CN114152688B - 从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法及特征标志物在鉴定蜂花粉中的应用，属于蜂花粉技术领域。该从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法，包括：S1、采用高效液相色谱串联高分辨质谱技术对蜂花粉提取物进行分析得到相关图谱数据；S2、将图谱数据进行处理获得峰对应的数据；S3、筛选峰对应的数据去除p＞0.05以及无二维质谱的数据得到数据集；S4、将数据集进行多元统计分析获得差异化合物；S5、分析差异化合物与抑制酪氨酸酶活性的相关性，筛选出特征标志物。本发明还包括特征标志物在鉴定蜂花粉中的应用。本发明筛选出的特征标志物可准确快速地判断待测蜂花粉是否具有优异的美白功效。

Description

从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法及其应用
技术领域
本发明涉及功能食品、化妆品和保健品技术领域，具体涉及一种从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法及特征标志物在鉴定蜂花粉中的应用。
背景技术
酪氨酸酶是人类黑色素形成的关键酶。酪氨酸酶羟化酪氨酸产生多巴胺，多巴胺被氧化为多巴醌，多巴醌在非酶条件下形成黑色素。过量的黑色素会导致人体色素沉着过多，影响人体皮肤的颜色，也会引起老年斑、雀斑、黄褐斑等皮肤病。抑制酪氨酸酶活性常被用作美白产品的评价指标。抑制酪氨酸酶活性越高，则美白功效越好。
蜂花粉是由植物花粉、花蜜和蜜蜂唾液混合而成的颗粒状物质。蜂花粉中含有多种营养物质和生物活性物质，是功能因子的天然来源，成为医药、化妆品和营养产品的原料和膳食补充剂。蜂花粉具有抑制酪氨酸酶活性，但是其抑制酪氨酸酶的标志性成分尚不清楚，关于美白蜂花粉的鉴定方法也缺乏。蜂花粉品种繁多，其成分受到地理环境、植物来源、生产方式等多种因素影响，导致蜂花粉的质量参差不齐，不同成分造成不同活性，所以不同来源的蜂花粉具有不同的酪氨酸酶抑制活性，但是目前市面上蜂花粉的使用混乱，商家盲目宣称其蜂花粉产品具有美白效果，难以监督；采购蜂花粉原料的厂家也因缺乏鉴定方法而无据可依。因此急需一种美白蜂花粉的鉴定方法，对蜂花粉的质量和行业进行控制和管理。由于蜂花粉中含有多种化合物，具有整体性特点，因此测定单一或几个成分并不能真正反映不同种蜂花粉应用在美白上的质量等级。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法及特征标志物在鉴定蜂花粉中的应用，解决现有技术中难以准确快速地判断蜂花粉是否具有美白功效的技术问题。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法，包括以下步骤：
S1、采用高效液相色谱串联高分辨质谱技术对蜂花粉提取物进行分析得到相关图谱数据；
S2、将步骤S1获得的所述图谱数据进行预处理获得峰对应的数据；
S3、筛选所述峰对应的数据去除p＞0.05以及无二维质谱的数据得到数据集；
S4、将所述数据集进行多元统计分析获得差异化合物；
S5、分析所述差异化合物与抑制酪氨酸酶活性的相关性，以皮尔逊相关系数r进行排序，筛选出r＞0.8的化合物即为特征标志物。
进一步地，在步骤S1中，所述高效液相色谱串联高分辨质谱技术中，设定色谱柱流速为0.3mL/min；柱温箱40℃；梯度洗脱条件为：A相-0.13％甲酸，B相-乙腈；0min，5％乙腈；3min，5％乙腈；20min，30％乙腈；25min 60％乙腈；27min，5％乙腈；30min，5％乙腈，进样量为2μL，检测波长280nm；质谱分析采用电喷雾离子化形式，正离子模式；质谱条件为：离子喷雾电压为5500mV，温度为550℃，离子源气体155；离子源气体255，质谱采集质量-电荷比范围为100-1500，碰撞能量为35V，聚簇电位为60V。
