CN114195872B - Fot1基因在水稻花时改良育种中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明“FOT1基因在水稻花时改良育种中的应用”，涉及生物育种技术，其特征在于，对目的水稻材料进行基因编辑，使位于第8染色体上3365730–3373434bp区域编码MYB类转录因子的FOT1基因的CDS发生碱基缺失、***或碱基替换，导致相应编码蛋白发生突变，以获得FOT1突变体材料；所述FOT1基因的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，所述FOT1基因的CDS的核苷酸序列如Seq ID No.4所示，本发明并利用CRISPR/Cas9敲除和RNAi技术，验证了FOT1基因的功能，证明其可应用于选择和培育早花时水稻品种。

Description

FOT1基因在水稻花时改良育种中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是FOT1基因在水稻花时改良育种中的应用。
背景技术
水稻花时(Flower Opening Time,FOT)是指水稻抽穗后一天中颖花开放的时间，通常以开颖高峰的时间表示(Hirabayashi et al.,2015)。水稻花药开裂、散粉、受精等关键生殖进程都在颖花开放后完成。花时作为一重要农艺性状，与杂交稻制种产量息息相关。杂交水稻制种产量的高低是能否大面积推广的关键因素之一。但是，在制种过程中，由于不育系与恢复系的花时习性差异导致的花时不同步，严重影响了不育系的异交结实率和制种产量。研究表明，花时不遇问题限制了许多优良水稻种质资源的利用和推广。
虽然已经有一些人工调节措施来缓解不育系花时较迟的问题，如喷施茉莉酸甲酯，赶露水等(周钧,1995；曾晓春等,1999；张旺等,2000；蒋海燕等,2008；周恒多等,2009；周钧等,2016；Liu et al.,2017)，但是均具有一定局限性，需要消耗较多的财力和人力，远远不能满足杂交水稻种子生产的需求。
前人的研究表明，水稻花时是一个非常复杂的数量性状，在不同遗传背景中可能受到不同主效基因的控制以及基因互作的影响。我国研究者们已检测到多个相关QTLs，分布在1、5、7、8、10和12染色体上(万国,2013；白刚,2010；马作斌等,2011)。日本的研究者们从具有早花时特性的野生稻资源中，定位到多个花时相关的QTLs(Sheehy et al.,2005；Nakagawa et al.,2007)。Thanh等利用Oryza rufipogon定位到3个QTLs，分布在4、5和10染色体(Thanh et al.,2010)；Hirabayashi等利用Oryza officinalis定位到3个QTLs，分布在3、6和8染色体，并进一步将第3染色体的qEMF3导入到南京11中，使南京11近等基因系花时提早约1.5小时(Hirabayashi et al.,2015)。至今为止，仍未有水稻花时调控基因被克隆的报道，暗示了研究水稻花时分子机制的困难程度。对于这种复杂数量性状基因的鉴定和克隆，无论是群体的构建，还是表型的鉴定，难度都非常大，往往需要多年的回交和群体构建，以达到纯化遗传背景的目的，耗时较长，效率较低。
创制和发掘具有早花时特性的水稻材料，克隆相关花时基因，通过分子标记辅助选择或CRISPR/Cas9基因编辑技术将早花时基因导入到生产中广为应用的不育系中，有望从根本上快速解决花时不遇的问题。
发明内容
基于上述领域的需求，本发明的目的在于发掘水稻花时调节基因及该类基因在培育花时改变的水稻品种中的用途，具体请求保护以下技术方案：
一种对水稻材料进行花时改良的方法，其特征在于，对目的水稻材料进行基因编辑，使位于第8染色体上3365730–3373434bp区域编码MYB类转录因子的FOT1基因的CDS发生碱基缺失或***或碱基替换，导致相应编码蛋白发生突变，以获得FOT1突变体材料；所述FOT1基因的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，所述FOT1基因的CDS的核苷酸序列如Seq IDNo.4所示。
所述的方法，其特征在于，所述基因编辑是指向目的水稻材料转入可编辑/敲除所述FOT1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。
所述的方法，其特征在于，其中所述CRISPR/Cas9基因编辑载体是通过将设计的如Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的包括PAM序列的gRNA靶点序列制备成Oligo二聚体；将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas载体BGK032而得。
任一上述方法，其特征在于，还包括对基因编辑成功的阳性材料进行自交、分离筛选出改良的早花时纯合突变体。
本发明的另一方面，提供一种CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，是通过将设计的如Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的包括PAM序列的gRNA靶点序列制备成Oligo二聚体；将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas载体BGK032而得，其包含的基因片段从上游到下游依次排列如下：U6-gRNAFOT1-UBI-CAS9.
