CN114107211A

CN114107211A - 一种多能干细胞及其衍生物

Info

Publication number: CN114107211A
Application number: CN202011397673.7A
Authority: CN
Inventors: 王淋立; 陈月花; 莫健; 杨建国
Original assignee: Future Intelligent Regenerative Medicine Research Institute Guangzhou Co ltd
Current assignee: Future Intelligent Regenerative Medicine Research Institute Guangzhou Co ltd
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2022-03-01
Also published as: WO2022116591A1; US20230241123A1

Abstract

本发明提供了一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中导入有第一核酸分子；且所述多能干细胞或其衍生物中的免疫应答相关基因的3’UTR区域导入有第二核酸分子；所述第一核酸分子编码介导RNA干扰的小核酸分子，且所述小核酸分子能够与第二核酸分子的转录产物特异性结合，从而启动RNA干扰程序，将免疫应答相关基因的mRNA降解或沉默，从而阻断免疫应答相关基因的表达，使得此类细胞具有免疫兼容的特性，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答反应。

Description

一种多能干细胞及其衍生物

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种免疫兼容的多能干细胞或其衍生物。

背景技术

干细胞是一类具备自我更新能力及向特定功能体细胞分化能力的“种子”细胞，具有再生为各种组织器官和人体的潜力，在免疫应答、衰老、肿瘤发生等重大生物学活动中发挥着核心且不可替代的作用。依据干细胞特性的程度差异，主要将干细胞分为：全能干细胞(Totipotent stem cells)、多能干细胞(Pluripotent stem cells，PSCs)和成体干细胞(adult stem cell)。

其中，多能干细胞PSCs具备几近无限的自我更新能力，以及在正常发育条件下向胚内所有胚层的器官、组织、细胞发育分化的潜能，典型的PSCs主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EGCs)、胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells，ECCs)，以及诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cells，iPSCs)等，这类细胞由于其强大的功能，并且可以一定程度地通过伦理限制，因此具有十分深远和广泛的应用前景。

由于PSCs的巨大应用前景，PSCs建库等产学研工作日益发展，但无论是自体iPSCs细胞库，还是免疫配型PSCs细胞库的构思或建立都需要花费极大的财力、物力和人力。同种异基因供受体的器官、组织或细胞移植的分子免疫学基础主要是基于经典的主要组织相容性复合体MHC-I和MHC-II(人又作HLA-I、HLA-II)的配型。截至2019年6月，已鉴定和命名的HLA***等位基因已超过20000个，仅经典的HLA-A、B、C的等位基因数分别都超过5000个，这些经典的HLA-I/II型等位基因各种可能的随机组合将是天文数字，并且随着新的等位基因的发现组合数随之增加，给器官、组织、细胞移植前的组织配型及供体选择带来极大的障碍，也给构建覆盖人群免疫配型PSCs细胞库带来巨大的困难。

于是，构建同种异体免疫兼容的通用型PSCs迫在眉睫。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA-I和HLA-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4-Ig、PD-L1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除B2M、CIITA的同时，敲入CD47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸NK等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。

为此，也有报道，不直接敲除B2M，而敲除HLA-A、HLA-B或一并敲除CIITA的同时，保留HLA-C，并构建12个覆盖人群超过90％的HLA-C免疫配型抗原，以此达到移植物的细胞仍具备一定程度的抗原提呈功能，并且同时能够通过HLA-C抑制NK细胞的固有免疫应答。但这类细胞，一来，HLA-I类抗原提呈的抗原类型缩小了三分之二以上，能够提呈的抗原完整性极大地不可逆的缩小，对于各种肿瘤、病毒以及其他疾病抗原的提呈具有极大的偏向性，仍然保留了相当程度的致瘤和病毒感染等疾病的风险，在CIITA同时敲除的情况下其致病风险更高；二来，12种高频率免疫配型的HLA-C抗原种族差异很大，通过我们核实计算部分地区仅能占到70％的比例，而中国、印度等人口大国目前尚未有权威的大样本量的HLA数据展示，这样制备出来的通用型PSCs使用仍受到巨大的配型空缺考验；第三，这种方法会经历数次反复的基因编辑工作，按每次基因编辑至少两轮单细胞分离培养计，整个过程至少需要六轮以上的单细胞分离培养，这些流程不可避免且极大概率地因多次基因编辑脱靶或染色质不稳定或因大量单细胞传代增殖造成细胞各种不可预测的突变，进而诱发致癌、代谢疾病等各种问题。由此可见，这类免疫兼容方案亦为“过渡时期”的权宜之计，仍有许多问题没有更好的解决。

此外，还有人设计通过诱导***基因在供体组织、细胞致病后诱导杀死，这样做的后果将产生严重的组织坏死、细胞因子风暴等不可预知的疾病风险问题，并且这类设计的细胞杀死后将不复存在合适的供体细胞、组织和器官又是一大难题。

RNA干扰是真核生物中普遍存在的一种自然现象，生物体内利用双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA发生特异性降解，从而导致基因沉默。在RNAi过程中，长链dsRNA被Dicer酶剪切成小干扰RNA(siRNA)，siRNA的一条链与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合，随后以碱基互补配对的方式与靶mRNA结合，导致mRNA的降解。由于siRNA可以抑制特定基因的表达，该技术已被广泛用于各种研究领域，包括基因治疗研究。

目前，已知可以介导RNA干扰的小核酸分子包括短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)。

发明内容

本发明的第一个目的，在于提供一种免疫兼容的多能干细胞或其衍生物。

本发明的第一个目的，在于提供一种免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物。

本发明的第三个目的，在于提供上述多能干细胞或其衍生物在制备用于细胞治疗的产品中的应用。

本发明的第四个目的，在于提供上述多能干细胞或其衍生物在制备用于器官移植的产品中的应用。

本发明的第五个目的，在于提供上述多能干细胞或其衍生物在构建通用型PSCs细胞库中的应用。

本发明的第六个目的，在于提供上述多能干细胞或其衍生物作为基因药物载体的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中导入有第一核酸分子；

且所述多能干细胞或其衍生物中的免疫应答相关基因的3’UTR区域导入有第二核酸分子；

所述第一核酸分子编码介导RNA干扰的小核酸分子，所述小核酸分子特异性靶向第二核酸分子的转录产物，且所述小核酸分子不靶向所述多能干细胞或其衍生物的任何其他的mRNA或lncRNA。

本技术方案中，所述第一核酸分子编码的小核酸分子能够与免疫应答相关基因3’UTR区域导入的第二核酸分子的转录产物特异性结合，从而启动RNA干扰程序，将免疫应答相关基因的mRNA降解或沉默，从而阻断免疫应答相关基因的表达，进而使得此类细胞具有免疫兼容的特性，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答反应。而且，该RNA干扰程序只作用于此类被改造过的多能干细胞或其衍生物，因此，当此类细胞或衍生物被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与免疫应答相关基因的3’UTR处导入的第二核酸分子所介导的免疫应答相关基因的RNA干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。

本发明的第二个方面，提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中导入有诱导型基因表达***，以及第一核酸分子；

所述第一核酸分子编码介导RNA干扰的小核酸分子，所述小核酸分子特异性靶向第二核酸分子的转录产物，且所述小核酸分子不靶向所述多能干细胞或其衍生物的任何其他的mRNA或lncRNA；

所述诱导型基因表达***调控第一核酸分子的表达。

上述技术方案中，诱导型基因表达***受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达***的开启与关闭，从而控制小核酸分子的表达量。

当诱导型基因表达***开启时，正常表达的小核酸分子和免疫应答相关基因3’UTR区域导入的第二核酸分子的转录产物特异性结合，从而启动RNA干扰程序，将免疫应答相关基因的mRNA降解或沉默，从而阻断免疫应答相关基因的表达。因此，此类细胞或衍生物被移植到受体中时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。

