码的双链探针

一方面，本公开提供了一种被编码的双链探针，所述被编码双链探针包含一条双链核酸杂交探针和连接在其上的被编码底物，该被编码底物用于鉴定识别双链探针。双链核酸杂交探针由两个不同长度的互补寡核苷酸组成。寡核苷酸的一条链用荧光基团标记，另一条用荧光猝灭基团标记。被编码的双链探针在不同条件下可以具有不同的结构，这可以通过荧光变化来反映。当以稳定的双链结构自身杂交时，荧光基团和荧光猝灭基团彼此靠近，从而荧光基团被荧光猝灭基团淬灭，并且探针在荧光基团的发射波长处是非荧光的。当在变性条件下，例如在酸，碱或高温溶液中时，探针的两条链被分离，荧光基团发出荧光。当杂交溶液中存在目标时，探针的长链可以自发结合目标，双链探针解离，荧光基团发出荧光。当杂交溶液中存在多个被编码的双链探针时，可以通过检测与发射荧光的双链探针相关联的被编码底物来确定被编码的双链探针的序列。

被编码的双链探针的示例性实施方案在图1A中示出。如图1A所示，被编码的双链探针1由两个不同长度的互补寡核苷酸2、3组成。较长的链，在这种情况下被称为正链2，用荧光基团4和被编码底物6标记。较短的负链3用荧光猝灭基团5标记。由于荧光基团和荧光猝灭基团彼此靠近，探针此时不具有荧光活性。

另一个被编码的双链探针的实施方案在图1B中示出。如图1B所示，被编码的双链探针1由两个不同长度的互补寡核苷酸2、3组成。较长的链2用与被编码底物6相连的荧光基团4标记。较短的负链3用荧光猝灭基团5标记。由于荧光基团和荧光猝灭基团彼此靠近，探针此时不具有荧光活性。

双链探针

在某些实施方案中，类似物是锁定的核酸。锁定的核酸是修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分被修饰，所述核糖上的2’氧和4’碳被连接形成额外的桥连，从而将核糖锁定在3’端内构象。锁定的核糖构象增强了碱基堆积和骨架预结构，这显着增加了寡核苷酸的解链温度。

在一些实施方案中，两条链的长度范围为5-100个核苷酸，优选为10-50个核苷酸，更优选为15-25个核苷酸。在大多数情况下，探针的两条链长度不同。在某些实施方案中，较长的基团比较短的链长1-5个核苷酸。在某些实施方案中，较长的链比较短的链长2-10个，优选为2-7个核苷酸。在某些实施方案中，较长链的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

在表1和表2中列出的化合物中罗列出了一些合适的荧光基团和荧光猝灭基团，但不限于此。使用本领域已知的方法，合适的荧光基团和荧光猝灭基团可与寡核苷酸相连接。例如，在合成寡核苷酸期间，含有被保护荧光基团(例如6-FAM亚磷酰胺)的亚磷酰胺试剂与羟基反应以制备被荧光标记的寡核苷酸。荧光基团和荧光猝灭基团都可以连接在双链探针的末端或内部碱基上。在某些实施方案中，它们分别在两条链末端的互补碱基上。在某些实施方案中，荧光基团和荧光猝灭基团均位于探针的平端上。在某些情况下，标记的位置可以根据最佳荧光淬灭进行调整。

双链探针的荧光基团

双链探针的荧光淬灭基团

荧光淬灭基团	最大吸收波长(nm)
		DDQ-I	430
Dacyl	475
		Eclipse	530
Iowa Black FQ	532
		BHQ-1	534
QSY-7	571
		BHQ-2	580
DDQ-II	630
		Iowa Black RQ	645
QSY-21	660
		BHQ-3	670

被编码底物

本公开中所用的“被编码底物”代表一种已知编码或已知标记，其能产生可检测的信号用于识别一个被编码底物，并与另一个区分开。

在某些实施方案中，被编码底物是数字编码结构，例如Ho的美国专利8,232,092中所描述的数字编码珠。简言之，数字编码的珠粒是具有数字编码结构的微珠，其具有部分透射性并且对于光不透明，并且光的透射图案可用于确定珠的身份。例如，珠可以包括具有一系列交替的透光和不透光部分的主体，其具有类似于一维和二维条形码图像的相对位置，宽度和间距。为了解码图像，交替的透光和不透光部分的主体被光扫描或成像，从而确定由透射光呈现的图像所表示的代码。在某些实施例中，数字编码的珠可以使用微流体装置进行解码，该微流体装置包括微流道，其尺寸和配置用于引导编码珠可以逐一通过解码区。解码区包括代码检测器，其可以检测每个编码珠对应的光的透射图案，从而解析各个图像对应的代码。