进一步地，在步骤S4中，所述多元统计分析包括通过主成分分析获得样品之间的关系，并利用正交偏最小二乘判别分析筛选差异化合物。
进一步地，在步骤S4中，所述差异化合物的筛选条件为：p[1]＞0.05，p(corr)[1]＞0.5，VIP＞1。
进一步地，在步骤S1中，所述蜂花粉提取物由以下步骤制得：将破壁后的蜂花粉用石油醚超声脱脂，将脱脂后的蜂花粉与乙醇混合并超声辅助提取30-40min，提取次数为2-3次，提取温度≤40℃；之后进行真空浓缩得到乙醇粗提物，将所述乙醇粗提物用乙酸乙酯萃取得到萃取物，将所述萃取物旋蒸浓缩，之后冷冻干燥得到蜂花粉提取物。
进一步地，所述破壁后的蜂花粉与所述石油醚的料液比为1g:2-4mL。
进一步地，所述脱脂后的蜂花粉与所述乙醇按照物料比1g:10-40mL混合。
进一步地，在步骤S5中，筛选出的所述特征标志物为：3-香豆酰精胺、3-咖啡酰亚精胺1、2-香豆酰-阿魏酰精胺、3-咖啡酰亚精胺2、2-咖啡酰-香豆酰亚精胺1、2-香豆酰-咖啡酰精胺、2-咖啡酰-香豆酰亚精胺2、2-香豆酰-二氢咖啡酰亚精胺、2-咖啡酰-阿魏酰亚精胺、香豆酰-咖啡酰-亚精胺、2-香豆酰-二氢咖啡酰精胺、咖啡酰-2-阿魏酰亚精胺、2-香豆酰亚精胺、3-香豆酰亚精胺1、香豆酰-2-阿魏酰亚精胺和3-香豆酰亚精胺2。
此外，本发明还提出一种上述筛选方法筛选得到的特征标志物在鉴定是否具有美白功效的蜂花粉中的应用。
进一步地，所述应用包括将待测蜂花粉采用高效液相色谱串联高分辨质谱技术对蜂花粉提取物进行分析得到相关图谱，获得所述特征标志物对应的峰面积值，若所述特征标志物的峰面积值总和≥10000，则判断该蜂花粉为高美白活性蜂花粉；若所述特征标志物的峰面积总和＜10000，则判断该蜂花粉为低美白活性蜂花粉。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提出的筛选方法，先采用高效液相色谱串联高分辨质谱技术对蜂花粉提取物进行分析得到相关图谱数据，之后所述图谱数据进行预处理获得峰对应的数据，之后筛选所述峰对应的数据去除p＞0.05以及无二维质谱的数据得到数据集，之后将所述数据集进行多元统计分析获得差异化合物，继续分析所述差异化合物与抑制酪氨酸酶活性的相关性，以皮尔逊相关系数r进行排序，筛选出r＞0.8的特征标志物，特征标志物总共有16个，通过这16个化合物的峰面积之和可准确快速地判断待测蜂花粉是否具有优异的美白功效，所述特征标志物的峰面积值总和≥10000，则判断该蜂花粉为高美白活性蜂花粉；若所述特征标志物的峰面积总和＜10000，则判断该蜂花粉为低美白活性蜂花粉。
本发明筛选出的特征标志物对于蜂花粉美白活性高低的判断的准确率为100％。
附图说明
图1是本发明实施例1中21组蜂花粉的PCA分析结果图；
图2是本发明实施例1中21组蜂花粉的OPLS-DA分析结果图；
图3是本发明实施例1中21组蜂花粉的置换检验图。
图4是本发明实施例1中21组蜂花粉的V+S图。
具体实施方式
本具体实施方式提供了一种从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法，包括以下步骤：
S1、采用高效液相色谱串联高分辨质谱技术对蜂花粉提取物进行分析得到相关图谱数据；所述高效液相色谱串联高分辨质谱技术中，设定色谱柱流速为0.3mL/min；柱温箱40℃；流动相为：0.13％甲酸(A)，乙腈(B)。梯度洗脱条件为：0min，5％B；3min，5％B；20min，30％B；25min 60％B；27min，5％B；30min，5％B，进样量为2μL，检测波长280nm；质谱分析采用电喷雾离子化形式，正离子模式；质谱条件为：离子喷雾电压为5500mV，温度为550℃，离子源气体155；离子源气体255，质谱采集质量-电荷比范围为100-1500，碰撞能量为35V，聚簇电位为60V；
