CN114195896B - 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体，所述单域抗体的重链互补决定区包括CDR1、CDR2、CDR3；所述的CDR1为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1有80％以上同一性的序列，CDR2为SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2有80％以上同一性的序列，CDR3为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3有80％以上同一性的序列。本发明提供的BCMA嵌合抗原受体由BCMA单域抗体基因片段和2代CAR结构基因序列串联组成，与靶细胞结合力更强、杀伤效果更好、体内持续时间更久。

Description

一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种浆细胞肿瘤性疾病，主要特征是单克隆浆细胞的恶性增殖、血液或尿液中出现单克隆免疫球蛋白，以及相关的终末器官损伤包括高钙血症、肾功损害、贫血和溶骨性破坏。目前认为所有MM患者均有未明意义单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS)阶段，也称骨髓瘤前期状态。MGUS进展到下一阶段为骨髓瘤，进展概率大约1％/年。骨髓瘤分为2个阶段：冒烟型骨髓瘤(smouldering multiple myeloma，SMM)和活动性骨髓瘤。SMM是介于MGUS和活动性骨髓瘤的中间阶段，也称为骨髓瘤早期。SMM患者不需要治疗，而活动性骨髓瘤患者则需要进行治疗。
MM在肿瘤性疾病中占比约1％，在血液***恶性肿瘤中占比约13-18％。MM的病因至今尚未明确，可能与病毒感染、电离辐射、接触某些化学物质和遗传等相关。MM的生存期很短，如果不进行任何治疗，进展期患者的中位生存期为6个月。近年来，随着人们对疾病关注意识的提高和蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、自体干细胞移植、达雷妥尤单抗(CD38靶点)和埃罗妥珠单抗(SLAMF7靶点)等应用，缓解率及生存期明显改善，MM患者5年以上的生存率已经达到了49％。但多数病人最终会出现耐药或复发、死亡，所以到目前MM仍被认为是一种不可治愈的疾病。
天然免疫***中，MM患者NK细胞的细胞毒性和免疫调节功能都受到削弱。MM患者中的抗原提呈细胞树突细胞吞噬细菌和抗原提呈能力下降，不能被肿瘤抗原有效刺激并上调T细胞活化的共刺激信号分子。获得性免疫***中，MM患者的T细胞分泌分化紊乱和B细胞的功能被削弱，Treg/Th17失衡促进了炎症的持续发生和肿瘤的生长。此外，肿瘤的异质性和骨髓微环境对疾病进展的影响也使得MM难以治愈，因此，开发新型治疗多发性骨髓瘤的方法迫在眉睫。
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是一种由抗原识别域、一个胞外铰链区(Hinge area)、一个跨膜区(Transmembrane region)、一至二个共刺激域(如CD28、4-1BB等)以及免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif，ITAM，如来自于CD3ζ链等的片段)构成的人工分子；其中抗原识别域通常来自于单克隆抗体抗原结合区域来源的单链可变片段(single-chain variablefragment，scFv)。
T淋巴细胞可以通过基因工程的手段人为表达CAR，成为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)，CAR-T通过scFv以抗原-抗体结合的方式来识别特定的细胞表面抗原，继而通过CAR下游的共刺激域以及免疫受体酪氨酸活化基序使CAR-T细胞活化、释放颗粒素、穿孔酶、IFN-γ等，从而特异性地靶向、杀伤表达该抗原的肿瘤细胞。
由于CAR-T分子是通过抗原-抗体结合的方式来识别抗原，有别于天然T细胞以TCR(T cell receptor)识别肿瘤细胞的MHC I-肽段复合物。因此，CAR-T细胞杀伤靶细胞的作用不受MHC分子的限制，从而可以克服肿瘤细胞通过下调MHC分子的机制逃脱免疫攻击，并且同一种CAR可以应用于不同的患者而无不像TCR-T技术一样有HLA限制性。此外，CAR分子可以识别细胞表面的任何类型的抗原，包括蛋白、糖类、糖脂等，这样相对于TCR只能识别MHC-肽段复合物，CAR使T细胞能识别的肿瘤表面标志物的范围大大增加。CAR-T的scFv段与肿瘤表面抗原的结合与抗原-抗体反应一样，也受抗体亲和力、抗原表位的结构、肿瘤细胞表面抗原的数量与密度、肿瘤局部环境中pH值(肿瘤细胞由于增殖迅速、缺氧，一般采用无氧糖酵解的途径产生ATP，因此肿瘤局部环境一般偏酸性，pH值约为6)、局部温度(例如肿瘤局部由于肿瘤细胞代谢增加、细胞坏死、血管增生、血液循环增加等通常出现局部发热)、离子强度(例如细胞坏死后释放的细胞内金属离子)等因素的影响。
最初设计的CAR的scFv来源于传统抗体的轻链可变区和重链可变区，两个可变区之间由一个链接区(linker)连接。这些传统抗体可来自于小鼠、兔等，其中以已上市的CD19CAR-T细胞药物为代表，其scFv来源于小鼠抗人CD19单克隆抗体(mab，克隆号FMC63)。随着CD19CAR-T在急性B淋巴细胞白血病中的瞩目成功，越来越多的研究机构设计了针对众多靶点的CAR。然而，在改造传统抗体的四聚体3D空间结构为轻链可变区-linker-重链可变区(即scFv)的线性结构，以及复杂的人源化(传统的鼠源性单克隆抗体与人源抗体的差异较大，因此免疫原性强，一般需要经过复杂的人源化序列改造、降低免疫原性才能才能提高其体内存留时间从而得以应用)后，很多scFv有可能出现亲和力下降甚至消失。因此CAR-T技术需要一种更简单有效的获得scFv的抗体形式。
1993年布鲁塞尔自由大学的Hamers-Casterman等首先报道了骆驼血液中除了传统四聚体抗体外，还存在另一种类型的抗体，与传统哺乳动物IgG抗体分子结构不同，这类抗体天然缺失传统抗体的轻链和重链恒定区1(CH1)区域，但仍具备对抗原的强结合力，被称为重链抗体(heavy-chain antibodies，HCAbs)。HCAbs的可变区仅由抗体重链的可变区组成，与传统抗体的Fab类似，该可变区可以与抗原特异性结合。重链抗体的抗原识别区片段称为VHH(variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)，研究者在此基础上开发出只含有HCAbs的VHH结构域的单域抗体(single domain antibody，sdAb)。由于VHH晶体长4nm，直径2.5nm，因此又被称为纳米抗体(nanobody，Nb)。
相比于传统抗体而言，单域抗体有如下优点：(1)分子量小，因此更易于携带靶向药物进入细胞内部或穿透血脑屏障起效。因为没有轻链的存在，VHH的大小仅12-15kDa左右，是已知的最小的抗原结合单位；(2)VHH具有更好的溶解度和稳定性(包括热稳定性、抗蛋白降解、抗强酸等方面)；(3)VHH的CDR3较长，除了增加抗体的多样性外，可使VHH结合到传统抗体结合不到的隐蔽的抗原表位；(4)与鼠源性抗体相比，HCAbs的VHH和人抗体的VH相似度高，免疫原性低，更易于人源化改造和临床转化应用。
发明内容
本发明旨在解决复发/耐药性多发性骨髓瘤患者目前临床上无有效治疗手段，应用BCMA CAR-T技术特异性杀死骨髓中的骨髓瘤细胞，从而达到治疗复发/耐药性多发性骨髓瘤患者的目的。
本发明通过筛选特异性地针对BCMA抗原的HCAbs后，将其VHH通过基因重组的方法，构建一个针对BCMA抗原的VHH-CAR，通过基因转导的方式将VHH-CAR***人T淋巴细胞的基因组，使其细胞膜表面表达特异性的针对BCMA抗原的单域抗体源性嵌合抗原受体(nanoBCMA CAR-T)，通过体外扩增CAR-T细胞后回输患者体内，达到特异性的针对表达BCMA抗原的肿瘤细胞(骨髓瘤细胞)的过继免疫细胞疗法。