可以理解，如上所述的数字编码结构可以是任何形状，例如矩形，正方形，圆形或椭圆形等。以此类推，数字编码可以是任何形式，只要它能产生可区分的信号。例如，当结构是矩形微板时，数字编码可以是条形代码。当结构是圆形微盘时，数字编码可以是某些模式的组合。

在某些实施方案中，被编码底物是多色半导体量子点标记珠，这种多色半导体量子点标记珠被公开在Han等人发表的文章Nature Biotechnology，19：631-635(2001)中或美国专利申请10/185,226中。简而言之，多色半导体量子点连接在或者嵌入多孔聚合物。对于每个量子点，存在给定的强度(具有例如0-10的水平)和给定的颜色(波长)。对于每种单一颜色编码，多孔聚合物珠粒具有不同的量子点强度，取决于连接或嵌入其中的量子点的数量。如果使用多种颜色(n种颜色)和多种强度(m级强度)的量子点，那么具有唯一身份和代码的多孔聚合物珠粒总数等于m到n的指数减1(mⁿ-1)。

在某些实施方案中，被编码底物是有序阵列。本公开所用的“有序阵列”是指一个固体表面，所述固体表面上具有已知序列的双链探针的集合，并且所述探针集合以有序方式相连接，那么基于双链探针在固体表面上的位置就可以确定所述探针的身份(即，序列)。

被编码底物可以通过本领域已知的方法与核酸连接。例如，寡核苷酸可以以非共价相互作用(例如，氢键，离子键等)或共价相互作用与被编码底物结合。在某些实施方案中，寡核苷酸与底物上的一个或多个官能团缔合。

任何本公开中描述的官能团都可以被使用(例如氨基，羧基，巯基，膦酸酯基，生物素，链霉亲和素，抗生物素蛋白，羟基，烷基或其他分子，接头或基团)。在某些实施方案中，核酸通过链霉亲和素-生物素相互作用与被编码底物结合。例如，被编码底物在其表面上具有链霉亲和素，同时核酸与生物素连接。在组合两者后，链霉亲和素与生物素强烈结合，从而将被编码底物与核酸片段缔合。

被编码的双链探针与其目标之间的自发反应

具有不同长度的链的被编码双链探针可以与溶液中包含目标序列的单链寡核苷酸自发反应。在该反应中，双链探针中的短链被目标寡核苷酸序列置换，从而形成热力学上更稳定的双链体。由此过程造成的双链探针解离会产生增加的荧光信号。在该反应中，容易设计实施方案的双链探针可以在室温下识别目标和与所述目标之间存在一个核苷酸差别的错配目标。这个极高的特异性基于下述原理，即对比于探针自身双链的自我杂化反应，错配的是识别是更不利的。这个设计是优于单链探针的，因为单链探针是热力学不稳定的，并且可以与另一个单链多核苷酸杂交，即使存在错配。分子信标也应用同样的原理，因为它们具有稳定的茎-环结构，比不稳定的错配反应更有利，从而使得分子信标的特异性高于单链线性探针。然而，分子信标的识别部分是一个环路，而所述环路仍然是单链的，如果茎不够长或循环序列太长，则留下错配杂交的可能。最近的报道反映出，当与NASBA(核酸序列扩增)(一种众所周知的等温核酸扩增技术)结合使用时，分子信标不能直接用于单核苷酸的鉴别。

被编码的双链探针也可用于检测包含目标序列的双链核酸。通常，被编码的双链探针与溶液中的双链核酸混合。将该溶液加热至高温(例如，超过90℃，95℃或98℃)，在对应温度，被编码的双链探针会发生变性和解离。然后将溶液冷却至退火温度(例如约40℃，42℃或45℃)。在没有目标序列的情况下，探针的两条链将是双链构象，因此将是没有荧光信号的。然而，在存在目标序列的情况下，两个探针链将与目标杂交，从而导致荧光。或者，双链DNA可以使用碱性缓冲液变性。例如，可将双链DNA与变性缓冲液混合并在一定温度(例如约