S2、将步骤S1获得的所述图谱数据进行处理获得峰对应的数据；
S3、筛选所述峰对应的数据去除p＞0.05以及无二维质谱的数据得到数据集；
S4、将所述数据集进行多元统计分析获得差异化合物；所述多元统计分析包括通过主成分分析获得样品之间的关系，并利用正交偏最小二乘判别分析筛选差异化合物；所述差异化合物的筛选条件为：p[1]＞0.05，p(corr)[1]＞0.5，VIP＞1；
S5、分析所述差异化合物与抑制酪氨酸酶活性的相关性，以皮尔逊相关系数r进行排序，筛选出r＞0.8的特征标志物；筛选出的所述特征标志物为：3-香豆酰精胺、3-咖啡酰亚精胺1、2-香豆酰-阿魏酰精胺、3-咖啡酰亚精胺2、2-咖啡酰-香豆酰亚精胺1、2-香豆酰-咖啡酰精胺、2-咖啡酰-香豆酰亚精胺2、2-香豆酰-二氢咖啡酰亚精胺、2-咖啡酰-阿魏酰亚精胺、香豆酰-咖啡酰-亚精胺、2-香豆酰-二氢咖啡酰精胺、咖啡酰-2-阿魏酰亚精胺、2-香豆酰亚精胺、3-香豆酰亚精胺1、香豆酰-2-阿魏酰亚精胺和3-香豆酰亚精胺2。
进一步地，在步骤S1中，所述蜂花粉提取物由以下步骤制得：将破壁后的蜂花粉用石油醚超声脱脂，所述破壁后的蜂花粉与所述石油醚的料液比为1g:2-4mL；将脱脂后的蜂花粉与乙醇按照物料比1g:10-40mL混合并超声辅助提取30-40min，提取次数为2-3次，提取温度≤40℃；之后进行真空浓缩得到乙醇粗提物，将所述乙醇粗提物用乙酸乙酯萃取得到萃取物，将所述萃取物旋蒸浓缩，之后冷冻干燥得到蜂花粉提取物。
本具体实施方式还包括一种筛选方法筛选得到的特征标志物在鉴定是否具有美白功效的蜂花粉中的应用。
进一步地，所述应用，包括将待测蜂花粉采用高效液相色谱串联高分辨质谱技术对蜂花粉提取物进行分析得到相关图谱，获得所述特征标志物对应的峰面积值，若所述特征标志物的峰面积值总和≥10000，则判断该蜂花粉为高美白活性蜂花粉；若所述特征标志物的峰面积总和＜10000，则判断该蜂花粉为低美白活性蜂花粉。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
蜂花粉筛选方法的建立过程：
S0、蜂花粉样品的前处理：对21个蜂花粉样品(编号P1～P21)进行提取，蜂花粉原料于粉碎机中进行机械粉碎后得到破壁的蜂花粉，将破壁蜂花粉与石油醚按照料液比1g:2mL用石油醚超声脱脂两次，将脱脂后的蜂花粉用80％乙醇超声辅助提取，提取条件：料液比1g:30mL；提取时间为30min；提取次数为2次；提取温度≤40℃，用旋转蒸发仪进行真空浓缩后，将乙醇粗提物浮于蒸馏水后与乙酸乙酯以体积比1:1萃取，将上层萃取物旋蒸浓缩进行冷冻干燥得到蜂花粉提取物。
S1、蜂花粉成分分析：采用高效液相色谱串联高分辨质谱技术(UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS)对蜂花粉提取物的成分进行分析。称取一定量的蜂花粉提取物溶于色谱甲醇，配置成25μg/mL的样品溶液，用0.45μm的滤膜过滤后待测，采用AB SCIEX Triple T0F 5600+液质联用搭配Dionex UltiMate 3000UHPLC液相***。色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18(100×2.1mm,1.9μm)；设定流速0.3mL/min；柱温箱40℃。流动相为：0.13％甲酸(A)，乙腈(B)。梯度洗脱条件为：0min，5％B；3min，5％B；20min，30％B；25min60％B；27min，5％B；30min，5％B。进样量为2μL，检测波长280nm；质谱分析采用电喷雾离子化形式，正离子模式；质谱条件为：离子喷雾电压(ISVF)5500mV，温度550℃，离子源气体155；离子源气体255，质谱采集质量-电荷比(m/z)范围为100-1500，碰撞能量(CE)为35V，聚簇电位(DP)为60V。
