CN114107207A - 诱导神经干细胞分化的组合物及方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导神经干细胞分化的组合物及方法和用途。该组合物包括诱导培养液和浓度为3～20μg/ml的层粘连蛋白溶液，所述诱导培养液中含有KnockOut血清代替物。该组合物成本低，且诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的诱导率高。

Description

诱导神经干细胞分化的组合物及方法和用途
技术领域
本发明涉及一种诱导神经干细胞分化的组合物及方法和用途，尤其涉及一种层粘连蛋白溶液的用途以及一种多聚-L-赖氨酸的用途。
背景技术
星形胶质细胞是中枢神经***重要的胶质细胞，也是组成血脑屏障的三类细胞之一。星形胶质细胞是帮助中枢神经***神经元获取营养，辅助***代谢废物的重要胶质细胞。星形胶质细胞还为血脑屏障的屏障作用提供了重要的支撑。研究表明，星形胶质细胞与睡眠调节性障碍、癫痫、认知功能障碍、脑卒中、脑出血等疾病具有密切的联系。因此，星形胶质细胞在科学研究中发挥着重要的作用。目前，在神经科学研究中，在正常或不同疾病情况下，观察及检测星形胶质细胞的分子表达、功能形态等多个方面，已经发现了中枢神经***中存在着星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞。反应性星形胶质细胞是在应对中枢神经***损伤、疾病或感染时形体、分子和功能等方面发生改变的星形胶质细胞。GFAP蛋白表达上调被认为是反应性星形胶质细胞的标志，在阿尔兹海默症、脑卒中、帕金森等多种神经***疾病中都可以检测到GFAP蛋白的表达上调。
体外诱导星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞能够适用于中枢神经病变机理，药物筛选和临床治疗等方面的实验研究，具有重要的意义。
CN111235110A公开了一种神经干细胞的体外培养方法，包括(1)从新生大鼠海马中分离神经干细胞；(2)将分离出的神经干细胞放置在培养基中培养扩增；(3)观察20ng/ml浓度下的bFGF、EGF对神经干细胞分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的影响。该方将神经干细胞诱导为星型胶质细胞的诱导率低，且需要使用生长因子。生长因子具有制备成本高，制备和保存过程复杂，产量少等弊端。
CN112912495A公开了一种星形胶质细胞的制造方法，包括：(1)胚状体解离成单一细胞并在含有碱性成纤细胞生长因子和表皮生长因子的无血清培养皿中悬浮培养，得到神经干细胞团块的工序；和(2)将神经干细胞团块解离成单一细胞并在无血清含有BDNF和GDNF的无血清培养基中进行贴壁培养，得到包含星形胶质细胞的细胞群。该方法需要在培养基中加入BDNF和GDNF，该方法造价较高，且BDNF和GDNF的制备和保存过程复杂。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的在于提供了一种诱导神经干细胞分化的组合物，该组合物成本低，且诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的诱导率高。
本发明的另一个目的在于提供一种层粘连蛋白在定向诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞中的用途。
本发明的再一个目的在于提供一种诱导神经干细胞分化的方法，该方法诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的诱导率高，且成本低。
本发明的又一个目的在于提供一种多聚-L-赖氨酸的用途，其可以定向诱导神经干细胞分化为反应性星形胶质细胞。
上述技术目的通过如下技术方案实现。
一方面，本发明提供一种诱导神经干细胞分化的组合物，包括诱导培养液和浓度为3～20μg/ml的层粘连蛋白溶液，所述诱导培养液中含有KnockOut血清代替物。
根据本发明的组合物，优选地，所述诱导培养液中KnockOut血清替代物的体积含量为3～25vol％。
根据本发明的组合物，优选地，所述诱导培养液包括KnockOut血清代替物和DMEM/F12液体培养基。
根据本发明的组合物，优选地，所述KnockOut血清代替物和DMEM/F12液体培养基的体积比为1：(6～9)，所述DMEM/F12液体培养基中DMEM培养基与F12培养基的体积比为1:1。
根据本发明的组合物，优选地，所述诱导培养液中还包含B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液。
另一方面，本发明提供了一种层粘连蛋白溶液在定向诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞中的用途，所述层粘连蛋白溶液的浓度为3～20μg/ml。
