CN114196620B - 一种母猪乳腺组织体外培养方法 - Google Patents

一种母猪乳腺组织体外培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物科技领域，公开了一种母猪乳腺组织体外培养方法，包括以下步骤：（1）对母猪乳腺组织取样并消毒；（2）将母猪乳腺组织进行切片处理；（3）制备凝固胶并且将母猪乳腺组织切片放置于上下两层凝固胶之间，置于Transwell板的上室中，置于培养箱中培养30分钟使其固定；（4）将Transwell的下室中加入培养基，将Transwell板放置37度培养箱中培养。本发明具有高的体内环境模拟度、低成本、细胞生长速度快的特点。

Description

一种母猪乳腺组织体外培养方法
技术领域
本发明涉及生物科技领域，尤其涉及一种母猪乳腺组织体外培养方法。
背景技术
猪汗腺不发达、皮下脂肪较厚、散热比较慢，其次我国尤其是南方地区夏季 7～9月气温高达30℃以上，因此泌乳母猪易发生热应激。当环境温度高于泌乳母猪舒适区温度时，泌乳母猪和仔猪的生长性能受到影响，导致母猪的采食量下降、摄取的营养物质降低、泌乳量减少、哺乳期体重损失严重、背膘及蛋白质损失增加等，其中泌乳性能的改变直接影响了仔猪的生长。母猪泌乳性能对仔猪出生体重以及生长发育具有重要影响，热应激因素极易损伤乳腺组织，且乳腺长时间处于代谢旺盛状态，乳腺也产生氧化应激，导致乳腺功能损伤，降低母体泌乳性能。因此，构建母猪乳腺体外培养模型对研究应激状态下母猪乳腺损伤机制及深入探究营养素调控机制促进母仔猪生长性能，提高生产效益有着重要的意义。
此方面的研究可参考CN201811122209 .X和CN202010038062 .7 。
CN201811122209 .X公布了一种3D猪乳腺上皮细胞的方法，该发明中提供了一种Advanced DMEM/F12完全培养基，结合3D培养方法对猪乳腺细胞进行培养。该发明以EMC蛋白充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三位组织特异性结构，和传统2D培养方法相比其细胞内各乳份表达量显著提高，但是该发明所提供的方法所培养的细胞生长速度缓慢。
CN202010038062 .7 公布了一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法，该培养方法提供了一种三维持续培养方法，结合三维培养基，该方法可以充分真实的模拟体内生长模式，与单层细胞培养***相比，三维细胞培养***更准确地反映细胞在组织中的实际微环境。但是该发明中所使用的三维细胞培养基是根据单一的猪乳腺上皮细胞制定的特殊培养基，价格昂贵，使用成本过大。
发明内容
本发明的目的是提供一种母猪乳腺组织体外培养方法，该方法高度模拟体内环境，且在不影响细胞生长速度的情况下减小了培养基制作成本。
本发明不作特殊说明的情况下：nM代表纳摩尔/升，μM代表微摩尔/升，mM代表毫摩尔/升，M代表摩尔/升；
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种母猪乳腺组织体外培养技术，包括以下步骤：
将母猪乳腺组织切片后置于上凝固胶、下凝固胶之间，下凝固胶和培养基接触；每2-4天换一次培养基或者培养基变黄即更换；
优选的，所述培养基的组分为：
DMEM-F12：450～550ml；
DMEM basic：350～450 ml；
胎牛血清：80～120ml；
青霉素-链霉素：10～20ml；
胰岛素：8～12ug/ml；
500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液：0.8～1.2倍体积；
cholera toxin：0.05～0.15 nM；
EGF：5～15ng/ml ；
氢化可的松：0.7～13ug/ml；
ROCK 抑制剂Y27632：6～14μM。
需要说明的是：所述500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液：0.8～1.2倍体积的含义为：向每500ml培养基中加入500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液0.8～1.2ml。