当移植物发生病变后，可以通过添加外源诱导物来关闭诱导型基因表达***，进而关闭小核酸分子的表达，中止小分子核酸对免疫应答相关基因mRNA的干扰作用，恢复免疫应答相关基因的正常表达，进而恢复移植物细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的移植物，从而提高了这类多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。

而且，该RNA干扰程序只作用于此类被改造过的多能干细胞或其衍生物，因此，当此类细胞或衍生物被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与免疫应答相关基因的3’UTR处导入的第二核酸分子所介导的免疫应答相关基因的RNA干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。

所述诱导型基因表达***可以选自Tet-Off***、二聚体诱导表达***。

当采用的诱导型基因表达***为Tet-Off***时，可通过添加外源诱导物四环素(Doxycycline，Dox)来控制细胞或其衍生物中小核酸分子的表达。当所述的多能干细胞或其衍生物被移植到供体中后，甚至可以通过调整Dox的添加量，来逐步降低小核酸分子的表达量，使得细胞能够逐步地表达低浓度的免疫相关基因来刺激供体，从而使得供体对移植的细胞或其衍生物逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。通常情况下，Dox的添加量为0-100uM。

当采用的诱导型基因表达***为二聚体诱导表达***时，可通过添加外源诱导物雷帕霉素(或类似物)来控制细胞或其衍生物中小核酸分子的表达。同样可以通过调整雷帕霉素(或类似物)的添加量，来逐步降低小核酸分子的表达量，使得细胞能够相应地表达低浓度的免疫相关基因来刺激供体，从而使得供体对移植的细胞或其衍生物逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。通常情况下，雷帕霉素(或类似物)的添加量为0-1000nM。

关于本发明的第一个和第二个方面，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入CD47的表达序列，从而使得所述多能干细胞或其衍生物可以过表达CD47。

CD47是人抑制性受体信号调节蛋白(SIRP)的胞外配体，CD47与其特异性配体SIRPα相结合形成CD7-SIRPα信号复合体，能够发出抗吞噬信号，抑制吞噬细胞的吞噬。CD47可抑制巨噬细胞和NK细胞活性，造成免疫***漏洞，引发负性调节信号。CD47是T细胞活化的共刺激因子，活化T细胞凋亡过程，诱导T细胞无反应性，加强TCR信号传导的效率。CD47是一种非常有效的非HLA配体，可沉默所有先天免疫反应。在多能干细胞或其衍生物中过表达CD47可以进一步提高多能干细胞或其衍生物的免疫兼容或免疫耐受能力。

关于本发明的第一个和第二个方面，所述免疫应答相关基因包括：

(1)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种，其中：

B2M：即β2微球蛋白(β2microglobulin)为例，基因名为B2M(beta-2-microglobulin)，其构成HLA Ⅰ类分子的轻链部分(β链)。β2-m在整个HLA Ⅰ类分子在细胞表面表达过程中，促进HLA整个分子从内质网向细胞膜表面运输，也能维持整个HLA分子的结构稳定性，是其表面表达、组装、稳定所必须的亚基。许多研究报道，细胞敲除B2M基因后，细胞表面不再表达HLA Ⅰ类分子，与HLA Ⅰ类分子相关的同种异体HLA不匹配的免疫应答随之消失，对HLA Ⅰ不匹配的细胞、组织或器官移植(简称“移植物”)，受者将对其移植不匹配的HLA Ⅰ产生免疫兼容/耐受，从而达到构建免疫兼容的多能干细胞或多能干细胞源衍生物。然而彻底敲除B2M后，细胞完全丧失通过HLA Ⅰ类分子提呈抗原的能力，对移植后可能发生的细胞、组织或器官的各种病变(如癌变)，便毫无办法，极大的影响了应用安全性，不利于更进一步的临床应用。

CIITA：即主要组织相容性复合体II类反式激活蛋白基因(class II majorhistocompatibility complex transactivator)是已知的II类HLA基因转录的关键基因，其在抗原提呈细胞组成型表达，其他细胞也可通过IFN-γ诱导表达。细胞主要通过调控CIITA的表达来调节HLA II类基因的表达水平，进而调控免疫应答强度。CIITA作为共活化分子被招募至HLA II类基因的启动子附近，参与其基因表达录调控。CIITA的表达水平与HLA II的表达水平呈正相关，由此被认为是HLA II类基因表达最关键的调控分子。

(2)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种，其中：

I类分子(A、B、C)分布于所有有核细胞表面，而II类分子(DR、DQ、DP)仅表达于淋巴组织中一些特定的细胞表面，如专职性抗原提呈细胞(包括B细胞、巨噬细胞、树突状细胞)、胸腺上皮细胞和活化的T细胞等。主要组织相容性抗原(MHC抗原)，是能引起强烈排列反应的移植抗原，即由HLA复合体(人类MHC)编码的HLA分子。本质上，供、受者间HLA型别差异是发生急性移植排斥的主要原因。经典的HLA几乎都与移植排斥相关，尤其I类分子极为重要。

关于本发明的第一个和第二个方面，所述小核酸分子包括短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)，优选为miRNA、shRNA、shRNA-miR中的至少一种。其中：

短干扰核酸(siNA)：具有RNA干扰(RNAi)效应的所有小核酸分子的统称，通常指由20多个核苷酸组成的小分子核糖核酸。

短干扰RNA(siRNA)：小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)有时称为短干扰RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰(RNAi)现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。

双链RNA(dsRNA)：一种有互补链的RNA，与细胞中发现的DNA相似，dsRNA构成了一些病毒(双链RNA病毒)的基因组。像病毒RNA或siRNA之类的双链RNA能够促发真核细胞中的RNA干扰，引起脊椎动物中的干扰素反应。

miRNA：长度在21-23个核苷酸之间的单链RNA片段，调节基因的表达。miRNA由基因编码，从DNA转录而来，但不翻译成蛋白。初级转录产物(primary transcripts，pri-miRNA)缩短其颈环结构得到功能性的miRNA。成熟的miRNA分子与一个或更多个mRNA分子部分互补，其主要功能是下调基因的表达。

shRNA：shRNA包括两个短反向互补序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制，随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。

shRNA-miR：基于miR-30或者miR-155的双臂结构和shRNA的茎环结构设计，把microRNA的靶序列替换为shRNA的靶序列。

当所述多能干细胞或其衍生物来源于人类时，对应地，所述小核酸分子的序列为来源于不靶向人类任何mRNA或lncRNA的非人类物种的随机序列，优选来源于秀丽隐杆线虫。例如：

5’-TTGTACTACACAAAAGTACTG-3’(SEQ ID NO.1)

5’-TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGA-3’(SEQ ID NO.3)。

根据上述序列所设计的第一核酸分子、第二核酸分子为以下任一种组合：

组合一：

小核酸分子序列：5’-TTGTACTACACAAAAGTACTG-3’(SEQ ID NO.1)

(1)第一核酸分子(即小核酸分子的shRNA表达框架或shRNA-miR表达框架)：

shRNA表达框架：包括两个反向互补的小核酸分子序列，中间由一茎环序列分隔，组成发夹结构，随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

shRNA-miR表达框架：将miR-30或者miR-155的原有的靶序列替换为小核酸分子序列。

(2)第二核酸分子：包括至少3个重复的小核酸分子序列的反向互补序列，优选为6～10个重复的小核酸分子序列的反向互补序列。小核酸分子序列的反向互补序列可通过随机的Linker序列连接。

