CN114106125B - 一种银杏肽和含所述银杏肽的特殊医学用配方食品及应用 - Google Patents
一种银杏肽和含所述银杏肽的特殊医学用配方食品及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种银杏肽和含所述银杏肽的特殊医学用配方食品及应用，属于医学食品技术领域。本发明是以银杏果为原料，通过纤维素酶及超声波破壁，在碱性条件下酶解及除脂肪，在酸性条件再次酶解，通过超滤膜分离器进行分离，再通过Sephadex LH‑20分子筛层析、高效液相色谱分离纯化后得到的银杏肽。本发明所述银杏肽具有清除DPPH自由基作用，能够抑制血管紧张素转换酶，实现降血压和/或降血脂。
Description
技术领域
本发明涉及医学食品技术领域，具体涉及一种银杏肽和含所述银杏肽的特殊医学用配方食品及应用。
背景技术
特殊医学用配方食品对疾病没有预防和治疗的作用，但是在疾病的治疗、康复过程中，特殊医学用配方食品起着积极的改善作用。它可以减少因营养不良导致的并发症和住院率。
银杏具有抗氧化、延缓衰老、抗肿瘤和抗菌等多种生物活性，具有极高的营养保健价值。但是生食银杏会引起过敏反应甚至死亡。熟制的银杏也不能过多食用，儿童对银杏尤其敏感。酶解银杏蛋白是一种很好的使蛋白脱敏的方法，但是酶解方式不当，会产生一些苦味或者异味，另外，酶解的工艺水平也影响到所得的银杏肽结构和生物活性。
生物活性肽利用率高，具有独特的生理调节功能，来源广泛、种类丰富。与蛋白质相比，生物活性肽具有良好的起泡性、乳化性以及稳定性，黏度低。生物活性肽在人体中的营养吸收及安全性优于蛋白质。因此，生物活性肽组件的组合比蛋白质及氨基酸的组合具有更全面的营养性，更有利于患者的健康恢复。
但目前仍缺乏辅助降血脂效果好的银杏生物活性肽产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种银杏肽和含所述银杏肽的特殊医学用配方食品及应用。本发明所述银杏肽具有辅助降血压和/或降血脂作用。
本发明提供了所述银杏肽包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的肽。
本发明还提供了上述技术方案所述银杏肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将匀浆后的银杏果与纤维素酶混合，39℃酶解12～48h，得到酶解后的匀浆液；
2)将步骤1)得到的酶解后的匀浆液在pH值为8.5的条件下，40～50℃超声震荡50～100min，得到震荡后的匀浆液；将震荡后的匀浆液和碱性蛋白酶混合，40～50℃震荡酶解50～100min，离心取上清，干燥，得到脱脂粉；
3)将步骤2)得到的脱脂粉与复合酶混合，30～50℃震荡酶解50～100min，离心，取上清，得到酶解液；所述复合酶包括海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶，海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶的活力单位比为(5～7)：(4～6)：(1～3)；
4)将步骤3)得到的酶解液进行超滤分离，取截留分子量为4000Da以下的液体，得到超滤液；
5)将步骤4)得到的超滤液进行分子筛层析，收集具有DPPH清除作用的洗脱峰组分，进行高效液相色谱分离，得到银杏肽。
优选的是，步骤1)所述纤维素酶的添加重量为匀浆后的银杏果的0.5～2％；所述碱性蛋白酶的添加重量为酶解后的匀浆液的0.5～2％。
优选的是，步骤1)所述混合前，还包括将匀浆后的银杏果与磷酸盐缓冲液混合，所述磷酸盐缓冲液的pH值为4～6，物质的量浓度为0.01～0.1M，体积为匀浆后的银杏果的1～3倍；
步骤3)所述混合前，还包括将脱脂粉与磷酸缓冲液混合，所述磷酸盐缓冲液的pH值为4～6，物质的量浓度为0.01～0.1M，体积为脱脂粉的1～3倍。
优选的是，步骤5)所述分子筛层析包括以下步骤：通过Sephadex LH-20分子筛层析柱进行分子筛层析，所述分子筛层析采用磷酸盐缓冲液进行洗脱，所述磷酸盐缓冲液的pH值为4～6，物质的量浓度为0.01～0.1M。
优选的是，步骤5)所述高效液相色谱分离包括以下步骤：
将具有DPPH清除作用洗脱峰组分冷冻干燥，用去离子水配置成10～50mg/ml的去离子水溶液，离心取上清，得到上样上清液；