本发明的另一方面，一种分离的FOT1基因特异性片段，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.9所示。基于此，提供一种RNA干扰载体，其特征在于，是将Seq ID No.9所示的FOT1基因特异性片段作为干涉片段，并通过双酶切的方法使干涉片段以正向和反向序列连接在中间载体上构成的目的片段，然后连接到骨架载体上获得。所述的RNA干扰载体，所述中间载体是pUCCRNAi；所述骨架载体是pCAMBIA2300-actin1。
本发明进一步提供一种抑制或下调目的水稻材料中FOT1基因以改变水稻花时的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)向水稻材料之后转入权利要求5所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体，或权利要求8或9所述的RNA干扰载体，获得阳性转化细胞；
(b)培养(a)所得的阳性转化细胞，将其再生成水稻植株。
本发明RNAi验证了FOT1基因表达量与水稻花时之间的关系，被干扰导致FOT1基因表达量降低的材料中，大部分花时相应变早，因此，在选择早花时育种材料过程中，可以通过检测和比较FOT1基因表达水平选择早花时候选材料。基于此，本发明的再一方面提供一种筛选早花时水稻材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对待测水稻材料提取RNA，反转录得到cDNA；
(2)检测待测材料中FOT1基因的表达水平；与对照品种，如果显著低于对照品种，则待测材料可能是比对照品种花时更早的候选材料；所述FOT1基因的核苷酸序列如Seq IDNo.3所示，所述FOT1基因的CDS的核苷酸序列如Seq ID No.4所示。
优选地，所述检测待测材料中FOT1基因的表达水平，采用荧光定量PCR；
优选地，所述荧光定量PCR的上、下游引物的核苷酸序列分别如Seq ID No.10和Seq ID No.11所示。
申请人在之前的研究中，通过化学诱变处理获得一个突变体库，并筛选到一个水稻早花时突变体fot1。本发明以fot1为研究材料，采用MutMap方法克隆到了一个编码MYB类转录因子的候选基因FOT1，位于第8染色体3365730–3373434bp，并利用CRISPR/Cas9敲除(粳稻品种日本晴)和RNAi技术，验证了所克隆基因的功能，证明其可应用于选择水稻早花时育种候选材料，以及培育早花时水稻品种。
附图说明
图1.日本晴(WT)和fot1突变体的花时比较，其中A.fot1早花时表型。B.fot1花时统计；
图2.SNP指数在12条染色体上的分布情况；
图3.FOT1基因结构、突变位点及CRISPR/Cas9敲除位点，其中A.CRISPR/Cas9敲除靶点。B.FOT1基因结构。C.fot1突变位点；
图4.FOT1敲除株系的花时表型，其中WT：野生型日本晴。MT：FOT1敲除株系；
图5.CRISPR/Cas9基因编辑载体结构示意图；
图6.RNAi载体结构示意图；
图7.RNAi干涉阳性植株基因表达量检测结果，WT表示日本晴，1，2，3，表示三株经RNAi干涉花时变早的阳性植株；
图8.宜香1B、敲除宜香1B和雅恢2115的花时调查统计，其中A.WT：野生型宜香1B；MT：敲除宜香1B；B.花时调查统计表；
具体实施方式
以下通过具体实施方式和附图对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。下列实施例中，如无特殊说明，所用实验方法均匀本领域常规方法，所采用常规可商购试剂。
实施例1.FOT1基因的发现
实验材料来源:
发明人在之前的研究中，通过甲基磺酸乙酯(EMS，Ethyl Methane Sulfonate)化学诱变水稻品种日本晴处理获得一个突变体库，在其中筛选到一个水稻早花时突变体，命名为fot1。多年田间调查结果表明，fot1产量性状并无显著变化，暗示了FOT1在育种改良中的应用潜力。
突变材料“水稻早花时突变体fot1”保存于申请人实验室，申请人同意在申请日起二十年内年可以向公众提供用于验证实验。
fot1花时调查统计
2017年8月在四川成都调查的统计结果表明，fot1突变体从10:20开始开颖，而日本晴从11:20才开始开颖，说明fot1的花时比对照日本晴提早了约1小时(图1)，后续3年(2018-2020)的统计结果整体趋势与2017年表现一致。
实施例2.fot1突变性状的遗传分析及MutMap克隆
2.1 fot1突变性状的遗传分析
对(fot1/NIP)杂交的F1、F2代植株的花时进行统计分析发现，F1植株花时正常，与野生型一致，F2代群体中晚花时植株与早花时植株呈现显著的3:1分离，表明fot1的早花时突变性状受1对隐性核基因控制，将该基因命名为FOT1(表1)。
表1.F2(fot1/NIP)群体花时分离比统计
Figure BDA0003333253850000051
注:NIP为对照日本晴；当df＝1时，χ2 0.05(1)＝3.84.