一方面，本发明提供了一种BCMA单域抗体。
所述的BCMA单域抗体包括重链可变区，所述的重链可变区包括互补决定区。
所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2、CDR3。
所述的CDR1的序列选自SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1有80％以上同一性的序列；
所述的CDR2的序列选自SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2有80％以上同一性的序列；
所述的CDR3的序列选自SEQ ID NO.3，或与SEQ ID NO.3有80％以上同一性的序列。
所述的80％以上同一性的序列包括但不限于：85％以上同一性的序列、90％以上同一性的序列、95％以上同一性的序列、80％-90％同一性的序列，85％-95％同一性的序列；优选为90％以上同一性的序列；进一步优选为95％以上同一性的序列；更进一步地，为98％以上同一性的序列。
优选地，所述的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4-6中的一种或与SEQ IDNO.4-6有80％以上同一性的序列。
所述的80％以上同一性的序列包括但不限于：85％以上同一性的序列、90％以上同一性的序列、95％以上同一性的序列、80％-90％同一性的序列，85％-95％同一性的序列；优选为90％以上同一性的序列；进一步优选为95％以上同一性的序列；更进一步地，为98％以上同一性的序列。
或者，所述的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4-6中任一种的人源化序列；所述的人源化序列为SEQ ID NO.7-11种的一种；优选为SEQ ID NO.10。
另一方面，本发明提供了一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体。
所述的BCMA嵌合抗原受体的抗原识别域为前述的BCMA单域抗体中的一种或多种。
再一方面，本发明提供了一种编码基因。
所述的编码基因编码前述的BCMA单域抗体或BCMA嵌合抗原受体。
优选地，所述的编码基因的序列为SEQ ID NO.12-15中的一种或与SEQ ID NO.12-15有80％以上同一性的序列；进一步优选为SEQ ID NO.15。
所述的80％以上同一性的序列包括但不限于：85％以上同一性的序列、90％以上同一性的序列、95％以上同一性的序列、80％-90％同一性的序列，85％-95％同一性的序列；优选为90％以上同一性的序列；进一步优选为95％以上同一性的序列；更进一步地，为98％以上同一性的序列。
又一方面，本发明提供了一种病毒载体。
所述的病毒载体携带前述的编码基因。
优选地，所述的病毒为慢病毒。
进一步优选地，所述的病毒载体为BCMA嵌合抗原受体慢病毒载体。
更进一步地，所述的BCMA嵌合抗原受体慢病毒载体为pCDH-EF1a-BCMA CAR。
又一方面，本发明提供了一种抗体偶联物。
所述的抗体偶联物包括前述的BCMA单域抗体。
又一方面，本发明提供了一种CAR-T细胞。
所述的CAR-T细胞为采用前述的病毒载体转导的人T淋巴细胞。
又一方面，本发明提供了前述的BCMA单域抗体和/或BCMA嵌合抗原受体和/或编码基因和/或病毒载体和/或抗体偶联物和/或CAR-T细胞在肿瘤治疗和/或预后和/或预防的药物中的应用。
所述的肿瘤为表达BCMA的肿瘤，优选地，为表达BCMA的多发性骨髓瘤。
又一方面，本发明提供了一种肿瘤诊断试剂盒。
所述试剂盒中包括前述的BCMA单域抗体和/或BCMA嵌合抗原受体和/或编码基因和/或病毒载体和/或抗体偶联物和/或CAR-T细胞。
优选地，所述的肿瘤为多发性骨髓瘤。
又一方面，本发明提供了一种用于肿瘤治疗或预后的药物。
所述的药物中包括前述的BCMA单域抗体和/或BCMA嵌合抗原受体和/或编码基因和/或病毒载体和/或抗体偶联物和/或CAR-T细胞。
本发明的有益效果：
本发明采用了与现有技术不同的嵌合抗原受体基因组合，由BCMA单域抗体基因和2代CAR结构基因序列串联组成。
使用和已知BCMA单域抗体结构不同的氨基酸序列；使用的抗体为单域抗体，较传统抗体来源的CAR与靶细胞结合力更强、杀伤效果更好、体内持续时间更久。
附图说明
图1为VHH+CH1片段扩增的凝胶电泳结果。
图2为VHH片段扩增的凝胶电泳结果。
图3为流式细胞术检测16-B7重组抗体与高表达BCMA的重组细胞株CHO-BCMA的结合能力。
图4为16-B7重组抗体在不同的稀释倍数下与BCMA结合能力检测。
图5为流式细胞术检测重组抗体与BCMA靶蛋白结合的能力。
图6为流式细胞术检测纯化后16-B7-HM4重组抗体与BCMA靶蛋白结合的能力。
图7为16-B7及其人源化克隆16-B7-HM4的SPR亲和力检测结果。
图8为BCMA CAR慢病毒感染滴度检测结果(流式检测)。
图9为BCMA CAR慢病毒物理滴度检测结果(RT-PCR检测)。
图10流式细胞术检测BCMA CAR-T细胞膜表面BCMA CAR的表达率。
图11为RT-PCR的方法检测BCMA CAR-T细胞上CAR的平均拷贝数。
图12为流式细胞术检测重组Nalm6-BCMA-LUC细胞株的BCMA阳性率。
图13为BCMA CAR-T细胞对Nalm6-BCMA-LUC细胞的杀伤作用。
图14为BCMA CAR-T细胞IFN-γ释放量。
图15为BCMA CAR-T细胞IL2释放量。
图16为BCMA CAR-T体内功能评价中荷瘤小鼠活体成像。
图17为BCMA CAR-T体内功能评价中荷瘤小鼠体重曲线。
图18为BCMA CAR-T体内功能评价中荷瘤小鼠生存曲线。
图19为临床患者(κ轻链型MM II期)回输BCMA CAR-T后第一天检测外周血中CAR拷贝数/基因组DNA比值。
图20为临床患者(κ轻链型MM II期)治疗前尿κ轻链检测报告。
图21为临床患者(κ轻链型MM II期)治疗前血清κ轻链检测报告。
图22为临床患者(κ轻链型MM II期)治疗后血清κ轻链检测报告。
图23为临床患者(κ轻链型MM II期)治疗后尿κ轻链检测报告。
图24为临床患者(κ轻链型MM II期)治疗前后血清κ轻链和尿κ轻链检测结果对比。
需要特别说明的是，由于部分图片为仪器直出或扫描图，其中细节难以修改，但涉及数据部分均清晰可辨，不影响结果的判定。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
术语：
VHH：重链可变区。
实施例1获取BCMA单域抗体VHH基因
BCMA单域抗体文库构建：利用商业化BCMA抗原蛋白(购自ACRO BIOSYSTEMS，货号为BCA-H522y-1mg)对健康成年羊驼进行多点皮下注射免疫，共进行5次免疫，每次免疫时间间隔为14天；第三次免疫结束后，开始颈静脉采集外周血测定血清抗体效价，第五次免疫结束后检测结果如下：
Figure GDA0003607150950000071
Figure GDA0003607150950000081
第五次免疫结束后血清抗BCMA抗体效价>1：64000。
第5次免疫结束后采外周血150mL，使用淋巴细胞分离液(Axis-Shield/AlereTechnologies AS，货号：1114546)分离PBMC后，提取总RNA，再反转录成cDNA，通过两轮PCR扩增HCAbs的可变区片段VHH：第一轮PCR的上下游引物分别为针对HCAbs的VHH的FR1及CH2(恒定区2)的序列，目的片段为VHH+CH2，长度为750bp，结果见图1，凝胶电泳、胶回收后测定浓度；以第一轮PCR产物为模板，第二轮PCR上下游引物分别为HCAbs的VHH的FR1起始端和FR4末端序列，目的片段400bp，结果见图2。
