CN114107111A - 一种丁酸梭菌的发酵方法及其微生态制剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丁酸梭菌的发酵方法及其微生态制剂和应用，属于微生物发酵领域，具体为：先对丁酸梭菌进行培养形成优势菌群，再通过补料加入酿酒酵母菌种子液，待发酵至丁酸梭菌开始形成芽孢时通过升温来抑制或杀死酿酒酵母菌以促进丁酸梭菌形成芽孢，之后通过喷雾干燥制得固体粉状菌剂。其中，喷雾干燥过程中的高温可以灭活发酵菌液中残留的酿酒酵母菌。本发明中通过酿酒酵母菌与丁酸梭菌协同发酵，利用酿酒酵母菌的有氧呼吸来消耗培养基中氧气，降低培养基的氧化还原电位，能有效促进丁酸梭菌生长，同时，酿酒酵母菌发酵时产生的胞外酶也能促进丁酸梭菌对原料的利用效率。其可制成耐受性菌剂并应用于饲料中，提高动物消化吸收能力与免疫能力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体而言，涉及一种丁酸梭菌的发酵方法及其微生态制剂和应用。
背景技术
丁酸梭菌又称丁酸梭状芽孢杆菌，是一种专性厌氧的革兰氏阳性菌，细菌呈可产生芽孢，即将产生芽孢时，菌体中间膨大成梭状，且由于其主要代谢产物为丁酸，故名丁酸梭菌。由于其为厌氧芽孢杆菌，对于胃酸、胆汁酸、多种饲用抗生素有较强的耐受性，适用面广。
丁酸梭菌作为专性厌氧菌，对于培养基中的溶氧特别敏感，溶氧及氧化还原电位的高低会极大的影响丁酸梭菌的生长繁殖，目前生产丁酸梭菌的厂家多是使用复杂的设备及工艺条件来达到厌氧环境，导致目前国内丁酸梭菌产品产量低下，价格高昂，难以普及。如何采用较为简单的方法快速发酵得到丁酸梭菌是本领域一直追求的。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种丁酸梭菌的发酵方法及其微生态制剂和应用。
本发明是这样实现的:
本发明提供一种丁酸梭菌的发酵方法，其包括：将丁酸梭菌发酵培养至对数期时向培养基中加入酵母菌，发酵至丁酸梭菌开始形成芽孢时升温抑制或杀死酵母以促进丁酸梭菌形成芽孢，当丁酸梭菌的芽孢率≥96％时，完成发酵，得到丁酸梭菌菌液。
本发明还提供一种包含丁酸梭菌菌液或丁酸梭菌菌粉的微生态制剂。
本发明还提供一种上述丁酸梭菌微生物菌剂在制备益生菌菌剂、饲料和饲料添加剂方面的应用。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种丁酸梭菌的发酵方法及其微生态制剂和应用。所提供的丁酸梭菌的发酵方法为：先对丁酸梭菌进行培养形成优势菌群，再通过补料加入酿酒酵母菌种子液，待发酵至丁酸梭菌开始形成芽孢时通过逐步升温来抑制或杀死酵母菌以促进丁酸梭菌形成芽孢，当丁酸梭菌的芽孢率≥96％时，完成发酵，得到丁酸梭菌菌液。本发明提供的丁酸梭菌的发酵方法：通过酿酒酵母菌与丁酸梭菌协同发酵，利用酿酒酵母菌的有氧呼吸来消耗培养基中氧气，降低培养基的氧化还原电位，能有效促进丁酸梭菌生长，同时，酿酒酵母菌发酵时产生的胞外酶也能促进丁酸梭菌对原料的利用效率，且发酵工艺简单，对设备要求低，易于推广，解决丁酸梭菌发酵工艺复杂、产量低等问题。将丁酸梭菌菌液或丁酸梭菌菌粉作为微生物菌剂添加到畜禽饲料后，饲喂动物，可有效改善养殖动物健康状况，提高动物消化吸收能力与免疫能力，并减少抗生素的使用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的目的在于提供丁酸梭菌的发酵方法，克服目前丁酸梭菌发酵需要昂贵复杂的厌氧设备的缺陷，巧妙利用酿酒酵母菌，将两者协同发酵，利用酿酒酵母菌的有氧呼吸来消耗培养基中氧气，降低培养基的氧化还原电位，能有效促进丁酸梭菌生长，同时，酿酒酵母菌发酵时产生的胞外酶也能促进丁酸梭菌对原料的利用效率。