以F2(fot1/NIP)大群体作为MutMap克隆用群体，从中随机选取20株典型的早花时突变单株，以等量基因组DNA混合组成突变株混池，并用于高通量测序，测序深度大于30×。利用MutMap方法构建了12条染色体上的SNP指数散点图。
根据遗传连锁关系，突变基因附近的SNP指数应该等于或接近1，且呈现连锁分布，即距离突变基因越远，SNP指数会逐渐变小，距离突变基因越近，SNP指数会逐渐变大。
根据12条染色体上的SNP指数散点图，只有第8染色体近端粒端的SNP位点呈连续分布，而且呈现出明显的单峰分布，见图2。因此，初步推测该突变基因位于第8染色体短臂近端粒区域。参照高通量测序结果，最终将目标基因锁定在水稻第8染色体2-4M区间。
依据以上测序和分析结果，发现在该区域内仅有一个编码MYB类转录因子的基因FOT1发生了突变。
2.2验证突变位点的正确性
设计和合成横跨突变位点的一对引物：
Seq ID No.1上游引物：CTAACTGACAAAGCGACCAA
Seq ID No.2上游引物：AATAAATCAGACGGCAAACA
以突变体fot1基因组DNA为模版，经PCR扩增出FOT1基因片段(Seq ID No.3)并与日本晴基因组比对分析，发现如图4所示，该基因CDS(Seq ID No.4)第44位碱基由G突变成了A，相应密码子编码氨基酸由精氨酸变成赖氨酸，即发生了移码突变，导致基因功能受损，暗示了该基因可能就是导致fot1花时变早的突变基因。
实施例3.CRISPR/Cas9敲除验证
构建FOT1基因两个不同靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑载体
载体构建方法：
1.设计包括PAM序列的gRNA靶点序列GCATTGATTCATAGTTCCGCTGG(Seq ID No.5)和TTCACCTTCTATGCGCTGCCAGG(Seq ID No.6)，制备Oligo二聚体：
将合成的Oligo加水溶解至10μM，按下列反应体系混合后，95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃(推荐采用PCR仪)。
Figure BDA0003333253850000061
2.将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas载体
按下列反应体系在冰上混合各个组分，混匀后室温(20℃)反应1小时。
Figure BDA0003333253850000062
3.得到的CRISPR/Cas9基因编辑载体如图5所示,表达盒包含依次排列的U6-gRNA-UBI-CAS9。
4.所述CRISPR/Cas9基因编辑载体通过农杆菌转化野生型水稻品种日本晴：
参考标准步骤转化大肠杆菌：取5μl反应液加到至少50μl的感受态细胞中，混匀后冰浴静置30分钟(期间切勿晃动，严格保持静置)；轻轻取出，37℃热激60秒，立即置于冰上2分钟；加入500μl SOB/LB，37℃200rpm培养1小时；取适量菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
每个载体均成功获得了20株左右阳性植株。
将这些植株进一步自交、分离，在T1代获得了9个纯合突变株系(表2)，且花时均与fot1保持一致，比日本晴早1小时左右(图4)。
表2.CRISPR/Cas9敲除纯合株系突变位点
Figure BDA0003333253850000071
实施例4.RNAi验证
构建FOT1基因的RNAi载体并转入野生型日本晴中，获得阳性植株24株，对FOT1基因表达量进行检测，具体步骤如下：
步骤1.RNAi载体构建
设计引物(Seq ID No.7和Seq ID No.8)扩增FOT1基因cDNA中特异性较强的169bp片段作为干涉片段(Seq ID No.9)。
Seq ID No.7上游引物：
Figure BDA0003333253850000072
下划线为XbaI酶切位点
Seq ID No.8下游引物：
Figure BDA0003333253850000073
下划线为SalI酶切位点
Seq ID No.9干涉片段
ATGGAGATTAATTCCTCTGGTGAGGAAGCGGTGGTAAAGGTGAGGAAGCCATACACAATCACAAAGCAGAGGGAGCGTTGGACTGAGGCAGAGCACAACAGGTTCCTTGAAGCCTTGAAACTGTATGGGAGAGCCTGGCAGCGCATAGAAGAGCATGTTGGGACAAAGA。
通过XbaI/SalI双酶切的方法使干涉片段以正向和反向序列连接在中间载体(pUCCRNAi)上，以便形成发夹结构，最终将目的片段(正向序列+中间载体序列+反向序列)连接到载体pCAMBIA2300-actin1上得到RNAi载体，其结构如图6所示；经过双酶切检测以及测序验证。
步骤2.将构建成功的RNAi干涉载体通过农杆菌转化野生型水稻品种日本晴，获得24株阳性植株。
步骤3.表达量检测
提取野生型植株和RNAi干涉阳性植株叶片的mRNA，反转录后利用荧光定量PCR方法检测LHY表达量，具体方法如下:
3.1采用Trizol试剂法进行RNA的提取：
(1)准备工作：将枪头、1.5mL EP管放入高压灭菌锅灭菌2h；三氯甲烷、异丙醇、75％用DEPC水配置的酒精放入-20℃保存；高速离心机4℃预冷；超净工作台紫外灭菌30min后用75％酒精擦拭；将EP管提前做好标记。
(2)将液氮中保存好做好标记的水稻样品依次用液氮在研钵中研磨碎，期间不时倒入液氮保证研钵低温，磨好后用勺子舀进EP管加入1mL Trizol试剂放冰上；
(3)在每个EP管中加入350mL预冷的三氯甲烷，放入盒中徒手剧烈震荡3min后放冰上或离心机中静置5min；静置好后放入4℃离心机12000r/min离心15min；小心吸出500mL上清液于做好标记的新EP管，每管加入预冷的500mL异丙醇，颠倒混匀后放冰上或离心机中静置10min；静置好后放入4℃离心机12000r/min离心10min，这时会出现白色沉淀物，在超净工作台中将上清液倒掉后加入1mL 75％用DEPC水配置的酒精，用移液枪将沉淀物悬浮起来后再放入离心机离心1min后拿出倒掉上清液，放入离心机空转EP管1mL，小心吸干多余水分后冰上静置2min；加入30mL DEPC水溶解RNA，若不急用RNA则放入-80℃冰箱保存。
3.2反转录：按试剂盒(Vazyme)标明的操作步骤进行RNA的反转录：
(1)基因组DNA的去除：
Figure BDA0003333253850000081
(2)将第1部分反应液用移液枪吸打混匀后放入PCR仪器中，42℃，2min；
(3)取出反应液静置30sec，加入5×Select qRT Super MixⅡ2μl，再次混匀；
(4)反转录程序50℃，15min；85℃，5sec；