将上样上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，以甲醇的体积百分含量为5％的甲醇水溶液为流动相A，以甲醇的体积百分含量为95％的甲醇水溶液为流动相B，以1ml/min的流速进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：0～20min，流动相A为100％；20.5～40min，流动相A为50％，流动相B为50％；40.5～60min，流动相B为100％，得到银杏肽。
本发明还提供了一种含银杏肽的特殊医学用配方食品，以质量份计，所述特殊医学用配方食品包括10～20份的银杏肽、20～40份的鱼胶原蛋白肽、10～30份的低聚异麦芽糖、5～15份的麦芽糊精、2～10份的姜粉和10～20份的牡蛎粉；所述银杏肽为上述技术方案所述的银杏肽或上述技术方案所述制备方法得到的银杏肽。
优选的是，所述牡蛎粉的制备方法包括以下步骤：
将全牡蛎和复合酶混合，37℃酶解12～48h，得到牡蛎酶解物；所述复合酶包括海洋碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，海洋碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活力单位比为(5～7)：(4～6)：(1～3)；
将牡蛎酶解物在100℃下处理15min，离心，取上清，干燥，得到牡蛎粉。
优选的是，所述全牡蛎与复合酶混合前，还包括将全牡蛎匀浆，得到全牡蛎匀浆液，将全牡蛎匀浆液与磷酸缓冲液混合；所述磷酸盐缓冲液的pH值为7～8，物质的量浓度为0.01～0.1M，体积为全牡蛎匀浆液的1～3倍；所述复合酶的添加重量为全牡蛎匀浆液的0.5～2％。
本发明还提供了上述技术方案所述的银杏肽或上述技术方案所述的制备方法得到的银杏肽或上述技术方案所述的特殊医学用配方食品在如下(A)～(C)任一项或多项中的应用；
(A)制备辅助降血压和/或降血脂的产品中的应用；
(B)在制备抑制血管紧张素转换酶的产品中的应用；
(C)在制备具有清除DPPH自由基作用的产品中的应用。
本发明提供了一种银杏肽。本发明所述银杏肽具有清除DPPH自由基作用，能够抑制血管紧张素转换酶，实现辅助降血压和/或降血脂。试验结果表明，本发明银杏肽含氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两种肽，且本发明所述银杏肽具有较好的清除DPPH自由基的能力；相比常规市售产品，本发明银杏肽还具有更好的ACE抑制作用，具有降血压作用；后续与本发明的牡蛎粉等其它组分复配后，具有更好的降血压和/或降血脂功效。
附图说明
图1为本发明提供的Sephadex LH-20分子筛层析图；
图2为本发明提供的高效液相色谱图；
图3为本发明提供的质谱图；
图4为本发明提供的银杏肽清除DPPH自由基的能力示意图；
图5为本发明提供的牡蛎粉清除DPPH自由基的能力示意图。
具体实施方式
本发明提供了所述银杏肽包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的肽：LQIVAIADTSNHQNQLDQTYRPF和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的肽：TLAGTAQTTEDRK。本发明所述银杏肽具有清除DPPH自由基作用，能够抑制血管紧张素转换酶，实现辅助降血压和/或降血脂。
本发明还提供了所述银杏肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将匀浆后的银杏果与纤维素酶混合，39℃酶解12～48h，得到酶解后的匀浆液；
2)将步骤1)得到的酶解后的匀浆液在pH值为8.5的条件下，40～50℃超声震荡50～100min，得到震荡后的匀浆液；将震荡后的匀浆液和碱性蛋白酶混合，40～50℃震荡酶解50～100min，离心取上清，干燥，得到脱脂粉；
3)将步骤2)得到的脱脂粉与复合酶混合，30～50℃震荡酶解50～100min，离心，取上清，得到酶解液；所述复合酶包括海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶，海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶的活力单位比为(5～7)：(4～6)：(1～3)；
4)将步骤3)得到的酶解液进行超滤分离，取截留分子量为4000Da以下的液体，得到超滤液；