)下温育一段时间(例如约

分钟)。然后在加入杂交步骤需要的被编码探针之前加入中和缓冲液(例如NaAc)。

图2是被编码的双链探针与其目标之间自发反应的示例性实施方案的示意图。如图2A所示，被编码的双链探针1由两个不同长度的互补寡核苷酸2、3组成。较长的链2用荧光基团4和被编码底物6标记。较短的负链3用荧光猝灭基团5标记。由于荧光基团和荧光猝灭基团彼此靠近，探针此时不具有荧光活性。当目标7存在时，负链3被目标7置换，并且脱离的荧光基团4发出荧光。应当理解，如果荧光基团4和荧光猝灭基团5互换，也将产生荧光。检测被编码底物6从而确定双链探针1的身份。

图2B显示了双链探针1和双链核酸8.探针1包含用荧光基团4和被编码底物6标记的链2，和用荧光淬灭基团5标记的互补链3标记位于链的末端平端。核酸8包含互补链9和10。当高温变性时，探针的第2,3链与核酸的链9,10都解离。当温度降低至退火温度时，探针链2,3退火或杂交到核酸链9、10上，其中所述核酸链9、10包含探针链2、3的互补序列。荧光基团4不被荧光淬灭基团5淬灭，发出荧光。

用于多重分析的被编码的双链探针

在另一方面，本公开提供了在一个样品中同时检测两种或更多种不同目标序列(在不同核酸中或在给定核酸的不同部分中)的方法。该方法包括使用一组被编码的双链探针，其中每个探针包含与具有特异目标序列的双链探针相关联的不同编码的底物。基于所发射荧光和底物的唯一编码的组合，样品中不同目标序列可以被检测。

在某些实施方案中，同时检测一个样品中两种或更多种不同目标序列的方法包括：(a)将样品与如上所述的两个或多个被编码的双链探针接触，其中每个探针包含不同的被编码底物，所述被编码底物与特异性结合不同目标序列的双链探针相关联；(b)检测被编码的双链探针所发射的荧光；并且(c)分析被编码的双链探针的所述被检测到的被编码底物从而确定样品中被检测到被编码的双链探针所对应的目标序列的存在。

图3是使用被编码的双链探针进行多重分析方法的示例性实施方案的示意图。如图3所示，在一个反应中，5组被编码的双链探针(探针#

)与多个双链核酸(包括目标#2、3和5)接触。每个探针包含用荧光基团标记并与被编码底物(ID#

)相关联的链，以及用荧光淬灭基团标记的互补链。当目标#2、3和5存在时，探针#2、3和5的负链被相应的目标置换，对应探针#2,3和5的荧光基团不被荧光淬灭基团淬灭并发出荧光。探针#2,3和5的被编码底物被解码从而确定探针#2、3和5的身份(即目标序列)。结果表明了起始核酸中存在探针#2、3和5对应的目标序列，不存在探针#1和4对应的目标序列。应当理解，目标#2、3、5可以是单一目标的多个部分。

检测多个目标(或单一目标的多个部分)的方法可以建立诊断库，所述诊断库包含如上所述制备的多个被编码的双链探针，并且该探针流过微通道或扩散在基底表面上。被编码的双链探针可以通过或可以不通过化学方式连接到基底表面。被编码的双链探针可以通过其它非成键相互作用(例如静电相互作用，磁性等)停留在表面底物上。被编码的双链探针包括与被编码底物相关联的双链探针，所述被编码底物可用于鉴定探针的身份。探针流过微通道或通过本领域已知的方法在基底表面上扩散。使含有目标的样本与诊断库相接触。自发反应后，发射的荧光将指示样品中存在哪些目标。在发现目标在样品中存在(或不存在)后，探针的身份将通过解码被编码底物来确定。通过了解探针的身份，可以找到目标序列的身份。理论上，诊断库可以包含无限数量的缀合物。诊断文库将包含至少一个被编码的双链探针，优选至少20、50、100、500或1000个探针。

使用被编码的双链探针测序核酸

在另一方面，本公开提供了使用如上所述的被编码的双链探针测序核酸的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将一组被编码的双链探针与核酸杂交的步骤，其中可以基于双链探针的序列组装核酸序列。

如本文所用，术语“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以具有任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因，基因片段，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转移RNA，核糖体RNA，核糖酶，cDNA，shRNA，单链短或长RNA，重组多核苷酸，核苷酸，质粒，载体，任何序列的被分离出来的DNA，对照区，任何序列的被分离出来的RNA，核酸探针和引物。核酸可以是直链或环状的。

