CN114184789B - 一种***特异性抗原检测探针、一种检测***特异性抗原试剂盒 - Google Patents
一种***特异性抗原检测探针、一种检测***特异性抗原试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114184789B CN114184789B CN202111589344.7A CN202111589344A CN114184789B CN 114184789 B CN114184789 B CN 114184789B CN 202111589344 A CN202111589344 A CN 202111589344A CN 114184789 B CN114184789 B CN 114184789B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- specific antigen
- prostate specific
- detection probe
- prostate
- secondary antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 title claims abstract description 158
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 title claims abstract description 158
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 48
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Substances [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 92
- 239000013110 organic ligand Substances 0.000 claims abstract description 26
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims abstract description 12
- GPNDARIEYHPYAY-UHFFFAOYSA-N palladium(ii) nitrate Chemical compound [Pd+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O GPNDARIEYHPYAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 17
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 12
- FEOWHLLJXAECMU-UHFFFAOYSA-N 4,7-dibromo-2,1,3-benzothiadiazole Chemical compound BrC1=CC=C(Br)C2=NSN=C12 FEOWHLLJXAECMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 7
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 5
- -1 ethanamine diene Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000012304 carboxyl activating agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 239000002091 nanocage Substances 0.000 abstract description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 abstract description 2
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 36
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 32
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 17
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical group C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 13
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 13
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 11
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical group CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- MUJIDPITZJWBSW-UHFFFAOYSA-N palladium(2+) Chemical compound [Pd+2] MUJIDPITZJWBSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 7
- 210000000064 prostate epithelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 6
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 235000005811 Viola adunca Nutrition 0.000 description 4
- 240000009038 Viola odorata Species 0.000 description 4
- 235000013487 Viola odorata Nutrition 0.000 description 4
- 235000002254 Viola papilionacea Nutrition 0.000 description 4