将VHH片段及pCANTAB 5E载体(奥诺基因，货号：HG-VSW0284)分别进行SfiI 50℃酶切过夜、T4DNA连接酶16℃连接过夜后将VHH片段克隆至噬菌体展示载体中，然后通过电转(2500V，5ms)将连接产物电转入大肠杆菌中，立刻加入SOC培养基(Solarbio，LA2500)重悬菌体，37℃摇床培养1小时。1小时后取菌液15mL进行噬菌体拯救，另取20μL菌液，稀释后均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。第二天取出平板，计算每个连接能够产生的克隆数，计算库容，并挑取平板上的20个单克隆至含氨苄青霉素的2YT培养基(生工，货号：B540126-0500)中，37℃震荡培养约6-8小时，送菌液测序(测序通用引物M13R)，计算库的多样性。
噬菌体展示库的复苏和拯救：将电转后的大肠杆菌用2YT培养至OD600值达0.5后投入M13KO7(NEB,货号：N0315S)，摇匀后37℃静置30min后，37℃，225rpm培养1h，离心后去上清，用2YT-AK培养基(2YT加100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素))重悬、继续过夜培养后，将菌液用PEG6000/NaCl溶液浓缩，得到噬菌体原始库。
噬菌体库的淘选：使用Streptavidin magnetic beads(Thermo ScientificTM，货号88816)与biotin化的BCMA目标抗原孵育后，再与待淘选的噬菌体库进行孵育，洗去非特异性结合的噬菌体，使用TEA将结合在目标抗原上的重组噬菌体洗脱下来，并进行扩增；经4轮淘选后，挑选阳性单克隆进行Sanger测序，获得VHH抗体序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：QARFVESGGGLVQSGGSLVLSCTVSDVTLDDYVTAWFRQAPGKEREGVSCISKRNFTSYVDSVKGRFTTSRDITKNTVLLQMNALTPEDTGVYYCATPILPSLAFGEVCSLQTEFRSWGPGTRVTVSS(SEQ ID NO.4，下划线部分为CDR区)；
其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.12。
将SEQ ID NO.12进行基因合成，克隆至表达载体pcDNA3.1-hIgG1-Fc2(上海禾午生物，货号：P8203)中。重组表达载体pcDNA3.4-16-B7-hIgG1-Fc2经测序验证无误后，大提质粒得抗体表达载体。
重组抗体的表达验证：从-80度冰箱中取出LVTransm转染试剂(爱康得生物，货号：LVTran100)及抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出4℃存放的PBS缓冲液，复温至室温。取500μL PBS至24孔板的一个孔，加入4μg pcDNA3.4-16-B7-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入12μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
将上述DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293T细胞(ATCC,货号：CRL-3216TM)中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6-8小时后，加入1.5mL新鲜的FreeStyleTM293Expression Medium培养基(GibcoTM，货号：12338018)，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，取滤液进行流式检测。
使用流式细胞术检测16-B7重组抗体与高表达BCMA的重组细胞株CHO-BCMA的结合能力：将空白对照细胞CHO和CHO-BCMA细胞各分为若干份，每份细胞的数量为5.0E+05个细胞；将总蛋白浓度为1μg/mL的16-B7重组抗体分别与靶细胞和对照细胞混匀后，4度孵育1小时；PBS洗涤细胞3次后加入100μL PBS重悬细胞后加入1μL PE Anti-human IgG Fc(BioLegend，货号：409304)，充分混匀后，4℃避光孵育30分钟；PBS洗涤细胞3次后上机检测，结果见图3，结果显示16-B7重组抗体可与BCMA结合。
将获得的重组抗体进行蛋白纯化后，测定重组抗体浓度。将空白对照细胞CHO和CHO-BCMA细胞各分为若干份，每份细胞的数量为5.0E+05个细胞；将浓度为10、2、0.4、0.08μg/mL的16-B7纯化重组抗体分别与靶细胞和对照细胞混匀后，4℃孵育1小时；PBS洗涤细胞3次后加入100μL PBS重悬细胞后加入1μL PE Anti-human IgG，充分混匀后，4℃避光孵育30分钟；PBS洗涤细胞3次后上机检测，结果见图4：图4显示16-B7重组抗体在不同的稀释倍数均可与BCMA结合，在抗体浓度为2μg/mL时已达到饱和。
根据筛选的单域抗体16-B7序列，采用CDR Grafting的方案进行人源化设计。人源化抗体序列如下：
16-B7-HM1 SEQ ID NO.7
16-B7-HM2 SEQ ID NO.8
16-B7-HM3 SEQ ID NO.9
16-B7-HM4 SEQ ID NO.10
16-B7-HM5 SEQ ID NO.11
将SEQ.ID NO.7-11对应的基因合成后按16-B7重组抗体的制备步骤，进行抗体表达后用流式细胞术检测与BCMA靶蛋白结合的能力，结果见图5。结果显示，16-B7-HM4人源化重组抗体与过表达BCMA细胞株的结合能力与原始序列16-B7相当。为进一步确定人源化候选抗体与原始抗体的差异，将16-B7-HM4及16-B7重组抗体参照前述方法进行纯化后进行流式检测，结果见图6。结果显示，在不同抗体浓度下，人源化重组抗体16-B7-HM4与原始序列重组抗体16-B7与靶蛋白的结合能力相当。
重组抗体的亲和力检测：
将目标抗原BCMA(ACRO BIOSYSTEMS，货号为BCA-H522y-1mg)用10mM Acetate缓冲液固定在芯片上，以上述制备的重组抗体作为流动相，检测人源化前后抗体与靶蛋白BCMA的结合能力。实验结果表明，重组抗体亲和力在nM级别，其中16-B7的亲和力为3.729×10- 9M；16-B7-HM4亲和力为1.060×10-9M。(图7)。
实施例2嵌合抗原受体基因载体构建
由华大基因公司合成以下VHH序列基因：
Figure GDA0003607150950000101
Figure GDA0003607150950000111
另外合成一段设计的2代CAR结构基因，包括CD8a铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域+CD3ζ胞内信号传导结构域，编码包含这些结构域的2代CAR结构基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.17。
分别得到两段合成基因后，进行BCMA CAR的载体构建，首先通过PCR扩增片段、EcoRI、BamHI双酶切、T4ligase酶连得到：
SEQ ID NO.18(B7CAR)、SEQ ID NO.19(16-B7HM4CAR)、SEQ ID NO.20(BB2121CAR)。
将慢病毒载体pCDH-EF1a(addgene,货号：#170446)和SEQ ID NO.18-20，分别进行EcoRI,BamHI(NEB,货号：R0101S，R3136S)双酶切、T4DNA 连接酶连接后，转化Stbl3感受态细胞(博迈德，货号：BC108-01；步骤：Stbl3感受态存从-80℃冰箱中取出，冰上融化；取连接产物1μL于有感受态的离心管中，轻轻旋转微量离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30分钟；然后于42℃水浴锅中热激90s后迅速置于冰上5min。向微量离心管中加入1mL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm，摇床振荡培养60分钟后，取100μL菌液加至入氨苄抗性LB固体平板表面，用一次性涂布棒均匀涂开。在超净台中静置5分钟等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养18-20小时)、挑单克隆，菌液测序无误后，大提质粒，得到序列正确的慢病毒载体pCDH-EF1a-BCMA-16-B7、pCDH-EF1a-BCMA-16-B7-HM4及pCDH-EF1a-BCMA-BB2121。