组装过程可以基于至少两个序列重叠的双链探针来完成。例如，为了确定一段包含连续的上游区域，重叠区域和下游区域核酸的序列(即，上游区域的3’末端通过磷酸二酯键与重叠区域的5’末端相连接，并且重叠区域的3’端通过磷酸二酯键与下游区域的5’末端相连接)，至少需要使用两个双链探针。所述第一双链探针与所述包含连续上游区域和重叠区域的第一序列互补，并且第二双链探针与所述包含连续重叠区域和下游区域的所述第二序列互补。当确定第一和第二双链探针的序列时，基于重叠序列(或，重叠区域的互补序列)，通过组合第一和第二双链探针的序列可以确定核酸序列。类似地，当更多的探针与核酸杂交并且每个探针至少与一个其它的探针重叠时，核酸序列可以通过组合探针的序列来确定。在某些实施方案中，上游区域的核酸长度可以为1、2、3、4、5、6或更多。在某些实施方案中，重叠区域的核酸长度可以为3、4、5、6、7、8、9或更多。在某些实施方案中，下游区域的核酸长度可以为1、2、3、4、5、6或更多。

因此，在某些实施方案中，该方法包含(a)使待测序的核酸与如上所述制备的多个被编码的双链探针接触；(b)检测一组被编码的双链探针所发射的荧光，其中组内的每个探针的序列至少与该组内的一个其它探针的序列重叠；(c)分析检测到的被编码的双链探针对应的被编码底物从而确定组中每个探针的序列；和(d)组装组内的探针序列从而确定核酸的序列。

在某些实施方案中，与核酸接触的多个被编码的双链探针包含被设计用于代表目的基因组区域的探针，所述基因组区域最优时与整个基因组一样大。在某些实施方案中，每个被编码的双链探针有对应的目标序列X₁X₂X₃...X_N(N＝4-20)，并且其中X可以是A，T，C或G中的任一个。4^N个不同的被编码双链探针可以覆盖长度为n的寡核苷酸的所有排列，从而代表整个基因组。例如，每个被编码的双链探针有对应的目标序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆，其中X可以是A，T，C或G中的任一个。那么，4⁶(＝4096)个不同的被编码双链探针可以覆盖长度为七的寡核苷酸的所有排列，从而代表整个基因组。在其他实例中，每个被编码的双链探针有对应额目标序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇，X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈，X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉或X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀，其中X可以是A，T，C或G中的任一个。相应地，4⁷,4⁸,4⁹或4¹⁰个不同的被编码双链探针可以覆盖长度为7、8、9、10的寡核苷酸的所有排列，从而代表整个基因组。

图4A-4示出了核酸测序的方法的示例性实施方案。

如图4A所示，多个双链探针由两条不同长度的互补寡核苷酸制成，其长链是六聚体。每个被编码的双链探针有对应的目标序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆，其中X可以是A，T，C或G中的任一个。那么，4⁶(＝4096)个不同的被编码双链探针可以覆盖长度为六的寡核苷酸的所有排列。较长的链(六聚体)用荧光基团标记，较短的链用荧光淬灭基团标记。每个六聚体与条形码微板相连接，以与其他六聚体区分。

如图4B所示，给定长度(x nt)的DNA序列(目标)可以通过x-5个DNA六聚体探针组装。通常，目标DNA序列通过链式聚合反应(PCR)扩增，然后与4096个被条形码标记的六聚体探针混合。六聚体探针与目标DNA杂交，从而发射出荧光并被鉴定。读取发射荧光的六聚体探针的条形码，从而确定这些六聚体探针的序列。对比所有检测到的六聚体的序列并实现DNA目标序列的组装。

如图4C所示，为了证明根据本公开的探针在单核苷酸突变检测中的应用，两个单链DNA模板(目标)被制备：野生型序列ssDNA_WT(40bp，用作参考)和具有一个点突变的序列ssDNA_Mut(40bp)。两个目标之间因单核苷酸替代而存在差别。