5)将步骤4)得到的超滤液进行分子筛层析，收集具有DPPH清除作用的洗脱峰组分，进行高效液相色谱分离，得到银杏肽。
本发明将匀浆后的银杏果与纤维素酶混合，39℃酶解12～48h，得到酶解后的匀浆液。在本发明中，所述酶解时间优选为18～30h，更优选为24h。在本发明中，所述混合前，优选还包括将匀浆后的银杏果与磷酸盐缓冲液混合，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为4～6，更优选为5，物质的量浓度优选为0.01～0.1M，更优选为0.05M，体积优选为匀浆后的银杏果的1～3倍，更优选为2。在本发明中，所述纤维素酶优选≥5000U/g，源于木霉属。在本发明中，所述纤维素酶的添加重量优选为匀浆后的银杏果的0.5～2％，更优选为1.5％。本发明此步酶解能够高效破除银杏果的细胞壁。
得到酶解后的匀浆液后，本发明将酶解后的匀浆液在pH值为8.5的条件下，40～50℃超声震荡50～100min，得到震荡后的匀浆液，将震荡后的匀浆液和碱性蛋白酶混合，40～50℃震荡酶解50～100min，离心取上清，干燥，得到脱脂粉。本发明对pH值调节的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规pH调节剂进行调节即可，如使用质量百分含量为1％的氢氧化钠水溶液。本发明所述超声震荡的温度更优选为45℃，超声震荡的时间更优选为60min。在本发明中，所述碱性蛋白酶的添加重量优选为酶解后的匀浆液的0.5～2％，更优选为1.5％。本发明所述碱性蛋白酶(Alcalase)优选购自诺维信。本发明所述振荡酶解优选在水浴中进行。本发明所述震荡酶解的温度优选为47℃，时间优选为60min。在本发明中，所述离心的转速优选为5000～7000r/min，更优选为6000r/min，所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。在本发明中，所述干燥的方式优选包括冷冻干燥。
得到脱脂粉后，本发明将脱脂粉与复合酶混合，30～50℃震荡酶解50～100min，离心，取上清，得到酶解液。在本发明中，所述混合前，优选还包括将脱脂粉与磷酸缓冲液混合，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为4～6，更优选为5，物质的量浓度优选为0.01～0.1M，更优选为0.05M，体积优选为脱脂粉的1～3倍，更优选为2.5。在本发明中，所述复合酶的添加量优选为脱脂粉重量的0.5～2％，更优选为1.5％。在本发明中，所述复合酶的总酶活优选为100～500U/mg，更优选为250U/mg。在本发明中，所述复合酶包括海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶；所述复合酶中，海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶的活力单位比为(5～7)：(4～6)：(1～3)，更优选为5：4：1。在本发明中，所述离心的转速优选为5000～7000r/min，更优选为6000r/min，所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。本发明所述酶解条件的设定能够保证本申请银杏肽的获得。
得到酶解液后，本发明将酶解液进行超滤分离，取截留分子量为4000Da以下的液体，得到超滤液。
得到超滤液后，本发明将超滤液进行分子筛层析，收集具有DPPH清除作用的洗脱峰组分，进行高效液相色谱分离，得到银杏肽。在本发明中，所述分子筛层析优选包括以下步骤：通过Sephadex LH-20分子筛层析柱进行分子筛层析，所述分子筛层析采用磷酸盐缓冲液进行洗脱，所述磷酸盐缓冲液的pH值为4～6，物质的量浓度为0.01～0.1M。具体的，本发明优选按每管1ml收集洗脱峰，取第19～25管进行冷冻干燥。
在本发明中，所述高效液相色谱分离优选包括以下步骤：将具有DPPH清除作用洗脱峰组分冷冻干燥，用去离子水配置成10～50mg/ml的去离子水溶液，离心取上清，得到上样上清液；将上样上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，以甲醇的体积百分含量为5％的甲醇水溶液为流动相A，以甲醇的体积百分含量为95％的甲醇水溶液为流动相B，以1ml/min的流速进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：0～20min，流动相A为100％；20.5～40min，流动相A为50％，流动相B为50％；40.5～60min，流动相B为100％，得到银杏肽。在本发明中，所述离心的温度优选为4℃，转速优选为7000～9000r/min，更优选为8000r/min，离心时间优选为8～12min，更优选为10min。