为实现上述的目的，本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种丁酸梭菌的发酵方法，包括以下步骤：
1、制备种子液
将保存于斜面的丁酸梭菌、酿酒酵母菌菌株接种到摇瓶培养基中，培养24-30小时，作为种子液。
其中，丁酸梭菌的摇瓶培养条件为36-38℃，静置培养，培养基为RCM液体培养基；
其中，酿酒酵母菌的摇瓶培养条件为36-38℃，200r/min转速，培养基为YPD肉汤；
2、丁酸梭菌扩培
将步骤一得到的丁酸梭菌种子液接种于发酵罐中，接种体积比为0.8-1％，进行菌体扩培，培养4-6小时，得到丁酸梭菌发酵液。
其中，发酵罐中培养基组成为：葡萄糖8-10g/L，酵母粉6-8g/L，蛋白胨12-16g/L，麸皮10-12g/L，豆粕8-10g/L，乙酸钠2-3g/L，碳酸钙5-6g/L，亚硫酸钠1.8-2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.4-0.5g/L，海藻酸钠4-5g/L。
其中，发酵过程中工艺参数为：通过10％氢氧化钠溶液调控ph不低于6.5，温度控制为36-38℃，转速40-50rpm，不通气。
本发明实施例提供的丁酸梭菌的发酵方法，在丁酸梭菌扩培过程中，对培养丁酸梭菌的培养基进行改良：
其中，碳酸钙、麸皮作为固形物，可以作为丁酸梭菌的附着物，促进生长及形成芽孢，同时碳酸钙是丁酸梭菌芽孢结构中重要组成部分吡啶二羧酸钙盐合成时的重要原料；
其中，亚硫酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐作为还原剂，可以降低培养基的氧化还原电位，促进作为专性厌氧菌的丁酸梭菌生长；
其中，海藻酸钠是一种天然增稠剂，通过增加培养基的粘稠度，可以一定程度上降低底层溶氧，促进丁酸梭菌在培养基底层生长。
3、加入酿酒酵母种子液
将步骤一中得到的酿酒酵母种子液接种于步骤二中的丁酸梭菌发酵液中，接种时间为丁酸梭菌扩培4-5小时后，接种体积比为0.8-1％，接种之后继续发酵12-14小时。
其中，发酵过程中工艺参数同步骤二。
丁酸梭菌为专性厌氧菌，对培养基中的溶氧特别敏感，而常规的发酵设备无法通过注入氮气等方法来降低溶氧，导致丁酸梭菌发酵效果差。本发明实施例提供的丁酸梭菌的发酵方法，为了能实现采用较为简单的方法快速发酵得到丁酸梭菌，克服了传统使用复杂的厌氧设备来进行发酵的缺陷，巧妙利用酿酒酵母菌，将酿酒酵母菌与丁酸梭菌协同发酵，利用酿酒酵母菌的有氧呼吸来消耗培养基中氧气，降低培养基的氧化还原电位，能有效促进丁酸梭菌生长，同时，酿酒酵母菌发酵时产生的胞外酶也能促进丁酸梭菌对原料的利用效率。作为兼性厌氧菌，酿酒酵母菌也能在低溶氧的情况下生长活动，不至于由于溶氧过低死亡而失去效果。但是加入酿酒酵母菌的时机是关键，加入酿酒酵母菌种子液的时间为丁酸梭菌扩培4-5小时后，此时丁酸梭菌已经形成优势菌群，防止出现酿酒酵母菌大量扩培导致过分影响丁酸梭菌生产的情况。
4、培养基升温
温度每半小时提高5℃，待培养基温度提升至51-53℃后，继续发酵6-8小时，镜检发酵液，当芽孢率达96-98％时，完成发酵，得丁酸梭菌菌液。
丁酸梭菌作为芽孢杆菌，形成芽孢后有较强的抗逆性，本发明在丁酸梭菌即将产孢时通过逐段升温的方式逐步调节温度至51-53℃，一方面通过逐步恶化环境促使丁酸梭菌产孢；另一方面由于丁酸梭菌形成芽孢时代谢停滞，拮抗能力降低，升温能抑制甚至杀死酿酒酵母，防止由于丁酸梭菌产孢时拮抗能力的降低导致酿酒酵母大量扩培，进而影响丁酸梭菌形成芽孢。
其中，升温采用逐步升温的方式，是因为丁酸梭菌在尚未形成芽孢时抗逆性不强，防止由于升温过快导致丁酸梭菌在还未形成芽孢前就死亡。
5、喷雾干燥
将发酵完成的丁酸梭菌菌液与轻质碳酸钙按20:1的质量比混合，待菌液与保护剂完全混合完毕后，进入喷雾塔进行喷雾，其中，进风温度设置为170℃-180℃，通过调节进料频率控制出风温度为80℃-85℃。