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- XEZNGIUYQVAUSS-UHFFFAOYSA-N 18-crown-6 Chemical compound C1COCCOCCOCCOCCOCCO1 XEZNGIUYQVAUSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000003990 18-crown-6 derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 201000005866 Exanthema Subitum Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- SEQUALWBCFCDGP-UHFFFAOYSA-N [C].[N].[Fe] Chemical compound [C].[N].[Fe] SEQUALWBCFCDGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
- C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table compounds of the platinum group
- C07F15/006—Palladium compounds
- C07F15/0066—Palladium compounds without a metal-carbon linkage
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种***特异性抗原检测探针、一种检测***特异性抗原试剂盒,属于生物传感技术领域。在本发明中,含Pd有机配合物L‑Pd表面具有氨基,能够与***特异性抗原二抗的羧基通过NH‑CO键化学结合,具有良好的稳定性;同时,含Pd有机配合物L‑Pd具有良好的水溶性,能够大大提高***特异性抗原检测探针的生物相容性。在本发明中,有机配体L与(乙胺二烯)钯二硝酸盐自组装后形成的L‑Pd具有超分子纳米笼结构,对TMB极好的催化氧化效果,不仅仅因为其中的金属Pd起到了贵金属的催化作用,同时其纳米笼的结构也对TMB有一定程度的富集效果,从而进一步达成信号放大的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感技术领域,特别涉及一种***特异性抗原检测探针、一种检测***特异性抗原试剂盒。
背景技术
在男性泌尿***和生殖器官常见的恶性肿瘤中,***癌的出现率高达95%,同时也列男性恶性肿瘤发病率的第六位,并且发病极大受遗传因素的影响。***癌不仅对患者的生活质量带来破坏,也对身体健康和生命安全带来巨大威胁。通过对***癌具有特异性和敏感性的生物标志物的检测,可以达到对***癌进行早期诊断和监控的目的,从而降低其发病率和严重程度,有效保证生活质量,提高了生存率。
因此,通过对***特特异性抗原的含量和变化情况判断***癌的性质和状态达到对***癌进行早期诊断和监控。在医学上,通过对血清中的***特异性抗原的定量检测进行疾病诊断已成为目前临床上的焦点和热点。利用抗体抗原的特异性结合,通过化学生物免疫传感器检测***特异性抗原。此法具有灵敏度高、成本低、操作简便和检测速度快的优点,是对生物标志物检测的重要方法。
对于传统的酶联免疫吸附试验,检测抗体通常用天然酶标记。但现有的天然酶如辣根过氧化物酶、漆酶、磷酸碱脂酶用于ELISA检测时存在稳定性差、催化活性弱的缺陷。
现有的纳米酶如四氧化三铁、单原子铁氮碳等具有稳定性好、成本低、催化活性强、对底物亲和力强等突出优点。基于纳米酶的优异性能,将其作为传统酶联免疫吸附法中天然酶的有力替代品。然而现有的纳米酶水溶性差,导致生物相容性下降,这给***特异性抗原的ELISA检测增加了难度。
发明内容
有鉴于此,本发明目的在于提供一种***特异性抗原检测探针、一种检测***特异性抗原试剂盒。本发明提供的***特异性抗原检测探针具有良好的水溶性。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种***特异性抗原检测探针,包括***特异性抗原二抗和与所述***特异性抗原二抗化学结合的含Pd有机配合物L-Pd;
所述含Pd有机配合物L-Pd由有机配体L与(乙胺二烯)钯二硝酸盐自组装得到,所述有机配体L具有式I所示结构:
优选的,所述含Pd有机配合物L-Pd的制备方法,包括以下步骤:
(1)将4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、双-(4-吡啶)-胺、催化剂和有机溶剂混合,进行配合反应,得到有机配体L;
(2)将有机配体L、(乙胺二烯)钯二硝酸盐和水混合,进行自组装,得到含Pd有机配合物L-Pd。
优选的,有机配体L、(乙胺二烯)钯(Ⅱ)二硝酸盐的质量比为1:1.5~2。
优选的,所述配合反应的温度为160~180℃,时间为4~6天;
所述自组装的温度为45~55℃,时间为10~20h。
优选的,所述***特异性抗原二抗与含Pd有机配合物L-Pd的质量比为1:5~10。
本发明提供了上述***特异性抗原检测探针的制备方法,包括以下步骤:
将***特异性抗原二抗与羧基活化剂混合,进行羧基活化,得到活化羧基的***特异性抗原二抗;
将所述活化羧基的***特异性抗原二抗与含Pd有机配合物L-Pd混合,进行化学结合,得到***特异性抗原检测探针。
本发明提供了***特异性抗原检测探针在制备检测***特异性抗原试剂盒中的应用。
本发明提供了一种检测***特异性抗原试剂盒,包括上述***特异性抗原检测探针,***特异性抗原一抗,非特异性蛋白以及显色底物。
优选的,所述显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
优选的,还包括pH值为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液和pH值为4~4.5的磷酸盐缓冲液。
本发明提供了一种***特异性抗原检测探针,包括***特异性抗原二抗和与所述***特异性抗原二抗化学结合的含Pd有机配合物L-Pd,所述含Pd有机配合物L-Pd由有机配体L与(乙胺二烯)钯二硝酸盐自组装得到,所述有机配体L具有式I所示结构。在本发明中,含Pd有机配合物L-Pd表面具有氨基,能够与***特异性抗原二抗的羧基通过NH-CO键化学结合,具有良好的稳定性;同时,含Pd有机配合物L-Pd具有良好的水溶性,能够大大提高***特异性抗原检测探针的生物相容性。在本发明中,有机配体L与(乙胺二烯)钯二硝酸盐自组装后形成的L-Pd具有超分子纳米笼结构,对TMB有极好的催化氧化效果,不仅仅因为其中的金属Pd起到了贵金属的催化作用,同时其纳米笼的结构也对TMB有一定程度的富集效果,从而进一步达成信号放大的目的。