作为本发明的一个实施例，所述第二核酸分子由开头10nt的随机序列、及8个重复的小核酸分子序列的反向互补序列通过随机的linker序列(CGTA)连接而成：atTCTAGATACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTA(SEQ ID NO.2)

组合二：

小核酸分子序列：5’-TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGA-3’(SEQ ID NO.3)

(1)第一核酸分子：

shRNA-miR表达框架：将microRNA mir-30或者mir-155的原有的靶序列替换为小核酸分子序列。

作为本发明的一个实施例，所述第二核酸分子由开头10nt的随机序列、及8个重复的小核酸分子序列的反向互补序列通过随机的linker序列(CGTA)连接而成：atTCTAGATATCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGACGTATCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGACGTATCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGACGTATCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGACGTATCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGACGTATCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGACGTATCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGACGTATCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGACGTA(SEQID NO.4)

关于本发明的第一个和第二个方面，所述第一核酸分子、诱导型基因表达***的导入位点为基因组安全位点。

作为优选的，所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的至少一种。其中：

AAVS1位点(别名“PPP1R2C位点”)：位于人类基因组第19号染色体上，是一个经过验证、能够确保转入DNA片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录，且该位点***外源目的片段对细胞无已知的副作用。

eGSH安全位点：位于人类基因组第1号染色体上，是一个经过论文验证、能够确保转入DNA片段预期功能的另一个“安全港”位点。

H11安全位点(也叫Hipp11)：位于人的22号染色体，是Eif4enif1与Drg1这两个基因之间的一个位点，由Simon Hippenmeyer于2010年发现并命名，由于H11位点位于两个基因之间，故外源基因***后影响內源基因表达的风险很小。H11位点被验证是一个基因间的安全的转录激活区域，是AAVS1、eGSH位点之外的一个新的“安全港”位点。

关于本发明的第一个和第二个方面，所述第一核酸分子、诱导型基因表达***的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或者基因编辑的方法。

关于本发明的第一个和第二个方面，所述第二核酸分子的导入采用基因编辑的方法。

所述基因编辑优选为基因敲入。

本发明的第三个方面，提供第一个或第二个方面所述的多能干细胞或其衍生物在制备用于细胞治疗的产品中的应用。

本发明的第四个方面，提供第一个或第二个方面所述的多能干细胞或其衍生物在制备用于器官移植的产品中的应用。

本发明的第五个方面，提供第一个或第二个方面所述的多能干细胞或其衍生物在构建通用型PSCs细胞库中的应用。

本发明的第六个方面，提供第一个或第二个方面所述的多能干细胞或其衍生物作为基因药物载体的应用。

本发明的有益效果是：

本发明的第一个方面所提供的多能干细胞或其衍生物，具有免疫兼容的特性，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答反应。而且，该多能干细胞或其衍生物的RNA干扰程序只作用于此类被改造过的多能干细胞或其衍生物。因此，当此类细胞或衍生物被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与第二核酸分子的转录产物所介导的针对免疫应答相关基因的RNA干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。

本发明的第二个方面所提供多能干细胞或其衍生物，具有免疫兼容可逆的特性。当诱导型基因表达***开启时，正常表达的小分子核酸和免疫应答相关基因3’UTR区域导入的第二核酸分子的转录产物特异性结合，从而启动RNA干扰程序，将免疫应答相关基因的mRNA降解或沉默，从而阻断免疫应答相关基因的表达。因此，此类细胞或衍生物被移植到受体中时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。

当移植物发生病变后，可以通过添加外源诱导物来关闭诱导型基因表达***，从而停止小核酸分子的表达及小分子核酸对免疫应答相关基因mRNA的干扰作用，恢复免疫相关基因的正常表达，进而恢复移植物细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的移植物，从而提高了这类多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。

本发明的免疫兼容可逆的多能干细胞或其衍生物还具有另一个非常显著的优点：可以通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间，来逐步降低多能干细胞或其衍生物中小核酸分子的表达量，使得供体细胞能够逐步地表达低浓度的免疫相关基因来刺激供体，从而使得供体对移植的细胞或其衍生物逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。此时，即使移植物细胞表面表达不匹配的HLA Ⅰ类分子，也能够被受体免疫***兼容。

附图说明

图1：Cas9(D10A)质粒图谱。

图2：sgRNA Clone AAVS1-1质粒图谱。

图3：sgRNA Clone AAVS1-2质粒图谱。

图4：sgRNA clone B2M-1质粒图谱。

图5：sgRNA clone B2M-2质粒图谱。

图6：sgRNA clone CIITA-1质粒图谱。

图7：sgRNA clone CIITA-2质粒图谱。

图8：AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒图谱。

图9：AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒图谱。

图10：AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒图谱。

图11：AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒图谱。

图12：B2M KI Vector。

图13：CIITA KI Vector。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

1实验材料

1.1起始干细胞或其衍生物

多能干细胞或其衍生物可选自胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)以及其他形式的多能干细胞，例如hPSCs-MSCs、NSCs、EBs细胞。其中：

iPSCs：使用我们所建立的第三代高效安全的episomal-iPSCs诱导***(6F/BM1-4C)，pE3.1-OG--KS和pE3.1-L-Myc--hmiR302 cluster经电转进入体细胞中，RM1培养2天，含2uM Parnate的BioCISO-BM1培养2天，含2uM Parnate、0.25mM sodium butyrate、3uMCHIR99021和0.5uM PD03254901的BioCISO-BM1培养2天，在用干细胞培养基BioCISO培养到17天左右即可挑取iPSCs克隆，所挑取的iPSCs克隆经纯化、消化、传代以获得稳定的iPSCs。具体构建方法参见：Stem Cell Res Ther.2017Nov 2；8(1):245。

hPSCs-MSCs：将iPSCs使用干细胞培养基(BioCISO，含10uM TGFβ抑制剂SB431542)培养25天，期间80-90汇合度进行消化传代(2mg/mL Dispase消化)，1:3传代到Matrigel包被的培养板中，接着ESC-MSC培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR、NEAA、双抗、谷氨酰胺、β-巯基乙醇、10ng/mL bFGF和SB-431542)进行培养，每天换液，80-90汇合度进行传代(1:3传代)，连续培养20天即可。具体构建方法参见：Proc Natl Acad Sci U S A.2015；112(2):530-535。

NSCs：将iPSCs使用诱导培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR，含TGF-β抑制剂，BMP4抑制剂)培养14天，挑取玫瑰花环状的神经细胞到低粘附培养板中进行培养，培养基使用比例为1:1的DMEM/F12(含1％N2，Invitrogen)和Neurobasal培养基(含2％B27，Invitrogen)，还含有20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF，进行培养，消化使用Accutase进行消化传代即可。具体构建方法参见：FASEB J.2014；28(11):4642-4656。

EBs细胞：将汇合度达到95％的iPSCs使用BioC-PDE1消化6min后使用机械刮传法将细胞刮成块状，沉降降细胞团块，沉降的细胞团块转移到低粘附培养板中使用BioCISO-EB1培养7天，隔天换液。7天后转移到Matrigel包被的培养板中继续使用BioCISO进行贴壁培养，7天后即可获得具有内、中、外三胚层结构的拟胚体(EBs)。具体构建方法参见：StemCell Res Ther.2017Nov 2；8(1):245。

所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织。

1.2小核酸分子及对应的第一核酸分子、第二核酸分子

小核酸分子序列为：5’TTGTACTACACAAAAGTACTG 3’(SEQ ID NO.1)

本领域技术人员可以理解，其他不靶向人类任何mRNA或lncRNA的非人类物种的随机序列均可以实现本发明的目的，例如SEQ ID NO.3。

第一核酸分子(即小核酸分子的shRNA表达框架或shRNA-miR表达框架)：

(1)shRNA表达框架：由5’到3’依次包括小核酸分子序列、茎环序列、小核酸分子序列的反向互补序列、Poly T；两个反向互补序列由中间一茎环序列分隔组成发夹结构，最后连上Poly T作为RNA聚合酶III的转录终止子；