喷雾干燥时进风温度和出风温度分别设置为170℃-175℃和80℃-85℃，且喷雾时只添加轻质碳酸钙作为载体，主要是为了杀死发酵液中残留的酵母菌，保证菌粉的纯度，同时，形成芽孢后的丁酸梭菌抗逆性强，并不会在喷雾干燥中死亡。
第二方面，本发明实施例还提供一种包含丁酸梭菌菌液或丁酸梭菌菌粉的微生态制剂。
第三方面，本发明实施例还提供一种上述丁酸梭菌微生物菌剂在制备益生菌菌剂、饲料和饲料添加剂方面的应用。
优选地，在仔猪日粮中，以活菌数不低于1.0×108cfu/g的发酵物计，添加量为10-15kg/t。
优选地，微生态制剂用于断奶仔猪提高生产性能、降低腹泻率和降低料肉比。
优选地，微生态制剂用于仔猪提高日增重和日采食量。
优选地，微生态制剂用于仔猪提高仔猪成活率降低腹泻率。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本发明以下实施例中，原材料来源、组分、制备和实验方法与对比例相同。
1、制备种子液
将保存于斜面的丁酸梭菌、酿酒酵母菌菌株接种到摇瓶培养基中，培养24-30小时，作为种子液。
其中，丁酸梭菌的摇瓶培养条件为36-38℃，静置培养，培养基为RCM液体培养基；
其中，酿酒酵母菌的摇瓶培养条件为36-38℃，200r/min转速，培养基为YPD肉汤。
2、丁酸梭菌扩培
将步骤一得到的丁酸梭菌种子液接种于发酵罐中，接种体积比为0.8-1％，进行菌体扩培，培养4-6小时，得到丁酸梭菌发酵液。
其中，发酵罐中培养基组成为：葡萄糖8-10g/L，酵母粉6-8g/L，蛋白胨12-16g/L，麸皮10-12g/L，豆粕8-10g/L，乙酸钠2-3g/L，碳酸钙5-6g/L，亚硫酸钠1.8-2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.4-0.5g/L，海藻酸钠4-5g/L。
其中，发酵过程中工艺参数为：通过10％氢氧化钠溶液调控ph不低于6.5，温度控制为36-38℃，转速40-50rpm，不通气。
3、加入酿酒酵母种子液
将步骤一中得到的酿酒酵母种子液接种于步骤二中的丁酸梭菌发酵液中，接种体积比为0.8-1％，继续发酵12-14小时。
其中，发酵过程中工艺参数同步骤二。
4、培养基升温
温度每半小时提高5℃，待培养基温度提升至51-53℃后，继续发酵6-8小时，镜检发酵液，当芽孢率达96-98％时，完成发酵，得丁酸梭菌菌液。
5、喷雾干燥
将发酵完成的丁酸梭菌菌液与轻质碳酸钙按20:1的质量比混合，待菌液与保护剂完全混合完毕后，进入喷雾塔进行喷雾，其中，进风温度设置为170℃-180℃，通过调节进料频率控制出风温度为80℃-85℃。
实施例1
1、制备种子液
将保存于斜面的丁酸梭菌、酿酒酵母菌菌株接种到摇瓶培养基中，培养24-30小时，作为种子液。
其中，丁酸梭菌的摇瓶培养条件为36-38℃，静置培养，培养基为RCM液体培养基；
其中，酿酒酵母菌的摇瓶培养条件为36-38℃，200r/min转速，培养基为YPD肉汤。
2、丁酸梭菌扩培
将步骤一得到的丁酸梭菌种子液接种于发酵罐中，接种体积比为0.8-1％，进行菌体扩培，发酵4小时，得到丁酸梭菌发酵液。
其中，发酵罐中培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉6g/L，蛋白胨12g/L，麸皮12g/L，豆粕10g/L，乙酸钠2g/L，碳酸钙5g/L，亚硫酸钠2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，海藻酸钠5g/L。
其中，发酵过程中工艺参数为：通过10％氢氧化钠溶液调控ph不低于6.5，温度控制为36-38℃，转速40-50rpm，不通气。
3、加入酿酒酵母种子液
将步骤一中得到的酿酒酵母种子液接种于步骤二中的丁酸梭菌发酵液中，接种体积比为1％，继续发酵12小时。