优选的，所述上凝固胶、下凝固胶均由以下成分组成：
胶原collagen I、10倍体积的F12培养基、缓冲液；
胶原collagen I、10倍体积的F12培养基、缓冲液的重量比为6:1:1～8:1:1。
优选的，所述缓冲液是由100mL无菌水、0.05 M NaOH、 200mm HEPES、 2.2 gNaHCO3的混合物组成。
优选的，所述上凝固胶、下凝固胶的体积比为1:1～2。
优选的，所述母猪乳腺组织切片的具体方法为：
将剔除掉***和脂肪的乳腺组织剪成小块，将乳腺组织***6%（体积分数）的液态的琼脂中，放入冰箱中，使其凝固；
琼脂凝固后将包含乳腺组织的琼脂块切成正方体；
采用切片机将正方体切割成为厚度为250～350 μm的薄片并放入PBS溶液（无菌PBS溶液含 KH2PO4，NaCl，Na2HPO4，pH 7.2-7.4）中；在体视显微镜下剥离掉琼脂，即可得到切片后的乳腺组织。
优选的，所述PBS溶液中含3倍体积青霉素-链霉素和1倍体积的500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液。
优选的，所述正方体的规格为3*3cm。
与现有技术相比本发明的有益效果是：
本发明所提供的母猪乳腺组织体外培养技术比现有技术更加的模拟体内环境，且可以做到在不影响细胞生长状态的条件下降低培养基的成本。
附图说明
图1中标号1-4为实施例1和对比例1在不同时间的培养照片。
图2为对比例2持续培养2天后的组织培养的照片。
图3中标号1-4为实施例1提供的不同放大倍数情况下的乳腺组织HE染色图，放大倍数依次为5、10、20、40倍。
图4中标号1-3为为实施例1提供的不同放大倍数情况下的乳腺组织Tunel 染色图，放大倍数依次为10、20、40倍。
图5为对比例3的组织培养的照片。
图6为对比例4的组织培养的照片。
图7为对比例5的组织培养的照片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳 动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试剂说明
DMEM basic：Gibco（Thermo Fisher scientific）国内配制
DMEM F12：Gibco（Thermo Fisher scientific）国内配制
胰岛素：货号I9278，Sigma
Gentamicin/ Amphotericin B（500X）：货号HY-B0221，MCE公司；Gentamicin/Amphotericin B（500X）的中文名为：500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液；
cholera toxin：货号HY-129040A，MCE公司
表皮生长因子EGF：货号PHG0311，Gibco
氢化可的松：货号HY-N0583，MCE公司
Y27632（ROCK 抑制剂）：货号HY-10071，MCE公司
Advanced DMEM/F12：Gibco（Thermo Fisher scientific）国内配制
胎牛血清： Gibco（Thermo Fisher scientific）
青霉素-链霉素：Gibco（Thermo Fisher scientific）；（下述实施例和对比例在未做特别说明的地方，“双抗”均指本处的青霉素-链霉素）
胶原collagen I：货号C0130，Sigma
HEPES：货号15630080，Gibco（Thermo Fisher scientific）
NaHCO3：货号25080094，Gibco（Thermo Fisher scientific）
Transwell板：货号3450/3460，Corning
B-27：货号17504044，Gibco（Thermo Fisher scientific）
谷氨酰胺：货号A2916801，Gibco（Thermo Fisher scientific）
支原体去除剂Plasmocin：普诺赛