此外,L-Pd只有在紫外光催化下才具有类氧化酶的效果,不仅可以通过结束紫外光照简单快捷地停止整个催化反应,简化操作步骤,具有更好的可控性与更广的应用范围。
本发明提供了一种检测***特异性抗原试剂盒,包括***特异性抗原检测探针,***特异性抗原一抗,非特异性蛋白以及显色底物。在本发明中,***特异性抗原一抗、待测***特异性抗原和***特异性抗原检测探针能够构成抗体-抗原-抗体三明治夹心式生物传感器,其中***特异性抗原检测探针可以特异性识别***特异性抗原,且具有良好的酶活性,能够催化显色底物显色,随着***特异性抗原的浓度增加,紫外分析检测到的吸光度增强,且在0.0001~1000ng/mL内的***特异性抗原浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测下限为30fg/mL,具有具有高灵敏度、低成本、检测快、检测限低的优点。
附图说明
图1为L配体和L-Pd的制备流程图及结构模拟;
图2为实施例3所得L-Pd的透射电镜图;
图3为实施例3所得L配体的核磁共振氢谱图;
图4为实施例3中对PSA是否进行紫外光照的吸光度对比图;
图5为实施例3中磷酸缓冲溶液的pH值对PSA的吸光度的影响;
图6为实施例3中温度对L-Pd催化氧化TMB能力的影响;
图7为实施例3中吸光度随PSA抗原浓度变化的工作曲线;
图8为实施例3中吸光度与PSA抗原浓度的对数值的线性关系;
图9为干扰物对***特异性抗原检测结果的影响;
图10为可对PSA进行表达的***上皮细胞的***特异性抗原检测结果;
图11为长时间放置后化学生物免疫传感器吸光度峰值变化。
具体实施方式
本发明提供了一种***特异性抗原检测探针,包括***特异性抗原二抗和与所述***特异性抗原二抗化学结合的含Pd有机配合物L-Pd;
所述含Pd有机配合物L-Pd由有机配体L与(乙胺二烯)钯二硝酸盐自组装得到,所述有机配体L具有式I所示结构:
在本发明中,所述含Pd有机配合物L-Pd的制备方法,优选包括以下步骤:
(1)将4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、双-(4-吡啶)-胺、催化剂和有机溶剂混合,进行配合反应,得到有机配体L;
(2)将有机配体L、(乙胺二烯)钯二硝酸盐和水混合,进行自组装,得到含Pd有机配合物L-Pd。
本发明将4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、双-(4-吡啶)-胺、催化剂和有机溶剂混合,进行配合反应,得到有机配体L。在本发明中,所述催化剂优选为无水硫酸铜和无水碳酸钾,所述无水硫酸铜和无水碳酸钾的摩尔比优选为10:8~9。
在本发明中,所述配合反应中还优选加入配合促进剂,所述配合促进剂优选为18-冠-6。
在本发明中,所述有机溶剂优选为二苯醚。
在本发明中,所述4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、双-(4-吡啶)-胺的摩尔比优选为1:2.5~3.5,更优选为1:3;所述4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑与配合促进剂的摩尔比优选为1:0.01~0.02;所述4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑与无水硫酸铜的摩尔比优选为1:4~5。
在本发明中,所述混合的方式优选为搅拌混合,所述搅拌混合的温度优选为50℃,时间优选为30min。
在本发明中,所述配合反应的温度优选为160~180℃,更优选为170℃;时间优选为4~6天,更优选为5天。
所述配合反应后,本发明优选对所得配合反应液进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
去除所述配合反应液的有机溶剂,所得剩余物进行洗脱纯化,得到洗脱液;
对所得洗脱液依次进行旋蒸和干燥,得到有机配体L。
在本发明中,去除所述配合反应液的有机溶剂的方式优选为加压蒸馏。
在本发明中,所述洗脱纯化包括:
以中性氧化铝为固定相、二氯甲烷为流动相进行第一洗脱,之后以THF和二氯甲烷的混合溶液为流动相进行第二洗脱。在本发明中,所述第二洗脱时THF和二氯甲烷的体积比优选为1:1。
在本发明中,所述固定相的粒径优选为100~200目。在本发明中,所述第一洗脱的目的是去除副产物,所述第一洗脱后,所得剩余物在紫外光照下可见蓝紫色荧光。
在本发明中,所述第二洗脱后所得洗脱液在紫外条件下具有黄色荧光。
在本发明中,所述旋蒸的温度优选为60℃;在本发明中,所述干燥的方式优选为真空干燥。
在本发明中,所述有机配体L不溶于水。
得到所述有机配体L后,本发明将有机配体L、(乙胺二烯)钯(Ⅱ)二硝酸盐和水混合,进行自组装,得到含Pd有机配合物L-Pd。
在本发明中,所述(乙胺二烯)钯(Ⅱ)二硝酸盐具有式II所示结构:
在本发明中,有机配体L、(乙胺二烯)钯(Ⅱ)二硝酸盐的质量比优选为1:1.5~2,更优选为1:1.65。
在本发明中,所述自组装的温度优选为45~55℃,更优选为50℃;时间优选为10~20h,更优选为12~15h。
有机配体L、(乙胺二烯)钯(Ⅱ)二硝酸盐自组装形成的L-Pd具有超分子纳米笼结构。
所述自组装后,本发明优选对所得自组装产物进行后处理,所述后处理优选包括:
对所述自组装产物洗涤和干燥,得到含Pd有机配合物L-Pd固体。
在本发明中,所述洗涤用洗涤剂优选为丙酮,所述洗涤的次数优选为3次。
在本发明中,所述干燥的方式优选为真空干燥,所述干燥的温度优选为50℃。
在本发明中,所述***特异性抗原二抗与含Pd有机配合物L-Pd的质量比优选为1:5~10,更优选为1:6~8。
本发明提供了上述***特异性抗原检测探针的制备方法,包括以下步骤:
将***特异性抗原二抗与羧基活化剂混合,进行羧基活化,得到活化羧基的***特异性抗原二抗;
将所述活化羧基的***特异性抗原二抗与含Pd有机配合物L-Pd混合,进行化学结合,得到***特异性抗原检测探针。
本发明将***特异性抗原二抗与羧基活化剂混合,进行羧基活化,得到活化羧基的***特异性抗原二抗。在本发明中,所述羧基活化剂优选为EDC和NHS,所述EDC和NHS的质量比优选为1:1。
在本发明中,所述羧基活化的温度优选为0~4℃,更优选为4℃,时间优选为1~2h。
得到所述活化羧基的***特异性抗原二抗后,本发明将所述活化羧基的***特异性抗原二抗与含Pd有机配合物L-Pd混合,进行化学结合,得到***特异性抗原检测探针。在本发明中,所述化学结合的温度优选为0~4℃,时间优选为18~30h,更优选为24h。
所述化学结合后,本发明优选对所得化学结合后的产物进行透析和冻干。在本发明中,所述透析优选在超纯水中进行,所述透析的截留分子量优选为1000,所述透析的时间优选为3天。