其中，发酵过程中工艺参数同步骤二。
4、培养基升温
温度每半小时提高5℃，待培养基温度提升至51-53℃后，继续发酵6-8小时，镜检发酵液，当芽孢率达96-98％时，完成发酵，得丁酸梭菌菌液。
5、喷雾干燥
将发酵完成的丁酸梭菌菌液与轻质碳酸钙按20:1的质量比混合，待菌液与保护剂完全混合完毕后，进入喷雾塔进行喷雾，其中，进风温度设置为170℃-180℃，通过调节进料频率控制出风温度为80℃-85℃。
实施例2
本实施例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤二中，发酵罐中培养基组成为：葡萄糖8g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨16g/L，麸皮10g/L，豆粕8g/L，乙酸钠3g/L，碳酸钙6g/L，亚硫酸钠1.8g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.4g/L，海藻酸钠4g/L。
实施例3
本实施例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤二中发酵时间为6小时。
实施例4
本实施例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤三中酿酒酿母菌种子液接种体积比为0.8％。
实施例5
本实施例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤三中继续发酵14小时。
对比例1
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤二中，发酵罐中培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉6g/L，蛋白胨12g/L，豆粕10g/L，乙酸钠2g/L，亚硫酸钠2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，海藻酸钠5g/L。
对比例2
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤二中，发酵罐中培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉6g/L，蛋白胨12g/L，麸皮12g/L，豆粕10g/L，乙酸钠2g/L，碳酸钙5g/L，海藻酸钠5g/L。
对比例3
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤二中，发酵罐中培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉6g/L，蛋白胨12g/L，麸皮12g/L，豆粕10g/L，乙酸钠2g/L，碳酸钙5g/L，亚硫酸钠2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
对比例4
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于步骤三为：
不接种酿酒酵母种子液，继续发酵12小时。
其中，发酵过程中工艺参数同步骤二。
对比例5
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于步骤三为：
将步骤一中得到的酿酒酵母种子液接种于步骤二中的丁酸梭菌发酵液中，接种体积比为0.4％，继续发酵12小时。
其中，发酵过程中工艺参数同步骤二。
对比例6
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于步骤三为：