表达框架的前端根据表达的需要加上启动子序列以及配套的启动子调控元件。

具体序列为：

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTGCTAGCGCCACC(SEQ ID NO.5)N₁...N₂₁TTCAAGAGA(SEQ ID NO.6)N₂₂...N₄₂TTTTTT

其中：

a、N₁...N₂₁为小核酸分子序列，N₂₂...N₄₂为小核酸分子序列的反向互补序列；

b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA，则每个基因分对应一个shRNA表达框架，然后无缝连接起来；

c、带不同抗性基因的组成型shRNA质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；

d、N表示A、T、G、C碱基；

e、SEQ ID NO.5为启动子序列；

f、SEQ ID NO.6为茎环序列。

(2)shRNA-miR表达框架：将小核酸分子序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。具体序列如下：

GAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG(SEQ ID NO.7)M₁N₁...N₂₁TAGTGAAGCCACAGATGTA(SEQ ID NO.8)N₂₂...N₄₂M₂TGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAAT(SEQ ID NO.9)

其中：

b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA-miR，则每个基因分对应一个shRNA-miR表达框架，然后无缝连接起来；

c、带不同抗性基因的组成型shRNA-miR质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；

d、M碱基表示A或C碱基，N表示A、T、G、C碱基；

e、如果N1为G碱基，则M1为A碱基；否则M1为C碱基；

f、M1碱基与M2碱基互补。

第二核酸分子(B2M-3’UTR-miRNA-locus/CIITA-3’UTR-miRNA-locus)：

atTCTAGATACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTA(SEQ IDNO.2)

1.3免疫相关基因

本实施例选择的免疫相关基因为B2M(NCBI Gene ID:567)和CIITA(NCBI GeneID:4261)，在这两个基因的3’UTR处***第二核酸序列。

1.4基因组安全位点

本实施例中，基因敲入的基因组安全位点为AAVS1安全位点。本领域技术人员可以理解，敲入其他的基因组安全位点，例如eGSH安全位点、H11安全位点，同样可以实现本发明的目的。

1.5诱导型基因表达***

本实施例中，诱导型基因表达***选自：tet-Off***。本领域技术人员可以理解，采用二聚体关闭表达***同样可以实现本发明的目的。

2实验方法

2.1基因敲入

将诱导型基因表达***及第一核酸分子敲入多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点，将第二核酸分子(SEQ ID NO.2)敲入B2M和CIITA基因的3’UTR处。

(一)sgRNA构建

1、质粒

外源基因的敲入采用Cas9(D10A)质粒和sgRNA质粒***。Cas9(D10A)质粒图谱如图1所示，AAVS1安全位点的sgRNA质粒图谱如图2、图3所示，B2M基因的sgRNA质粒图谱如图4、图5所示，CIITA基因的sgRNA质粒图谱如图6、图7所示。

2、同源臂

(1)、AAVS1同源臂AAVS1-HR-L和AAVS1-HR-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；

(2)B2M同源臂B2M-HR-L和B2M-HR-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示；

(3)CIITA同源臂CIITA-HR-L和CIITA-HR-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；

3、sgRNA序列

sgRNA-AAVS1-1：5’-TATAAGGTGGTCCCAGCTCGGGG-3’(SEQ ID NO.16)；

sgRNA-AAVS1-2：5’-AGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGG-3’(SEQ ID NO.17)。

sgRNA-B2M-1:5’-CTCCTGTTATATTCTAGAACAGG-3’(SEQ ID NO.18)；

sgRNA-B2M-2:5’-TTTCAGCATCAATGTACCCTGGG-3’(SEQ ID NO.19)。

sgRNA-CIITA-1:5’-GGCACTCAGAAGACACTGATGGG-3’(SEQ ID NO.20)；

sgRNA-CIITA-2:5’-AAGGTGTCTGGTCGGAGAGCAGG-3’(SEQ ID NO.21)。

4、质粒构建方法

(1)使用限制性内切酶BbsI酶切sgRNA空载体，然后回收。

(2)合成sgRNA引物(含载体黏性末端)。

(3)引物加水稀释成10uM，配反应体系于沸水煮5min，后冷却至室温，获得退火产物。

反应体系：上游引物：2uL，下游引物：2uL，水：12.8uL

(4)使用DNA连接反应试剂盒(TaKaRa，6022)把前面步骤载体和退火产物连接起来，获得包含基因靶序列的sgRNA质粒。

(二)基因编辑过程

1.AAVS1基因敲入的单细胞克隆操作步骤(1)电转程序：

供体细胞准备：人多能干细胞

试剂盒：Human Stem Cell

Kit 1

仪器：电转仪

培养基：BioCISO

诱导质粒：Cas9D10A、sgRNA clone AAVS1-1、sgRNA clone AAVS1-2、AAVS1 neoVectoⅠ、AAVS1 neo VectorⅡ

(2)电转后的人多能干细胞进行含G418和puro的双抗生素培养基进行筛选

(3)进行单细胞克隆筛选及培养，获得单细胞克隆株。

2.AAVS1基因敲入的单细胞克隆株培养试剂

(1)培养基：BioCISO+300μg/ml G418+0.5μg/ml puro

(应提前置于室温，避光条件放置30～60分钟，直至恢复到室温。注意：不应将BioCISO置于37℃进行预热，避免生物分子活性降低。)

(2)基质胶：hESC级Matrigel

(传代或复苏细胞前，将Matrigel工作液加入细胞培养瓶皿中并摇匀，确保Matrigel完全没过培养瓶皿底部，且在使用前任意一处Matrigel都不能干掉。为保证细胞能够更好的贴壁和存活，Matrigel放入37℃培养箱包被时间：1:100X Matrigel不能低于0.5小时；1:200X Matrigel不能低于2小时。)

(3)消化液：使用DPBS溶解EDTA至终浓度为0.5mM，pH7.4

(注意：EDTA不能使用水稀释，否则细胞会因渗透压降低而死亡。)

(4)冻存液：60％BioCISO+30％ESCs级FBS+10％DMSO

3.常规维持传代培养过程

(1)传代的最佳时刻以及传代比例

a.传代最佳时刻：细胞整体汇合度达80％～90％。

b.传代最佳比例：1:4～1:7传代，次日最佳汇合度应维持在20％～30％。

(2)传代过程

a.事先将包被好的细胞培养瓶皿中的Matrigel吸走弃掉，加入适量培养基(BioCISO+300μg/ml G418+0.5μg/ml puro)，并放入37℃、5％CO2培养箱中孵育；

b.待细胞符合传代的要求，吸掉培养基上清，加入适量的0.5mM EDTA消化液到细胞瓶皿中；

c.将细胞放入37℃、5％CO2培养箱中孵育5～10分钟(消化至镜下观察到大部分细胞收缩变圆但还未漂浮即可，轻柔吹打细胞使其从壁上脱离，将细胞悬液吸到离心管内，200g离心5分钟；

d.离心后，弃上清，用培养基重悬细胞，轻柔反复吹打细胞数次至混匀，然后将细胞转移至事先准备好包被Matrigel的瓶皿中；

e.细胞转移至细胞瓶皿后，前后左右水平摇匀，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养；

f.次日观察细胞贴壁存活状态，吸掉培养基每天正常按时换液。

4.细胞冻存

(1)按照常规传代的操作步骤，使用0.5mM EDTA消化细胞至大部分细胞收缩变圆但尚未漂浮，轻柔吹打细胞，收集细胞悬液，200g离心5分钟，弃上清，加入适量冻存液重悬细胞，将细胞转移至冻存管(建议六孔板汇合度80％冻存一支，冻存液体积为0.5ml/支)；