实施例3 BCMA CAR慢病毒制备
慢病毒包装质粒混合物(包括PSPAX2(丰晖生物，货号：BR036)和VSVG(丰晖生物，货号：FH1657)按摩尔比1:1混匀)分别与pCDH-EF1a-BCMA-16-B7或pCDH-EF1a-BCMA-16-B7-HM4或pCDH-EF1a-BCMA-BB2121，按1：2的比例混合后，加入助转染试剂，室温下孵育15分钟。然后将转染混合物逐滴加入293T细胞(ATCC，货号：CRL-3216TM)。1-3天后收集培养基上清得到慢病毒粗液。在4℃下500g离心10min后收集上清液。然后超高速离心(82,700g，4℃离心3小时)以进行慢病毒浓缩。在超离心结束后，小心弃去上清液，并用预冷的DPBS(GibcoTM,货号：14190144)小心重悬慢病毒颗粒，得到慢病毒颗粒：LV-16-B7、LV-16-B7-HM4、LV-BB2121。将慢病毒分装后储存在-80℃下。基于RT-PCR方法和流式细胞术测定慢病毒的物理滴度和感染滴度。结果见图8-9。
实施例4 BCMA CAR-T细胞的制备
PBMC制备：
将静脉血30mL在800g，20℃离心30分钟，离心结束后，将上层血浆转移入另外一个离心管。在50mL离心管中加入15mL人淋巴细胞分离液(天津灏洋，产品编号：HY2015，企业内控号：LTS1077006)，用电动移液枪将离心后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液上方，250g，20℃，离心10分钟。弃掉上层液体，用10mL PBS重悬计数，用于T细胞纯化。
T细胞纯化：
根据以下所述的制造商的方案，使用Miltenyi Pan T细胞分离试剂盒(目录号130-096-535)从PBMC纯化人T细胞。PBMC计数后，300g、20℃，离心10分钟。倒掉上清液，将细胞沉淀按每107个/40μL缓冲液重悬于缓冲液中后，加入10μL/107Pan T细胞生物素-抗体混合物，充分混匀后4℃孵育5分钟。然后加入30μL缓冲液，和20μL Pan T细胞微珠粒混合物。充分混匀后在4℃孵育10分钟。孵育结束后用1mL缓冲液，洗涤PBMC，250g、4℃离心10分钟。离心后细胞用500μL的缓冲液重悬，通过LS柱，细胞悬液随重力流出，收集流出物(即T细胞组分)，继续通过缓冲剂洗涤LS柱并收集流出液。然后离心富集T细胞并重悬于淋巴细胞培养基+1000IU/mL IL-2中，按2×106个/孔的密度接种于6孔板中的4个孔。
CAR-T制备：
根据美天旎的方案用人T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi#130-091-441)预活化所制备的T细胞24-96小时后，进行慢病毒感染。
在活化后的T细胞悬液(六孔板中的3个孔)中加入10μg/mL聚凝胺后，按MOI＝10每孔分别加入慢病毒LV-16-B7、LV-16-B7-HM4或LV-BB2121，另外一孔T细胞不予处理作为空白对照细胞；加入病毒后将六孔板1200g、32℃离心1小时。离心结束后将六孔板放入细胞培养箱，每天补加适量T细胞培养基。
感染7天后，将BCMA Fc蛋白与BCMA CAR-T孵育后，用流式细胞仪检测T细胞膜表面CAR的表达率。检测结果见图10。图10的结果显示，实施例4制备的BCMA CAR-T细胞中CAR表达效率在32-53％。同时将1×106个BCMA CAR-T细胞提取DNA后用RT-PCR的方法检测BCMACAR-T细胞上CAR的拷贝数，结果见图11，图11的结果显示，实施例4制备的BCMA CAR-T细胞中，每个BCMA CAR-T细胞上均带1.8-3.8个CAR分子。
实施例5 BCMA CAR-T细胞功能评价
1)体外功能评价
重组Nalm6-BCMA-LUC细胞株流式细胞术检测BCMA阳性率，结果见图12。结果显示，BCMA分子在Nalm6-BCMA-LUC重组细胞株中高效表达，在Nalm6细胞中不表达，可分别作为CAR-T杀伤实验的靶细胞和对照细胞。
按照效靶比10:1、5:1、2.5:1、1.25:1设置四个梯度，将实施例4制备的16-B7BCMACAR-T细胞、16-B7-HM4BCMA CAR-T细胞、BB2121BCMA CAR-T细胞、T空白对照细胞分别和Nalm6-BCMA-LUC或Nalm6细胞共培养20小时后，使用发光荧光素酶测定试剂盒(Promega#E6110)，检测孔中的剩余荧光素酶活性。用下列公式计算特异性细胞毒性：特异性细胞毒性％＝100％×(1-(RLU样品-RLU最小)/(RLU最大-RLU最小))。同时，取上清用IFN-γELISA试剂盒(达科为)检测IFN-γ，结果见图13-15，其中对Nalm6-BCMA-LUC细胞的杀伤作用参见图13；IL2、IFN-γ释放见图14-15。结果说明，实施例4制备的BCMA CAR-T细胞可以特异高效地杀伤BCMA阳性的细胞。图13-15中，*表示P<0.05，与CTRL T相比。
2)体内功能评价
通过小鼠尾静脉输注肿瘤细胞Nalm6-BCMA-Luciferase细胞2×106个/200μL，建立小鼠肿瘤模型，小鼠尾静脉接种肿瘤5天后，第一次活体成像，并记录为第0天；将小鼠随机分为2组，通过尾静脉分别输注16-B7-HM4BCMA CAR-T或者T细胞(备注：由于动物实验是为临床研究做准备，因此动物实验中仅验证人源化BCMA CART(16-B7-HM4)的体内药效，未做原始序列BCMA CART(16-B7)的体内药效)；D14天及D21天，分别进行活体成像，监测小鼠体内肿瘤细胞的增殖情况。结果显示，D14天成像时，处理组小鼠体内的肿瘤基本完全被CAR-T细胞清除，而对照组的小鼠体内肿瘤负荷不断提高；D21天，对照小鼠仅存活一只小鼠，CAR-T处理组小鼠持续存活，且体内无肿瘤细胞(图16)。
输注对照T细胞的小鼠从第13天开始体重显著下降，而输注CAR-T细胞的小鼠体重基本维持，表明CAR-T细胞抑制了小鼠体内的肿瘤细胞增殖(图17)。小鼠生存分析显示对照组小鼠从建模后第23天全部死亡，而CAR-T处理组小鼠状态正常，进行持续观察至30+天，人源化BCMA CAR-T注射小鼠仍全部存活，表明单域抗体序列BCMA CAR-T能有效清除荷瘤小鼠体内肿瘤细胞(图18)。
实施例6临床研究数据
本实施例选用按实施例4制备的临床级别BCMA CAR-T细胞进行临床研究。
患者为广东医科大学附属医院患者，本研究经患者同意，患者病情：多次检测血、尿κ轻链明显升高，诊断为多发性骨髓瘤、κ轻链型(IIA期)。
患者于2021年03-08月化疗无效，遂于2021年09月进入BCMA CAR-T临床研究治疗组ID方案化疗(伊沙佐米4mg d1、8、15+***40mg d1、8、15、21)；，2021年09月06日予(氟达拉滨50mg d1-3+环磷酰胺1470mg)预处理，2021年09月11日回输BCMA CAR-T细胞30mL(CAR-T细胞总数：2×108cells，CAR阳性率30％，CAR+T总数6×107cells)，治疗过程顺利，患者未出现发热等反应。
回输前检测结果：免疫球蛋白：IgG 5.49g/L，IgA0.364g/L，IgM 0.511g/L，IgE9.87IU/mL；血β2-MG 2.37mg/L，尿蛋白定量(24h尿量1500mL)：M-TP 2156.6mg/24h尿；检验外送-尿免疫固定电泳：SP阳性(+)，κ轻链阳性(+)；检验外送-血清游离轻链组合：游离 Kappa轻链1134.986mg/L，游离Kappa/游离lambda 148.3477Ratio，游离lambda轻链7.65mg/L；尿游离Kappa轻链15800mg/L；检验外送-尿蛋白电泳：M蛋白含量，尿，计算法856.54mg/24h，γ球蛋白，尿，琼脂糖凝胶电泳法99.1％，24小时尿量1000.0mL/24h。