(5)最后用高速离心机瞬离，总cDNA保存于-20℃冰箱备用。
3.3实时荧光定量
qRT-PCR体系
Figure BDA0003333253850000091
qRT-PCR程序
预变性：
95℃ 5min
循环反应：
95℃ 10sec
60℃ 30sec
融解曲线：
95℃ 15sec
60℃ 1min
95℃ 15sec
荧光定量PCR结果显示，24株阳性植株中有12株的FOT1基因表达量显著下调，这12株的花时均与材料fot1保持一致，即比日本晴早1小时左右，如图7示出了其中3株花时变早的阳性植株与野性型品种日本晴的FOT1基因表达量差异。
实施例5.对籼稻品种敲除FOT1以获得提早花时品种
采用实时例3所得相同的CRISPR/Cas9基因编辑载体，对花时较迟的籼稻保持系材料宜香1B中敲除FOT1基因得到转基因阳性植株；
将这些植株进一步自交、分离，在T1代成功获得宜香1B的纯合敲除株系(敲除宜香1B)，该株系花时在不同气温条件下(雨天除外)相对野生型宜香1B均可稳定提前1小时左右。
水稻主栽品种宜香优2115在长江上游连续多年种植面积排名第一，并荣获2019四川省科学技术进步一等奖。但是，经多年跟踪调查发现，该组合因保持系宜香1B和不育系宜香1A的花时迟，制种产量低，种子成本高。
本发明对宜香1B、敲除宜香1B和主栽恢复系品种雅恢2115的花时进行了调查。
统计结果表明，野生型宜香1B花时晚于雅恢2115，敲除宜香1B的花时早于恢复系雅恢2115，且比野生型宜香1B提早1小时左右(图8)，进一步证明FOT1在水稻花时改良中的应用潜力。
综上所述，本发明通过CRISPR/Cas9敲除、RNAi等实验充分证实了FOT1基因对早花时表型的影响，并证明了fot1的早花时表型是由FOT1的突变引起编码蛋白发生移码突变引起。因此对目的材料的FOT1基因进行编辑，使其CDS区域发生碱基缺失、***或替换，引起译码突变，可获得花时改变的水稻育种材料，应用于水稻育种。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川农业大学
<120> FOT1基因在水稻花时改良中的应用
<130> P210111-SAU
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> FOT1基因片段上游引物
<400> 1
ctaactgaca aagcgaccaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> FOT1基因片段下游引物
<400> 2
aataaatcag acggcaaaca 20
<210> 3
<211> 7705
<212> DNA
<213> FOT1基因
<400> 3
ttgtgtattt tgttgttctg gcaggatcaa ggaagtgttt ggccttcgta ggtgagcctg 60
attactgttt gcattgctgc ttcatatatt tttcatactt ctaattggtt ttatgtttct 120
aattaattct tcttttttta atggttgcat aatttgagaa ctgcgagttt taatctgatt 180
ctagagttga agataacgaa aggagcaagg gtgaactctg ctgacttggt ttttgtgtgc 240
acagaccaac tgcagctgag gatttagtag gtgagtggag tggtgctgta ctgcgctgtc 300
cctggatttt tgtctcgagt aattgttgta gttgtggaac cctttagttt tatcaaatta 360
agtgatgcct tcttttgggg aaataaatgt ttttttcttg gtggagttca gtttgaccat 420
ttggagatgc ttatgaattt aaaatgatgt ggccccttat tgcatttttt ttttcagatt 480
gactgcaatt ggatcaattc aagtaggtga gtggaattga tcctcttgaa gattttgacc 540
caagtccaat tcacaagtag aattgtgaat tctttaggtt ctaccttggg tttgtaacac 600
taatttggct gctcttttgt ggttggccgc acaaatttga aatactggga gtgttggcgt 660
gatatagagg tctaggagga ggtatgaggt actacttgcg tcaggtccag cgtttggttg 720
gagatatgga aggaggagtg cttttgtttg tggaagacct caactctaac tgacaaagcg 780
accaattgcc aacacttctg ttatatttct tctttttctt gaattgggaa tggagattaa 840
ttcctctggt gaggaagcgg tggtaaaggt gagttgttct ttgatgtgca tgttgattcg 900
tgttaaaagg gagcagcatt ttattagggg ttatttgtag gtgaggaagc catacacaat 960
cacaaagcag agggagcgtt ggactgaggc agagcacaac aggttccttg aagccttgaa 1020
actgtatggg agagcctggc agcgcataga aggtgaattc tccacatata tatgtcatat 1080
cacaaatagt tctatgctat tactttctga atttactttt tgtactcact gtgattatta 1140
gctggttaat aaatacggct ttaattgagt tattgatatg gatcttgcat cttttttttt 1200
tcgttttctt gtttgccgtc tgatttattc tatagagcat gttgggacaa agacagctgt 1260
gcagatcaga agtcatgctc aaaagttctt caccaaggtt cttcctctat cttattggcc 1320
agtgctcctt tttttggttt agcgctatct ccttagcttt ctggtttcct tgtctttacc 1380
tttgggataa aaacggctgg cttttgtgct tactttctta ttattttttc ttactttctg 1440
cagtattatt tctttctttc cttcttttat tttacatatg agtacagcaa ttatgtacat 1500