(2)将冻存管置于程序降温盒中，立即放入-80℃过夜(需保证冻存管每分钟温度下降1℃)；

(3)次日立即将细胞转移入液氮。

5.细胞复苏

(1)提前准备好Matrigel包被的细胞瓶皿，复苏细胞前，吸掉Matrigel，向细胞瓶皿中加入适量的BioCISO，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育；

(2)将冻存管从液氮中快速取出，立即放入37℃水浴锅中快速摇晃，使细胞快速融解，仔细观察待冰晶完全消失停止摇晃，将细胞转移至生物安全柜；

(3)提前加入10ml DMEM/F12(1:1)基础培养基至15ml离心管，并平衡至室温，使用巴氏吸管吸取1ml DMEM/F12(1:1)缓慢加入冻存管中，轻柔混匀，将细胞悬液转移到准备好的含有DMEM/F12(1:1)的15ml离心管中，200g离心5分钟；

(4)小心弃掉上清，加入适量BioCISO，轻轻混匀细胞，种到提前准备好的细胞瓶皿中，水平前后左右摇匀后，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO2培养箱中培养；

(5)次日观察细胞贴壁存活状态，每天正常按时换液。若贴壁良好，则BioCISO更换为BioCISO+300μg/ml G418+0.5μg/ml puro。

(三)基因敲入检测方法

1.单细胞克隆AAVS1基因敲入检测

(1)AAVS1基因敲入检测说明

a.试验目的：PCR检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个Donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的Donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的Donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子；

b.试验方法:首先在Donor质粒抗性基因内部设计一条引物，然后在***位点的基因组(靠近重组臂)设计另一条引物。如果Donor片段在基因组能够正确***，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现)；

c.试验方案引物序列及PCR方案如表1所示：

表1试验方案引物序列及PCR方案

B2M和CIITA基因3’UTR处第二核酸分子敲入的检测方法与AAVS1的检测原理相同，采用的PCR检测条件如下：

表2试验方案引物序列及PCR方案(B2M位点的敲入检测)

表3试验方案引物序列及PCR方案(CIITA位点的敲入检测)

2.2干细胞同种异体免疫兼容效果的检验

2.2.1效应细胞的准备

抽取志愿者血液，分离T细胞和NK细胞。效应细胞和免疫兼容多能干细胞来自不同的人。

1)T细胞分离：使用Ficoll密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradientcentrifugation)分离人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，再使用Dynabeads^TM CD3(Invitrogen^TM，货号：11151D)试剂盒分离出T细胞。将细胞重悬在含10％FBS的RPMI1640培养基中，通过台盼蓝染色计数细胞，并浓缩至1×10⁷细胞/mL。

2)NK细胞分离：使用MagniSort^TM Human NK cell Enrichment Kit(Invitrogen^TM，货号：8804-6819-74)试剂盒分选分离出NK细胞。将细胞重悬在含10％FBS的RPMI1640培养基中，通过台盼蓝染色计数细胞，并浓缩至1×10⁷细胞/mL。

2.2.2靶细胞的准备

取由PSCs制备的拟胚体细胞，将其消化重悬，通过台盼蓝染色计数细胞，配成1×10⁷细胞/mL的细胞悬液。

2.2.3⁵¹Cr释放试验

正常细胞与T/NK细胞接触时(异体)，T/NK就会攻击正常细胞造成细胞裂解死亡。而免疫兼容性好则不会被T/NK攻击，即免疫逃逸。所以通过检测培养基中⁵¹Cr的量，即可反应出免疫兼容能力。⁵¹Cr的释放到培养液中的量越少，免疫兼容越好。

定量检测细胞介导的细胞毒作用，以放射性同位素⁵¹Cr标记靶细胞，与效应分子或细胞共孵育，根据靶细胞裂解所释放的⁵¹Cr放射脉冲数(cpm)而判断细胞毒活性。

1)将靶细胞用100μCi(Ci,放射性活度单位)的Na⁵¹CrO₄在37℃标记120min，每15分钟震摇一次，标记后再用清洗液离心清洗5次，最后重悬于培养液中，配成1×10⁶细胞/mL备用。

2)将靶细胞及T/NK细胞加入96孔培养板中，每孔加100μl靶细胞(2.5×10³个)及100μl效应细胞(E/T＝1:2、1:5、1:10，E/T为靶细胞与效应细胞T/NK的比)，同时设立自然释放对照孔(100μl靶细胞+100ul培养基)和最大释放孔(100μl靶细胞+100ul 2％SDS)。放置37℃，5％CO₂培养孵育4h。取出后用移液器吸出各孔上清液后，离心取上清液100μl，用γ计数仪测量cpm值。

注：一般要求⁵¹Cr自然释放率<10％

3)结果计算：根据公式计算⁵¹Cr自然释放率和T/NK细胞的活性：

2.2.4CFSE测试试验

荧光染料CFSE，也可称为CFDA SE(5,6-carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester，羟基荧光素二醋酸盐琥铂酰亚胺酯)，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，可通过流式细胞仪进行检测。

1)在靶细胞中加入CFSE工作液(终浓度为5μmol/L CFSE)，于37℃，5％CO₂培养孵育10min，洗涤2次。台盼蓝染色计数后用培养基重悬，配成1X10⁶细胞/mL备用。

2)将靶细胞及效应细胞加入5ml流式管中，每管加100μl靶细胞(1X10⁵ml^-1)及效应细胞(E/T＝1:2、1:5、1:10，E/T为靶细胞与效应细胞T的比)，并以只加靶细胞作为对照。将流式管中的效应细胞与靶细胞轻轻混匀。加入PI，放置37℃，5％CO₂培养孵育4h。流式细胞检测CFSE⁺PI⁺细胞(死亡的靶细胞)的百分率。

靶细胞死亡率(％)＝加T细胞刺激的靶细胞死亡率(％)-靶细胞自然死亡率(％)

2.2.5流式细胞仪(FCM)分析NK细胞CD_107a表达

在NK细胞杀伤靶细胞时，CD_107a分子被转运到细胞膜表面，CD_107a分子阳性表达的NK细胞可代表具有杀伤活性的NK细胞。

1)将效应细胞和靶细胞以一定比例混合(E/NK＝3:1、1:1、1:3，E/NK为靶细胞与效应细胞NK的比)，置于培养孔，37℃，5％CO₂培养孵育2h，加莫能菌素(monensin,2μmol/L)继续孵育3.5h后加PE-Cy5-CD_107a、FITC-CD₅₆抗体孵育30min。PBS缓冲液洗涤3次后，用200μL1％多聚甲醛固定进行流式分析。效应细胞同时仅用佛波脂醇(PMA,2.5μg/mL)和离子霉素(lonomycin,0.5μg/mL)刺激为阳性对照。

注：NK细胞膜表面CD_107a自然表达频率很低，大约为1.2％～5.8％

2)结果计算

NK细胞毒性＝加靶细胞刺激的CD_107a阳性率(％)-CD_107a自然表达率(％)

2.2.6MTT检测细胞活性实验

消化、计数好细胞后，用对应的培养基吹匀细胞，铺到96孔板中，每个孔种3000个细胞，种5个复孔，然后补入对应的培养基至终体积150uL,每天更换相应的培养基，细胞放置在37℃5％CO₂培养箱中培养72h后测MTT值。

3实验方案

实验方案一：

具体的实验分组如表4所示，“+”表示在基因组中敲入对应的项目。其中：

B2M-3’UTR-miRNA-locus或CIITA-3’UTR-miRNA-locus即第二核酸分子(SEQ IDNO.2)，分别敲入B2M和CIITA基因的3’UTR区域。