将步骤一中得到的酿酒酵母种子液接种于步骤二中的丁酸梭菌发酵液中，接种体积比为2％，继续发酵12小时。
其中，发酵过程中工艺参数同步骤二。
对比例7
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤二中发酵时间为2小时。
对比例8
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤二中发酵时间为8小时。
对比例9
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于步骤四为：
不对培养基升温，继续发酵6-8小时，镜检发酵液，当芽孢率达96-98％时，完成发酵，得丁酸梭菌菌液。
对比例10
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤三中继续发酵10小时。
对比例11
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤三中继续发酵16小时。
对比例12
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤四中温度每半小时提高10℃。
对比例13
本对比例与实施例1的其他步骤参数相同，区别仅在于：
步骤五中进风温度设置为180℃-185℃，出风温度设置为97℃-92℃。
实验例1
取喷雾结束后的菌粉，通过平板稀释涂布计数法检测菌粉中丁酸梭菌活菌量，结果如表1所示。
表1各例喷雾干燥后活菌量
由表1结果可知，如实施例2-5的配方及工艺变动幅度，对于发酵结果变化不大。
由表1对比例1-3结果可以看出，发酵培养基中未添加碳酸钙、麸皮、亚硫酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐、海藻酸钠等物质时，会降低菌粉的菌量。
由对比例4-5结果可以看出，未在丁酸梭菌发酵初期加入酿酒酵母菌种子液，或加入酿酒酵母菌种子液量过少，会极大幅度降低菌粉的菌量。
由对比例6-7结果可以看出，加入酿酒酵母菌种子液量过多，或者加入酿酒酵母菌种子液的时间提前，均会导致菌粉菌量下降，原因是丁酸梭菌相比酿酒酵母菌未能形成优势菌群，导致酿酒酵母菌大量扩培，消耗了较多营养。
由对比例8结果可以看出，推迟加入酿酒酵母菌种子液的时间，也会导致菌粉菌量的降低。
由对比例9-10结果可以看出发酵后期未升温，或推迟升温开始的时间，也会导致菌粉菌量有较大的降低，原因是酵母菌在丁酸梭菌形成芽孢的过程中大量扩培，影响到丁酸梭菌形成芽孢的过程，进而导致菌粉菌量低。
由对比例11结果可以看出，升温时间提前，菌粉菌量也会有一定的降低，原因是丁酸梭菌还未利用完培养基中的养分，就因为升温提前进入了形成芽孢的进程。
由对比例12结果可以看出，培养基升温时升温速度过快，会导致菌粉菌量降低，原因是部分丁酸梭菌形成芽孢进度落后于升温的速度，在高温的状态下活力降低，进而导致不能形成芽孢。
由对比例13结果可以看出，喷雾干燥的进出风温度过高，会导致丁酸梭菌菌粉菌量下降，原因为部分丁酸梭菌芽孢形成不完全或芽孢耐热性较差，导致在过高的温度下死亡，另外，喷雾干燥进出风温度过低会导致酿酒酵母菌存活率较高，导致菌粉中杂菌率高。
综上所述，本发明通过改良发酵培养基及培养工艺，大大提升了在普通发酵设备上发酵丁酸梭菌的效果，促进了生产活动。
丁酸梭菌菌剂制备
常规发酵组
选取经发酵罐扩培的丁酸梭菌菌液，将扩培后的菌液与轻质碳酸钙按20:1的质量比混合，待菌液与碳酸钙完全混合完毕后，进入喷雾塔进行喷雾，喷雾制得的丁酸梭菌菌粉用沸石粉、碎豆粕混合物稀释至菌量为1.0×108CFU/g，混合均匀后分装密封，得到常规发酵组丁酸梭菌菌剂。
其中，发酵培养基为RCM培养基。
其中，发酵工艺参数为：种子液接种量为0.3％，温度控制为36-38℃，转速50rpm，不通气，发酵过程中通过10％氢氧化钠溶液调控培养基pH不低于6.5，培养时间24-28小时。