根据本发明的用途，优选地，定向诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的过程在KnockOut血清替代物存在的条件下进行。
再一方面，本发明提供一种采用上述组合物诱导神经干细胞分化的方法，包括如下步骤：
将待分化神经干细胞和含有KnockOut血清代替物的诱导培养液置于浓度为3～20μg/ml的层粘连蛋白包被的培养容器中培养。
又一方面，本发明还提供了一种多聚-L-赖氨酸在定向诱导神经干细胞分化为反应性星形胶质细胞中的用途。
根据本发明的用途，优选地，定向诱导神经干细胞分化为反应性星形胶质细胞的过程在KnockOut血清替代物存在的条件下进行。
本发明的组合物中包含KnockOut血清代替物和浓度为3～20μg/ml的层粘连蛋白溶液。采用这样的培养基和细胞外基质的组合能够提诱导高神经干细胞分化为星形胶质细胞的诱导率。本发明的组合物成本低，使用方便，且诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的诱导率高。本发明的发明人意外地发现，以多聚-L-赖氨酸作为细胞外基质，能够将神经干细胞定向诱导为反应性星形胶质细胞。
附图说明
图1为实施例1～2和比较例3所得的分化细胞GFAP蛋白表达量图。
图2为实施例1所得的分化细胞的免疫荧光图。
图3为比较例1所得的分化细胞的免疫荧光图。
图4为实施例2所得的分化细胞的免疫荧光图。
具体实施方式
在本发明中，％表示vol％，即体积百分比，除非特别声明。
<诱导神经干细胞分化的组合物>
本发明的诱导神经干细胞分化的组合物包括诱导培养液和层粘连蛋白溶液。在某些实施方式中还包括抗凝剂。本发明的组合物中不含有细胞因子。根据本发明的一个实施方式，本发明的组合物由诱导培养液、抗凝剂和层粘连蛋白溶液组成。
本发明的诱导培养液中含有KnockOut血清代替物。诱导培养液中KnockOut血清替代物的体积含量可以为3～25vol％；优选为5～20vol％；更优选为8～15vol％。根据本发明的一个实施方式，诱导培养液中KnockOut血清替代物的体积含量为10vol％。KnockOut血清代替物和层粘连蛋白溶液联合使用能够诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞，且具有较高的诱导率。这样无需使用细胞因子，降低了组合物的成本，且能够保持较高的诱导率。
本发明的诱导培养液中还可以含有DMEM/F12液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液中的一种或多种。根据本发明的一个实施方式，诱导培养液由KnockOut血清代替物、DMEM/F12液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液组成。
在本发明的诱导培养液中DMEM/F12液体培养基的体积含量可以为60～95vol％；优选为75～90vol％；更优选为85～90vol％。根据本发明的一个实施方式，诱导培养液中DMEM/F12液体培养基的体积含量为87vol％。DMEM/F12液体培养基中DMEM培养基与F12培养基的体积比可以为1:1。根据本发明的一个实施方式，DMEM/F12液体培养基为DMEM/F12(1:1)液体培养基(1×)。
在本发明中，KnockOut血清代替物和DMEM/F12液体培养基的体积比可以为1：(6～9)；优选为1：(7～9)；更优选为1：(8～9)。
本发明的诱导培养液中还可以含有B27细胞培养添加剂。B27细胞培养添加剂在诱导培养液中的浓度为工作浓度。例如采用B27细胞培养添加剂(50×)，则诱导培养液中B27细胞培养添加剂的体积含量为2vol％。
本发明的诱导液中还可以含有青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液。青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液在诱导培养液中的浓度为工作浓度。例如采用青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(100×)，则诱导培养液中青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液的体积含量为1vol％。
本发明的组合物中可以含有抗凝剂。以诱导培养液为基准，抗凝剂的用量为5～40μg/ml；优选为10～30μg/ml；更优选为15～25μg/ml。抗凝剂可以为肝素钠。
在本发明的组合物中，层粘连蛋白溶液的浓度为3～20μg/ml；优选为5～15μg/ml；更优选为8～12μg/ml。这样的层粘连蛋白溶液包被的培养皿更适宜将神经干细胞诱导分化为星形胶质细胞，提高诱导率。层粘连蛋白溶液的浓度超出上述范围，则导致诱导效果变劣。具体原因尚不清楚，可能的原因是只有合适浓度范围的层粘连蛋白溶液才能在包被的培养皿表面形成适合诱导的层粘连蛋白层。层粘连蛋白溶液的浓度太低，无法将培养皿完全包被；层粘连蛋白溶液的浓度太高，则导致培养皿包被的层粘连蛋白层过厚，反而不利于将神经干细胞诱导分化为星形胶质细胞。