S2、差异化合物的筛选方法：UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS数据以WIFF(*.wiff)格式保存。采用QI V 2.0软件进行数据预处理获得峰对应的数据。
S3、软件自动选择最优QC样本作为数据对齐的参考文件。筛选所述峰对应的数据，去除p＞0.05、无二维质谱的数据。然后以CVS(*.cvs)格式导出数据集。
S4、使用SIMCA 14.1软件进行多元统计分析，通过主成分分析(PCA)获得样品之间的关系，并利用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)筛选差异化合物，差异化合物的筛选条件为：p[1]＞0.05，p(corr)[1]＞0.5，VIP＞1。
具体地，PCA分析是一种无监督模型，是对变量进行综合的考虑和显示。由PCA图(图1)可知21个蜂花粉样本沿PC1轴分为两组。PCA的分组趋势(PC1轴的左边和右边)和测得的抑制酪氨酸酶活性等级的分组(见表2)是一致的，说明蜂花粉成分的不同导致其活性的不同，预示着可以用成分指标来对活性进行分级。OPLS-DA是一种有监督的模型，可以直观的观察到样本的分类效果。根据以上分组将21组样品分为两组进行OPLS-DA分析，可以从图中(图2)看出这两组明显分开，且在置信区间内，说明高活性组和低活性组之间的成分有显著差异，R2Y(cum)＝0.992，Q2(cum)＝0.984证明模型拟合良好，具有可预测性。采用置换(n＝200)对模型进行验证，发现R2和Q2均大于原始值，且Q2截距值小于0[R2＝(0.0,0.379)，Q2＝(0.0,-0.674)](图3)，说明模型验证成功。通过OPLS-DA的V+S图(图4)筛选差异化合物，筛选条件为：p[1]＞0.05，p(corr)[1]＞0.5，VIP＞1。
S5、特征标志物的确定和蜂花粉鉴定方法的建立：使用MetaboAnalyst 5.0在线平台分析蜂花粉差异化合物与抑制酪氨酸酶活性的相关性，以皮尔逊相关系数r进行排序，选择r＞0.8的化合物即为特征标志物，共16个化合物。根据化合物的质谱信息对其进行鉴定，结果见表1，这16个化合物都属于酚胺类化合物。
表1 16个特征标志物信息
No 特征标志物名称 tR(min) [M+H]+(m/z) 分子式 r
1 3-香豆酰精胺 12.24 641.1725 C37H44N4O6 0.87
2 3-咖啡酰亚精胺1 16.74 632.2615 C34H37N3O9 0.93
3 2-香豆酰-阿魏酰精胺 16.76 671.2731 C38H46N4O7 0.83
4 3-咖啡酰亚精胺2 17.33 632.2607 C34H37N3O9 0.92
5 2-咖啡酰-香豆酰亚精胺1 17.85 616.2669 C34H37N3O8 0.84
6 2-香豆酰-咖啡酰精胺 18.45 657.2927 C37H44N4O7 0.81
7 2-咖啡酰-香豆酰亚精胺2 18.46 616.2667 C34H37N3O8 0.88
8 2-香豆酰-二氢咖啡酰亚精胺 18.78 602.2781 C34H39N3O7 0.84
9 2-咖啡酰-阿魏酰亚精胺 19.33 646.3324 C35H39N3O9 0.89