B2M/CIITA-3’UTR-shRNA为小核酸分子的shRNA表达框架，也即第一核酸分子，特异性靶向B2M基因和CIITA基因3’UTR区域第二核酸分子的转录产物，敲入位点为基因组安全位点AAVS1。

B2M/CIITA-3’UTR-shRNA-miR为小核酸分子的shRNA-miR表达框架，也即第一核酸分子，靶向B2M基因和CIITA基因3’UTR区域第二核酸分子的转录产物，敲入位点为基因组安全位点AAVS1。

CD47表示CD47表达序列，其敲入位点为基因组安全位点AAVS1。

表4组成型表达实验方案

实验方案二：

具体的实验分组如表5所示，“+”表示在基因组中敲入对应的项目。其中：

CD47表示CD47表达序列，其敲入位点为基因组安全位点AAVS1。

Tet-Off***敲入位点为基因组安全位点AAVS1，用于调控shRNA或shRNA-miR、CD47的表达。

表5诱导型表达实验方案

各实验组的实验操作

1、构建表达质粒

KI(Knock-in)质粒构建方法：

a.获取质粒基本骨架：设计引物，通过PCR的方法从pUC18(Takara，Code No.3218)质粒获取Amp(R)-pUC origin片段，然后回收产物。

b.重组臂的获取：设计引物，以人细胞的基因组DNA为模板，扩增AAVS1-HR-L(SEQID NO.10)，AAVS1-HR-R(SEQ ID NO.11)，B2M-HR-L(SEQ ID NO.12),B2M-HR-R(SEQ IDNO.13),CIITA-HR-L(SEQ ID NO.14)，CIITA-HR-R(SEQ ID NO.15)片段，然后回收产物。

c.其它质粒元件的获取：设计引物，直接对含该质粒元件的质粒进行亚克隆，然后回收产物。

d.质粒组装：把前面步骤获取的各种产物通过overlap PCR连接成大片段，最后使用重组酶(南京诺唯赞生物，C113-01)通过重组的方法将大片段连接成一个环状质粒。

2、各分组的分子***KI质粒的操作如下：

(1)A1分组：空白对照组，不做任何处理。

(2)A2分组：AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒(图8)的shRNA表达框架1放入小核酸分子的序列SEQ ID NO.1；

B2M KI Vector(如图12所示)放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector(如图13所示)放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus。

(3)A3分组：AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒(图10)的shRNA-miR表达框1架放入小核酸分子的序列SEQ ID NO.1；

B2M KI Vector放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus。

(4)A4分组：AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的MCS放入CD47基因序列，shRNA表达框架1放入小核酸分子的序列SEQ ID NO.1；

B2M KI Vector(如图12所示)放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector(如图13所示)放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus。

(5)A5分组：AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)质粒的MCS放入CD47基因序列，shRNA-miR表达框1架放入小核酸分子的序列SEQ ID NO.1；

B2M KI Vector放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus。

(6)B1分组：空白对照组，不做任何处理。

(7)B2分组：AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒(图9)的shRNA表达框架1放入小核酸分子的序列SEQ ID NO.1；

B2M KI Vector放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus。

(8)B3分组：AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒(图11)的shRNA-miR表达框架1放入小核酸分子的序列SEQ ID NO.1；

B2M KI Vector放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus。

(9)B4分组：AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)质粒的MCS放入CD47基因序列，shRNA表达框架1放入小核酸分子的序列SEQ ID NO.1；

B2M KI Vector放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus。

(10)B5分组：AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)质粒的MCS放入CD47基因序列，shRNA-miR表达框架1放入小核酸分子的序列SEQ ID NO.1；

B2M KI Vector放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；)

CIITA KI Vector放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus。

4、实验结果

4.1⁵¹Cr释放试验检测改造后的干细胞或其衍生物的免疫兼容效果

根据表4和表5的实验方案对hPSCs源EBs进行改造，使用⁵¹Cr释放试验检测改造后的EB球与T细胞的免疫兼容效果：

1、将EB球免疫兼容细胞消化成单个的细胞作为靶细胞；

2、将经⁵¹Cr标记的靶细胞及T细胞以1:5的比例加入96孔培养板中进行反应后检测；

3、根据⁵¹Cr释放试验检测EB球免疫兼容细胞的细胞特异性⁵¹Cr释放率，结果见表6所示。

表6 EB球免疫兼容细胞的细胞特异性⁵¹Cr释放率

从表6可以看出，我们所制备的hPSCs源EB球细胞免疫兼容效果显著。而在培养基中添加6uM的Dox处理细胞48h后，诱导型表达组(B2-B5)恢复抗原提呈能力，呈现非免疫兼容状态，从而实现了细胞免疫兼容的可逆性调控。

进一步使用⁵¹Cr释放试验检测改造后的EB球免疫兼容细胞与NK细胞的免疫兼容效果：

1、将EB球免疫兼容细胞消化成单个的细胞作为靶细胞；

2、将经⁵¹Cr标记的靶细胞及NK细胞以1:5的比例加入96孔培养板中进行反应后检测；

3、根据⁵¹Cr释放试验检测EB球免疫兼容细胞的细胞特异性⁵¹Cr释放率，结果见表7所示。

表7 EB球免疫兼容细胞的细胞特异性⁵¹Cr释放率

从表7可以看出，我们所制备的hPSCs源EB球细胞免疫兼容效果显著。而在培养基中添加6uM的Dox处理细胞48h后，诱导型表达组(B2-B5)恢复抗原提呈能力，呈现非免疫兼容状态，从而实现了细胞免疫兼容的可逆性调控。

4.2采用CFSE试验检测EB球免疫兼容细胞分泌的外泌体对其他细胞产生免疫逃逸的效果

1、根据表4和表5的实验方案对hPSCs源EBs进行改造，将得到的EB球免疫兼容细胞进行培养，并收集培养上清提取外泌体；

2、将外泌体添加到没有改造的EB球非免疫兼容细胞以及经B2M&CIITA-3’UTR-miRNA-locus改造的EB球非免疫兼容细胞(改造方案：仅将B2M-3’UTR-miRNA-locus或CIITA-3’UTR-miRNA-locus即第二核酸分子(SEQ ID NO.2)，分别敲入B2M和CIITA基因的3’UTR区域。)中进行培养72h，消化成单个的细胞作为靶细胞；

3、将经CFSE标记的靶细胞及T细胞以1:5的比例加入5ml流式管中进行反应后在进行检测；

4、根据CFSE测试试验检测CFSE+PI+细胞(死亡的靶细胞)的百分率，结果见表8。

表8 CFSE测试结果

从表8可以看出，细胞产生的B2M/CIITA-3’UTR-shRNA和B2M/CIITA-3’UTR-shRNA-miR通过外泌体抵达受体细胞时，仅会对经B2M&CIITA-3’UTR-miRNA-locus敲入改造过的细胞起作用而产生免疫兼容，不会致使其他非供体细胞产生免疫兼容效果，即细胞所产生的免疫兼容效果仅能在供体细胞中起作用。

4.3使用流式细胞仪(FCM)分析NK细胞CD_107a表达来检测EB球免疫兼容细胞分泌的外泌体对其他细胞产生免疫逃逸的效果

3、将靶细胞及NK细胞以1:1的比例加入5ml流式管中进行反应后在进行检测；

4、根据NK细胞CD_107a表达检测NK细胞毒性，结果见表9。

表9 NK细胞CD_107a表达检测结果

从表9可以看出，细胞产生的B2M/CIITA-3’UTR-shRNA和B2M/CIITA-3’UTR-shRNA-miR通过外泌体抵达受体细胞时，仅会对经B2M&CIITA-3’UTR-miRNA-locus敲入改造过的细胞起作用而产生免疫兼容，不会致使其他非供体细胞产生免疫兼容效果，即细胞所产生的免疫兼容效果仅能在供体细胞中起作用。

