CN114107280A - 一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法及其应用。本发明方法通过惰性电极构建了解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1或贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2菌株培养的电极体系，将活化的菌株用低压直流电刺激，将温度维持在30‑37℃，培养16‑24h，能够提高功能菌株的生化活性20‑50%，发酵密度提高1‑2倍以上。该方法极大的提高菌株的生化活性和发酵密度，工艺简单，操作简便，成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于微生物学科领域，具体涉及一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法及其应用。
背景技术
植物生长促进菌是一群生活在根际范围内，对植物生长有促进作用的一群有益细菌的统称。植物生长促进菌能够通过代谢活动活化土壤营养物质，促进植物吸收营养、加快生长等。而应用富含活性促生菌的菌剂有利于修复土壤生态***的平衡，恢复土壤肥力，引起了人们的广泛关注。研究表明，植物生长促进菌能够通过直接和间接两种途径来促进作物生长，直接作用如分泌植物激素促进生长，分泌有机酸促进难溶磷转化成有效磷，分泌固氮酶等增加土壤肥力，而间接作用包括诱导作物产生抗性、直接与病原菌拮抗等。目前影响植物生长促进菌应用的关键问题之一就是优良菌种的筛选与培育。
低压弱电场会对生物体细胞内外的电荷分布、排列和运动情况产生影响，从而影响细胞新陈代谢和增殖。基于以上理论，将电场作为一种生物刺激因素，在微生物生长过程中施加微小电场，具有能耗低、不产生有毒有害物质的特点，是一种绿色环保的技术。用电场处理果蔬，可以延缓其成熟期，减缓水分损失速率，从而延长果蔬储存时间。
近年来随着研究的深入，电场的生物效应已经从宏观层面不断向微观机理深入。资料显示，电场可以影响细胞的代谢过程、细胞的基因表达、细胞增殖、酶活力和细胞膜通透性，从而影响细胞内的自由基反应和生物高分子合成。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法及其应用，基于对所用菌株进行弱电流刺激，提高菌株生化活性和发酵密度，所得电刺激菌株培养液可用于协助植物生长及防治灰霉病和炭疽病。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法，通过惰性电极构建了菌株培养的电极体系，先进行电化学诱导驯化，再利用低压直流电刺激菌株的生长，提高其生化活性和发酵密度，得到电刺激菌株培养液；所述菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1或贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2。
作为改进的是，上述电刺激提高菌株生理生化活性的方法，包括以下步骤：
步骤1，菌株的活化
取低温保存的菌株，按照体积比为5-10%的量接入灭菌后的500 mL三角瓶，瓶中装有已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行活化，于28-37℃恒温摇床培养16-24h得活化后菌株种子液；
步骤2，电化学诱导
将灭菌后的惰性电极***灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，按照体积比为5-10%的量，将活化后的菌株种子液接入的液体培养基，通过惰性电极通入低压直流电，于28-37℃下恒温摇床培养24h，得电化学诱导驯化的菌株培养液；
步骤3，电刺激菌株的生长
将电化学诱导驯化的菌株培养液按照体积比为5-10%接入灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基，通入低压直流电刺激菌株的生长，恒温摇床培养16-48h，即得电刺激菌株培养液。
作为改进的是，所述当菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1时，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1的保藏日期为2020年6月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 20036。
作为改进的是，所述当菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2于2020年6月8日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20037。
作为改进的是，步骤2中低压直流电的电流强度为5-10mA。
作为改进的是，步骤3中低压直流电刺激的电流强度为5-30 mA。
上述所得的电刺激菌株培养液在促进植物生长、防治灰霉病和炭疽病上的应用。
作为改进的是，当菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1时，所述应用为促进草莓或桑树的生长；当菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2时，所述应用为防治桑树、草莓或葡萄的灰霉病或炭疽病。
一种植物生长添加剂，含有上述任一种电刺激菌株培养液。
作为优选的是，当菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1时，所述植物生长添加剂为植物生长促生菌剂；当菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2时，所述植物生长添加剂为微生物杀菌剂。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法及其应用，该方法能够提高解淀粉芽孢杆菌ZJK1促生能力30-50%和贝莱斯芽孢杆菌ZJK2生防能力20-30%，还能提升菌体发酵密度1-2倍。该方法低成本提高功能菌株的能力，易于实现工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1外加电流对菌株分泌IAA能力的影响；
图2为本发明方法外加电流对贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2的生长曲线图影响。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
实施例1
所述当菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1时，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1的保藏日期为2020年6月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 20036
一种外加直流电场促进解淀粉芽孢杆菌ZJK1发酵密度的方法，包括以下步骤：
先对通电培养瓶，电极材料和牛肉膏蛋白胨液体培养基等进行高压蒸汽灭菌（在121℃条件下灭菌 20 min）；然后从经电化学诱导驯化的解淀粉芽孢杆菌ZJK1种子液中取15m L振荡均匀的菌悬液，分别接入到4个装有 300m L经高压蒸汽灭菌冷却后的培养基的500m L三角瓶中，其中1瓶不通电流，作为空白对照。其余3瓶采用不锈钢电极(表观面积2cm*3cm，电极间距 2cm)，加入10mA直流电刺激。4瓶菌液同时置于37℃恒温摇床 (180 r/min)中培养。