本发明提供了上述***特异性抗原检测探针或上述制备方法制备得到的***特异性抗原检测探针在制备检测***特异性抗原试剂盒中的应用。
本发明提供了一种检测***特异性抗原试剂盒,包括上述***特异性抗原检测探针,***特异性抗原一抗,非特异性蛋白以及显色底物。
在本发明中,所述显色底物优选为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。
在本发明中,所述非特异性蛋白优选为牛血清蛋白。
在本发明中,所述检测***特异性抗原试剂盒还优选包括pH值为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液和pH值为4~4.5的磷酸盐缓冲液。
在本发明中,所述检测***特异性抗原的方法,优选包括以下步骤:
将***特异性抗原一抗在孵育器中进行第一孵育,得到第一孵育产物;
向所述第一孵育产物中加入非特异性蛋白,进行第二孵育,去除未结合物,得到第二孵育产物;
向所述第二孵育产物中加入待测样品,进行第三孵育,去除未结合物,得到第三孵育产物;
向所述第三孵育产物中加入***特异性抗原检测探针,进行第四孵育,去除未结合物,得到第四孵育产物;
向所述第四孵育产物中加入显色底物,在紫外光条件下进行显色反应,测试显色液在550~800nm处的吸光度峰值;
根据预定的标准曲线和所述吸光度峰值,获得待测样品中***特异性抗原的浓度;所述标准曲线为***特异性抗原浓度的对数与吸光度峰值的线性关系曲线。
本发明将***特异性抗原一抗在孵育器中进行第一孵育,得到第一孵育产物。在本发明中,所述孵育器优选为96孔酶标板。所述第一孵育前,本发明优选对所述96孔酶标板进行洗涤,所述洗涤用洗涤剂优选为水和pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液。
本发明对所述***特异性抗原一抗没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的***特异性抗原一抗即可。
在本发明中,所述***特异性抗原一抗的浓度优选为2μg/mL。在本发明中,所述第一孵育的温度优选为4℃,时间优选为8~12h。
得到所述第一孵育产物后,本发明向所述第一孵育产物中加入非特异性蛋白,进行第二孵育,去除未结合物,得到第二孵育产物。在本发明中,所述非特异性蛋白优选为牛血清蛋白。在本发明中,所述牛血清蛋白的浓度优选为1wt%。本发明利用所述非特异性蛋白,封闭未结合的一抗。
在本发明中,所述第二孵育的温度优选为室温,时间优选为45~60min。
在本发明中,所述去除未结合物的方式优选为使用pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液进行洗涤。
得到所述第二孵育产物后,本发明向所述第二孵育产物中加入待测样品,进行第三孵育,去除未结合物,得到第三孵育产物。在本发明中,所述待测样品优选为血清样品。在本发明中,所述第三孵育的温度优选为25~37℃,更优选为28~30℃,时间优选为1.5~2h。
在本发明中,所述去除未结合物的方式优选为使用pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液进行洗涤。
得到所述第三孵育产物后,本发明向所述第三孵育产物中加入***特异性抗原检测探针,进行第四孵育,去除未结合物,得到第四孵育产物。在本发明中,所述***特异性抗原检测探针的浓度优选为1μg/mL。在本发明中,所述第四孵育的温度优选为25~37℃,更优选为28~30℃,时间优选为1h。
在本发明中,所述去除未结合物的方式优选为使用pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液进行洗涤。
得到所述第四孵育产物后,本发明向所述第四孵育产物中加入显色底物,在紫外光条件下进行显色反应,测试显色液在550~800nm处的吸光度峰值。在本发明中,所述显色底物优选为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。在本发明中,所述显色底物的浓度优选为75mM。
在本发明中,所述紫外光的波长优选为325nm。在本发明中,所述显色反应温度优选为室温,时间优选为10~15min。
本发明优选使用紫外分光光度计测试显色液的吸光度。
得到所述吸光度峰值后,本发明根据预定的标准曲线和所述吸光度峰值,获得待测样品中***特异性抗原的浓度;所述标准曲线为***特异性抗原浓度的对数与吸光度峰值的线性关系曲线。
作为本发明的一个具体实施例,所述标准曲线的绘制方法优选包括以下步骤:
提供梯度浓度的***特异性抗原的标准品溶液,所述梯度浓度包括10-4、10-3、10-2、0.1、1、10、100、1000ng/mL。
以梯度浓度的***特异性抗原的标准品溶液作为待测样品,按照本发明的检测方法进行测试,获得梯度浓度的***特异性抗原的标准品溶液对应的吸光度峰值,以***特异性抗原的对数为横坐标,以吸光度值为纵坐标绘图,得到***特异性抗原浓度的对数与吸光度值的线性关系曲线。
具体的,所述标准曲线的相关数据见表1。
表1标准曲线相关数据
在本发明中,所述***特异性抗原的检测下限为30fg mL-1(S/N=3),检测范围为0.0001~1000ng mL-1。
下面结合实施例对本发明提供的一种***特异性抗原检测探针、一种检测***特异性抗原试剂盒进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(一)制备***特异性抗原检测探针
(1)L配体的合成:取4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑(0.3g,1.02mmol)和双-(4-吡啶)-胺(1g,6mmol)混合于100mL圆底烧瓶中,加入18-冠-6(0.01g,0.04mmol),无水硫酸铜(0.16g,10mmol)和无水碳酸钾(1.12g,8.16mmol),最后再加入40mL二苯醚作为溶剂。使用氮气脱气,封闭后于50℃下搅拌30min,然后将温度升高至170℃,在氮气环境下加热搅拌4天后减压蒸馏去掉二苯醚并干燥。先以中性氧化铝为固定相,二氯甲烷为流动相进行洗脱纯化,洗脱至副产物去除(即紫外光照下可见蓝紫色荧光)后以THF和二氯甲烷的混合溶液作为流动相洗脱,所获得黄色荧光物质即为目标产物配体L。
(2)L-Pd的合成:收集所得含L的洗脱液,于60℃下进行水浴旋蒸,去除THF和二氯甲烷,真空干燥后得到不溶于水的配体。再取20mg配体L和33mg(乙胺二烯)钯(Ⅱ)二硝酸盐溶于10mL圆底烧瓶中,加入4mL超纯水,在55℃下搅拌12h。所得产物干燥后用丙酮洗涤三次,完成后50℃真空干燥,即得在紫外照射下具有类氧化酶效果的水溶性L-Pd保存备用。