10 香豆酰-咖啡酰-亚精胺 19.41 454.2350 C25H31N3O5 0.81
11 2-香豆酰-二氢咖啡酰精胺 19.87 673.1668 C38H48N4O7 0.84
12 咖啡酰-2-阿魏酰亚精胺 19.91 660.2928 C36H41N3O9 0.90
13 2-香豆酰亚精胺 19.91 438.2400 C25H31N3O4 0.86
14 3-香豆酰亚精胺1 19.91 583.2710 C34H37N3O6 0.84
15 香豆酰-2-阿魏酰亚精胺 19.96 644.3056 C36H41N3O8 0.85
16 3-香豆酰亚精胺2 20.40 583.2698 C34H37N3O6 0.83
注：上标数字代表同分异构体。
抑制酪氨酸酶活性的测定：以L-多巴(L-DOPA)为底物测定酪氨酸酶活性。将21种蜂花粉提取物用甲醇溶解(10mg/mL)，随后用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.8)稀释至不同浓度。取50μL样品液和50μL酪氨酸酶(200U/mL)在37℃96孔板中预孵育2min。然后在每孔中加入150μL L-DOPA(0.5mM)开始反应。从0到5min，每10s在475nm处测量混合物的吸光度。所有试验重复三次进行。抑制率的计算公式如下:
抑制率(％)＝(1-k1/k0)×100％
k1：有抑制剂时反应得到的反应动力学方程斜率；k0：无抑制剂时反应得到的反应动力学方程斜率。
通过回归方程计算半抑制浓度IC50，IC50值越小则活性越好。IC50＞80μg/mL的为低美白活性蜂花粉；IC50≤80μg/mL的为高美白活性蜂花粉。
将每个样品的所有特征标志物的峰面积进行加和，结合表2，根据这21个蜂花粉的特征标志物总和以及抑制酪氨酸酶活性的等级，可以得出：高活性组的特征标志物峰面积总和都大于10000，低活性组的特征标志物峰面积总和都小于10000，因此，若所述特征标志物的峰面积值总和≥10000，则判断该蜂花粉为高美白活性蜂花粉；若所述特征标志物的峰面积总和＜10000，则判断该蜂花粉为低美白活性蜂花粉。
表2 21个蜂花粉样品的测定结果
样品编号 特征标志物峰面积总和 IC50(μg/mL) 活性等级
P1 422 92.8 低
P2 46650 9.1 高
P3 577 119.0 低
P4 56180 9.7 高
P5 2817 342.1 低
P6 58014 11.4 高
P7 19148 15.6 高
P8 2360 448.6 低
P9 1992 423.7 低
P10 44872 27.1 高
P11 978 336.0 低
P12 1157 294.2 低
P13 20757 10.0 高
P14 999 407.3 低
P15 15162 12.3 高
P16 924 302.3 低
P17 1350 378.7 低
P18 774 258.1 低
P19 47750 27.8 高
P20 713 92.6 低
P21 41909 31.1 高
用另外8组蜂花粉样品对建立的鉴定方法进行验证，结果见表3。根据鉴定条件特征标志物峰面积总和≥10000，通过8组样品的特征标志物含量总和的判断，23、25、26、27、29号样品属于高活性等级，22、24、28号样品属于低活性等级，进一步按照上述抑制酪氨酸酶活性的测定方法检测8组蜂花粉的IC50值，结果如表3所示，从表3可以看出根据特征标志物的峰面积总和判断蜂花粉活性等级的结果与实测的抑制酪氨酸酶活性相符，说明鉴定结果全部正确，本鉴定方法的准确度为100％，由此证实此方法可以用于美白用途的蜂花粉鉴定。
表3 8组蜂花粉样品的鉴定验证结果
样品编号 特征标志物峰面积总和 活性等级 实测IC50值(μg/mL)
P22 435 低 405.6