结果表明，与不通电的对照组相比，外加直流电流刺激的细菌生长曲线明显提高。
通过细菌计数法得出，通电的培养液中菌体浓度约是未通电的1.8倍，可见，对解淀粉芽胞杆菌通入10 mA 的直流电作用能够有效的促进其生长繁殖。
实施例2
电刺激解淀粉芽孢杆菌培养液分泌植物生长素IAA的影响
分别将0.5 mL电刺激和未通电的种子液接种于含有100 mg/L L-色氨酸的50 mLLB液体培养基中，30 ℃、120 r/min摇床培养下，培养至6、18、30、48 h时，各取1mL样品，然后以12000 r/min转速离心10 min，取100 μL上清液加入等体积 Salkowski比色液，混匀后避光静置30 min后测定其OD530值，以不加L-色氨酸的LB培养基作为空白对照。参照标准曲线计算单位体积菌液IAA的含量。结果表明，通电10mA的培养液中的IAA浓度比对照高40%以上。
实施例3
电刺激解淀粉芽孢杆菌培养液促生桑树幼苗效果的盆栽实验
挑选饱满一致的桑树种子，用50℃温开水浸泡，水凉后浸泡12 h。催芽后进行育苗，等长出两叶一心时移栽定植。选取长势一致的健康桑树苗移栽与塑料盆(含200g风干土壤)中，等桑苗定植一周后，采用灌根法接种培养48h的促生菌液。
处理组为灭菌牛肉膏蛋白胨培养液对照(CK)、稀释200倍的未通电菌液和200倍的通电10mA电刺激解淀粉芽孢杆菌培养液，每处理5个平行样，每盆灌根50mL。
桑树苗长出四叶一心时，测量实验组和对照组桑树的株高、鲜重，然后小心的剥离土壤后105℃烘干至恒重，称量地上部干重和根系干重，结果如下表：
由表可知，电刺激解淀粉芽孢杆菌培养液与未通电的相比，在桑苗株高、整株鲜重、地上部重和根系干重都显著增加。
实施例4
本发明所用的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO. 20037，保藏日期为2020年6月8日。
一种外加直流电场促进贝莱斯芽孢杆菌ZJK2高密度发酵的方法。
先对通电培养瓶，电极材料和牛肉膏蛋白胨液体培养基等进行高压蒸汽灭菌（在121℃条件下灭菌 20 min）；然后从经电化学诱导驯化的贝莱斯芽孢杆菌ZJK2种子液中取3m L振荡均匀的菌悬液，分别接入到4个装有 300m L经高压蒸汽灭菌冷却后的培养基的500m L三角瓶中，其中1瓶不通电流，作为空白对照。其余3瓶采用不锈钢电极(表观面积2cm*3cm，电极间距 2cm)，加入10mA直流电刺激。4瓶菌液同时置于37℃恒温摇床 (180 r/min)中培养。
结果表明，与不通电的对照组相比，外加直流电流刺激的细菌生长曲线明显提高。通过细菌计数法得出，通电的培养液中菌体浓度约是未通电的2倍。可见，对贝莱斯芽孢杆菌ZJK2通入10 mA 的直流电作用能够有效的促进其增殖。
实施例5
把通电（10 mA）和不通电培养24h的贝莱斯芽孢杆菌ZJK2的菌液分别稀释200和100倍；将草莓灰霉病的PDA固体培养基用直径5mm的打孔器打取同质量的圆块，并将圆块取出，接种于PDA平板一侧；再将PDA平板的另一侧用直径5mm的打孔器打取同质量的圆块，并将圆块取出，分别接种100μL无菌水、通电和不通电的稀释菌液，28℃培养7d，观察。不同处理液对平板上灰霉病菌的抑制率计算如下：
表明贝莱斯芽孢杆菌ZJK2通电和不通电的抑菌率分别为93.6%和72.5%，表明通电10mA的直流电提高贝莱斯芽孢杆菌ZJK2的约30%的抗菌能力。
以上所述，仅为本发明部分具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法，其特征在于，通过惰性电极构建了菌株培养的电极体系，先进行电化学诱导驯化，再利用低压直流电刺激菌株的生长，提高其生化活性和发酵密度，得到电刺激菌株培养液；所述菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1或贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2。
2.根据权利要求1所述的一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，菌株的活化
取低温保存的菌株，按照体积比为5-10%的量接入灭菌后的500 mL三角瓶，瓶中装有已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行活化，于28-37℃恒温摇床培养16-24h得活化后菌株种子液；
步骤2，电化学诱导
将灭菌后的惰性电极***灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，按照体积比为5-10%的量，将活化后的菌株种子液接入的液体培养基，通过惰性电极通入低压直流电，于28-37℃下恒温摇床培养24h，得电化学诱导驯化的菌株培养液；
步骤3，电刺激菌株的生长
将电化学诱导驯化的菌株培养液按照体积比为5-10%接入灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基，通入低压直流电刺激菌株的生长，恒温摇床培养16-48h，即得电刺激菌株培养液。
3.根据权利要求1所述的一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法，其特征在于，所述当菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1时，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1的保藏日期为2020年6月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo. 20036。
4.根据权利要求1所述的一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法，其特征在于，所述当菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2于2020年6月8日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 20037。
5.根据权利要求1所述的一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法，其特征在于，步骤2中低压直流电的电流强度为5-10 mA。
6.根据权利要求1所述的一种电刺激提高菌株生理生化活性的方法，其特征在于，步骤3中低压直流电刺激的电流强度为5-30 mA。
7.基于权利要求1或权利要求2所得的电刺激菌株培养液在促进植物生长、防治灰霉病和炭疽病上的上的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，当菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1时，所述应用为促进草莓或桑树的生长；当菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2时，所述应用为防治桑树、草莓或葡萄的灰霉病或炭疽病。
9.一种植物生长添加剂，其特征在于，含有权利要求1-8中任一种电刺激菌株培养液。
10.根据权利要求9所述的植物生长添加剂，其特征在于，当菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZJK1时，所述植物生长添加剂为植物生长促生菌剂；当菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZJK2时，所述植物生长添加剂为微生物杀虫剂。
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