(3)Ab2@L-Pd的合成:取0.4mg Ab2溶于4mL超纯水中,加入5mM的EDC与NHS,在4℃下搅拌1h,对二抗的羧基进行活化。活化完成后,加入4mg L-Pd,继续在4℃下搅拌24h。取1000分子量的透析袋,活化后将(1)中混合溶液置入透析袋中,并在装有100mL超纯水的烧杯中进行搅拌透析,在4℃下透析3d,去掉多余L-Pd,其中每隔8h更换烧杯中超纯水一次。透析完成后将所得溶液量再固定为4mL冷冻待用,使用时稀释十倍。
(二)***特异性抗原的检测方法
(1)准备标准96孔酶标板,依次使用纯水、pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液进行清洗;
(2)将100μL浓度为2μg/mL的Ab1溶液加入(1)所处理过的酶标孔中,在4℃下过夜放置孵育;
(3)使用pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液对(2)中酶标孔缓慢清洗三次,加入1%的BSA溶液进行封闭,1h后再次使磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(4)将100μL浓度为0.0001~1000ng/mL的PSA溶液依次加入(3)处理过的酶标孔中,37℃孵育2h后,使用pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(5)取100μL浓度为1μg/mL Ab2@L-Pd溶液加入(4)所处理的酶标孔中,37℃下孵育1h后,使用pH=7.0-7.4的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次,加入75mM的TMB溶液100μL,再加入200μL pH=4.0~4.5的磷酸盐缓冲溶液,室温下于325nm波长的紫外灯照射下放置10min。
本发明所述检测***特异性抗原的水溶性化学生物免疫传感器的应用方法,具体步骤如下:
(1)紫外照射后取酶标板中混合溶液于微量比色皿中,置于紫外分光光度计进行测试,扫描范围为550~800nm,将在660nm范围处出现峰值,记录吸光度峰值;
(2)记录不同浓度下的***特异性抗原所对应的吸光度峰值;
(3)利用标准曲线法取得待测样品中***特异性抗原浓度,检测范围为0.0001~1000ng/mL,LOD达到30fg/mL(S/N=3)。
实施例2
(一)制备***特异性抗原检测探针
(1)L配体的合成:取4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑(1g,3mmol)和双-(4-吡啶)-胺(1g,6mmol)混合于100mL圆底烧瓶中,加入18-冠-6(0.01g,0.04mmol),无水硫酸铜(0.16g,10mmol)和无水碳酸钾(1.12g,8.16mmol),最后再加入40mL二苯醚作为溶剂。使用氮气脱气,封闭后于50℃下搅拌30min,然后将温度升高至170℃,在氮气环境下加热搅拌4天后减压蒸馏去掉二苯醚并干燥。先以中性氧化铝为固定相,二氯甲烷为流动相进行洗脱纯化,洗脱至副产物去除(即紫外光照下可见蓝紫色荧光)后以THF和二氯甲烷的混合溶液作为流动相洗脱,所获得黄色荧光物质即为目标产物配体L。
(2)L-Pd的合成:收集所得含L的洗脱液,于60℃下进行水浴旋蒸,去除THF和二氯甲烷,真空干燥后得到不溶于水的配体。再取20mg配体L和33mg(乙胺二烯)钯(Ⅱ)二硝酸盐溶于10mL圆底烧瓶中,加入4mL超纯水,在55℃下搅拌12h。所得产物干燥后用丙酮洗涤三次,完成后50℃真空干燥,即得在紫外照射下具有类氧化酶效果的水溶性L-Pd保存备用。
(3)Ab2@L-Pd的合成:取0.4mg Ab2溶于4mL超纯水中,加入5mM的EDC与NHS,在4℃下搅拌1h,对二抗的羧基进行活化。活化完成后,加入4mg L-Pd,继续在4℃下搅拌24h。取1000分子量的透析袋,活化后将(1)中混合溶液置入透析袋中,并在装有100mL超纯水的烧杯中进行搅拌透析,在4℃下透析3d,去掉多余L-Pd,其中每隔8h更换烧杯中超纯水一次。透析完成后将所得溶液量再固定为4mL冷冻待用,使用时稀释十倍。
(二)***特异性抗原的检测方法
(1)准备标准96孔酶标板,依次使用纯水、pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液进行清洗;
(2)将100μL浓度为2μg/mL的Ab1溶液加入(1)所处理过的酶标孔中,在4℃下过夜放置孵育;
(3)使用pH=7.0-7.4的磷酸盐缓冲液对(2)中酶标孔缓慢清洗三次,加入1%的BSA溶液进行封闭,1h后再次使磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(4)将100μL浓度为0.0001-1000ng/mL的PSA溶液依次加入(3)处理过的酶标孔中,37℃孵育2h后,使用pH=7.0-7.4的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(5)取100μL浓度为1μg/mL Ab2@L-Pd溶液加入(4)所处理的酶标孔中,37℃下孵育1h后,使用pH=7.0-7.4的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次,加入75mM的TMB溶液100μL,再加入200μL pH=4.0-4.5的磷酸盐缓冲溶液,室温于325nm波长的紫外灯照射下放置10min。
本发明所述检测***特异性抗原的水溶性化学生物免疫传感器的应用方法,具体步骤如下:
(1)紫外照射后取酶标板中混合溶液于微量比色皿中,置于紫外分光光度计进行测试,扫描范围为550-800nm,将在660nm范围处出现峰值,记录吸光度峰值;
(2)记录不同浓度下的***特异性抗原所对应的吸光度峰值;
(3)利用标准曲线法取得待测样品中***特异性抗原浓度,检测范围为0.0001-1000ng/mL,LOD达到30fg/mL(S/N=3)。
实施例3
(一)制备***特异性抗原检测探针
(1)L配体的合成:取4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑(0.6g,2.04mmol)和双-(4-吡啶)-胺(1g,6mmol)混合于100mL圆底烧瓶中,加入18-冠-6(0.01g,0.04mmol),无水硫酸铜(0.16g,10mmol)和无水碳酸钾(1.12g,8.16mmol),最后再加入40mL二苯醚作为溶剂。使用氮气脱气,封闭后于50℃下搅拌30min,然后将温度升高至170℃,在氮气环境下加热搅拌4天后减压蒸馏去掉二苯醚并干燥。先以中性氧化铝为固定相,二氯甲烷为流动相进行洗脱纯化,洗脱至副产物去除(即紫外光照下可见蓝紫色荧光)后以THF和二氯甲烷的混合溶液作为流动相洗脱,所获得黄色荧光物质即为目标产物配体L。