治疗后检测结果：回输后第一天外周血中CAR拷贝数/基因组DNA比值见图19。骨髓检查系列(血液研究室)：结合病史，MM治疗后红系比例增高骨髓象2021年9月28日检测患者血清游离Kappa轻链118.71mg/L；尿游离Kappa轻链705.00mg/L。2021年10月检测患者；尿游离Kappa轻链322.5mg/L。之后患者完成自体造血干细胞移植，目前情况良好，定期复查。患者血清、尿Kappa轻链检测报告单见图20-23，治疗前后Kappa轻链的动态变化见图24。
序列表
<110> 东莞清实生物科技有限公司
<120> 一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Val Thr Leu Asp Asp Tyr Val
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Lys Arg Asn Phe Thr
1 5
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Thr Pro Ile Leu Pro Ser Leu Ala Phe Gly Glu Val Cys Ser Leu
1 5 10 15
Gln Thr Glu Phe Arg Ser
20
<210> 4
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ala Arg Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Val Leu Ser Cys Thr Val Ser Asp Val Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Val Thr Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Lys Arg Asn Phe Thr Ser Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Ile Thr Lys Asn Thr Val Leu Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ala Leu Thr Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Pro Ile Leu Pro Ser Leu Ala Phe Gly Glu Val Cys Ser Leu Gln
100 105 110
Thr Glu Phe Arg Ser Trp Gly Pro Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ala Arg Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Val Leu Ser Cys Thr Val Ser Asp Val Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Val Thr Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Lys Arg Asn Phe Thr Ser Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Ala Thr Thr Ser Arg Asp Ile Thr Lys Asn Thr Val Leu Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ala Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Pro Ile Leu Pro Ser Leu Ala Phe Gly Glu Val Cys Ser Leu Gln
100 105 110
Thr Glu Phe Arg Ser Trp Gly Pro Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 6
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Ala Arg Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Val Leu Ser Cys Thr Val Ser Asp Val Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Val Thr Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Lys Arg Asn Phe Thr Ser Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Ile Thr Lys Asn Thr Val Leu Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Leu Thr Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Thr
85 90 95
Pro Ile Leu Pro Ser Leu Ala Phe Gly Glu Val Cys Ser Leu Gln Thr
100 105 110
Glu Phe Arg Ser Trp Gly Pro Gly Thr Arg Val Thr Val Ala Ser Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Ala Gln Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Asp Val Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Val Thr Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Lys Arg Asn Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Pro Ile Leu Pro Ser Leu Ala Phe Gly Glu Val Cys Ser Leu Gln
100 105 110
Thr Glu Phe Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Ala Gln Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Val Ser Asp Val Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Val Thr Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Lys Arg Asn Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Pro Ile Leu Pro Ser Leu Ala Phe Gly Glu Val Cys Ser Leu Gln
100 105 110
Thr Glu Phe Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Ala Gln Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Asp Val Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Val Thr Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Lys Arg Asn Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Pro Ile Leu Pro Ser Leu Ala Phe Gly Glu Val Cys Ser Leu Gln