agagtctgaa ctgtgtgtga tcagttcctt tcgattatta tgagaaatac acttatggct 1560
tttgtgctct gttagttgga tgaaacgtta actaaacagt gctgagatgg aaaagaagca 1620
ctaggaagtg tttgtctcgt agtaaaaaaa aaataatgtt gcaaaattga tgctattaaa 1680
cattctgttt gcatgttcct ttatttacat atccatccta tcactgagat tttgagcatg 1740
cacagatgca cttatgacaa aaaaaaaagc attttggtac tgttatattt acatactaag 1800
tcaagtcaaa ttgtatatct ggactatcat caagattagt aataaagatt tagttaaaca 1860
tgttccagtg cctacgtggt gttcataact aataaggatt cttaaaaaaa aaaagaacta 1920
gggcagccat ttgagacaat ttattaaaat aagaaaaatg taaaatgatt tgcaagttga 1980
ccaaggtatc accttccatt agaaatagcc actcaatcgc gcatttgcgc gactttgact 2040
gacagcatat aatatgtagg agtagttata acagtcacga gtggattaag tttcttttat 2100
ttatacatta ggcttatttt ttaatgaaat tctaatttac gcggtagaat tgtatcttta 2160
tttttgaaaa gggttgtcta ttattaatga tttttttaat caaggtgtaa tattggaatt 2220
cacagttatt tgttcggcaa acattgtaat aattgtctgt agattcacta aagtaaaggt 2280
cggaataatt tttgccatgc tggctttttc tttagaaaaa aaaagaagaa aactgttgtc 2340
cggtttcctc caattttttt tctacgtggg ctgcctgcag gttctggagg tttctctttg 2400
gaactctcct tgtttgatta gggctaatcc aacggttgtt gttgcttatt tctttgcatt 2460
ggacggtcct acatttcttt cttatgtggc tcaaccagat tgtgtgaaag tagttctttc 2520
actactttat attgtgtgaa aggtcggaaa acatcaaaaa taatactgta cacctattgt 2580
ttatcagtca aaacagaagg acctagtcca ttcccttctt ttaaaaaatt tactcccaat 2640
ctaagtcttg ttttttttcc tgttgcgcaa tctacccaaa ctgtgccttt taggggcttt 2700
acactgccac ctgatggagg tcacgttgcc atcactgtgc aacagccact ggactgttgc 2760
attgttgatt gcatcatcat cctctcaaag gtctcattgc aagatctatg aatggggagg 2820
aacacaaggt tagtaattta agaaacatga tggctttctg gtttctcaac tctatatcca 2880
gccaacatcc atgagcatct gaccgtccat tgttgtggtg ggttggattt ttggttgttg 2940
attaaagagg tgaataggtc tgccctaatc tccataaaat atgtaataca gctaataggt 3000
tttcgtcgct gcaagtactt gccagtaact gttctccatg tctaggctca taaaaaatat 3060
agagtgacaa gtaacaacgt ttaacctgac caatacttat actgcttaaa caccttctgt 3120
tttctaacaa gtatgcagta aatgtaatca gtgctacaat aacttcttga acattaacca 3180
tgcctagaac ttgggaccat acgctcataa cattggtttg agaagggtag tggactggga 3240
ggatatactc tagtcacgta tttcctagta atcccttggt tttgccaaaa aaaaggcaac 3300
caaggcaaat taccactgtt cattgaaccc tgatagtcaa tagttcgaaa agtggtaact 3360
aataactgtg aaatgtccat tgtggttgat gtcaattaaa ttagtcttta ctttgataag 3420
atgtccaaga gctttttgga gccccgaagg gttatgagtg atggccattc caggcttcag 3480
atgcacagtc gcttttcttt tgcaaagaca tgcaacaatg tttggttcta catcagcact 3540
ataccagtaa ttgcagtagt atagttttgg cttgtcgtta ctggtttctg ggctgaagtc 3600
caacatgact aggctccatt tgtggtctta tctagtgact aggctccatt tggttcttgt 3660
cataattatc cacagagatc tggttcattg atcacttttt ctactgtatc agcgaaaagt 3720
ttgatgatat taccgcctat acaaatgtta tagcatgctg ctaatcatac ccaccaatgc 3780
atactctccc ctgtttggtc aatgatgatt gatgccatgg ttgatgttca aactaaacct 3840
cggcaggtca ttctgagatc agaaggataa tataggcata aaactaaatc tatgacaacc 3900
tgtaatgtgg aaatggcctt tttcttttat gcaggtgaaa aaaaataaat gcgtactaaa 3960
ttaataataa cccaagggga gagacatccc aaaggcattg catataaggt tgagcaaagg 4020