其中，喷雾过程中，进风温度设置为170℃-180℃，通过调节进料频率控制出风温度为80℃-85℃。
其中沸石粉、碎豆粕混合物组成为：沸石粉50％，碎豆粕50％。
实验发酵组
将实施例1中制得的丁酸梭菌菌粉用沸石粉、碎豆粕混合物稀释至菌量为1.0×108CFU/g，混合均匀后分装密封，得到实验发酵组丁酸梭菌菌剂。
其中沸石粉、碎豆粕混合物组成同常规发酵组。
饲喂实验
按照0.2％金霉素、0.025％阿莫西林与常规饲料混合后使用作为抗生素组；按照1％常规发酵组丁酸梭菌菌剂与常规饲料混合后使用作为常规菌剂组；按照0.5％、1％、2％实验发酵组丁酸梭菌菌剂与常规饲料混合后使用作为实验菌剂组。
按照上述3组与空白组饲喂30头断奶仔猪30天。
其中，腹泻率(％)＝试验期腹泻仔猪头次/(试验仔猪头数×试验天数)×100％；
其中，实验期腹泻仔猪头次＝第1天腹泻仔猪数+第2天腹泻仔猪数+……第30天腹泻仔猪数。
表2各处理组仔猪生产性能实验结果
由表2可得，与空白组相比，常规发酵丁酸梭菌菌剂组的日增重及日采食有所提高，而料肉比、腹泻率、死亡率均有降低，效果与抗生素组接近，略优于抗生素组，而实验发酵丁酸梭菌菌剂组的日增重及日采食显著高于抗生素组及常规发酵丁酸梭菌菌剂组，料肉比、腹泻率相比抗生素组和常规发酵丁酸梭菌菌剂组也更低。同时，实验发酵丁酸梭菌菌剂组中，添加量0.5％效果明显不如1％、2％，同时添加量由1％增加为2％时，各项指标并没有显著变化，因此本发明发酵丁酸梭菌菌剂添加量优选为1％-2％。
以上本发明实施例提供的丁酸梭菌的发酵方法，通过改良发酵培养基及培养工艺，大大提升了在普通发酵设备上发酵丁酸梭菌的效果，对设备要求低，更利于普及，同时本发明所制得的丁酸梭菌菌剂在仔猪饲喂中可明显提升生长速度，降低料肉比，且能有效改善仔猪腹泻和死亡的情况，大大促进了相关生产活动。
综上，本发明实施例提供了一种丁酸梭菌的发酵方法，具体为：先对丁酸梭菌进行培养形成优势菌群，再通过补料加入酿酒酵母菌种子液，待发酵至丁酸梭菌开始形成芽孢时通过升温来抑制或杀死酿酒酵母菌并促进丁酸梭菌形成芽孢，之后通过喷雾干燥制得固体粉状菌剂。其中，喷雾干燥过程中的高温可以灭活发酵菌液中残留的酿酒酵母菌。与现有技术中需要使用复杂的厌氧设备来进行发酵相比，本发明中通过酿酒酵母菌与丁酸梭菌协同发酵，利用酿酒酵母菌的有氧呼吸来消耗培养基中氧气，降低培养基的氧化还原电位，能有效促进丁酸梭菌生长，同时，酿酒酵母菌发酵时产生的胞外酶也能促进丁酸梭菌对原料的利用效率。本发明发酵工艺简单，对设备要求低，易于推广，解决丁酸梭菌发酵工艺复杂、产量低等问题。将丁酸梭菌菌液或丁酸梭菌菌粉作为微生物菌剂添加到畜禽饲料后，饲喂动物，可有效改善养殖动物健康状况，提高动物消化吸收能力与免疫能力，增加日增重、日采食，降低料肉比、腹泻率和死亡率，并减少抗生素的使用。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种丁酸梭菌的发酵方法，其特征在于，其包括：将丁酸梭菌发酵培养至对数期时向培养基中加入酵母菌，发酵至丁酸梭菌开始形成芽孢时升温抑制或杀死酵母菌以促进丁酸梭菌形成芽孢，当丁酸梭菌的芽孢率≥96％时，完成发酵，得到丁酸梭菌菌液。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将丁酸梭菌种子液接种于发酵罐中进行菌体扩培直至形成丁酸梭菌优势菌群，得到丁酸梭菌发酵液，之后通过补料加入酿酒酵母菌种子液，发酵至丁酸梭菌开始形成芽孢时升温抑制或杀死酿酒酵母菌以促进丁酸梭菌形成芽孢，当丁酸梭菌的芽孢率达96-98％时，完成发酵，得到丁酸梭菌菌液。