(2)L-Pd的合成:收集所得含L的洗脱液,于60℃下进行水浴旋蒸,去除THF和二氯甲烷,真空干燥后得到不溶于水的配体。再取20mg配体L和33mg(乙胺二烯)钯(Ⅱ)二硝酸盐溶于10mL圆底烧瓶中,加入4mL超纯水,在55℃下搅拌12h。所得产物干燥后用丙酮洗涤三次,完成后50℃真空干燥,即得在紫外照射下具有类氧化酶效果的水溶性L-Pd保存备用。
(3)Ab2@L-Pd的合成:取0.4mg Ab2溶于4mL超纯水中,加入5mM的EDC与NHS,在4℃下搅拌1h,对二抗的羧基进行活化。活化完成后,加入4mg L-Pd,继续在4℃下搅拌24h。取1000分子量的透析袋,活化后将(1)中混合溶液置入透析袋中,并在装有100mL超纯水的烧杯中进行搅拌透析,在4℃下透析3d,去掉多余L-Pd,其中每隔8h更换烧杯中超纯水一次。透析完成后将所得溶液量再固定为4mL冷冻待用,使用时稀释十倍。
(二)***特异性抗原的检测方法
(1)准备标准96孔酶标板,依次使用纯水、pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液进行清洗;
(2)将100μL浓度为2μg/mL的Ab1溶液加入(1)所处理过的酶标孔中,在4℃下过夜放置孵育;
(3)使用pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液对(2)中酶标孔缓慢清洗三次,加入1%的BSA溶液进行封闭,1h后再次使磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(4)将100μL浓度为0.0001-1000ng/mL的PSA溶液依次加入(3)处理过的酶标孔中,37℃孵育2h后,使用pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次;
(5)取100μL浓度为1μg/mL Ab2@L-Pd溶液加入(4)所处理的酶标孔中,37℃下孵育1h后,使用pH=7.0~7.4的磷酸盐缓冲液缓慢清洗三次,加入75mM的TMB溶液100μL,再加入200μL pH=4.0~4.5的磷酸盐缓冲溶液,室温下于325nm波长的紫外灯照射下放置10min。
本发明所述检测***特异性抗原的水溶性化学生物免疫传感器的应用方法,具体步骤如下:
(1)紫外照射后取酶标板中混合溶液于微量比色皿中,置于紫外分光光度计进行测试,扫描范围为550~800nm,将在660nm范围处出现峰值,记录吸光度峰值;
(2)记录不同浓度下的***特异性抗原所对应的吸光度峰值;
(3)利用标准曲线法取得待测样品中***特异性抗原浓度,检测范围为0.0001~1000ng/mL,LOD达到30fg/mL(S/N=3)。
图1为L配体和L-Pd的制备流程图及结构模拟,其中(A)为L配体的制备流程图,(B为)L-Pd(B)的制备流程图及结构模拟。其中L-Pd的结构模拟为八面超分子纳米笼。
图2为步骤(2)中L-Pd的透射电镜图,其中可以看出L-Pd超分子纳米笼的尺寸较小,为大小约为1-2nm,呈点状分布。
图3为实施例3步骤(1)中L配体的核磁共振氢谱图,其中8.5ppm处为L四角苯环上的邻氮氢的峰,7.5ppm处为L四角苯环上的间氮氢的峰,7.0ppm为L配体中心苯环上的氢。由于二苯醚为高沸点溶剂难以去除,在7.0~7.5ppm处会出现溶剂峰等少量杂峰。此核磁共振氢谱说明了配体L的成功合成。
图4为对浓度分别为0.01、0.1、1ng/mL的PSA是否进行紫外光照的吸光度对比图,可以看出在L-Pd催化氧化TMB的能力受到紫外光的诱导,紫外光照能极大增强L-Pd的类氧化酶能力,而这种能力在没有紫外光照时极弱。
图5为改变所用磷酸缓冲溶液的pH值后检测10ng/mL的PSA溶液的吸光度变化值,可以看出pH=4.0~4.5为L-Pd催化氧化TMB的最佳pH范围。
图6为温度对L-Pd催化氧化TMB能力的影响。随着温度的升高,L-Pd催化氧化TMB的能力逐渐减弱,故从成本考虑20-25℃的室温为最佳温度范围。
图7所示为抗原浓度分别取10-4、10-3、10-2、0.1、1、10、100、1000ng/mL后吸光度随PSA抗原浓度变化的工作曲线。可以看出随着PSA浓度的增加,Ab2@L-Pd的含量增加,对TMB的催化氧化能力提高,蓝色逐渐加深,该体系的吸光度逐渐增加。
图8为吸光度与PSA抗原浓度的对数值的线性关系。可以看出吸光度与抗原浓度(ng/mL)的对数值呈良好的线性关系,其中R2=0.9983,故可根据吸光度的变化达到对PSA的含量进行准确定量的目的。
实施例4
将实施例3***特异性抗原(PSA)替换为血清中常见干扰物,其他与实施例3相同,***特异性抗原的检测方法同实施例3。其中,常见干扰物为牛血清蛋白(BSA)、OVA(卵清蛋白)、LZ(溶菌酶)、AA(抗坏血酸)、SUC(蔗糖)和GLC(葡萄糖)以及PSA溶液和以上所有干扰物与PSA的混合溶液。干扰物的浓度为100ng/mL。
图9为干扰物对***特异性抗原检测结果的影响。可以看出血清干扰物对吸光度并无较大影响,同时对PSA的含量检测也不受血清干扰物的影响,说明此化学生物传感器选择性较好,抗干扰能力较强,具有在实际检测中应用的潜力。
实施例5
将实施例3中***特异性抗原(PSA)替换为可对PSA进行表达的***上皮细胞,其他与实施例3相同,***特异性抗原的检测方法同实施例3。其中,***上皮细胞分别取:正常***上皮细胞(RWPE-1)、PSA低表达的***上皮细胞(DU145和PC3)以及PSA高表达的***上皮细胞(LNCaP和22RV1)。
图10为可对PSA进行表达的***上皮细胞的***特异性抗原检测结果。计算可得五种细胞中PSA的含量符合预期,RWPE-1、DU145和PC3中PSA的含量远低于LNCaP和22RV1中的PSA含量,证明该化学生物传感器可良好应用于实际样品的检测中。
实施例6
将实施例3中***特异性抗原(PSA)替换为浓度为1ug/mL的PSA溶液,并将制备的传感器放置3周,分别测量其在第1、2、3、4、5、6、7、14、21天时的吸光度峰值变化,其他与实施例3相同,制备得到的化学生物免疫传感器的使用方法同实施例3。
吸光度峰值变化如图11所示,可看出该传感器稳定性好,测量结果受时间影响较小,其中第21天的吸光度约为第1天的84.82%,说明该传感器在长时间放置后仍具有良好的检测能力,使用简便快捷。
实施例7
将实施例3中***特异性抗原(PSA)替换为分别加入0.1、1、10ng/mL PSA溶液的人造血清样品,其他与实施例3相同,制备得到的化学生物免疫传感器的使用方法同实施例3。