ccccaaagcc agctcataac cgtatgggta ctttagggga acatatagcg aggggtcttt 4080
ttttttgtga gaactaggaa gcctcatgac tggaggactt accagttacc accgtgctac 4140
aagcacgttc tctctactaa atttataata gcaaagtact tggcttcaat gtgacttttt 4200
aggtccagga aaaatgcttt caaatttctt atcaacttat catcacaata gctagacgat 4260
gattttgatc aataaaagag caggggaatg tctagttgac tgaaagtaga agaggaacaa 4320
ttttctttct gcaaatttgg cttcaaaata atctgttgaa atattcatca ttacatgttt 4380
tcttttggac aaaggaagtg taacttccag cctctgcacc aactaaggat gcaaacaacc 4440
atatttgtgg ataccaggat ttgaaccctg gtggctggag tcattacatg ttttctatat 4500
tccaacttcc atgtcaaacc atgttcctga agtataatgc tcattaatta tctaatatgg 4560
cagcaaggca gacataatcc ggtaagtaaa gggtagggct gaccgccctc tggtcaagca 4620
ggctctccct gcatagcagg aggctctgct cggtgaaata caaaatcctt ctctgatatt 4680
attgcttatt tttccttaat acacatacta gtccaccttt atagcacaag tgctgagata 4740
tgtacttgga agtactaaat aaactaggaa gctctagcta gaaagtaccg gttcccgaac 4800
cgatggcttc atgaaacttt ttgccaaagg tttttagtaa ccttctacat gacactccct 4860
ctactccaca atatttgtcc aagactacca tctgcataga ccaaggaggt gcaagatata 4920
agaaatagtt aatgataatg gactatatat accatctgca taacttttat acctctttta 4980
agcattatat aaagtttagt agagagttgg gacatcgcaa taagtccaaa ctcctaattt 5040
tctcgacaaa cagacattgt caaaggggac agccccgaga aaatgaacaa atcttgtgga 5100
gcagacggag tagcattatg taaaatatca atatcatgta gtatggcact ttcatatatg 5160
tcaaaattac tgttagatat gcctgatttg ttttctgttt ctttatgtaa tttaactgta 5220
tctaactaat tgaaatatta cagttggaaa aggaagctat caacaatggc acttctccag 5280
gacaagctca tgacatcgac atacctccac cacgaccaaa aagaaaacct aacagtccat 5340
atcctcgaaa aagttgtctc agctctgaga catccaccag ggaagttcaa aatgataagg 5400
caacaatatc aaatatgacg aacaatagca ctgcacaaat ggcaggtgat gcagctcttg 5460
aggtacatac ctttgtagta tttcgtttta gttaggtttc tatttttgat ttatcctttt 5520
ctttaatgtg ctatcctgtt tctttaacaa gaaactcact tacattcaga aacttcaaag 5580
aaaggagata tctgaaaaag gaagttgctc cgaagttctt aatctctttc gagaagtccc 5640
atcggcatca ttttcttcag ttaacaaaag ctcttcaaat catggtgcat ccagggggct 5700
ggaaccgact aaaacagaag tcaaagatgt ggtcatcttg gaaagggatt ctatttccaa 5760
tggtgcaggg aaggatgcaa aagatatcaa tgatcaagaa atggaaaggc tcaatgggat 5820
acacatcagc tcgaagcctg atcattctca tgaaaactgt ttggatacct caagccaaca 5880
atttaagcca aaatcaaact ctgtggagac aacatatgtg gattggtctg ctgcaaaagc 5940
ttcacactac caaatggaca gaaatggggt tactggcttt caagccactg gaactgaagg 6000
aagccatcct gatcaaacaa gtgatcaaat gggaggagcc agcggaacta tgaatcaatg 6060
catccatcca acacttcctg tggatccaaa attcgacggc aatgccgcag cacagccctt 6120
tcctcacaac tatgcagcct ttgcaccaat gatgcaatgc cactgcaacc aagatgccta 6180
cagatctttt gccaatatgt catccacctt ctccagcatg cttgtctcca cattgttgtc 6240
aaaccctgca atccatgcag ctgccaggct tgcagcatcg tactggccta cagtagacgg 6300
caatactcct gatccaaatc aagaaaatct ttctgagagt gctcaaggaa gccacgctgg 6360
ctctcctccc aacatggcat ctattgtcac agctacagtt gctgcagcat cagcatggtg 6420
ggcaacacaa ggtcttctcc ctctttttcc tccacctata gcttttccat ttgttccagc 6480
tcctagtgct cccttttcca cagcagatgt tcagcgagct caagagaaag atatagactg 6540