根据本发明的一个实施方式，组合物包括诱导培养液、抗凝剂和层粘连蛋白溶液。诱导培养液包括87vol％DMEM/F12(1:1)液体培养基(1×)，2vol％B27细胞培养添加剂(50×)，1vol％青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(100×)和10vol％KnockOut血清替代物。以诱导培养液为基准抗凝剂的添加量为20μg/ml。层粘连蛋白溶液的浓度为9.6μg/ml。
<诱导神经干细胞分化的方法>
将待分化神经干细胞在含有KnockOut血清代替物的诱导培养液和浓度为3～20μg/ml的层粘连蛋白溶液存在的条件下培养。优选地，将待分化神经干细胞在诱导培养液、抗凝剂和浓度为3～20μg/ml的层粘连蛋白溶液存在的条件下培养。诱导培养液、层粘连蛋白溶液和抗凝剂的选择和用量如前文所述，在此不再赘述。
具体地，将待分化神经干细胞和诱导培养液置于层粘连蛋白包被的培养容器中培养。优选地，将待分化神经干细胞、诱导培养液和抗凝剂置于层粘连蛋白包被的培养容器中培养。任选地，还可以包括制备粘连蛋白包被的培养容器的步骤。“培养容器”指能够使神经干细胞在其中培养分化的实验器皿。例如：培养皿、培养板等。待分化神经干细胞、诱导培养液和任选地抗凝剂能够形成单细胞悬液，将单细胞悬液置于层粘连蛋白溶液包被的培养容器中培养使神经干细胞分化。
本发明的层粘连蛋白包被的培养容器可以采用如下方法制备得到：将浓度为3～20μg/ml的层粘连蛋白溶液包被于培养容器上，形成层粘连蛋白包被的培养容器。具体地，将层粘连蛋白溶液加入培养容器中，将具有层粘连蛋白的培养容器孵育，然后用PBS缓冲液冲洗，得到层粘连蛋白溶液包被的培养容器。层粘连蛋白溶液的浓度具体如前文所述。具有层粘连蛋白的培养容器在室温(20～38℃)下进行孵育。孵育时间为40～90min；优选为50～70min。可以用PBS缓冲液冲洗多次，例如，3次。层粘连蛋白溶液的加入量能够完全覆盖培养容器底即可。
以3×105个神经干细胞为基准，诱导培养液的用量为0.5～5ml；优选为1～4ml；更优选为1.5～3ml。
本发明的待分化神经干细胞可以来自于鼠、人或猴等哺乳动物。待分化神经干细胞可以由提取的神经干细胞采用表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)双因子筛选法筛选，在明胶包被的培养容器中培养3～7代得到。
根据本发明的一个实施方式，待分化神经干细胞通过如下步骤制备得到：
(1)分离神经干细胞的步骤；
(2)纯化并扩增神经干细胞的步骤。
分离神经干细胞的步骤可以包括如下步骤：将分离得到的分离神经干细胞和神经干细胞培养液置于明胶包被的培养容器中培养至单个分离单细胞成为一代神经干细胞克隆团。具体地，包括如下步骤：将分离得到的纹状体用胰蛋白(Trypsin)酶消化，用神经干细胞培养液终止消化后离心，废弃上清液，然后加入神经干细胞培养液，并吹打为单细胞悬液；将单细胞悬液种植于明胶包被的培养容器中，每1～3天去50％上清液，更换神经干细胞培养液，至单个分离单细胞成为一代神经干细胞克隆团。
胰蛋白(Trypsin)酶消化温度可以为34～40℃；优选为36～38℃。消化时间可以为5～12min；优选为8～10min。
单细胞悬液可以以150000～250000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。优选地，单细胞悬液以180000～220000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。更优选地，单细胞悬液以195000～205000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。
纯化并扩增神经干细胞的步骤可以包括如下步骤：将一代神经干细胞克隆团和神经干细胞培养液置于明胶包被的培养容器中培养至单个一代神经干细胞单细胞成为二代神经干细胞克隆团。具体地，包括如下步骤：将一代神经干细胞克隆团吹打并离心，弃上清液，加入神经干细胞培养液吹打为一代神经干细胞单细胞悬液。将一代神经干细胞悬液种植于明胶包被的培养容器中，每1～3天去50％上清液，更换神经干细胞培养液，至单个一代单细胞成为二代神经干细胞克隆团。再将上述步骤重复1～5次，这样相对应地能够得到三至七代神经干细胞克隆团。将三至七代任意一代神经干细胞克隆团吹打并离心，弃上清液，得到待分化神经干细胞。
一代单细胞悬液可以以150000～250000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。优选地，一代单细胞悬液以180000～220000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。更优选地，一代单细胞悬液以195000～205000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。