4.4不同多能干细胞或其衍生物的免疫兼容效果

根据表5的B4实验方案组分别改造hPSCs、hPSCs-MSCs、NSCs、EBs细胞。分别将这些改造后的细胞消化成单个的细胞作为靶细胞，使用⁵¹Cr释放试验检测靶细胞免疫兼容效果：

1、将经⁵¹Cr标记的靶细胞及T细胞以1:5的比例加入96孔培养板中进行反应后检测；

3、根据⁵¹Cr释放试验检测靶细胞的细胞特异性⁵¹Cr释放率，结果见表10所示。

表10 hPSCs-MSCs、NSCs、EBs免疫兼容细胞的⁵¹Cr释放率

注：组1为对照组(没有改造的细胞组)；组2为构建的免疫兼容细胞组(方案B4)；组3为使用诱导剂(Dox)处理后的免疫兼容细胞组。

从表10可以看出，我们所制备的hPSCs及hPSCs源衍生物(hPSCs-MSCs、NSCs、EBs)的免疫兼容效果显著，在使用诱导剂(Dox)处理后，这些细胞可恢复抗原提呈能力，实现了免疫兼容可逆。

<110> 未来智人再生医学研究院（广州）有限公司；王淋立

<120> 一种多能干细胞及其衍生物

<130>

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 1

ttgtactaca caaaagtact g 21

<210> 2

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attctagata cagtactttt gtgtagtaca acgtacagta cttttgtgta gtacaacgta 60

cagtactttt gtgtagtaca acgtacagta cttttgtgta gtacaacgta cagtactttt 120

gtgtagtaca acgtacagta cttttgtgta gtacaacgta cagtactttt gtgtagtaca 180

acgtacagta cttttgtgta gtacaacgta 210

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 3

tcacaacctc ctagaaagag taga 24

<210> 4

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attctagata tctactcttt ctaggaggtt gtgacgtatc tactctttct aggaggttgt 60

gacgtatcta ctctttctag gaggttgtga cgtatctact ctttctagga ggttgtgacg 120

tatctactct ttctaggagg ttgtgacgta tctactcttt ctaggaggtt gtgacgtatc 180

tactctttct aggaggttgt gacgtatcta ctctttctag gaggttgtga cgta 234

<210> 5

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

ctttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca 300

gtgatagaga aaagtgaaag tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa 360

agtcgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc 420

ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa 480

agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag tcgagctcgg 540

tacccgggtc gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg 600

aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 660

gaccgatcca gcctgctagc gccacc 686

<210> 6

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcaagaga 9

<210> 7

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaggcttcag tactttacag aatcgttgcc tgcacatctt ggaaacactt gctgggatta 60

cttcttcagg ttaacccaac agaaggctaa agaaggtata ttgctgttga cagtgagcg 119

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagtgaagcc acagatgta 19

<210> 9

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgcctactgc ctcggacttc aaggggctac tttaggagca attatcttgt ttactaaaac 60

tgaatacctt gctatctctt tgatacattt ttacaaagct gaattaaaat ggtataaat 119

<210> 10

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgctttctct gacctgcatt ctctcccctg ggcctgtgcc gctttctgtc tgcagcttgt 60

ggcctgggtc acctctacgg ctggcccaga tccttccctg ccgcctcctt caggttccgt 120

cttcctccac tccctcttcc ccttgctctc tgctgtgttg ctgcccaagg atgctctttc 180

cggagcactt ccttctcggc gctgcaccac gtgatgtcct ctgagcggat cctccccgtg 240

tctgggtcct ctccgggcat ctctcctccc tcacccaacc ccatgccgtc ttcactcgct 300

gggttccctt ttccttctcc ttctggggcc tgtgccatct ctcgtttctt aggatggcct 360

tctccgacgg atgtctccct tgcgtcccgc ctccccttct tgtaggcctg catcatcacc 420

gtttttctgg acaaccccaa agtaccccgt ctccctggct ttagccacct ctccatcctc 480

ttgctttctt tgcctggaca ccccgttctc ctgtggattc gggtcacctc tcactccttt 540

catttgggca gctcccctac cccccttacc tctctagtct gtgctagctc ttccagcccc 600

ctgtcatggc atcttccagg ggtccgagag ctcagctagt cttcttcctc caacccgggc 660

ccctatgtcc acttcaggac agcatgtttg ctgcctccag ggatcctgtg tccccgagct 720

gggaccacct tatattccca gggccggtta atgtggctct ggttctgggt acttttatct 780

gtcccctcca ccccacagtg gggc 804

<210> 11

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

actagggaca ggattggtga cagaaaagcc ccatccttag gcctcctcct tcctagtctc 60

ctgatattgg gtctaacccc cacctcctgt taggcagatt ccttatctgg tgacacaccc 120

ccatttcctg gagccatctc tctccttgcc agaacctcta aggtttgctt acgatggagc 180

cagagaggat cctgggaggg agagcttggc agggggtggg agggaagggg gggatgcgtg 240

acctgcccgg ttctcagtgg ccaccctgcg ctaccctctc ccagaacctg agctgctctg 300

acgcggccgt ctggtgcgtt tcactgatcc tggtgctgca gcttccttac acttcccaag 360

aggagaagca gtttggaaaa acaaaatcag aataagttgg tcctgagttc taactttggc 420

tcttcacctt tctagtcccc aatttatatt gttcctccgt gcgtcagttt tacctgtgag 480

ataaggccag tagccagccc cgtcctggca gggctgtggt gaggaggggg gtgtccgtgt 540

ggaaaactcc ctttgtgaga atggtgcgtc ctaggtgttc accaggtcgt ggccgcctct 600

actccctttc tctttctcca tccttctttc cttaaagagt ccccagtgct atctgggaca 660

tattcctccg cccagagcag ggtcccgctt ccctaaggcc ctgctctggg cttctgggtt 720

tgagtccttg gcaagcccag gagaggcgct caggcttccc tgtccccctt cctcgtccac 780

catctcatgc ccctggctct cctgcccctt ccctacaggg gttcctggct ctgctct 837

<210> 12

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cctggacttc tccagtactt tctggctgga ttggtatctg aggctagtag gaagggcttg 60

ttcctgctgg gtagctctaa acaatgtatt catgggtagg aacagcagcc tattctgcca 120

gccttatttc taaccatttt agacatttgt tagtacatgg tattttaaaa gtaaaactta 180

atgtcttcct tttttttctc cactgtcttt ttcatagatc gagacatgta agcagcatca 240

tggaggtaag tttttgacct tgagaaaatg tttttgtttc actgtcctga ggactattta 300

tagacagctc taacatgata accctcacta tgtggagaac attgacagag taacatttta 360

gcagggaaag aagaatccta cagggtcatg ttcccttctc ctgtggagtg gcatgaagaa 420

ggtgtatggc cccaggtatg gccatattac tgaccctcta cagagagggc aaaggaactg 480

ccagtatggt attgcaggat aaaggcaggt ggttacccac attacctgca aggctttgat 540

ctttcttctg ccatttccac attggacatc tctgctgagg agagaaaatg aaccactctt 600

ttcctttgta taatgttgtt ttattcttca gacagaagag aggagttata cagctctgca 660

gacatcccat tcctgtatgg ggactgtgtt tgcctcttag aggttcccag gccactagag 720

gagataaagg gaaacagatt gttataactt gatataatga tactataata gatgtaacta 780

caaggagctc cagaagcaag agagagggag gaacttggac ttctctgcat ctttagttgg 840

agtccaaagg cttttcaatg aaattctact gcccagggta cattgatgct gaaaccccat 900

<210> 13

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcaaatctcc tgttatattc tagaacaggg aattgatttg ggagagcatc aggaaggtgg 60