cccaatggat aatgcacaga aggaattgca agaaactcgg aaacaagata attttgaagc 6600
tatgaaggtc atagtgtctt cagagactga tgagagtgga aaaggagaag tgtcgctcca 6660
cactgagtta aagatatctc cagcagataa ggccgacacc aaacctgccg caggagctga 6720
aacaagtgac gtttttggaa ataagaaaaa gcaggatcgc tcttcatgtg gttccaacac 6780
accgtcaagt agtgatatag aagcagataa tgctcctgag aatcaagaaa aggctaacga 6840
caaggcaaag caagcatctt gcagtaactc ttcagccggt gacaataacc accgtagatt 6900
taggagcagt gcaagcacaa gtgattcatg gaaggaagtt tctgaagagg tggtcgtcta 6960
ccagcattcc gcatattcac atttatctta ctcgctgaac atccatcact gcttttctaa 7020
ttcacatttc tgctgtcagg gtcgtctggc ttttgatgca ctgttcagta gagaaaggct 7080
tccccaaagc ttttctcctc cgcaagtaga aggatcaaag gagattagca aggaggaaga 7140
agatgaagta accacggtga cggttgacct caacaagaat gccgctatta ttgatcaaga 7200
actcgacaca gcggatgagc caagagcttc ctttcctaat gaattgtcaa acctgaagct 7260
gaaatctcgc aggaccggtt tcaaaccata caagaggtgc tcagtggaag cgaaggagaa 7320
cagggtaccg gctagcgatg aggttggtac caagaggatt cgtcttgaga gcgaagcatc 7380
gacatgattt gctttccacc tggttgctgg cctctaccaa gtcagaagtt aaatttacat 7440
ccgagctacc ataggacttc agaccttcca atgcattacc tcacaaactc aatttattgt 7500
gtgttgtatc ttaatgcttg ccaagcagct cctatagact gcttttaaac cgtatctcat 7560
agacttttga ttagcattta agcgactgct aaactttctt cataaaaggg tattatcctt 7620
attatgcatt atagtctggg gaaggtaata agtggaattt tggttcattt ttctgggtca 7680
tattttacca actgcatttt tatcc 7705
<210> 4
<211> 2160
<212> DNA
<213> FOT1基因的CDS
<400> 4
atggagatta attcctctgg tgaggaagcg gtggtaaagg tgaggaagcc atacacaatc 60
acaaagcaga gggagcgttg gactgaggca gagcacaaca ggttccttga agccttgaaa 120
ctgtatggga gagcctggca gcgcatagaa gagcatgttg ggacaaagac agctgtgcag 180
atcagaagtc atgctcaaaa gttcttcacc aagttggaaa aggaagctat caacaatggc 240
acttctccag gacaagctca tgacatcgac atacctccac cacgaccaaa aagaaaacct 300
aacagtccat atcctcgaaa aagttgtctc agctctgaga catccaccag ggaagttcaa 360
aatgataagg caacaatatc aaatatgacg aacaatagca ctgcacaaat ggcaggtgat 420
gcagctcttg agaaacttca aagaaaggag atatctgaaa aaggaagttg ctccgaagtt 480
cttaatctct ttcgagaagt cccatcggca tcattttctt cagttaacaa aagctcttca 540
aatcatggtg catccagggg gctggaaccg actaaaacag aagtcaaaga tgtggtcatc 600
ttggaaaggg attctatttc caatggtgca gggaaggatg caaaagatat caatgatcaa 660
gaaatggaaa ggctcaatgg gatacacatc agctcgaagc ctgatcattc tcatgaaaac 720
tgtttggata cctcaagcca acaatttaag ccaaaatcaa actctgtgga gacaacatat 780
gtggattggt ctgctgcaaa agcttcacac taccaaatgg acagaaatgg ggttactggc 840
tttcaagcca ctggaactga aggaagccat cctgatcaaa caagtgatca aatgggagga 900
gccagcggaa ctatgaatca atgcatccat ccaacacttc ctgtggatcc aaaattcgac 960
ggcaatgccg cagcacagcc ctttcctcac aactatgcag cctttgcacc aatgatgcaa 1020
tgccactgca accaagatgc ctacagatct tttgccaata tgtcatccac cttctccagc 1080
atgcttgtct ccacattgtt gtcaaaccct gcaatccatg cagctgccag gcttgcagca 1140
tcgtactggc ctacagtaga cggcaatact cctgatccaa atcaagaaaa tctttctgag 1200
agtgctcaag gaagccacgc tggctctcct cccaacatgg catctattgt cacagctaca 1260