N-乙酰半胱氨酸：货号A105422，阿拉丁
0.20μM过滤器：Millipore
P38抑制剂SB202190：货号HY-10295，MCE公司
Matrigel：货号354234，BD公司
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
组织提取方法
母猪乳腺组织采取：当90日龄以上的母猪经过屠宰流程后（已经过清洗），并使用75%（体积分数）（体积分数）酒精擦拭采样部位，割下第二对***的整个乳腺，使用无菌PBS反复冲洗5遍， 装进预先准备好的高温灭菌大烧杯中，用无菌PBS浸泡（含3%（体积分数）双抗），牛皮纸封好，放进有两三个冰袋的泡沫盒中，迅速带回实验室；将整块乳腺放入托盘中，以***为中心割出一个3×3cm的块，剩下乳腺弃掉，再沿着***割开，捏住***往下摸可以感觉到导管，将***下2-3cm处的乳导管割出1立方厘米的乳腺小块，剔除明显的***和脂肪组织，使用含3%（体积分数）双抗的清洗3遍，直至培养基上清液清亮无杂物，将其置于含1倍体积的500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液的 PBS的培养皿中。
实施例1
（1）切片制备准备：取出高温灭菌后的剪刀，将乳腺组织剪成小块，将乳腺组织纵向***6%（体积分数）琼脂中（约40℃，不烫手），放入4℃冰箱中，使其凝固；琼脂凝固后将包含乳腺组织的琼脂块切成小正方体，用520强力胶黏贴在载物台上。
（2）凝固胶制备：将胶原collagen I，10倍体积的F12培养基和缓冲液按照8:1:1的比例混合，制成重组胶原凝胶，其中缓冲液是由100mL无菌水，0.05 M NaOH， 200mm HEPES，2.2 g NaHCO3的混合物组成。如果过酸可以适当调Ph值到7.0。混匀后放入12孔的Transwell板上的chamber上，每孔50-100μl，37℃培养箱放置15分钟，使其凝固。
（3）切片制备：振动切片机切成250～350 μm的薄片放入PBS（3倍体积双抗和1倍体积的500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液）；在体视显微镜下剥离掉琼脂，而后将制备好的组织切片放置在凝固胶上，组织切片上再放30-50μl凝固胶，37℃培养。在chamber下方加入500ul的培养基。
培养基制备：称取以下物质混合：DMEM-F12：500ml，DMEM basic：373 ml，胎牛血清：100ml，青霉素-链霉素：15ml，胰岛素：10ug/ml，500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液：1倍体积，cholera toxin：1 nM，EGF：10ng/ml ，氢化可的松：10ug/ml，ROCK 抑制剂Y27632：10μM。
对比制备后第一天（图1中标号1）与制备后第十四天（图1中标号3），可以发现制备十四天后，一到两天培养基就变黄（判断细胞生长状态的依据），与对比例1相比，细胞生长速度相当。
图4中标号1-3为不同标尺情况下的乳腺组织Tunel 染色结果，在该图中，并无红色区域，表示组织生长良好。
实施例2
改变了实施例1培养基各组分的添加量如下：
DMEM-F12：450ml，DMEM basic：350 ml，胎牛血清：80ml，青霉素-链霉素：10ml，胰岛素：8ug/ml，500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液：0.8倍体积，cholera toxin：0.05 nM，EGF：5ng/ml ，氢化可的松：0.7ug/ml，ROCK 抑制剂Y27632：6μM。
运用此培养基培养出的猪乳腺上皮组织细胞生长状况与实施例1差别不大，生长速度稍慢。
实施例1和实施例2的成本近似。
实施例3
改变了实施例1培养基各组分的添加量如下：
DMEM-F12：550ml，DMEM basic：450 ml，胎牛血清：120ml，青霉素-链霉素：20ml，胰岛素：12ug/ml，500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液：1.2倍体积，cholera toxin：0.15nM，EGF：15ng/ml ，氢化可的松：1.3ug/ml，ROCK 抑制剂Y27632：14μM。
运用此对比例所述培养基培养出的猪乳腺上皮组织细胞生长状况与实施例1稍差，生长速度相当。
实施例1和实施例3的成本近似。
对比例1
（1）切片制备准备：取出高温灭菌后的剪刀，将乳腺组织剪成小块，将乳腺组织纵向***6%（体积分数）琼脂中（约40℃，不烫手），放入4℃冰箱中，使其凝固；琼脂凝固后将包含乳腺组织的琼脂块切成小正方体，用520强力胶黏贴在载物台上。
（2）凝固胶制备：将胶原collagen I，10倍体积的F12培养基和缓冲液按照质量比8:1:1的比例混合，制成重组胶原凝胶，其中缓冲液是由100mL无菌水，0.05 M NaOH， 200mmHEPES， 2.2 g NaHCO3的混合物组成。如果过酸可以适当调Ph值到7.0。混匀后放入12孔的Transwell板上的chamber上，每孔50-100μl，37℃培养箱放置15分钟，使其凝固。
（3）切片制备：振动切片机切成250～350 μm的薄片放入PBS（3倍体积双抗和1倍体积的500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液）；在体视显微镜下剥离掉琼脂，而后将制备好的组织切片放置在凝固胶上，组织切片上再放30-50μl凝固胶，37℃培养。在chamber下方加入500ul的对比培养基。
（4）对比培养基制备：
1 mL Advanced DMEM/F12培养基：40～60%（体积分数）L-WRN cells培养上清液，该上清液为富含Wnt3α，R-spondins，Noggin蛋白因子的条件性培养基，8～12%（体积分数）胎牛血清，1～2%（体积分数） 青霉素-链霉素，8～12μM ROCK抑制剂Y27632，8～12μM P38抑制剂SB202190；8～12ng/mL表皮生长因子；0.4～0.6 μg/mL氢化可的松；1*B-27；1*谷氨酰胺；0.01～0.02%（体积分数） ITS；1*两性霉素B&庆大霉素；25μM支原体去除剂Plasmocin；1.00～1.50mM N-乙酰半胱氨酸，培养基用0.20μM过滤器过滤。
对比制备后第一天（图1中的标号1）与制备后第十四天（图1中的标号3），可以发现制备十四天后培养基明显变黄（判断细胞生长状态的依据）。
与实施例1相比，细胞生长速度相当。
本对比例1的培养基的成本约为实施例1的培养基的成本的5倍。
对比例2
（1）切片制备准备：取出高温灭菌后的剪刀，将乳腺组织剪成小块，将乳腺组织纵向***6%（体积分数）琼脂中（约40℃，不烫手），放入4℃冰箱中，使其凝固；琼脂凝固后将包含乳腺组织的琼脂块切成小正方体，用520强力胶黏贴在载物台上。
（2）切片制备：振动切片机切成250～350 μm的薄片放入PBS（3倍体积双抗和1倍体积的500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液）；在体视显微镜下剥离掉琼脂，将切片组织放入500ul的液体培养基中，37℃培养。
（3）液体培养基的组分如下：称取以下物质混合：MEM-F12 500ml， DMEM basic373ml， 10ug/ml 胰岛素， 1倍体积的500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液， choleratoxin 0.1 nM， 10ng/ml EGF，1ug/ml氢化可的松， 10μM Y27632。其和实施例1的培养基组成完全一致。
图2示出了采用液体培养基培养乳腺组织的结果，可以发现，采用液体培养基无法对乳腺组织进行顺利的培养，其表现为组织易干燥、培养速度非常慢。
对比例3
采用CN202010038062 .7中实施例1所述的方法和培养基对猪乳腺上皮组织进行培养，参考该对比文件中的蛋白酶消化法对组织进行消化和3D培养。
参考图5，图5中猪乳腺上皮组织生长良好。
对比例4