本发明还提供了一种含上述技术方案所述银杏肽的特殊医学用配方食品，以质量份计，所述特殊医学用配方食品包括10～20份的银杏肽、20～40份的鱼胶原蛋白肽、10～30份的低聚异麦芽糖、5～15份的麦芽糊精、2～10份的姜粉和10～20份的牡蛎粉。在本发明中，所述特殊医学用配方食品中更优选包括20份的银杏肽。在本发明中，所述特殊医学用配方食品中更优选包括35份的鱼胶原蛋白肽。在本发明中，所述特殊医学用配方食品中更优选包括23份的低聚异麦芽糖。在本发明中，所述特殊医学用配方食品中更优选包括5份的麦芽糊精。在本发明中，所述特殊医学用配方食品中更优选包括2份的姜粉。在本发明中，所述特殊医学用配方食品中更优选包括15份的牡蛎粉。
本发明将上述技术方案制备得到的银杏肽与其他组分配伍，能够获得一种具有辅助降血脂和/或降血压作用的特殊医学用配方食品，包括银杏肽、鱼胶原蛋白肽、低聚异麦芽糖、麦芽糊精、姜粉和牡蛎粉。其中银杏肽是以银杏果为原料，通过纤维素酶及超声波破壁，在碱性条件下酶解及除脂肪，在酸性条件再次酶解，通过超滤膜分离器进行分离，再通过Sephadex LH-20分子筛层析、高效液相色谱分离纯化后得到的银杏肽；该银杏肽能够有效清除DPPH自由基。牡蛎粉是以全牡蛎为原料，在碱性条件下进行酶解，同时进行热水浸提，最后得到牡蛎肽和牡蛎多糖的混合物。本发明中的两个重要组分的制备保证了药物有效发挥其具有的辅助降血脂和/或降血压作用。鱼胶原蛋白肽也有降血压的作用。本发明对鱼胶原蛋白肽、低聚异麦芽糖、麦芽糊精、姜粉的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明所述鱼胶原蛋白肽优选购自威海市宇王集团有限公司。
在本发明中，所述牡蛎粉的制备方法包括以下步骤：
将全牡蛎(含脏器)和复合酶混合，37℃酶解12～48h，得到牡蛎酶解物；将牡蛎酶解物在100℃下处理15min，离心，取上清，干燥，得到牡蛎粉。
在本发明中，所述复合酶优选包括海洋碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶；所述海洋碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活力单位比优选为(5～7)：(4～6)：(1～3)，进一步优选为5：4：1。在本发明中，所述复合酶的添加重量优选为全牡蛎匀浆液的0.5～2％，更优选为1.5％。在本发明中，所述复合酶的总酶活优选为100～500U/mg，更优选为250U/mg。在本发明中，所述全牡蛎与复合酶混合前，优选还包括将全牡蛎匀浆，得到全牡蛎匀浆液，将全牡蛎匀浆液与磷酸缓冲液混合；所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7～8，更优选为8，物质的量浓度优选为0.01～0.1M，更优选为0.01M，体积优选为全牡蛎匀浆液的1～3倍，更优选为3倍。本发明上述条件的设定能够最大限度地获得牡蛎肽。
得到牡蛎酶解物后，本发明将牡蛎酶解物在100℃下处理15min，离心，取上清，干燥，得到牡蛎粉。本发明优选通过水浴提供100℃的条件，100℃处理15min能够获得牡蛎多糖。在本发明中，所述离心的转速优选为5000～7000r/min，更优选为6000r/min，所述离心的时间优选为10～20min，更优选为15min。在本发明中，所述干燥优选包括喷雾干燥。本发明所述牡蛎粉的制备方法能够同时获得牡蛎肽和多糖，其中，牡蛎粉中肽质量百分含量为30～50％，多糖质量百分含量为20～60％。此牡蛎粉具有较好的降血压、DPPH清除作用。
本发明还提供了上述技术方案所述的银杏肽或上述技术方案所述的特殊医学用配方食品在制备辅助降血压和/或降血脂的产品中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的银杏肽或上述技术方案所述的特殊医学用配方食品在制备抑制血管紧张素转换酶的产品中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的银杏肽或上述技术方案所述的特殊医学用配方食品在制备具有清除DPPH自由基作用的产品中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种银杏肽和含所述银杏肽的特殊医学用配方食品及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