实施例7为使用加标回收法检测人造血清样品中的PSA浓度以评估该传感器检测分析实际样品的可行性和准确性,结果如表1所示。
表1加标回收法检测结果
由表1可以看出,传感器的回收率为99.8%-100.2%,RSD值为2.4%-8.8%,这表明该传感器可以应用于对PSA含量的实际检测,具有在***癌诊断分析中应用的巨大潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种检测***特异性抗原试剂盒,包括***特异性抗原检测探针,***特异性抗原一抗,非特异性蛋白以及显色底物;
所述***特异性抗原检测探针,包括***特异性抗原二抗和与所述***特异性抗原二抗化学结合的含Pd有机配合物L-Pd;
所述含Pd有机配合物L-Pd由有机配体L与(乙胺二烯)钯二硝酸盐自组装得到,所述有机配体L具有式I所示结构:
所述***特异性抗原二抗与含Pd有机配合物L-Pd的质量比为1:5~10;
所述化学结合的温度为0~4℃,时间为18~30h;
所述***特异性抗原检测探针的制备方法,包括以下步骤:
将***特异性抗原二抗与羧基活化剂混合,进行羧基活化,得到活化羧基的***特异性抗原二抗;
将所述活化羧基的***特异性抗原二抗与含Pd有机配合物L-Pd混合,进行化学结合,得到***特异性抗原检测探针;
所述显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
2.根据权利要求1所述的检测***特异性抗原试剂盒,其特征在于,所述含Pd有机配合物L-Pd的制备方法包括以下步骤:
(1)将4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、双-(4-吡啶)-胺、催化剂和有机溶剂混合,进行配合反应,得到有机配体L;
(2)将有机配体L、(乙胺二烯)钯二硝酸盐和水混合,进行自组装,得到含Pd有机配合物L-Pd。
3.根据权利要求2所述的检测***特异性抗原试剂盒,其特征在于,有机配体L、(乙胺二烯)钯二硝酸盐的质量比为1:1.5~2。
4.根据权利要求2所述的检测***特异性抗原试剂盒,其特征在于,所述配合反应的温度为160~180℃,时间为4~6天;
所述自组装的温度为45~55℃,时间为10~20h。
5.根据权利要求1所述的检测***特异性抗原试剂盒,其特征在于,还包括pH值为7.0~7.4的磷酸盐缓冲液和pH值为4~4.5的磷酸盐缓冲液。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111589344.7A CN114184789B (zh) | 2021-12-23 | 2021-12-23 | 一种***特异性抗原检测探针、一种检测***特异性抗原试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111589344.7A CN114184789B (zh) | 2021-12-23 | 2021-12-23 | 一种***特异性抗原检测探针、一种检测***特异性抗原试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114184789A CN114184789A (zh) | 2022-03-15 |
CN114184789B true CN114184789B (zh) | 2023-06-16 |
Family
ID=80544815
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111589344.7A Active CN114184789B (zh) | 2021-12-23 | 2021-12-23 | 一种***特异性抗原检测探针、一种检测***特异性抗原试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114184789B (zh) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1924581A (zh) * | 2005-08-30 | 2007-03-07 | 郑州安图绿科生物工程有限公司 | ***特异性抗原化学发光定量检测试剂盒 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20110069618A (ko) * | 2009-12-17 | 2011-06-23 | 주식회사 셀앤바이오 | 전립선암 진단용 키트 및 진단방법 |
AU2018100220A4 (en) * | 2018-02-20 | 2018-03-22 | Li, Mingji MR | A PtCu oxidase mimic with nanoflower structure |
CN108445142B (zh) * | 2018-03-12 | 2021-02-09 | 国家纳米科学中心 | 一种铑片纳米酶在模拟生物酶催化中的应用 |
CN108872217A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-11-23 | 青岛农业大学 | 二氧化铱纳米酶的合成与应用 |
AU2019100367A4 (en) * | 2019-04-05 | 2019-05-09 | Chen, Qianqian Miss | Synthesis of CoFe Cube Nanozymes and a New Method for Ferrous Ions Detection |
CN110632040B (zh) * | 2019-05-10 | 2022-03-29 | 长沙理工大学 | 一种血清中***特异性抗原的分析方法 |
CN112206771A (zh) * | 2019-07-12 | 2021-01-12 | 华南理工大学 | 一种三元金属Pd-M-Ir纳米酶及其制备方法和应用 |
CN111198222B (zh) * | 2020-01-13 | 2021-09-07 | 云南大学 | 一种检测***特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备及使用方法 |
AU2020100704A4 (en) * | 2020-05-05 | 2020-06-11 | Chen, Shumeng Miss | A method of synthesis of ultrathin palladium nanosheet with peroxidase mimetic activity for the colorimetric detection of H2O2 |
