CN114164188B - 牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解芦苇秆生产漆酶的方法及应用 - Google Patents

牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解芦苇秆生产漆酶的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种牦牛瘤胃自然共生的厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解芦苇秆生产漆酶的方法及应用，所述的共培养物为YakQH5，由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)组成，于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19299。所述的混合培养物YakQH5能够降解芦苇杆，并产生大量漆酶，漆酶活性高达60.5U/mL，具有重要的工业应用价值。

Description

牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解芦苇秆生产漆酶的 方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌共培养物 降解芦苇秆生产漆酶的方法及应用。
背景技术
传统能源物质面临枯竭的危险，且这些传统能源物质在使用时产生了大量温室气体，污 染环境。缓解当今人类而临的“粮食、能源、环境”三大危机是实现农业可持续发展战略的 重要途径之一。粗饲料是指天然水分含量在60％以下，干物质中粗纤维含量高于18％，并以 风干物形式饲喂的饲料，包括干草、作物秸秆、树叶、果皮、酒糟和秕壳等。粗饲料的纤维 含量高，蛋白质、矿物质含低，适口性差。秸秆、干草和秕壳等粗饲料的主要成分是木质纤 维素，包括木质素、纤维素和半纤维素。秸秆、干草和秕壳等“用则利，弃则害”，它们作 为废弃物会带来环境污染等害处，而作为重要的可再生资源加以充分利用则可实现变废为宝， 造福人类。
粗饲料中的木质素和半纤维素以共价键的形式形成一种天然的屏障，将纤维素包裹在其 中，防止纤维素被酶解。木质纤维素中的纤维素、半纤维素、木质素三者共同形成了致密结 构。木质素是一类由5-羟基松柏醇、对香豆醇、芥子醇和松柏醇形成的酚类聚合物，以共价 键的形式紧密的连接在一起，是稳定纤维素和半纤维素的核心骨架。木质素化学结构稳定， 导致采用传统方式很难降解。粗饲料的预处理包括物理、化学、生物学方法，目前采用能分 泌有效酶类的微生物降解秸秆、干草和秕壳等粗饲料具有耗能小、成本低、操作安全、无污 染的特点而引起国内外越来越多的广泛关注。
木质素的生物降解在环境和能源科学中具有重要意义。木质纤维素的微生物降解是由于 其分泌的一系列酶的共同作用。在这一降解过程中，木聚糖酶、羧甲基纤维素酶和漆酶等酶 系相互协同作用，在降解木质纤维素的反应过程中发挥着十分重要的作用。漆酶是木质素降 解酶系中的一个重要成员，是木质素降解过程中的关键酶，通过攻击木质素中酚类化合物来 实现对木质素的降解，通常从木质素中汲取电子把空气中氧气还原为水。
漆酶最早于1883年在日本的漆树中被发现并分离出来，迄今有关漆酶的研究已经持续了 140多年。漆酶在自然界中广泛分布于高等植物、微生物、藻类、昆虫和无脊椎动物中，多 种生物都能够产生漆酶，目前主要来源是土壤中的细菌和各类好氧真菌。漆酶是一种可以氧 化多种酚类和非酚类化合物的多铜氧化酶，属于铜蓝氧化酶，以分子氧作为最终电子受体， 能催化木质素和一大类酚类及芳胺类物质的聚合、降解及转化。漆酶的肽链主要由500个左 右的氨基酸组成，糖配基占整个分子的10％-45％。铜离子参与漆酶活性中心的构建，共同构 成漆酶结构中最重要的部分，决定着漆酶的活力和特异性，是结合底物及直接参与键断裂形 成的区域。由于漆酶的底物十分广泛且具有非底物特异性，催化生成的产物不污染环境，催 化反应的副产物只有水，所以漆酶作为一种绿色生物催化剂在各领域中均有巨大的应用潜力， 尤其是在食品工业、造纸工业、纺织工业、医药、合成化学、化妆品、土壤生物修复、生物 降解、生物燃料电池、环境保护等方面起着重要作用。漆酶作为一种生物酶，能够将酚类、 胺类、羧酸类等难降解的污染物在温和的条件下降解为对环境毒性更弱的小分子物质，有着 巨大应用潜力和广阔的市场前景。目前人们对漆酶研究主要是担子菌门中的白腐真菌所分泌 的漆酶，以及里氏木霉也是工业用漆酶的重要生产菌株。
漆酶在各方面的优越性能使得人们对其关注度越来越高。虽然对于漆酶的研究已经取得 较大进展，生化研究、三维结构、催化机理等都有了进一步的研究，但是有关漆酶实际应用 的研究还很肤浅，漆酶测定方法及测定体系差异较大，对酶活、产量之间的比较存在一定的 难度，有关漆酶的大规模工业化生产报道较少，漆酶的合成成本较高，生产水平较低等，所 以筛选优良的高产漆酶菌株、获得性能稳定的漆酶、实现漆酶的高效生产迫在眉睫。
厌氧真菌在木质纤维素的降解中起到了重要作用。厌氧真菌中的大多数种属都能够通过 其假根分泌高活性酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、酯酶和漆酶等，这些酶类协同作用分解 利用结构复杂的，晶体状的纤维素、半纤维素、果胶和木质素等物质。一些甲烷菌可以利用 厌氧真菌的代谢产物，如氢气、甲烷、甲酸等，与厌氧真菌形成稳定的共培养物，即：厌氧 真菌和甲烷菌共培养物，这个过程促进了厌氧真菌和甲烷菌的生长，同时显著提高了厌氧真 菌降解木质纤维素所产生的各种木质纤维素降解酶的活性和对木质纤维素的降解能力。
牦牛适应高寒生态条件，耐粗饲、耐严寒、耐低氧的恶劣自然环境。牦牛瘤胃内栖息着 独特的，复杂多样，大量的微生物群落协同高效降解野牧草为牦牛提供生存能量和营养物质。 本发明意外发现，采用从青海省海南州的放牧牦牛瘤胃中分离出的厌氧真菌和甲烷菌共培养 物YakQH5降解芦苇秆能够生产高活性漆酶，产生的漆酶活性高达60.5U/mL，远高于降解其 它秸秆等废弃物(小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、高粱秸秆、燕麦秸秆、大豆秸秆、棉花 秸秆、胡麻秸秆、芝麻秸秆、黄豆秸秆、土豆秸秆、番茄渣、小麦壳、水稻壳、瓜子壳、核 桃壳、花生壳、椰子壳、麸皮、苹果皮、黄豆皮、香蕉皮、玉米皮、剑麻、木屑、羊草)所 漆酶的活性，取得了意想不到的效果。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种自然共生的混合培养物降解废弃物生产漆 酶的方法，所述的混合培养物由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)组成，所述的方法包括如下步骤：
(1)混合培养物菌剂的制备：向以小麦秸秆为底物的厌氧培养基中接入混合培养物，加 入复合抗生素，厌氧培养即得到高活力的菌剂；
(2)生产漆酶：吸取步骤(1)所得菌剂接入以芦苇秆为底物的厌氧培养基中，加入复 合抗生素，厌氧培养，即得。
优选地，所述的混合培养物为YakQH5(Neocallimastix frontalis和Methanobrevibacter gottschalkii的混合培养物)，于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。所述混合培养物YakQH5中Neocallimastix frontalis的ITS序列如SEQ ID NO.1所示，Methanobrevibactergottschalkii的16S rDNA序列 如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述步骤(1)中混合培养物的接种量为10％v/v。
优选地，所述步骤(2)中菌剂的接种量为10％v/v.
优选地，所述步骤(2)中芦苇秆含量为1％w/v。
优选地，所述步骤(1)中厌氧培养的温度为39℃，时间为72h。
优选地，所述步骤(2)中厌氧培养的温度为39℃，时间为120h。
优选地，所述复合抗生素由1600IU/mL的青霉素钠和2000IU/mL的硫酸链霉素组成。
优选地，所述复合抗生素的加入量为1％v/v。
优选地，所述厌氧真菌培养基的配方为：酵母膏1.0g，NaHCO3 7.0g，1.0g/L刃天青1mL， L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，盐溶液Ⅰ82.5mL，盐溶液II 16.5mL，蒸馏水定容至1000mL；所述 的盐溶液I配制步骤如下：NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL；所述的盐溶液II配制步骤如下：4g K2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
优选地，所述的步骤(2)中，接入芦苇杆后除氧，充入二氧化碳，高温高压灭菌。
本发明的有益效果是：本发明采用Neocallimastix frontalis和Methanobrevibacter gottschalkii的自然共生的混合培养物YakQH5共培养物厌氧发酵降解芦苇秆，能用于漆酶的 生产，产生的漆酶活性达到最高值60.5U/mL，显著高于降解其它底物(小麦秸秆、水稻秸秆、 玉米秸秆、高粱秸秆、燕麦秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆、胡麻秸秆、芝麻秸秆、黄豆秸秆、 土豆秸秆、番茄渣、小麦壳、水稻壳、瓜子壳、核桃壳、花生壳、椰子壳、麸皮、苹果皮、 黄豆皮、香蕉皮、玉米皮、剑麻、木屑、羊草)所产漆酶的活性，具有显著的进步；而且本 发明中采用的共培养物可以通过保藏在体外存活传代，便于推广，为生产提供了极大的方便。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等， 如无特殊说明，均从商业途径得到；所使用的培养基为本专利发明人对于常规的厌氧真菌培 养基进行了改良和简化后的配方，如下：
厌氧真菌培养基配方：酵母膏1.0g，NaHCO37.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐 酸盐1.7g，盐溶液I 82.5mL，盐溶液II 16.5mL，蒸馏水定容至1000mL；所述盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL； 所述盐溶液II包括4gK2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
实施例1共生培养物YakQH5菌剂的制备
吸取1mLNeocallimastix frontalis和Methanobrevibacter gottschalkii的混合培养物YakQH5 接种到含有9mL以风干粉碎的小麦秸秆为底物的厌氧培养基的20mL亨氏厌氧管中，同时加 入0.1mL复合抗生素(终浓度为1600IU/mL青霉素和2000IU/mL硫酸链霉素)，39℃厌氧培 养72h，即达到生长高峰，此时发酵液为高活力菌剂。
实施例2共培养物YakQH5降解废弃物生产漆酶
在100mL体积厌氧发酵瓶中盛45mL液体基本培养基，分别以0.5g干燥粉碎后的小麦秸 秆、水稻秸秆、玉米秸秆、高粱秸秆、燕麦秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆、胡麻秸秆、芝麻秸秆、黄豆秸秆、土豆秸秆、番茄渣、小麦壳、水稻壳、瓜子壳、核桃壳、花生壳、椰子壳、 麸皮、苹果皮、黄豆皮、香蕉皮、玉米皮、剑麻、木屑、羊草和芦苇秆作为底物。除氧，然 后高压灭菌。把传代培养72h的混合培养物YakQH5用无菌注射器吸取5mL分别接种到上述 加有27种废弃物底物的厌氧培养基中，同时加入0.5mL复合抗生素(终浓度为1600IU/mL 青霉素和2000IU/mL硫酸链霉素)，39℃厌氧培养5天，共设置3个平行实验。
实施例3漆酶含量测定
隔24h测定实施例2中厌氧瓶中发酵液的漆酶活性。漆酶活力测定方法(采用ABTS法)：
(1)发酵液在4℃，5000r/min条件下离心15min，取上清液即为粗酶液；
(2)配制0.5mmol/LABTS溶液：试剂一：0.0384gABTS定容到10mL；试剂二：0.0134g过硫酸钾定容到10mL，试剂一与试剂二1：1混合，12h避光后得7mmol/L ABTS溶液，稀 释14倍后得到0.5mol/LABTS溶液；
(3)吸取1.00mL粗酶液加2.00mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6.8)稀释3倍，将稀释好的酶液在39℃下水浴30min，测定时取2.9mL ABTS溶液，加入0.1mL已预热的稀释酶液，迅 速放入紫外分光光度计中，记录吸光度值从一点(A1)变化到另一个点(A2)的时间t，根据 酶活力定义计算酶活力：
Figure BDA0003376730680000051
A1、A2为吸光度值变化的两个端值，t为吸光度值从A1增加到A2经历的时间(s)；酶活 力单位定义为每分钟氧化1μmol底物所需的酶量为1个酶活力单单位(U)；酶活力单位为U/mL。
27种废弃物成分分析如表1所示，漆酶活性测定结果如表2所示。
表1 27种废弃物底物的木质纤维素成份
Figure BDA0003376730680000052
表2共培养物YakQH5在5天培养期分别降解27种废弃物所产的漆酶活性
Figure BDA0003376730680000061
注:a,b,c,d表示差异显著性(p<0.05)
上述实验结果表明：5天培养期内，Neocallimastix frontalis和Methanobrevibacter gottschalkii的共生培养物YakQH5分别降解27种废弃物产生胞外酶—漆酶的活性达到的最高 值分别为：小麦秸秆11.0U/mL、水稻秸秆8.7U/mL、玉米秸秆9.0U/mL、高粱秸秆8.3U/mL、 燕麦秸秆10.6U/mL、大豆秸秆7.0U/mL、棉花秸秆6.5U/mL、胡麻秸秆15.0U/mL、芝麻秸秆 6.1U/mL、黄豆秸秆11.5U/mL、土豆秸秆7.1U/mL、番茄渣30.0U/mL、小麦壳9.2U/mL、水 稻壳1.1U/mL、瓜子壳0、核桃壳0、花生壳0、椰子壳1.8U/mL、麸皮9.3U/mL、苹果皮2.9U/mL、 黄豆皮15.0U/mL、香蕉皮2.0U/mL、玉米皮25.0U/mL、羊草33.8U/mL、剑麻6.4U/mL、木 屑1.9U/mL、芦苇秆60.5U/mL，其中降解芦苇秆所产的漆酶的活性高达60.5U/mL，显著高 于降解其它底物所产漆酶的活性，具有重要的工业应用价值。
序列表
<110> 甘肃省科学院生物研究所
<120> 牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解芦苇秆生产漆酶的方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 784
<212> DNA
<213> 厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)
<400> 1
agtgaatcct tcggattggc ttctttttct ggcaacagaa tttagtcgct gaaaagttgg 60
gcaaacttgg tcatttagag gaagtaaaag tcgtaacaag gtttccgtag gtgaacctgc 120
ggaaggatca ttaataaatg gctccggttt ttttaaaatg gagcacttaa taatccctac 180
cctttgtgaa tttgttgttt gaaataattt tttttaaaaa aaaattattg aattgtcggg 240
ccctgtttaa ttggaatcct tttcggacgt gaaaattccc aaggggataa ggcaattcaa 300
taaatttttt taaaaaagac ctttttttta aattaaactt tttgtattca ttttgtctaa 360
aatttatttt ataatataaa aacaactttt gacaatggat ctcttggttc tcgcaacgat 420
gaagaacgca gcaaaatgcg ataagtagtg tgaattgcag aatacgtgaa tcatcgaatc 480
ttcgaacgca tattgcactt ttttagttta ctaaaaaagt atgtctgttt gagtatcagt 540
aaaatattct cataaaaaat attttgtttt tatggttttg agtgttttac aacggataca 600
agttgtttca ctttaaattt atgtagaaat tggatttttt tttaaatttt aattaaaatt 660
ggataaaatt ttcccgtaaa aaggaattaa ctttacacaa ttttattttt taaaaacata 720
acggtccgac atttaaaagg aaatttatac caaaaataac ttgatctcaa atcagattta 780
cggg 784
<210> 2
<211> 1169
<212> DNA
<213> 甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)
<400> 2
tactctggga actgaggata atactggata ggcaattttt cctgtaatgg ttttttgttt 60
aaatgttttt tcgcctaagg atgggtctgc ggccgattag gtagttggtt aggtaatggc 120
ttaccaagcc tttgatcggt acgggttgtg ggagcaagag cccggagatg gaacctgaga 180
caaggttcca ggccctacgg ggtgcagcag gcgcgaaacc tccgcaatgt gagaaatcgc 240
gacgggggga tcccaagtgc tattcttaac gggatagctt ttctttagtg taaagagctt 300
ttggaataag agctgggcaa gaccggtgcc agccgccgcg gtaacaccgg cagctctagt 360
ggtagcaatt tttattgggc ctaaagcgtc cgtagccggt ttaataagtc tctggtgaaa 420
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ctgcttcagt gccgaaggga agctgttaag tccgccgcct gggaagtacg gtcgcaagac 720
tgaaacttaa aggaattggc gggggagcac cacaacacgt ggagcctgcg gtttaattgg 780
attcaacgcc ggacatctca ccagaggcga cagctgtatg atagccaggt tgatgacttt 840
gcttgactag ctgagaggag gtgcatggcc gccgtcagct cgtaccgtga ggcgtcctgt 900
taagtcaggc aacgagcgag acccacgccc ttagttacca gcttgtcctt tttttggatg 960
atagggcaca ctaaggggac cgcctatgat aaataggagg aaggagtgga cgacggtagg 1020
tccgtatgcc ccgaatcctc tgggcaacac gcgggctaca atggctggga caatgggttc 1080
cgacaccgaa aggtggaggt aatcctctaa acttagtcgt agttcggatt gaggactgta 1140
actcgttctc atgaagctgg aatgtgtag 1169

Claims (9)

1.一种自然共生的混合培养物降解废弃物生产漆酶的方法，其特征在于，所述的混合培养物由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)的组成，所述的方法包括如下步骤：
(1)混合培养物菌剂的制备：向以小麦秸秆为底物的厌氧培养基中接入混合培养物，加入复合抗生素，厌氧培养，即得到高活力的菌剂；
(2)生产漆酶：吸取步骤(1)所得菌剂接入以芦苇秆为底物的厌氧培养基中，加入复合抗生素，厌氧培养，即得；所述的自然共生的混合培养物为YakQH5，于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中混合培养物的接种量为10％v/v。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中菌剂的接种量为10％v/v。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中芦苇秆含量为1％w/v。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中厌氧培养的温度为39℃，时间为72h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中厌氧培养的温度为39℃，时间为120h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合抗生素由终浓度为1600IU/mL的青霉素钠和2000IU/mL的硫酸链霉素组成；所述复合抗生素的加入量为1％v/v。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述厌氧培养的培养基配方为：酵母膏1.0g，NaHCO3 7.0g，1.0g/L刃天青1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，盐溶液Ⅰ82.5mL，盐溶液II16.5mL，蒸馏水定容至1000mL；所述的盐溶液I配制步骤如下：NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO43g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL；所述的盐溶液II配制步骤如下：4g K2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，接入芦苇杆后除氧，充入二氧化碳，高温高压灭菌。
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