可以将神经干细胞单细胞悬液通过计数板计数，以确定单位体积神经干细胞单细胞悬液中神经干细胞的含量。
明胶包被培养容器可以通过如下方法制备得到：将明胶溶液加入培养容器中，孵育，PBS缓冲液冲洗，得到明胶包被培养容器。
孵育可以在35～39℃和5％CO2条件下进行。孵育时间可以为15～50min；优选为20～40min。
本发明的神经干细胞培养液中包含基础培养液、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在某些实施方式中，神经干细胞培养液由基础培养液、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)组成。
基础培养液中含有DMEM/F12液体培养基、N-2添加物和青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液。DMEM/F12中DMEM与F12的体积比为1:1。根据本发明的一个实施方式DMEM/F12液体培养基为DMEM/F12(1:1)液体培养基(1×)。N-2添加物在基础培养液中的浓度为工作浓度。例如，N-2添加物为N-2添加物(100×)，则其在基础培养液中的体积含量为1vol％。青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液在基础培养液中的浓度为工作浓度。例如，青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液为青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(100×)，则其在基础培养液中的体积含量为1vol％。根据本发明的一个实施方式，基础培养液由98vol％DMEM/F12(1:1)液体培养液(1×)、1vol％N-2添加物(100×)和1vol％青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(100×)组成。
以基础培养液为基础，表皮生长因子EGF的添加量为可以为5～35ng/ml；优选为10～30ng/ml；更优选为15～25ng/ml。根据本发明的一个实施方式，表皮生长因子EGF的添加量为20ng/ml。
以基础培养液为基础，碱性成纤维细胞生长因子bFGF的添加量为可以为5～35ng/ml；优选为10～30ng/ml；更优选为15～25ng/ml。根据本发明的一个实施方式，碱性成纤维细胞生长因子bFGF的添加量为20ng/ml。
<层粘连蛋白溶液的用途>
将待分化神经干细胞和含有KnockOut血清替代物的诱导培养液置于多层粘连蛋白包被培养容器中培养，能够将神经干细胞定向诱导分化为星形胶质细胞。因此，本发明提供了一种层粘连蛋白溶液在定向诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞中的用途。优选地，定向诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的过程在KnockOut血清替代物存在的条件下进行。更优选地，定向诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的过程在KnockOut血清替代物、DMEM/F12液体培养基、B27细胞培养添加剂、青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液和抗凝剂存在的条件下进行。层粘连蛋白溶液的浓度为3～20μg/ml；优选为5～15μg/ml；更优选为8～12μg/ml。星形胶质细胞可以为1型星形胶质细胞(纤维性星形胶质细胞)。各物质的选择及用量如前文所示，在此不再赘述。
本发明的层粘连蛋白溶液在定向诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞中的用途具体可以包括如下步骤：将待分化神经干细胞在诱导培养液、抗凝剂和浓度为3～20μg/ml的层黏连蛋白溶液存在的条件下培养。根据本发明的一个实施方式，将待分化神经干细胞、诱导培养液和抗凝剂置于层粘连蛋白包被的培养容器中培养。任选地，还可以包括制备粘连蛋白包被的培养容器的步骤。具体步骤和参数等如前文所述，在此不再赘述。
<多聚-L-赖氨酸的用途>