将DNA模板与一系列被条形码标记的六聚体探针混合后，读取具有荧光信号的条形码微板，并组装六聚体序列。在野生型反应中，在条形码#1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的探针中检测到荧光，上述探针的序列分别为AGCTCA，GCTCAT，CTCATC，TCATCA，CATCAC，ATCACG，TCACGC，CACGCA，ACGCAG和CGCAGC。在突变体反应中，在条形码#1、2、3、4、11、12、13、14、15和16的探针中检测到荧光，上述探针的序列分别为AGCTCA，GCTCAT，CTCATC，TCATCA，CATCAT，ATCATG，TCATGC，CATGCA，ATGCAG和TGCAGC。组装完检测到的探针的序列之后，野生型和突变型DNA的序列可以被确定。

如图4D所示，可以使用上述方法测定具有单核苷酸复制或单核苷酸缺失的DNA序列。

在某些实施方案中，为了富集目标序列，在与探针混合之前，使用PCR扩增DNA模板。在某些实施方案中，使用不对称PCR来产生单链目标序列。此时，不需要变性步骤来检测DNA模板和探针的杂交。

使用被编码的双链探针诊断疾病

本发明可应用于各种诊断测定中，包括但不限于病毒感染，癌症，心脏疾病，肝脏疾病，遗传疾病和免疫疾病的检测。本发明可以用于诊断测定以检测某些疾病目标，例如，(a)从受试者获得待测试的样品；(b)如上所述使样品与多个被编码的双链探针接触，(c)检测发射荧光的被编码双链探针；(d)分析所述检测到的被编码双链探针对应的被编码底物以确定受试者中状况的存在。受试者的样品可以是体液(例如唾液，泪液，血液，血清，尿液)，细胞或组织活检样品。

Claims

1.一种检测样品中多重目标核酸序列的方法，其中所述多重目标核酸序列至少包含第一目标序列和第二目标序列，所述方法包含以下步骤：

a)使待测样品在杂交温度下至少与第一被编码探针和第二被编码探针接触，

其中所述第一被编码双链探针包含：

(1)第一双链核酸杂交探针，所述第一双链核酸杂交探针由以下组成：

i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含与所述第一目标序列互补的第一序列；

ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含与所述第一序列互补但比所述第一序列短长达10个核酸的第二序列；

iii)连接所述第一个或第二个寡核苷酸之一的第一荧光基团；

iv)连接在不与所述荧光基团相连的所述第一或第二寡核苷酸的第一荧光淬灭基团，其中当所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸杂化时，所述第一荧光淬灭基团可以淬灭所述第一荧光基团；和

(2)和所述第一双链核酸杂交探针连接的第一被编码底物；

其中所述第二被编码双链探针包含：

(1)第二双链核酸杂交探针，所述第二双链核酸杂交探针有以下组成：

i)第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含与第二个目标序列互补的第三序列；

ii)第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸包含与第三序列互补但比所述第三序列短长达10个核酸的第四序列，；

iii)连接所述第三或第四寡核苷酸之一的第二荧光基团；

iv)连接在不与所述荧光基团相连的所述第三或第四寡核苷酸的第二荧光淬灭基团，其中当所述第三寡核苷酸和所述第四寡核苷酸杂化时，所述第二荧光淬灭基团可以淬灭所述第二荧光基团；和

(2)和所述第二双链核酸杂交探针连接的第二被编码底物；

b)检测由所述第一被编码双链探针发射出的第一荧光信号和由所述第二被编码双链探针发射出的第二荧光信号；

并且

c)分析所述第一被编码底物和所述第二被编码底物从而确定所述第一和第二目标序列是否存在于样品中。

2.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸可以在所述第二寡核苷酸存在的情况下，自动的与所述第一目标序列杂化，并且所述第三寡核苷酸可以在所述第二寡核苷酸存在的情况下，自动的与所述第二目标序列杂化。

3.权利要求2的方法，其中所述第一寡核苷酸不能够自动的与同所述第一目标序列之间存在一个核苷酸差别的错配序列杂化，和/或，所述第三寡核苷酸不能够自动的与同所述第二目标序列之间存在一个核苷酸差别的错配序列杂化。

4.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸杂化产生第一双链平端，所述第一荧光基团和所述第一荧光淬灭基团连接在所述第一平端，和/或所述第三寡核苷酸和所述第四寡核苷酸杂化产生第二双链平端，所述第二荧光基团和所述第二荧光淬灭基团连接在所述第二平端。