gttgctgcag catcagcatg gtgggcaaca caaggtcttc tccctctttt tcctccacct 1320
atagcttttc catttgttcc agctcctagt gctccctttt ccacagcaga tgttcagcga 1380
gctcaagaga aagatataga ctgcccaatg gataatgcac agaaggaatt gcaagaaact 1440
cggaaacaag ataattttga agctatgaag gtcatagtgt cttcagagac tgatgagagt 1500
ggaaaaggag aagtgtcgct ccacactgag ttaaagatat ctccagcaga taaggccgac 1560
accaaacctg ccgcaggagc tgaaacaagt gacgtttttg gaaataagaa aaagcaggat 1620
cgctcttcat gtggttccaa cacaccgtca agtagtgata tagaagcaga taatgctcct 1680
gagaatcaag aaaaggctaa cgacaaggca aagcaagcat cttgcagtaa ctcttcagcc 1740
ggtgacaata accaccgtag atttaggagc agtgcaagca caagtgattc atggaaggaa 1800
gtttctgaag agggtcgtct ggcttttgat gcactgttca gtagagaaag gcttccccaa 1860
agcttttctc ctccgcaagt agaaggatca aaggagatta gcaaggagga agaagatgaa 1920
gtaaccacgg tgacggttga cctcaacaag aatgccgcta ttattgatca agaactcgac 1980
acagcggatg agccaagagc ttcctttcct aatgaattgt caaacctgaa gctgaaatct 2040
cgcaggaccg gtttcaaacc atacaagagg tgctcagtgg aagcgaagga gaacagggta 2100
ccggctagcg atgaggttgg taccaagagg attcgtcttg agagcgaagc atcgacatga 2160
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> gRNA靶点序列1
<400> 5
gcattgattc atagttccgc tgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> gRNA靶点序列2
<400> 6
ttcaccttct atgcgctgcc agg 23
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> RNAi干扰片段上游引物
<400> 7
cgttctagaa tggagattaa ttcctctggt g 31
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> RNAi干扰片段下游引物
<400> 8
cgtgtcgact ctttgtccca acatgct 27
<210> 9
<211> 169
<212> DNA
<213> RNAi干扰片段
<400> 9
atggagatta attcctctgg tgaggaagcg gtggtaaagg tgaggaagcc atacacaatc 60
acaaagcaga gggagcgttg gactgaggca gagcacaaca ggttccttga agccttgaaa 120
ctgtatggga gagcctggca gcgcatagaa gagcatgttg ggacaaaga 169
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 实时荧光定量上游引物
<400> 10
cagataaggc cgacaccaaa c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 实时荧光定量下游引物
<400> 11
ggtgtgttgg aaccacatg 19

Claims (7)

1.FOT1基因在水稻花时改良中的应用，其特征在于，对目的水稻材料进行基因编辑，使位于第8染色体上3365730–3373434 bp区域编码MYB类转录因子的FOT1基因的CDS发生碱基缺失、***或碱基替换，导致相应编码蛋白发生突变，以获得FOT1突变体材料；
所述FOT1基因的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，所述FOT1基因的CDS的核苷酸序列如Seq ID No.4所示；
所述水稻花时是指水稻抽穗后一天中开颖高峰的时间。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编辑是指向目的水稻材料转入可编辑/敲除所述FOT1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其中所述CRISPR/Cas9基因编辑载体是通过将设计的如Seq ID No.5和Seq ID No.6所示的包括PAM序列的gRNA靶点序列制备成Oligo二聚体; 将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas载体BGK032而得，其包含从上游到下游依次排列的基因片段：U6-gRNAFOT1-UBI-CAS9。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，还包括对基因编辑成功的阳性材料进行自交、分离筛选出改良的早花时纯合突变体。
5.一种筛选早花时水稻材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对待测水稻材料提取RNA，反转录得到cDNA；
（2）检测待测材料中FOT1基因的表达水平；与对照品种相比，如果显著低于对照品种，则待测材料可能是比对照品种花时更早的候选材料；所述FOT1基因的核苷酸序列如Seq IDNo.3所示，所述FOT1基因的CDS的核苷酸序列如Seq ID No.4所示。
6.根据权利要求5所述的方法，所述检测待测材料中FOT1基因的表达水平，采用荧光定量PCR。
7.根据权利要求6所述的方法，所述荧光定量PCR的上、下游引物的核苷酸序列分别如Seq ID No.10和Seq ID No.11所示。
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