采用CN202010038062 .7中实施例1所述的方法和本发明的实施例1所提及培养基对猪乳腺上皮组织进行培养，参考该对比文件中的蛋白酶消化法对组织进行消化和3D培养。
参考图6，图6中，本发明的培养基对猪乳腺上皮组织采用3D模型进行培养8天后发现细胞生长缓慢，甚至出现细胞死亡等情况。
通过对比例3和对比例4的测试可以发现：
本发明的培养基并不能在所有的培养体系中均适用，其仅仅适用于本发明的气液培养体系。
但是不能忽视的是对比培养基成本太高，在大规模的工业应用中具有较大的局限性。
对比例5
本对比例是为了测试不同的低成本培养基对于本发明的培养模型的适应程度。
其具体的培养方法可参考实施例1。
采用的是CN201811122209 .X实施例1所用培养基，如下：
Advanced DMEM/F12完全培养基的组成为：Advanced DMEM/F12基础培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰岛素、氢化可的松和上皮生长因子，其中Advanced DMEM/F12基础培养基和胎牛血清的体积比为9:1，青霉素、链霉素、胰岛素、氢化可的松和上皮生长因子在Advanced DMEM/F12完全培养基中的浓度分别为50μg/ml、4μg/ml、10ug/ml、1ug/ml、10ng/ml。
本对比例的培养基对乳腺组织细胞培养结果为：
此对比例中的培养基成本同样不高，但是参考图7可以明显看出，运用此对比例所述培养基培养出的猪乳腺上皮组织细胞生长状况不佳。
综上所述：
1.本发明的气液培养方式结合本发明的培养基，可以达到快速、低成本的乳腺组织的培养目的。
2.本发明在先申请的发明专利所涉及的培养基应用于本发明的培养体系中之后要么成本过高，要么培养速度过低，这两项都会增大工业化扩大生产的成本。
3.本发明的培养基并不适用于液体培养方法，换句话说，传统的液体培养方法对于培养基的营养成分要求过高，低成本培养基无法适用。

Claims (7)

1.一种母猪乳腺组织体外培养方法，其特征在于，所述方法具体为：将母猪乳腺组织切片后置于上凝固胶、下凝固胶之间，下凝固胶和培养基接触；每2～4天换一次培养基或者培养基变黄即更换；
所述培养基的1L配制组分为：
DMEM-F12：500ml；
DMEM basic：373 ml；
胎牛血清：100ml；
青霉素-链霉素：15ml；
胰岛素：10ug/ml；
500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液：1倍体积；
cholera toxin：1 nM；
EGF：10ng/ml ；
氢化可的松：10ug/ml；
ROCK 抑制剂Y27632：10μM。
2.根据权利要求1所述的母猪乳腺组织体外培养方法，其特征在于，所述上凝固胶、下凝固胶均由以下成分组成：
胶原collagen I、10倍体积的F12培养基、缓冲液；
胶原collagen I、10倍体积的F12培养基、缓冲液的重量比为6:1:1~8:1:1。
3.根据权利要求2所述的母猪乳腺组织体外培养方法，其特征在于，所述缓冲液是由100mL无菌水、0.05 M NaOH、 200mm HEPES、 2.2 g NaHCO3的混合物组成。
4.根据权利要求1所述的母猪乳腺组织体外培养方法，其特征在于，所述上凝固胶、下凝固胶的体积比为1:1～2。
5.根据权利要求1所述的母猪乳腺组织体外培养方法，其特征在于，所述母猪乳腺组织切片的具体方法为：
将剔除掉***和脂肪的乳腺组织剪成小块，将乳腺组织***体积分数为6%的液态的琼脂中，放入冰箱中，使其凝固；
琼脂凝固后将包含乳腺组织的琼脂块切成正方体；
采用切片机将正方体切割成为厚度为250~350 μm的薄片并放入PBS溶液中；在体视显微镜下剥离掉琼脂，即可得到切片后的乳腺组织。
6.根据权利要求5所述的母猪乳腺组织体外培养方法，其特征在于，所述PBS溶液中含3倍体积青霉素-链霉素和1倍体积的500X的庆大霉素-两性霉素B混合溶液。
7.根据权利要求5所述的母猪乳腺组织体外培养方法，其特征在于，所述正方体的规格为3*3cm。
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