5.权利要求1的方法，其中所述第一和第二目标序列的长度大概为5～30个核苷酸。

6.权利要求1的方法，其中所述第二寡核苷酸比所述第一序列短1～5个核苷酸，和/或所述第四寡核苷酸比所述第三序列短1～5个核苷酸。

7.权利要求1的方法，其中所述第二寡核苷酸比所述第一序列短2～7个核苷酸，和/或所述第四寡核苷酸比所述第三序列短2～7个核苷酸。

8.权利要求1的方法，其中所述第一序列与所述第一目标序列100％互补，和/或，所述第三序列与所述第二目标序列100％互补。

9.权利要求1的方法，其中所述杂化温度的范围在4℃～B0℃。

10.权利要求1的方法，其中所述第一被编码底物与连有所述荧光基团的寡核苷酸相连，和/或所述第一被编码底物与连有所述荧光基团的寡核苷酸相连。

11.权利要求1的方法，其中所述第一被编码底物与连有所述荧光淬灭基团的寡核苷酸相连，和/或所述第二被编码底物与连有所述荧光淬灭基团的寡核苷酸相连。

12.权利要求1的方法，其中所述第一被编码底物与所述荧光基团或所述荧光淬灭基团相连，和/或所述第二被编码底物与所述荧光基团或所述荧光淬灭基团相连。

13.权利要求1的方法，其中所述第一编码底物和/或所述第二编码底物是数字编码珠，有规律的阵列或者是彩色量子点。

14.权利要求1的方法，进一步包括步骤(d)分析所述第一和所述第二荧光信号的强度，从而确定所述第一和所述第二目标序列的丰度。

15.权利要求1的方法，其中所述样品来源于病人，家畜，环境或者食物。

16.使用多个被编码的双链探针测定核酸序列的方法，其中所述核酸序列包含连续的上游序列，重叠序列和下游序列，其中所述多个被编码的双链探针包含至少第一被编码的双链探针和第二被编码的双链探针，其中所述第一被编码的双链探针包含：

(1)第一双链核酸杂交探针，所述第一双链核酸杂交探针有以下组成：

i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含与所述第一序列互补的第一序列，其中所述第一目标序列由连续的所述上游序列和所述重叠序列组成；

ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含与所述第一序列互补但可以比所述第一序列短长达10个核苷酸的第二序列；

iii)连接在所述第一或所述第二寡核苷酸上的第一荧光基团；

iv)连接在不与所述荧光基团相连的所述第一或所述第二寡核苷酸上的第一荧光淬灭基团，其中当所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸杂化时，所述第一荧光淬灭基团可以淬灭所述第一荧光基团；和

(2)连接所述第一双链核酸杂交探针标记的第一底物；

其中所述第二被编码的双链探针包含：

(1)第二双链核酸杂交探针，所述第二双链核酸杂交探针由以下组成：

i)第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含和第二目标序列是互补的第三序列，其中所述第二目标序列由连续的所述重叠序列和所述下游序列组成；

ii)第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸包含和第三序列互补但比所述第三序列短长达10个核酸的第四序列，；

iii)连接在所述第三或所述第四寡核苷酸上的第二荧光基团；

iv)连接在不和所述荧光基团相连的所述第三或第四寡核苷酸上的第二荧光淬灭基团，其中当所述第三寡核苷酸和所述第四寡核苷酸杂化时，所述第二荧光淬灭基团可以淬灭所述第二荧光基团；和

(2)连接所述第二双链核酸杂交探针的第二被编码底物；

所述方法包含如下步骤：

a)在杂化温度下，使所述核酸与所述多个被编码的双链探针接触；

并且

c)分析所述第一被编码底物和所述第二被编码底物从而确定所述第一和第二目标序列；和

d)组装所述第一和第二目标序列。

17.权利要求16的方法，其中所述第一寡核苷酸可以在所述第二寡核苷酸存在的情况下，自动的与所述第一目标序列杂化，并且所述第三寡核苷酸可以在所述第二寡核苷酸存在的情况下，自动的与所述第二目标序列杂化。

18.权利要求17的方法，其中所述第一寡核苷酸不能够自动的与同所述第一目标序列之间存在一个核苷酸差别的错配序列杂化，和/或，所述第三寡核苷酸不能够自动的与同所述第二目标序列之间存在一个核苷酸差别的错配序列杂化。

19.权利要求16的方法，其中所述第一和所述第二目标序列各自的长度大概为5～30个核苷酸。

20.权利要求19的方法，其中所述杂化温度的范围在4℃～80℃。