CN114112594A - 一种***-1预处理试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种***‑1预处理试剂。涉及生物试剂技术领域。包括以下成分：甘氨酸‑盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子‑2和Tween‑20的Tris‑NaCl缓冲液。本发明实现在不影响后续IGF‑1和抗体反应的基础上能得到更加准确可靠血清IGF‑1的结果，并实现完全的全自动化。且由两个缓冲液体系组成，具有释放彻底，中性pH条件下进行反应，对后续反应影响小等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物试剂技术领域，更具体的说是涉及一种***-1预处理试剂。
背景技术
***-I(IGF-I)是一种单链多肽，具有3个分子内二硫键。它由70个氨基酸残基组成。它与***-Ⅱ(IGF-Ⅱ)和胰岛素具有结构同源性。在血液循环中的IGF-I和IGF-Ⅱ与胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)和酸性不稳定亚基结合，主要以高分子三体聚合物的形式存在。在人体内，生长激素通过肝脏生长激素受体促进肝脏IGF-I基因的表达，从而促进IGF-I的合成和释放；IGF-I反馈抑制垂体生长激素的释放。血清IGF-I的浓度和血清生长激素水平在24小时内大致平行。IGF-I能促进细胞增殖、分化、成熟，并可抑制细胞凋亡，介导生长激素的大部分作用，促进生长和合成代谢，且有降低血糖、调节免疫等作用。另外IGF-I是调节骨细胞功能和代谢的重要因子。IGF-I是介导GH促生长作用的主要物质，血清IGF-I与一类IGF结合蛋白组成复合物，血清浓度相对较稳定，无明显脉冲式分泌及昼夜节律变化，因此，单一血清IGF-I测定值可更好地反映个体GH分泌状态。另外，IGF-I升高反映24小时GH分泌总体水平，可作为巨人症和肢端肥大症治疗是否有效的指标。因为IGF-I与胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)和酸性不稳定亚基结合，使得IGF-I的测量变得复杂，所以对样本进行预处理是必要的。
目前IGF-I预处理试剂有以下几种，但都具有相应的技术缺陷。
1)有机溶剂提取法。如使用无水乙醇提取，其原理是通过相似相溶原理，将IGF-I溶解到有机相中，使用离心机离心，获取含有IGF-I的萃取液。在该方法中，IGF-I解离后需要离心，不便于实现自动化操作。
2)强酸法。依赖过低的pH值，使IGFBP-3和酸不稳定蛋白变性或者构象变化，失去与IGF-I的结合能力，从而将IGF-I释放出来。该方法获取的IGF-I溶液为低pH溶液，不利于下一步的IGF-I与IGF-I抗体发生免疫反应。
3)置换法。使用IGF-I类似物对IGF-I进行竞争性的取代替换，将IGF-I从结合的蛋白中替换出来。该方法的缺陷为，置换反应为可逆反应，加入IGF-I类似物无法完全置换IGF-1，从而导致检测结果不准确
因此，如何提供一种***-1预处理试剂是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种***-1预处理试剂。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种***-1预处理试剂，包括以下成分：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液。
优选的：甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为0.5～1.5M，盐酸浓度为0.1～0.3M。
有益效果在于：甘氨酸-盐酸缓冲液主要是用来提供酸性环境，pH为2.0-4.0之间，使得IGFBP-3和酸不稳定蛋白变性或者构象变化，失去与IGF-I的结合能力，从而将IGF-I释放出来。
优选的：Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.2～0.6M；胰岛素生长因子-2浓度为1.0～4.0μg/mL；以所述Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为2～4％。
有益效果在于：
Tris-盐酸缓冲液用来提供缓冲环境，中和组分1中酸性环境，使反应在pH 6-8的缓冲区间进行，该缓冲区间最适宜解离后的IGF-I和其单抗进行抗原抗体结合反应。
IGF-Ⅱ为IGF-I的类似物，将IGF-I从结合的蛋白中替换出来，从而得到更多的IGF-I。
Tween-20是表面活性剂，它可以使解离的游IGF-I与后续抗体反应更具有特异性。
本发明还提供了上述的***-1预处理试剂。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种***-1预处理试剂，取得的技术效果为实现在不影响后续IGF-1和抗体反应的基础上能得到更加准确可靠血清IGF-1的结果，并实现完全的全自动化。且由两个缓冲液体系组成，具有释放彻底，中性pH条件下进行反应，对后续反应影响小等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的实施例1对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图2附图为本发明提供的实施例2对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图3附图为本发明提供的实施例3对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图4附图为本发明提供的实施例4对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图5附图为本发明提供的实施例5对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图6附图为本发明提供的实施例6对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图7附图为本发明提供的实施例7对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图8附图为本发明提供的实施例8对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图9附图为本发明提供的实施例9对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图10附图为本发明提供的实施例10对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图11附图为本发明提供的实施例11对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图12附图为本发明提供的实施例12对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图13附图为本发明提供的对比例1对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
图14附图为本发明提供的对比例2对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种***-1预处理试剂。
实施例1
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为0.5M，盐酸浓度为0.1M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.2M；
胰岛素生长因子-2浓度为1.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为2％。
实施例2
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为0.5M，盐酸浓度为0.1M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.2M；
胰岛素生长因子-2浓度为2.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为2％。
实施例3
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为0.5M，盐酸浓度为0.1M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.2M；
胰岛素生长因子-2浓度为3.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为2％。
实施例4
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为0.5M，盐酸浓度为0.1M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.2M；
胰岛素生长因子-2浓度为4.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为2％。