本发明的发明人意外地发现，以多聚-L-赖氨酸作为细胞外基质能够定向地将神经干细胞诱导分化为反应性星形胶质细胞。这对中枢神经***的病变机理，药物筛选和临床研究等具有重要的作用。因而，本发明提供了一种多聚-L-赖氨酸在定向诱导神经干细胞分化为反应性星形胶质细胞中的用途。优选地，定向诱导神经干细胞分化为反应性星形胶质细胞的过程在KnockOut血清替代物存在的条件下进行。更优选地，定向诱导诱导神经干细胞分化为反应性星形胶质细胞的过程在KnockOut血清替代物、DMEM/F12液体培养基、B27细胞培养添加剂、青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液和抗凝剂存在的条件下进行。在某些实施方式中，将待分化神经干细胞和含有KnockOut血清代替物的诱导培养液置于浓度为0.001～0.05wt％的多聚-L-赖氨酸溶液包被的培养容器中培养。反应性星形胶质细胞是在应对中枢神经***损伤、疾病或感染时形体、分子和功能等方面发生改变的星形胶质细胞。GFAP蛋白表达上调被认为是反应性星形胶质细胞的标志。
多聚-L-赖氨酸可以以溶液的形式使用。多聚-L-赖氨酸溶液的浓度可以为0.001～0.05wt％；优选为0.005～0.03wt％；更优选为0.008～0.015wt％。根据本发明的一个实施方式，多聚-L-赖氨酸溶液的浓度为0.01wt％。
具体地，包括如下步骤：将多聚-L-赖氨酸溶液加入培养容器中，然后孵育，PBS缓冲液冲洗，得到多聚-L-赖氨酸包被培养容器；将待分化神经干细胞和含有KnockOut血清替代物的诱导培养液置于多聚-L-赖氨酸包被培养容器中培养，得到反应性星形胶质细胞。优选地，包括如下步骤：将多聚-L-赖氨酸溶液加入培养容器中，然后孵育，PBS缓冲液冲洗，得到多聚-L-赖氨酸包被培养容器；将待分化神经干细胞、含有KnockOut血清替代物的诱导培养液和抗凝剂置于多聚-L-赖氨酸包被培养容器中培养，得到反应性星形胶质细胞。“培养容器”指能够使神经干细胞在其中培养分化的实验器皿。例如：培养皿、培养板等。
多聚-L-赖氨酸溶液的浓度如前文所述。孵育温度可以为20～35℃。孵育时间可以为2～30min；优选为3～10min。
诱导培养液中KnockOut血清替代物的体积含量可以为3～25vol％；优选为5～20vol％；更优选为8～15vol％。根据本发明的一个实施方式，诱导培养液中KnockOut血清替代物的体积含量为10vol％。KnockOut血清代替物和多聚-L-赖氨酸联合使用能够诱导神经干细胞分化为反应性星形胶质细胞。
本发明的诱导培养液中还可以含有DMEM/F12液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液中的一种或多种。根据本发明的一个实施方式，诱导培养液由KnockOut血清代替物、DMEM/F12液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液组成。
在本发明的诱导培养液中DMEM/F12液体培养基的体积含量可以为60～95vol％；优选为75～90vol％；更优选为85～90vol％。根据本发明的一个实施方式，诱导培养液中DMEM/F12液体培养基的体积含量为87vol％。DMEM/F12液体培养基中DMEM培养基与F12培养基的体积比可以为1:1。根据本发明的一个实施方式，DMEM/F12液体培养基为DMEM/F12(1:1)液体培养基(1×)。
在本发明中，KnockOut血清代替物和DMEM/F12液体培养基的体积比可以为1：(6～9)；优选为1：(7～9)；更优选为1：(8～9)。
本发明的诱导培养液中还可以含有B27细胞培养添加剂。B27细胞培养添加剂在诱导培养液中的浓度为工作浓度。例如采用B27细胞培养添加剂(50×)，则诱导培养液中B27细胞培养添加剂的体积含量为2vol％。
本发明的诱导培养液中还可以含有青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液。青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液在诱导培养液中的浓度为工作浓度。例如采用青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(100×)，则诱导培养液中青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液的体积含量为1vol％。
诱导培养液为基准，抗凝剂的用量为5～40μg/ml；优选为10～30μg/ml；更优选为15～25μg/ml。抗凝剂可以为肝素钠。
以3×105个神经干细胞为基准，诱导培养液的用量为0.5～5ml；优选为1～4ml；更优选为1.5～3ml。
本发明的待分化神经干细胞可以来自于鼠、人或猴等哺乳动物。待分化神经干细胞可以由提取的神经干细胞采用表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)双因子筛选法筛选，在明胶包被的培养容器中培养3～7代得到。
根据本发明的一个实施方式，待分化神经干细胞通过如下步骤制备得到：
(1)分离神经干细胞的步骤；
(2)纯化并扩增神经干细胞的步骤。