100 105 110
Thr Glu Phe Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Ala Arg Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Asp Val Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Val Thr Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Lys Arg Asn Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Ile Thr Lys Asn Thr Val Leu Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Pro Ile Leu Pro Ser Leu Ala Phe Gly Glu Val Cys Ser Leu Gln
100 105 110
Thr Glu Phe Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Asp Val Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Val Thr Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Lys Arg Asn Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Ile Thr Lys Asn Thr Val Leu Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Pro Ile Leu Pro Ser Leu Ala Phe Gly Glu Val Cys Ser Leu Gln
100 105 110
Thr Glu Phe Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggcgcgtt tcgtggagtc cgggggagga ttggtgcagt ctgggggatc tcttgtactc 60
tcctgtacag tttctgacgt cactttggat gattatgtca cagcgtggtt ccggcaggcc 120
ccagggaagg agcgtgaggg ggtctcctgt attagtaaga ggaatttcac gtcgtatgtg 180
gactccgtga agggccgatt caccacctcc agggacatca ctaagaatac ggtgcttcta 240
cagatgaacg ctctaacacc tgaggataca ggcgtttatt actgtgcgac gccgatttta 300
ccttcacttg cgttcggtga agtgtgctcc ctacagaccg agtttcgttc ctggggcccg 360
gggacccggg tcaccgtctc ctca 384
<210> 13
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caggcggcac gtttcgtgga gtccggggga ggattggtgc agtctggggg atctcttgta 60
ctctcctgta cagtttctga cgtcactttg gatgattatg tcacagcgtg gttccggcag 120
gccccaggga aggagcgtga gggggtctcc tgtattagta agaggaattt cacgtcgtat 180
gtggactccg tgaagggccg attcaccacc tccagggaca tcactaagaa tacggtgctt 240
ctacagatga acgctctaac acctgaggat acaggcgttt attactgtgc gacgccgatt 300
ttaccttcac ttgcgttcgg tgaagtgtgc tccctacaga ccgagtttcg ttcctggggc 360
ccggggaccc gggtcaccgc ggtctcctca 390
<210> 14
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caggcgcgtt tcgtggagtc cgggggagga ttggtgcagt ctgggggatc tcttgtactc 60
tcctgtacag tttctgacgt cactttggat gattatgtca cagcgtggtt ccggcaggcc 120
ccagggaagg agcgtgaggg ggtctcctgt attagtaaga ggaatttcac gtcgtatgtg 180
gactccgtga agggccgatt caccacctcc agggacatca ctaagaatac ggtgcttcta 240
cagatgaacg ctctaacacc tgaggataca ggcgtttatt actgtgcgac gccgatttta 300
ccttcacttg cgttcggtga agtgtgctcc ctacagaccg agtttcgttc ctggggcccg 360
gggacccggg tcaccgtctc ctca 384
<210> 15
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caggccagat tcgtggaatc tggcggagga ctggtgaagc ccggcggcag cctcagactg 60
agctgcaccg tgtccgacgt gacactggac gactatgtga ccgcctggtt ccggcaggct 120
cctggcaagg gccgggaagg cgtgtcttgt atcagcaagc ggaacttcac aagctacgcc 180
gatagcgtga aaggcagatt taccaccagc agagatatca ccaagaatac cgtgctgctg 240
cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gctgtgtact actgcgccac accaatcctg 300
ccttctctgg ccttcggcga ggtgtgcagc ctgcaaacag agttcagaag ctggggacag 360
ggcaccaccg tcacagtttc cagc 384
<210> 16
<211> 815
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccaccatgg cactccccgt caccgccctt ctcttgcccc tcgccctgct gctgcatgct 60
gccaggcccg acattgtgct cactcagtca cctcccagcc tggccatgag cctgggaaaa 120
agggccacca tctcctgtag agccagtgag tccgtcacaa tcttggggag ccatcttatt 180
cactggtatc agcagaagcc cgggcagcct ccaacccttc ttattcagct cgcgtcaaac 240
gtccagacgg gtgtacctgc cagattttct ggtagcgggt cccgcactga ttttacactg 300
accatagatc cagtggaaga agacgatgtg gccgtgtatt attgtctgca gagcagaacg 360
attcctcgca catttggtgg gggtactaag ctggagatta agggaagcac gtccggctca 420