atgatctgcc cagtcacact gttagtaaat tgtagagcca ggacctgaac tctaatatag 120

tcatgtgtta cttaatgacg gggacatgtt ctgagaaatg cttacacaaa cctaggtgtt 180

gtagcctact acacgcatag gctacatggt atagcctatt gctcctagac tacaaacctg 240

tacagcctgt tactgtactg aatactgtgg gcagttgtaa cacaatggta agtatttgtg 300

tatctaaaca tagaagttgc agtaaaaata tgctatttta atcttatgag accactgtca 360

tatatacagt ccatcattga ccaaaacatc atatcagcat tttttcttct aagattttgg 420

gagcaccaaa gggatacact aacaggatat actctttata atgggtttgg agaactgtct 480

gcagctactt cttttaaaaa ggtgatctac acagtagaaa ttagacaagt ttggtaatga 540

gatctgcaat ccaaataaaa taaattcatt gctaaccttt ttcttttctt ttcaggtttg 600

aagatgccgc atttggattg gatgaattcc aaattctgct tgcttgcttt ttaatattga 660

tatgcttata cacttacact ttatgcacaa aatgtagggt tataataatg ttaacatgga 720

catgatcttc tttataattc tactttgagt gctgtctcca tgtttgatgt atctgagcag 780

gttgctccac aggtagctct aggagggctg gcaacttaga ggtggggagc agagaattct 840

cttatccaac atcaacatct tggtcagatt tgaactcttc aatctcttgc actcaaagct 900

<210> 14

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cttgacaagt ctcctgctcc tcactatgaa gatcactgtc ccccagccct gtgctccccg 60

cactgtgctg cacgtccacc tccattccac tgcccctccc atccccccat cttgatagca 120

cccttcccag gtgtcaagct gcccctccta gagtgtcctg cctaaacccc ctctcctggc 180

tcctcccgct acagcatgtt ctctgaggac actaaccacg ctggaccttg aactgggtac 240

ttgtggacac agctcttctc caggctgtat cccatgagcc tcagcatcct ggcacccggc 300

ccctgctggt tcagggttgg cccctgcccg gctgcggaat gaaccacatc ttgctctgct 360

gacagacaca ggcccggctc caggctcctt tagcgcccag ttgggtggat gcctggtggc 420

agctgcggtc cacccaggag ccccgaggcc ttctctgaag gacattgcgg acagccacgg 480

ccaggccaga gggagtgaca gaggcagccc cattctgcct gcccaggccc ctgccaccct 540

ggggagaaag tacttctttt tttttatttt tagacagagt ctcactgttg cccaggctgg 600

cgtgcagtgg tgcgatctgg gttcactgca acctccgcct cttgggttca agcgattctt 660

ctgcttcagc ctcccgagta gctgggacta caggcaccca ccatcatgtc tggctaattt 720

ttcattttta gtagagacag ggttttgcca tgttggccag gctggtctca aactcttgac 780

ctcaggtgat ccacccacct cagcctccca aagtgctggg attacaagcg tgagccactg 840

caccgggcca cagagaaagt acttctccac cctgctctcc gaccagacac cttgacaggg 900

<210> 15

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cacaccgggc actcagaaga cactgatggg caacccccag cctgctaatt ccccagattg 60

caacaggctg ggcttcagtg gcagctgctt ttgtctatgg gactcaatgc actgacattg 120

ttggccaaag ccaaagctag gcctggccag atgcaccagc ccttagcagg gaaacagcta 180

atgggacact aatggggcgg tgagagggga acagactgga agcacagctt catttcctgt 240

gtcttttttc actacattat aaatgtctct ttaatgtcac aggcaggtcc agggtttgag 300

ttcataccct gttaccattt tggggtaccc actgctctgg ttatctaata tgtaacaagc 360

caccccaaat catagtggct taaaacaaca ctcacattta ttctgctcac atatctgtca 420

tttgagcagg gctcagcggg gacagctcct tctgtcctac tctgtgtcag gtggggcagc 480

ttgagggttg ggctggtgtc acctgaagac tcattcttct gtacgtctga caggcaatgc 540

tggctgttgg ctgggggcct cagtgccact acggaatagt tggctaggac ccctccatgt 600

gggctagttg ggcttcctca tagtatggtg gctgggttgg agggtgtccc aaaaagaaag 660

gaggggatag agagagacca cttttcataa cctagcctta gaagtcacac agtattactt 720

ctgctacata tatatgtttt aagaggcagg gtctcactct gtcgcccagt ctggaatgca 780

gtggtatgat cacggctcac tgcagcctca acctcctggg ctaagtgatc ctcccacctc 840

agcctcccga atagctggga ctacaggtgt gagtcaccaa gcccagttaa tctttagttt 900

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tataaggtgg tcccagctcg ggg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agggccggtt aatgtggctc tgg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctcctgttat attctagaac agg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tttcagcatc aatgtaccct ggg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ggcactcaga agacactgat ggg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aaggtgtctg gtcggagagc agg 23

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccatagctca gtctggtcta tc 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ctcttcgtcc agatcatcct ga 22

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cacaccttgc cgatgtcgag 20

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gcactgaacg aacatctcaa gaag 24

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tgctccgggt ttgtctcaga tg 22

Claims

1.一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中导入有第一核酸分子；

且，所述多能干细胞或其衍生物中的免疫应答相关基因的3’UTR区域导入有第二核酸分子；

2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有诱导型基因表达***，用于调控第一核酸分子的表达。

3.根据权利要求1或2所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有CD47的表达序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述免疫应答相关基因包括：

(1)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种；

(2)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种。

5.根据权利要求1-3任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述小核酸分子包括短干扰核酸、短干扰RNA、双链RNA，优选为miRNA、shRNA、shRNA-miR中的至少一种。

6.根据权利5所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物来源于人类；所述小核酸分子的序列为来源于不靶向人类任何mRNA或lncRNA的非人类物种的随机序列，优选来源于秀丽隐杆线虫。

7.根据权利要求6所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述小核酸分子的序列为以下任一种：

5’-TTGTACTACACAAAAGTACTG-3’；

5’-TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGA-3’。

8.根据权利要求1-7任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述第二核酸分子包括至少3个重复的小核酸分子序列的反向互补序列，优选为6～10个重复的小核酸分子序列的反向互补序列。

9.根据权利要求2-8任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述诱导型基因表达***包括Tet-Off***、二聚体诱导表达***中的至少一种。

10.根据权利要求1-9任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述第一核酸分子、诱导型基因表达***的导入位点为基因组安全位点，优选为AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的至少一种。

11.根据权利要求1-10任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述第一核酸分子、诱导型基因表达***的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或者基因编辑的方法；第二核酸分子的导入采用基因编辑的方法；所述基因编辑优选为基因敲入。

12.根据权利要求1-11任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；

所述衍生物包括多能干细胞来源的三胚层源器官、组织或者细胞；

所述多能干细胞来源的三胚层源细胞包括间充质干细胞、神经干细胞或祖细胞，或者其他成体干细胞。

13.权利要求1-12任一项所述的多能干细胞或其衍生物在制备用于细胞治疗的产品、或用于器官移植产品中的应用。

14.权利要求1-12任一项所述的多能干细胞或其衍生物在构建通用型多能干细胞细胞库中的应用。

15.权利要求1-12任一项所述的多能干细胞或其衍生物作为基因药物载体的应用。