分离神经干细胞的步骤可以包括如下步骤：将分离得到的分离神经干细胞和神经干细胞培养液置于明胶包被的培养容器中培养至单个分离单细胞成为一代神经干细胞克隆团。具体地，包括如下步骤：将分离得到的纹状体用胰蛋白(Trypsin)酶消化，用神经干细胞培养液终止消化后离心，废弃上清液，然后加入神经干细胞培养液，并吹打为单细胞悬液；将单细胞悬液种植于明胶包被的培养容器中，每1～3天去50％上清液，更换神经干细胞培养液，至单个分离单细胞成为一代神经干细胞克隆团。
胰蛋白(Trypsin)酶消化温度可以为34～40℃；优选为36～38℃。消化时间可以为5～12min；优选为8～10min。
单细胞悬液可以以150000～250000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。优选地，单细胞悬液以180000～220000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。更优选地，单细胞悬液以195000～205000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。
纯化并扩增神经干细胞的步骤可以包括如下步骤：将一代神经干细胞克隆团和神经干细胞培养液置于明胶包被的培养容器中培养至单个一代神经干细胞单细胞成为二代神经干细胞克隆团。具体地，包括如下步骤：将一代神经干细胞克隆团吹打并离心，弃上清液，加入神经干细胞培养液吹打为一代神经干细胞单细胞悬液。将一代神经干细胞悬液种植于明胶包被的培养容器中，每1～3天去50％上清液，更换神经干细胞培养液，至单个一代单细胞成为二代神经干细胞克隆团。再将上述步骤重复1～5次，这样相对应地能够得到三至七代神经干细胞克隆团。将三至七代任意一代神经干细胞克隆团吹打并离心，弃上清液，得到待分化神经干细胞。
一代单细胞悬液可以以150000～250000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。优选地，一代单细胞悬液以180000～220000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。更优选地，一代单细胞悬液以195000～205000细胞/ml的浓度种植于明胶包被的培养容器。
可以将神经干细胞单细胞悬液通过计数板计数，以确定单位体积神经干细胞单细胞悬液中神经干细胞的含量。
明胶包被培养容器可以通过如下方法制备得到：将明胶溶液加入培养容器中，孵育，PBS缓冲液冲洗，得到明胶包被培养容器。
孵育可以在35～39℃和5％CO2条件下进行。孵育时间可以为15～50min；优选为20～40min。
本发明的神经干细胞培养液中包含基础培养液、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在某些实施方式中，神经干细胞培养液由基础培养液、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)组成。
基础培养液中含有DMEM/F12液体培养基、N-2添加物和青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液。DMEM/F12中DMEM与F12的体积比为1:1。根据本发明的一个实施方式DMEM/F12液体培养基为DMEM/F12(1:1)液体培养基(1×)。N-2添加物在基础培养液中的浓度为工作浓度。例如，N-2添加物为N-2添加物(100×)，则其在基础培养液中的体积含量为1vol％。青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液在基础培养液中的浓度为工作浓度。例如，青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液为青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(100×)，则其在基础培养液中的体积含量为1vol％。根据本发明的一个实施方式，基础培养液由98vol％DMEM/F12(1:1)液体培养液(1×)、1vol％N-2添加物(100×)和1vol％青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(100×)组成。
以基础培养液为基础，表皮生长因子EGF的添加量为可以为5～35ng/ml；优选为10～30ng/ml；更优选为15～25ng/ml。根据本发明的一个实施方式，表皮生长因子EGF的添加量为20ng/ml。
以基础培养液为基础，碱性成纤维细胞生长因子bFGF的添加量为可以为5～35ng/ml；优选为10～30ng/ml；更优选为15～25ng/ml。根据本发明的一个实施方式，碱性成纤维细胞生长因子bFGF的添加量为20ng/ml。
下面介绍实验材料：
ICR小鼠购买自内蒙古大学实验动物研究中心；
胰蛋白(Trypsin)酶购买自日本宝生物工程株式会社(TAKARA,Japan)；
DMEM/F12(1:1)液体培养基(1×)，其品牌为Gibco，购买自赛默飞世尔科技有限公司；