gggaagccgg gctccggcga gggaagcacg aaggggcaaa ttcagctggt ccagagcgga 480
cctgagctga aaaaacccgg cgagactgtt aagatcagtt gtaaagcatc tggctatacc 540
ttcaccgact acagcataaa ttgggtgaaa cgggcccctg gaaagggcct caaatggatg 600
ggttggatca ataccgaaac tagggagcct gcttatgcat atgacttccg cgggagattc 660
gccttttcac tcgagacatc tgcctctact gcttacctcc aaataaacaa cctcaagtat 720
gaagatacag ccacttactt ttgcgccctc gactatagtt acgccatgga ctactgggga 780
cagggaacct ccgttaccgt cagttccgcg gccgc 815
<210> 17
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaagcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 180
ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt 240
aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg 300
ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat 360
gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga 420
gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg 480
cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa 540
gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg 600
taccagggac tcagcaccgc caccaaggac acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg 660
ccgcctcgg 669
<210> 18
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caggcgcgtt tcgtggagtc cgggggagga ttggtgcagt ctgggggatc tcttgtactc 60
tcctgtacag tttctgacgt cactttggat gattatgtca cagcgtggtt ccggcaggcc 120
ccagggaagg agcgtgaggg ggtctcctgt attagtaaga ggaatttcac gtcgtatgtg 180
gactccgtga agggccgatt caccacctcc agggacatca ctaagaatac ggtgcttcta 240
cagatgaacg ctctaacacc tgaggataca ggcgtttatt actgtgcgac gccgatttta 300
ccttcacttg cgttcggtga agtgtgctcc ctacagaccg agtttcgttc ctggggcccg 360
gggacccggg tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 420
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagaag cgtgccggcc agcggcgggg 480
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatttg ggcccctctg 540
gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt 600
cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa 660
gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc 720
gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctacaagc aggggcagaa ccagctctac 780
aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg 840
gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag 900
ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga 960
agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat 1020
gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg 1053
<210> 19
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caggccagat tcgtggaatc tggcggagga ctggtgaagc ccggcggcag cctcagactg 60
agctgcaccg tgtccgacgt gacactggac gactatgtga ccgcctggtt ccggcaggct 120
cctggcaagg gccgggaagg cgtgtcttgt atcagcaagc ggaacttcac aagctacgcc 180
gatagcgtga aaggcagatt taccaccagc agagatatca ccaagaatac cgtgctgctg 240
cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gctgtgtact actgcgccac accaatcctg 300
ccttctctgg ccttcggcga ggtgtgcagc ctgcaaacag agttcagaag ctggggacag 360
ggcaccaccg tcacagtttc cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 420
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagaag cgtgccggcc agcggcgggg 480
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatttg ggcccctctg 540
gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt 600
cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa 660
gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc 720
gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctacaagc aggggcagaa ccagctctac 780
aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg 840
gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag 900
ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga 960
agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat 1020
gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg 1053
<210> 20
<211> 1484
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gccaccatgg cactccccgt caccgccctt ctcttgcccc tcgccctgct gctgcatgct 60
gccaggcccg acattgtgct cactcagtca cctcccagcc tggccatgag cctgggaaaa 120
agggccacca tctcctgtag agccagtgag tccgtcacaa tcttggggag ccatcttatt 180
cactggtatc agcagaagcc cgggcagcct ccaacccttc ttattcagct cgcgtcaaac 240
gtccagacgg gtgtacctgc cagattttct ggtagcgggt cccgcactga ttttacactg 300
accatagatc cagtggaaga agacgatgtg gccgtgtatt attgtctgca gagcagaacg 360
attcctcgca catttggtgg gggtactaag ctggagatta agggaagcac gtccggctca 420
gggaagccgg gctccggcga gggaagcacg aaggggcaaa ttcagctggt ccagagcgga 480
cctgagctga aaaaacccgg cgagactgtt aagatcagtt gtaaagcatc tggctatacc 540
ttcaccgact acagcataaa ttgggtgaaa cgggcccctg gaaagggcct caaatggatg 600
ggttggatca ataccgaaac tagggagcct gcttatgcat atgacttccg cgggagattc 660
gccttttcac tcgagacatc tgcctctact gcttacctcc aaataaacaa cctcaagtat 720
gaagatacag ccacttactt ttgcgccctc gactatagtt acgccatgga ctactgggga 780
cagggaacct ccgttaccgt cagttccgcg gccgcaccac gacgccagcg ccgcgaccac 840
caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagaa gcgtgccggc 900
cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacattt 960
gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc actctttact 1020
gtaagcgcgg tcggaagaag ctgctgtaca tctttaagca acccttcatg aggcctgtgc 1080
agactactca agaggaggac ggctgttcat gccggttccc agaggaggag gaaggcggct 1140
gcgaactgcg cgtgaaattc agccgcagcg cagatgctcc agcctacaag caggggcaga 1200
accagctcta caacgaactc aatcttggtc ggagagagga gtacgacgtg ctggacaagc 1260
ggagaggacg ggacccagaa atgggcggga agccgcgcag aaagaatccc caagagggcc 1320
tgtacaacga gctccaaaag gataagatgg cagaagccta tagcgagatt ggtatgaaag 1380
gggaacgcag aagaggcaaa ggccacgacg gactgtacca gggactcagc accgccacca 1440
aggacaccta tgacgctctt cacatgcagg ccctgccgcc tcgg 1484

Claims (13)

1.一种BCMA单域抗体，其特征在于，所述的BCMA单域抗体包括重链可变区，所述的重链可变区包括互补决定区；所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2、CDR3；所述的CDR1的序列为SEQ ID NO.1；所述的CDR2的序列为SEQ ID NO.2；所述的CDR3的序列为SEQID NO.3。
2.根据权利要求1所述的BCMA单域抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.4-6中的一种。
3.根据权利要求2所述的BCMA单域抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.4-6中任一种的人源化序列；所述的人源化序列为SEQ ID NO.7-11中的一种。
4.一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体，其特征在于，所述的BCMA嵌合抗原受体的抗原识别域为权利要求1-3任一项所述的BCMA单域抗体中的一种或多种。
5.一种编码基因，其特征在于，所述的编码基因编码权利要求1-3任一项所述的BCMA单域抗体或权利要求4所述的BCMA嵌合抗原受体。
6.根据权利要求5所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的序列包括SEQ IDNO.12-15中的一种。
7.一种病毒载体，其特征在于，所述的病毒载体携带权利要求5或6所述的编码基因。
8.根据权利要求7所述的病毒载体，其特征在于，所述的病毒载体为BCMA嵌合抗原受体慢病毒载体；所述的BCMA嵌合抗原受体慢病毒载体为pCDH-EF1a-BCMA CAR病毒载体。
9.一种抗体偶联物，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的BCMA单域抗体。
10.一种CAR-T细胞，其特征在于，采用权利要求7或8所述的病毒载体转导人T淋巴细胞制备。
11.权利要求1-3中任一项所述的BCMA单域抗体和/或权利要求4所述的BCMA嵌合抗原受体和/或权利要求5或6所述的编码基因和/或权利要求7或8所述的病毒载体和/或权利要求9所述的抗体偶联物和/或权利要求10所述的CAR-T细胞在制备***的药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为表达BCMA的多发性骨髓瘤。
12.一种肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1-3中任一项所述的BCMA单域抗体和/或权利要求4所述的BCMA嵌合抗原受体和/或权利要求5或6的编码基因和/或权利要求7或8所述的病毒载体和/或权利要求9所述的抗体偶联物和/或权利要求10所述的CAR-T细胞。
13.一种用于肿瘤治疗和/或预后和/或预防的药物，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的BCMA单域抗体和/或权利要求4所述的BCMA嵌合抗原受体和/或权利要求5或6的编码基因和/或权利要求7或8所述的病毒载体和/或权利要求9所述的抗体偶联物和/或权利要求10所述的CAR-T细胞。
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