P23 19665 高 25.1
P24 390 低 459.8
P25 12642 高 51.3
P26 14174 高 64.0
P27 23797 高 19.0
P28 212 低 312.7
P29 10030 高 58.5
本发明通过代谢组学与活性测量相结合来构建蜂花粉美白鉴定方法。填补了美白用途蜂花粉鉴定方法的空白。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.一种从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法，其特征在于，采用的方法包括以下步骤：
S1、采用高效液相色谱串联高分辨质谱技术对蜂花粉提取物进行分析得到相关图谱数据；
S2、将步骤 S1 获得的所述图谱数据进行处理获得峰对应的数据；
S3、筛选所述峰对应的数据去除 p＞0.05 以及无二维质谱的数据得到数据集；
S4、将所述数据集进行多元统计分析获得差异化合物；
S5、分析所述差异化合物与抑制酪氨酸酶活性的相关性，以皮尔逊相关系数 r 进行排序，筛选出 r＞0.8 的化合物，根据化合物的质谱信息对其进行鉴定，得16个特征标志物，
通过这16个化合物的峰面积之和能够准确快速地判断待测蜂花粉是否具有优异的美白功效，在步骤 S1 中， 所述高效液相色谱串联高分辨质谱技术中，色谱柱为ThermoHypersil GOLD C18，设定色谱柱流速为 0.3 mL/min；柱温箱 40℃；流动相为：A 相-0.13%甲酸，B 相-乙腈；梯度洗脱条件为：0 min，5%乙腈；3 min，5%乙腈；20 min，30%乙腈；25 min60%乙腈；27 min，5%乙腈；30 min，5%乙腈，进样量为 2 μL，检测波长 280 nm；质谱分析采用电喷雾离子化形式，正离子模式；质谱条件为：离子喷雾电压为 5500 mV，温度为 550℃，离子源气体 155；离子源气体 255，质谱采集质量-电荷比范围为100-1500，碰撞能量为 35V，聚簇电位为 60 V，在步骤 S4 中， 所述多元统计分析包括通过主成分分析获得样品之间的关系，并利用正交偏最小二乘判别分析筛选差异化合物，在步骤 S4 中所述差异化合物的筛选条件为：p[1]＞0.05，p(corr)[1]＞0.5，VIP＞1，在步骤 S1 中，所述蜂花粉提取物由以下步骤制得：将破壁后的蜂花粉用石油醚超声脱脂，将脱脂后的蜂花粉与乙醇混合并超声辅助提取 30-40min， 提取次数为 2-3 次，提取温度≤40℃；之后进行真空浓缩得到乙醇粗提物，将所述乙醇粗提物用乙酸乙酯萃取得到萃取物，将所述萃取物旋蒸浓缩，之后冷冻干燥得到蜂花粉提取物。
2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述破壁后的蜂花粉与所述石油醚的料液比为 1g:2-4mL。
3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述脱脂后的蜂花粉与所述乙醇按照物料比 1g:10-40mL 混合。
4.一种权利要求 1-3任一项所述的筛选方法筛选得到的特征标志物在鉴定是否具有美白功效的蜂花粉中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括将待测蜂花粉采用高效液相色谱串联高分辨质谱技术对蜂花粉提取物进行分析得到相关图谱，获得所述特征标志物对应的峰面积值，若所述特征标志物的峰面积值总和≥10000，则判断该蜂花粉为高美白活性蜂花粉；若所述特征标志物的峰面积总和＜10000，则判断该蜂花粉为低美白活性蜂花粉。
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