N-2添加物(100×)，其品牌为Gibco，购买自赛默飞世尔科技有限公司；
青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(100×)，其品牌为Gibco，购买自赛默飞世尔科技有限公司；
表皮生长因子(EGF)购买自派普泰克公司(Pepro Tech Inc.)；
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购买自派普泰克公司(Pepro Tech Inc.)；
明胶溶液，其品牌为Sigma-Aldrich，购买自默克集团；
层粘连蛋白溶液购买自康宁(Corning)公司；
KnockOut血清替代物，其品牌为Gibco，购买自赛默飞世尔科技有限公司；
胎牛血清，其品牌为Gibco，购买自赛默飞世尔科技有限公司；
B27细胞培养添加剂(50×)，其品牌为Gibco，购买自赛默飞世尔科技有限公司；
神经干细胞培养液由基础培养液、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)组成。基础培养液由98vol％DMEM/F12(1:1)液体培养基(1×)，1vol％N-2添加物(100×)，1vol％青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(100×)组成。以基础培养液为基础，表皮生长因子EGF的添加量为20ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子bFGF的添加量为20ng/ml。
制备例1中的明胶包被培养皿的制备方法如下：取1wt％明胶溶液2ml于培养皿(直径为60mm)中，在5％CO2和37℃的条件下培养箱孵育30min，然后用PBS缓冲液清洗3遍，得到明胶包被培养皿。
制备例1
分离神经干细胞的步骤
A.用颈椎脱臼处死法将怀孕14.5天的ICR小白鼠处死，解剖腹部，取出子宫及胎鼠。
B.用冰PBS缓冲液清洗2～3次子宫及胎鼠后，将胎鼠与其他组织分离。
C.体式显微镜之下用镊子分离胎鼠头部，冰PBS缓冲液清洗后剖出胎鼠大脑。
D.从胎鼠大脑中分离纹状体，将纹状体在冰PBS缓冲液中剪碎，然后用胰蛋白(Trypsin)酶在37℃水浴锅中消化8～10min，得到分离神经干细胞。
F.向分离神经干细胞中加入神经干细胞培养液终止消化，然后在4℃下在离心机(转速为1000rpm)中离心5min；离心后弃上清液，加入神经干细胞培养液吹打分离为单细胞悬液。
G.将单细胞悬液以200000细胞/ml的浓度种植于明胶包被培养皿中培养，每两天换去50％上清液，更换神经干细胞培养液，至单个分离单细胞成为一代神经干细胞克隆团。
纯化并扩增神经干细胞的步骤
a.将一代神经干细胞克隆团收集于离心管中，吹打20次，然后在4℃和1000rpm的条件下离心5min，得到一代神经干细胞悬液。
b.将一代神经干细胞悬液拿出离心机，弃上清液，加入1ml神经干细胞培养液吹打为一代神经干细胞单细胞悬液。
c.将一代神经干细胞单细胞悬液以200000细胞/mL的浓度种植于明胶包被培养皿中，每两天去50％上清液，更换神经干细胞培养液，至单个一代神经干细胞单细胞成为二代神经干细胞克隆团。
d.重复步骤(a)～(c)直至得到第三代至第七代神经干细胞克隆团。
e.将第三代至第七代神经干细胞克隆团在25℃和1000rpm的条件下离心5分钟，弃上清液，得到待分化神经干细胞。
制备例2
将1ml浓度为9.6μg/ml的层粘连蛋白溶液加入到直径为35mm的培养皿中；将具有层粘连蛋白溶液的培养皿在25℃下孵育60min，然后用PBS缓冲液洗涤3次，得到层粘连蛋白包被的培养皿。
制备例3
将1ml浓度为1wt％的明胶溶液加入到直径为35mm的培养皿中；将具有明胶溶液的培养皿在37℃下孵育30min，然后用PBS缓冲液洗涤3次，得到明胶包被的培养皿。
制备例4
将1ml浓度为0.01wt％的多聚-L-赖氨酸溶液加入到直径为35mm的培养皿中；将具有多聚-L-赖氨酸溶液的培养皿在25℃下孵育5min，然后用PBS缓冲液洗涤3次，得到多聚-L-赖氨酸溶液包被的培养皿。
实施例1～2和比较例1～4
将制备例1得到的待分化神经干细胞、诱导培养液和肝素钠形成待分化神经干细胞悬液。诱导培养液由10vol％血清或其替代物、87vol％DMEM/F12(1:1)液体培养基(1×)、2vol％B27细胞培养添加剂(50×)和1vol％青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(100×)组成。以诱导培养液为基准，肝素钠的用量为20μg/ml；每3×105个待分化神经干细胞悬于2ml诱导培养液中。将2ml待分化神经干细胞悬液接种于培养皿中，每两天去上清液，更换诱导培养液和肝素钠，培养13天，得到分化细胞。血清或其替代物和培养皿的选择具体如表1所示。
表1
Figure BDA0003377202030000191