CN113084187A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-07-09 | 合肥工业大学 | 一种金银钯三金属过氧化物模拟酶的制备方法及其应用 |
CN113333024B (zh) * | 2021-05-31 | 2022-03-25 | 云南大学 | 一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料及其检测诺如病毒的试剂盒和应用 |
CN113770346B (zh) * | 2021-08-09 | 2023-11-03 | 北京化工大学 | 一种具有过氧化物酶活性的钯纳米片及其制备方法 |
-
2021
- 2021-12-23 CN CN202111589344.7A patent/CN114184789B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1924581A (zh) * | 2005-08-30 | 2007-03-07 | 郑州安图绿科生物工程有限公司 | ***特异性抗原化学发光定量检测试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114184789A (zh) | 2022-03-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Chen et al. | Fluorescence immunoassay based on the phosphate-triggered fluorescence turn-on detection of alkaline phosphatase | |
RU2566714C2 (ru) | Иммунохимическое определение одиночных мишеней | |
Long et al. | Multiplex immunodetection of tumor markers with a suspension array built upon core–shell structured functional fluorescence-encoded microspheres | |
Wu et al. | Highly sensitive and selective surface plasmon resonance biosensor for the detection of SARS-CoV-2 spike S1 protein | |
CN111208178B (zh) | 一种基于钴基金属有机框架物双重放大苝四羧酸信号构建电化学发光传感器的方法 | |
Shi et al. | Signal amplification in capillary electrophoresis based chemiluminescent immunoassays by using an antibody–gold nanoparticle–DNAzyme assembly | |
EP2699691B1 (en) | New method for enzyme-mediated signal amplification | |
Feng et al. | A novel strategy for multiplexed immunoassay of tumor markers based on electrochemiluminescence coupled with cyclic voltammetry using graphene-polymer nanotags | |
Hong et al. | A universal, portable, and ultra-sensitive pipet immunoassay platform for deoxynivalenol detection based on dopamine self-polymerization-mediated bioconjugation and signal amplification | |
CN114113582B (zh) | 金属有机框架纳米酶生物探针和elisa试剂盒 | |
CN110632040B (zh) | 一种血清中***特异性抗原的分析方法 | |
Lin et al. | An enzyme-free fluorescent biosensor for highly sensitive detection of carcinoembryonic antigen based on aptamer-induced entropy-driven circuit | |
CN109207561B (zh) | 基于dna-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法 | |
CN112763562B (zh) | 一种用于三磷酸腺苷检测的枝桠型步行机适体电化学传感器制备方法 | |
CN110850085A (zh) | 异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
CN114544934A (zh) | 一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条及其应用 | |
CN114184789B (zh) | 一种***特异性抗原检测探针、一种检测***特异性抗原试剂盒 | |
CN109536574A (zh) | 一种简易检测凝血酶的比色法 | |
CN114230804B (zh) | 一种过氧化铜/氢键有机骨架纳米材料及其探针、一种检测脂质运载蛋白-2试剂盒 | |
CN110749635B (zh) | 纳米复合材料、电化学microRNA生物传感器的制备方法及应用 | |
Li et al. | CRISPR/Cas12a-based fluorescence immunoassay: combination of efficient signal generation with specific molecule recognition | |
CN108760695B (zh) | 一种基于pret的磷光探针定量检测凝血酶的方法 | |
CN108956991B (zh) | 一种荧光共振能量转移生物传感器及其应用 | |
CN112300779A (zh) | 一种聚合增强电化学发光探针及其制备方法和应用 | |
CN113185578B (zh) | 一种模块化多肽-aie探针mp及其合成方法、包含其的试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |