CN114164138A - 一种利用不动杆菌属降解石油的方法 - Google Patents

一种利用不动杆菌属降解石油的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用不动杆菌属降解石油的方法，不动杆菌属(Acinetobacter sp.)HZ3(现保藏于广东省微生物菌种保藏中心，编号为(GDMCC 61775)，工艺步骤包括：(1)不动杆菌属HZ3的筛选和分离；(2)不动杆菌属HZ3的鉴定；(3)石油降解率的测定。本发明利用不动杆菌属的生物降解作用，对石油进行降解，10～12小时对石油中正构烷烃的降解率为5％～10％，对多环芳烃的降解率为20％～30％，有效降低石油污染。

Description

一种利用不动杆菌属降解石油的方法
技术领域
本发明属于微生物学技术在环保领域的应用，具体涉及一种利用不动杆菌属降解石油的方法，用于利用微生物的代谢作用对石油进行降解代谢，该技术利用生物降解法，为石油降解提供了一种高效而普遍的方式，该降解过程采用的是不动杆菌属，不动杆菌属(Acinetobacter sp.) HZ3(专利保藏号GDMCC 61775)是从油污土壤中分离出来的土著细菌，营养类型属于化能自养兼性异养菌。
背景技术
石油是一种含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳烃、脂环烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、环烷酸类等)的复杂混合物。有的石油样品含有200～300种烃类，分子量从16(甲烷)至1000左右，其物理状态有气体，挥发性液体，高沸点液体及固体。石油中的元素以碳和氢为主，其中碳占83％～87％，氢占11％～14％，含有少量的硫(0.06～0.8％)、氮(0.02～1.70％)和氢(0.08～1.82％)。石油中含有极少量的金属元素，如镍、钒、铁、铜等。石油中最常见的污染物质称为BTEX，即苯、甲基苯、乙基苯、二甲基苯(包括3种异构体)。石油已成为人类最主要的能源之一。但是，随着经济的发展，人类对能源的需求也不断扩大，各国都加快了对油气资源的开发利用，从沙漠到海洋、从无人区到人口稠密区，越来越多的油气井出现在全球各地。随着石油开采和使用量的增加，大量的石油及其加工品进入环境，在其开采、运输、炼制和使用过程中不可避免的对环境造成了污染，给人类和其它生物带来危害。
自然界中能够降解石油烃类化合物的微生物种类有数百种，七十多个属，主要是细菌、真菌和藻类三大类型的生物，多存在于土壤环境中和水体环境中。细菌在海洋生态***中占主导地位，而在淡水和陆地生态***中真菌则是更重要的微生物种类。水环境中能较好地降解石油烃的细菌有假单胞菌属、无色杆菌属、节杆菌属、微球菌属、诺卡氏菌属、不动杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、黄杆菌属，真菌有假丝酵母菌属、红酵母菌属、掷抱酵母菌属等。在受污染的水体中除细菌和酵母菌外，还有许多丝状菌。在土壤中，真菌的种属比细菌多，土壤中主要降解石油烃的降解菌除上述水体中的菌外，还有分枝杆菌属。藻类也是降解石油烃污染物的微生物种群之一，如颤藻属(Oscillatoria)等。这些藻类能对多种石油烃进行降解，包括苯、酚和萘等。张海荣等从大港油田区石油污染盐碱化土壤和油泥中筛选出10株耐盐碱石油烃降解菌，经鉴定分别为苍白杆菌属、葡萄球菌属、迪茨菌属、棒状杆菌属、无色杆菌属、微杆菌属、芽孢杆菌属，耐盐碱能力实验表明石油烃降解菌在不同微生物种属中广泛存在，并具有较好的耐盐碱特性。李兵等从辽河油田低温石油样品中筛选出一株低温石油降解菌LHB16，经鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，LHB16菌株能够有效地降解石油烃(尤其是长链烷烃)。Daane等从污染的底泥以及高盐沼泽中分离出以多环芳烃为唯一碳源和能源的菌株，对石油烃具有较好的降解效果。Stauffert等研究了反硝化细菌在石油污染降解中的作用，发现反硝化变形杆菌在石油污染中大量存在，沉积物生物扰动分析表明它们在石油烃的降解中起关键作用。也有研究报道了在硫酸还原菌 Deltaproteobacterium N47中发现与多环芳烃降解相关的代谢基因。
自然环境中的微生物极其丰富，但没有受石油污染前，其自然群落结构或微生物种群并不适合石油污染环境。当其生存环境被污染后，微生物群落结构会发生变化，能适应石油污染的种群继续发展，而一些不能适应石油污染的种群可能会受到抑制，或被完全淘汰。在未受石油污染的生态***中，石油降解菌不足土壤中微生物总数的0.1％；而在受石油污染的生态***中可达到100％，降解菌数升高几个数量级。微生物降解石油烃类化合物的能力取决于微生物群落和种属组成。研究表明，当菌群处于石油污染环境中时，能降解和利用烃类化合物的微生物数量会急剧增长。Atlas报道在正常环境下石油烃降解菌一般只占微生物群落的 1％。而当环境受到石油污染时，降解菌的比例可以提高到10％。石油污染能够诱导降解石油的微生物种群的生长，在受石油污染地区的降解菌的比例和数量明显上升，污染程度越重降解菌数量越多，说明石油污染能够使石油降解菌发生富集。
石油污染土壤涉及到环境科学、环境工程、生态学、地理学、植物学、分子生物学、微生物学、地质学、土壤学、植物营养学、农学等多个专业领域，但其处理方法主要有物理法、化学法和生物法。污染土壤的生物修复是指利用特定的生物植物、微生物或原生动物吸收、转化、清除或降解环境污染物，实现环境净化、生态效应恢复的生物措施。生物修复具有处理成本低、修复效果好、无二次污染、对环境影响小等优点。因此，该技术已被国内外专家学者认为是生态环境保护领域最有价值和最具生命力的处理技术，成为研究的热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种利用不动杆菌属降解石油的方法，利用不动杆菌属的生物降解作用，对石油进行降解，10～12小时对石油中正构烷烃的降解率为5％～10％，对多环芳烃的降解率为20％～30％。
为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现：
一种利用不动杆菌属降解石油的方法，按照以下工艺步骤进行：
(1)目标菌种的筛选和分离
①配制基础盐培养基(MSM)：按照MSM配比配制液体培养基， (NH4)2SO41.5～2.0g/L；MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/L；CaCl2·2H2O0.01～0.05g/L； FeSO4·7H2O0.001～0.005g/L；Na2HPO4·12H2O 1.5～2.0g/L；KH2PO41.5～2.0 g/L；蒸馏水1000mL；120℃～130℃灭菌20～40min，固体MSM培养基需要加入15～25g/L琼脂粉，其它成分与液体培养基相同；
②革兰氏阴性菌和苯耐菌选择性富集：取采集新鲜的土样2～5g接入配好的MSM培养基中，以苯作为唯一碳源，终浓度为0.1％(V/V)，苯加入前经0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，置于摇床培养，接种瓶以 100～120转/分的速度在25～35℃振荡到至浑浊状态培养10h～12h，同样的方法将培养的菌液再次转接富集；
③将液体培养物均匀涂布到固体MSM培养基上，28℃恒温培养箱培养4-5d；
④挑取单菌落多次划线分离、液体富集培养，分离出石油降解菌；
⑤将单个菌落转移到固体MSM培养基中，以增加其生长；该菌株纯化后保菌，并不断转接，以备后续实验。
(2)目标菌种的鉴定
使用通用引物27F/1492R对16S rRNA基因进行了靶向扩增，以获得(1)中分离株的物种信息。纯化的扩增子由广东省微生物菌种保藏中心进行测序，将获得的序列通过BLASTn查询16S rRNA序列数据库，根据检索到的序列，使用Mega 6.0软件分析该分离株的***发育关系。
(3)石油降解率测定
①将分离出的处于指数期(密度约为1×107-1×108菌群形成单位 /ml)的石油降解菌株接种到液体MSM培养基中，置于摇床培养，接种瓶以100～120转/分的速度在25～35℃振荡到至浑浊状态培养10h～12h，然后取2ml菌液接入含200微升石油的液体MSM培养基中，作为实验组；对照组则是不加菌液，只加石油的液体MSM培养基；为了避免数据波动，每次降解测定重复三次；所有的容量瓶在25℃～35℃、100～120转/分的条件下培养10～12h，石油浓度使用气相色谱-质谱法(GC/MS)测量，石油降解率由降解物与初始量的比值确定；
②石油降解菌的实际应用：利用模拟样品检测菌株对石油的降解能力，尝试利用该菌株进行环境保护或修复。
与现有技术相比，本发明技术方案带来的有益效果如下：
(1)来源广泛，成本低廉，无毒无害。目前，石油降解菌多筛选自受过石油污染的土壤或水体，主要有假单胞菌、黄杆菌、不动杆菌、芽孢杆菌、微球菌、红球菌、产碱杆菌等石油降解菌。相比于其他石油降解菌，不动杆菌属均有广泛存在，易于提取，培养环境要求简单，环境耐受能力强等优点。同时，该菌种不具有致病性，使用安全，代谢产物简单，不会造成二次污染。
(2)本发明的去除石油的方式适用于提炼厂或焦化、炼油、石油化工厂或受石油污染的土壤。利用特效降解菌株，可为石油污染土壤的处理提供一个独特而有效的解决途径。相比于物理和化学处理方法，本方法采用生物降解，由于微生物进行有效降解，所以无化学品残留，不会造成二次污染，每年可修复至少100亩污染土地和一平方公里范围的地下水，可以对受污染的场地进行原位修复，不受时间和场地限制，且代谢产物简单，不会产生二次污染。成本较低，方法简单，治理难度低，可以满足多数环保需求。相比于化学方法，本发明在自然条件下进行，不采用溶剂、各种盐和酸碱等物质，条件温和，不产生有毒有害气体，生物降解和土壤修复几乎在同一个过程完成，节省了社会资源。
(3)本发明的不动杆菌属HZ3是从油污土壤中分离出来的细菌，土样来源于阜新东梁油库附近土壤，属于土著微生物。采集距离地面0～60cm 的污染土样10份，同一平面多点采集。样品采集完毕后立即被运送到一个恒温约为4℃的冰箱中。在此土样中分离提取的微生物均属于当地土壤的土著微生物，适应该处生长的地质条件，具有本地优势，抗逆性较强。与外来微生物相比，该不动杆菌属对当地物理和化学因素适应能力强，原位修复应用潜力更大；不需要特异性培养，生化性质稳定，变异性和致病性可能小。
(4)本发明对菌种筛选并研究其对石油降解的情况，并对菌株降解酶基因进行初步探求，为石油污染的高效修复提供功能菌株，并为细菌修复污染的机理研究奠定基础。
附图说明
图1为本发明一种利用不动杆菌属降解石油的工艺流程图。
具体实施方式
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，详细说明如下。
本发明涉及到的生物保藏样品不动杆菌属HZ3，现保藏于广东省微生物菌种保藏中心，编号为GDMCC No：61775，地址是广州市先烈中路100 号大院59号楼5楼；该生物材料(株)的存活性经保藏中心于2021年7 月6日检测，结果是：“(1)存活√”。
本实施例提供的一种利用不动杆菌属降解石油的方法，采用的土样来自于辽宁省阜新市东梁油库附近土壤，参看图1，按照以下工艺步骤进行：
(1)目标菌种的筛选，分离：
①样品采集：采集距离地面0-60cm的污染土样10份，同一平面多点采集，样品采集完毕后立即被运送到一个恒温约为4℃的冰箱中，在此土样中分离提取的微生物均属于当地土壤的土著微生物，适应该处生长的地质条件，对于该环境的物质分解和土壤修复具有有效性；
②革兰氏阴性菌和苯耐菌的选择性富集：配制基础盐培养基(MSM)：按照MSM配比配制液体培养基，(NH4)2SO41.5～2.0g/L；MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/L；CaCl2·2H2O0.01～0.05g/L；FeSO4·7H2O0.001～0.005g/L； Na2HPO4·12H2O 1.5～2.0g/L；KH2PO41.5～2.0g/L；蒸馏水1000mL。120℃～130℃灭菌20～40min，固体MSM培养基需要加入15～25g/L琼脂粉，其它成分与液体培养基相同；取采集新鲜的土样2～5g接入配好的MSM 培养基中，以苯作为唯一碳源，终浓度为0.1％(V/V)，苯加入前经 0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，置于摇床培养，接种瓶以100～120转/ 分的速度在25～35℃振荡到至浑浊状态培养10h～12h，同样的方法将培养的菌液再次转接富集；菌的富集在含有50mL MSM培养基的250mL三角瓶中进行，取富集的菌液5～10mL接入配好的50mLMSM培养基中，置于 25℃，转速100r/min摇床培养，同样的方法将培养的菌液再次富集2次，将富集菌液5～10mL加入到50mL灭菌的MSM培养基进行摇床培养；
③当培养基颜色由澄清变为浑浊时，将1～3mL菌液均匀涂布到固体 MSM培养基上，28℃恒温培养箱培养4-5d；
④挑取单菌落多次划线分离、液体富集培养，分离出石油降解菌；
⑤将单个菌落转移到固体MSM培养基中，以增加其生长；该菌株纯化后保菌，并不断转接，以备后续实验。将分离株命名为HZ3。
(2)不动杆菌属的鉴定：
高速离心机收集菌液，用DNA试剂盒进行DNA提取，PCR方法对分离株细菌的特异性基因扩增，利用通用引物27F/1492R靶向扩增16S rRNA基因，纯化后的扩增子由广东省微生物菌种保藏中心进行测序，获得的序列通过BLASTn查询16S rRNA序列数据库，获取检索号，在检索序列的基础上，利用Mega 6.0软件对该分离物进行***发育关系分析，因此，分离株HZ3初步鉴定为Acinetobacter sp.GDMCC 61755，为不动杆菌属。
(3)石油降解效率测定：
将分离出的处于指数期(密度约为1×107-1×108菌群形成单位 /ml)的石油降解菌株接种到液体MSM培养基中，置于摇床培养，接种瓶以100～120转/分的速度在25～35℃振荡到至浑浊状态培养10h～12h，然后取2～5ml菌液接入含200微升石油的20ml液体MSM培养基中，作为实验组；对照组则是不加菌液，只加石油的液体MSM培养基；为了避免数据波动，每次降解测定重复三次；所有的容量瓶在25℃～35℃、 100～120转/分的条件下培养10～12h；石油浓度使用气相色谱-质谱法 (GC/MS)测量，石油降解率由降解物与初始量的比值确定。
(4)石油降解率的计算：
石油降解率的计算方法是，通过比较对照组和实验组在GC/MS分析得出的样品峰面积，用样品峰面积代表石油的含量，并进行定性定量分析，找到石油烃组分中的正构烷烃和多环芳烃进行计算降解前后的峰面积，得出样品中剩余石油含量，减少的石油量与原始石油量的比值为降解效率。
本方法可以有效降低土壤中石油含量，尤其是在石油轻度污染的环境中，同时在较严重污染环境中也能够得到应用。不动杆菌属是常见的细菌，在环境中广泛存在，其适宜生存温度在25℃～30℃，通过向石油中添加不动杆菌属，可使石油降解，如表1所示，三组重复实验得到对石油中正构烷烃的降解率为5％～10％，对多环芳烃的降解率为20％～30％。
表1不动杆菌属GDMCC 61775石油降解率统计表
Figure RE-GDA0003471493810000091
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种利用不动杆菌属降解石油的方法，其特征在于，不动杆菌属HZ3(现保藏于广东省微生物菌种保藏中心，编号为GDMCC 61775)，制备工艺步骤包括：
(1)目标菌种的筛选和分离
①配制基础盐培养基MSM：按照MSM配比配制液体培养基，(NH4)2SO4 1.5～2.0g/L；MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/L；CaCl2·2H2O 0.01～0.05g/L；FeSO4·7H2O 0.001～0.005g/L；Na2HPO4·12H2O 1.5～2.0g/L；KH2PO41.5～2.0g/L；蒸馏水1000mL；120℃～130℃灭菌20～40min，固体MSM培养基需要加入15～25g/L琼脂粉，其它成分与液体培养基相同；
②革兰氏阴性菌和苯耐菌选择性富集：取采集新鲜的土样2～5g接入配好的MSM培养基中，以苯作为唯一碳源，终浓度为0.1％(V/V)，苯加入前经0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，置于摇床培养，接种瓶以100～120转/分的速度在25～35℃振荡到至浑浊状态培养10h～12h，同样的方法将培养的菌液再次转接富集；
③将液体培养物均匀涂布到固体MSM培养基上，28℃恒温培养箱培养4-5d；
④挑取单菌落多次划线分离、液体富集培养，分离出石油降解菌；
⑤将单个菌落转移到固体MSM培养基中，以增加其生长；该菌株纯化后保菌，并不断转接，以备后续实验；
(2)目标菌的鉴定
使用通用引物27F/1492R对16S rRNA基因进行了靶向扩增，以获得步骤(1)中分离株的物种信息，纯化的扩增子由广东省微生物菌种保藏中心进行测序，将获得的序列通过BLASTn查询16S rRNA序列数据库，根据检索到的序列，使用Mega 6.0软件分析该分离株的***发育关系；
(3)石油降解率测定
将分离出的处于指数期的石油降解菌株接种到液体MSM培养基中，置于摇床培养，接种瓶以100～120转/分的速度在25～35℃振荡到至浑浊状态培养10～12h，然后取2～5ml菌液接入含200微升石油的液体MSM培养基中，作为实验组；对照组则是不加菌液，只加石油的液体MSM培养基，为了避免数据波动，每次降解测定重复三次；所有的容量瓶在25℃～35℃、100～120转/分的条件下培养10～12h，石油浓度使用气相色谱-质谱法测量，石油降解率由降解物与初始量的比值确定。
2.如权利要求1所述的利用不动杆菌属降解石油的方法，其特征在于，石油降解菌的实际应用：利用模拟样品检测菌株对石油的降解能力，利用该菌株进行环境保护或修复。
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