实验例1
分别收集培养至第11天的实施例1～2和比较例1～4所得的分化细胞，得到6组细胞。将每组细胞分别装到两个离心管中，其中一个离心管内加入ACAS-2蛋白的荧光抗体，另一个离心管内不加入任何抗体作为空白对照。采用流式细胞分析术分析6组细胞中星形胶质细胞的含量，所得结果如表2所示。
表2
序号 星形胶质细胞诱导率(％)
实施例1 94.2
实施例2 86.8
比较例1 30.4
比较例2 36.2
比较例3 29.9
比较例4 52.2
由表2可知，本发明的组合物能够有效地将神经干细胞诱导为星形胶质细胞，具有较高的诱导率，星形胶质细胞的含量达到了94.2％。比较例1将KnockOut血清代替物替换为胎牛血清，其诱导率显著降低。比较例3与本发明的区别仅在于将包被培养皿的细胞外基质改变为明胶，其诱导率也显著低于本发明。比较例2采用胎牛血清和明胶包被培养皿的组合，其诱导率也显著低于本发明。实施例2将包被培养皿的细胞外基质替换为多聚-L-赖氨酸，其诱导率降低了7.4％。比较例4的包被培养皿的细胞外基质为多聚-L-赖氨酸，并采用胎牛血清作为诱导液，其诱导率显著低于本发明。这表明本发明的组合物之间具有协同作用，这样的组合物并非为常规选择。
实验例2
分别收集实施例1、实施例2和比较例3的分化细胞，得到3组细胞。将每组细胞裂解后通过蛋白质免疫印迹法标记GFAP蛋白和beta-actin蛋白，并分析3组细胞的GFAP蛋白相对表达量。
由图2可知，实施例2的GFAP蛋白的相对表达量高于实施例1；由表2可知，实施例2的诱导率低于实施例1。因此，可以推断实施例2诱导得到的星形胶质细胞在单个细胞中GFAP蛋白的表达量显著增加，实施例2诱导得到的星形胶质细胞为反应性星形胶质细胞，实施例1诱导得到的为非反应性星形胶质细胞。
实验例3
分别收集实施例1、实施例2和比较例1的分化细胞，得到3组细胞。将每组细胞裂解后通过免疫荧光染色法染色，利用荧光显微镜判定结果。
由图2～4可知，实施例1的免疫荧光染色结果显示其诱导得到的星形胶质细胞足突细而长，表明诱导得到了1型星形胶质细胞(纤维性星形胶质细胞)。比较例1的免疫荧光染色结果显示其诱导得到的星形胶质细胞足突宽而短，表明诱导得到了2型星形胶质细胞(原浆性星形胶质细胞)。实施例2的免疫荧光染色结果显示其诱导得到的星形胶质细胞具有反应性星形胶质细胞特有的胶质瘢痕结构，表明诱导得到了反应性星形胶质细胞。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种诱导神经干细胞分化的组合物，其特征在于，包括诱导培养液和浓度为3～20μg/ml的层粘连蛋白溶液，所述诱导培养液中含有KnockOut血清代替物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述诱导培养液中KnockOut血清替代物的体积含量为3～25vol％。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述诱导培养液包括KnockOut血清代替物和DMEM/F12液体培养基。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述KnockOut血清代替物和DMEM/F12液体培养基的体积比为1：(6～9)，所述DMEM/F12液体培养基中DMEM培养基与F12培养基的体积比为1:1。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述诱导培养液中还包含B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液。
6.一种层粘连蛋白溶液在定向诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞中的用途，其特征在于，所述层粘连蛋白溶液的浓度为3～20μg/ml。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，定向诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞的过程在KnockOut血清替代物存在的条件下进行。
8.一种利用权利要求1～5任意一项所述的组合物诱导神经干细胞分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待分化神经干细胞和含有KnockOut血清代替物的诱导培养液置于浓度为3～20μg/ml的层粘连蛋白包被的培养容器中培养。
9.一种多聚-L-赖氨酸在定向诱导神经干细胞分化为反应性星形胶质细胞中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，定向诱导神经干细胞分化为反应性星形胶质细胞的过程在KnockOut血清替代物存在的条件下进行。
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