实施例5
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为1M，盐酸浓度为0.2M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.4M；
胰岛素生长因子-2浓度为1.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为3％。
实施例6
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为1M，盐酸浓度为0.2M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.4M；
胰岛素生长因子-2浓度为2.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为3％。
实施例7
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为1M，盐酸浓度为0.2M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.4M；
胰岛素生长因子-2浓度为3.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为3％。
实施例8
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为1M，盐酸浓度为0.2M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.4M；
胰岛素生长因子-2浓度为4.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为3％。
实施例9
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为1.5M，盐酸浓度为0.3M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.6M；
胰岛素生长因子-2浓度为1.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为4％。
实施例10
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为1.5M，盐酸浓度为0.3M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.6M；
胰岛素生长因子-2浓度为2.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为4％。
实施例11
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为1.5M，盐酸浓度为0.3M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.6M；
胰岛素生长因子-2浓度为3.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为4％。
实施例12
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为1.5M，盐酸浓度为0.3M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.6M；
胰岛素生长因子-2浓度为4.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为4％。
对比实验1
对比例1
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为2.0M，盐酸浓度为0.5M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.8M；
胰岛素生长因子-2浓度为6.0μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为6％。
对比例2
一种***-1预处理试剂包括：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液；
甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为0.2M，盐酸浓度为0.05M；
Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.1M；
胰岛素生长因子-2浓度为0.5μg/mL；
以Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为1％。
对实施例1～12及对比例进行线性的验证：
采用50个标本，用上述12个实施例及2组对比例对50个标本分别进行解离，并通过化学发光的方法测定IGF-I的浓度(ng/ml)；同时获取50个标本的罗氏测定值(ng/ml)。然后通过每个实施例与罗氏测定值进行线性拟合，获取其相关性。测试结果见表1。
表1
实施例1～12和对比例1、2对样本进行解离测定浓度后，与罗氏测定数据相关线性图参见图1～14。
结果表明：实施例1至实施例12的线性相关较好，R2值都在0.95以上，表明其相关性较佳。
从图13和图14可以看出，R2值为0.87～0.89，相关性较低，在对比例中，IGF-I预处理试剂中，甘氨酸盐酸缓冲液、Tris-NaCl缓冲液、IGF-II超出预定范围，所以其解离效果一般，从而导致最终测定值偏差较大。
对比实验2
对后续反应的影响
解离液在对***-1进行解离后，为了验证解离后的残留液对后续VD的测定是否有影响，实验如下：
取20个***-1样本，用市场上的A产品、对比例1、2(同实施例1)对其进行解离，然后测定化学发光的信号值(信号值越高，测定越准确，信号值越低，说明测定误差越大，也反应了释放IGF-I后，对后续反应大)。具体结果见表2。
表2
从表2可以看出，实施例1至实施例12的信号强度相对于A产品而言大约高出30％，由此可见，相对于A产品而言，本发明的解离液对后续反应影响小得多。
对比实验3
解离充分性验证
解离液在对***-1进行解离后，为了验证解离是否充分，实验如下：
取20个***-1样本，用市场上的A产品、12组实施例、两组对比例(同实施例1)对其进行解离，分别使用质谱法测定IGF-I浓度。具体结果见表3。
表3
由表3可见，在相同条件下，使用本发明IGF-1预处理试剂裂解出的IGF-I量比A产品大约多出20％～30％，且显著优于对比例，说明本发明解离液对IGF-1的解离更加彻底。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.一种***-1预处理试剂，其特征在于，包括以下成分：甘氨酸-盐酸缓冲液，含胰岛素生长因子-2和Tween-20的Tris-NaCl缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种***-1预处理试剂，其特征在于，所述甘氨酸-盐酸缓冲液中甘氨酸浓度为0.5～1.5M，盐酸浓度为0.1～0.3M。
3.根据权利要求1所述的一种***-1预处理试剂，其特征在于，所述Tris-NaCl缓冲液中Tris-NaCl浓度为0.2～0.6M；胰岛素生长因子-2浓度为1.0～4.0μg/mL；以所述Tris-NaCl缓冲液总质量计，Tween-20含量为2～4％。
4.一种试剂盒包括权利要求1～3任一所述的***-1预处理试剂。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114544978A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-05-27 | 美康生物科技股份有限公司 | 一种igf-1检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
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| JP2001165931A (ja) * | 1999-12-03 | 2001-06-22 | Kainosu:Kk | インスリン様成長因子の免疫学的測定方法 |
| US6465423B1 (en) * | 1988-07-15 | 2002-10-15 | Central Sydney Area Health Service | Acid-labile subunit (ALS) of insulin-like growth factor binding protein complex |
| CN104697829A (zh) * | 2015-02-10 | 2015-06-10 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 用于igf-ⅰ化学发光免疫检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法 |
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