3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，在丁酸梭菌发酵液中接种酿酒酵母菌种子液包括：对丁酸梭菌种子液进行扩培4-6h形成丁酸梭菌发酵液，随后按照接种比为0.8-1％接种酿酒酵母菌种子液，继续发酵12-14h至丁酸梭菌开始形成芽孢的状态，准备升温。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，在丁酸梭菌发酵液中接种酿酒酵母菌种子液进行发酵的发酵工艺为：调控pH不低于6.5，温度控制为36-38℃，转速40-50rpm，不通气；
优选地，将丁酸梭菌发酵液中接种酿酒酵母菌种子液的培养基采用逐步升温的方式进行升温，以抑制或杀死酿酒酵母以促进丁酸梭菌形成芽孢；
更优选地，将培养基的温度以每半小时提高5℃的速率提升至51-53℃后，继续发酵6-8小时，当丁酸梭菌的芽孢率达96-98％时，即为成熟，获得丁酸梭菌菌液。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，还包括：通过喷雾干燥杀死所述丁酸梭菌菌液中残留的酵母菌，获得丁酸梭菌菌粉；
优选地，将发酵完成的丁酸梭菌菌液与轻质碳酸钙按20:1的质量比混合均匀后进行喷雾干燥；
更优选地，喷雾干燥设备的进风温度为170℃-180℃，出风温度为80℃-85℃。
6.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述丁酸梭菌发酵液的制备包括以下步骤：将丁酸梭菌种子液接种于发酵罐中，接种体积比为0.8-1％，进行菌体扩培，培养4-6小时，得到丁酸梭菌发酵液；
优选地，所述丁酸梭菌发酵罐中培养基的组成为：葡萄糖8-10g/L，酵母粉6-8g/L，蛋白胨12-16g/L，麸皮10-12g/L，豆粕8-10g/L，乙酸钠2-3g/L，碳酸钙5-6g/L，亚硫酸钠1.8-2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.4-0.5g/L，海藻酸钠4-5g/L；
优选地，丁酸梭菌发酵罐中发酵的发酵工艺为：通过10％氢氧化钠溶液调控pH不低于6.5，温度控制为36-38℃，转速40-50rpm，不通气。
7.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，种子液的制备包括：将保存于斜面的丁酸梭菌、酿酒酵母菌菌株接种到摇瓶培养基中，培养24-30小时，作为种子液；
优选地，丁酸梭菌的摇瓶培养条件为36-38℃，静置培养，培养基为RCM液体培养基；
优选地，酿酒酵母菌的摇瓶培养条件为36-38℃，200r/min转速，培养基为YPD肉汤。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的发酵方法，其特征在于，丁酸梭菌的发酵方法包括以下步骤：
将丁酸梭菌种子液接种于发酵罐中，接种体积比为0.8-1％，进行菌体扩培，培养4-6小时，得到丁酸梭菌发酵液；
然后将酿酒酵母种子液接种于上述丁酸梭菌发酵液中，接种体积比为0.8-1％，继续发酵12-14小时；
将培养基以每半小时提高5℃的升温速率提升至51-53℃后，继续发酵6-8小时，镜检发酵液，当芽孢率达96-98％时，完成发酵，得丁酸梭菌菌液；
将发酵完成的丁酸梭菌菌液与轻质碳酸钙按20:1的质量比混合，待菌液与轻质碳酸钙混合完毕后，进入喷雾塔进行喷雾，其中，进风温度为170℃-180℃，出风温度为80℃-85℃，获得丁酸梭菌菌粉。
9.一种微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂包含权利要求1所述的丁酸梭菌菌液或权利要求5所述的丁酸梭菌菌粉。
10.根据权利要求9所述微生态制剂在制备益生菌菌剂、饲料和饲料添加剂方面的应用。
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