一种具有降血脂作用的含银杏肽粉的特殊医学用配方食品，由以下重量配比的原料：
20份的银杏肽、35份的鱼胶原蛋白肽、23份的低聚异麦芽糖、5份的麦芽糊精、2份的姜粉和15份的牡蛎粉。
制备方法：将上述原料混合即可。
银杏肽由以下工艺制备而成：
a将银杏果匀浆，向匀浆后的银杏果中加入3倍体积pH 6的0.01M磷酸缓冲液及为匀浆重量1.5％的纤维素酶(≥5000U/g，源于木霉属)，于39℃酶解24h；
b将上述酶解后的匀浆液用1％NaOH调pH至8.5，在40～50℃超声波震荡60min，再加入匀浆重量比为1.5％的碱性蛋白酶Alcalase(诺维信)进行酶解，在47℃震荡水浴酶解60min。在6000r/min转速离心15min，取上清液，冷冻干燥；
c将b步骤冷冻干燥所获的产物与3倍体积pH 4的0.01M磷酸缓冲液混合后，用干燥产物重量的1.5％的复合酶进行酶解，在37℃震荡水浴酶解60min，所述复合酶的总酶活为250U/mg；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶、酸蛋白酶按活力单位比为5：4：1比例混合；酶解后在6000r/min转速离心15min，得上清液；
d用截留分子量为4000Da的超滤膜分离器分离上清液，取透过超滤膜的液体；
e通过Sephadex LH-20分子筛层析柱，按每管1ml收集洗脱峰，取第19～25管进行冷冻干燥；将每个洗脱峰配成终浓度为1mg/ml，测定各组分的DPPH自由基清除率(SephadexLH-20分子筛层析分离结果如图1)；
f将e步骤所得到的具有DPPH清除作用的冷冻干燥物(第19～25管的冷冻干燥物)制备成20mg/ml的去离子水溶液，于8000rpm、4℃条件下离心10min，用0.22μm水膜过滤，得到上样上清液；
g使用ddH2O配制5％甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45μm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A；使用ddH2O配制95％甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45μm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0～20min，流动相A100％；20.5～40min，流动相A50％，流动相B50％；40.5～60min,流动相B100％；将上液上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，收集紫外检测波长280nm的吸收峰(结果如图2)，得到收集物；
h.挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到银杏肽制品。
牡蛎粉由如下工艺制备而成：
a将全牡蛎(含脏器)匀质后，向匀浆中加入3倍体积pH 8的0.01M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为1.5％的复合酶，于37℃酶解24h；所述复合酶的总酶活为250U/mg；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶按活力单位比为5：4：1比例混合；
b酶解后在沸水浴中煮15min；
c在6000r/min转速离心15min，取上清液，喷雾干燥，得牡蛎粉；
d经检测牡蛎粉中肽含为49.2％，多糖含量为55.3％。
将实施例1中的银杏肽制备成5～10mg/ml的去离子水溶液，使用液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪，经过一级质谱和二级质谱解析(结果如图3所示)，在NCBI上进行BLAST的分析，得到m/z为2671.3354氨基酸序列为LQIVAIADTSNHQNQLDQTYRPF以及m/z为1390.7052氨基酸序列为TLAGTAQTTEDRK的两个抗氧化银杏肽。
实施例2
一种具有降血脂作用的含银杏肽粉的特殊医学用配方食品，由以下重量配比的原料：
12份的银杏肽、25份的鱼胶原蛋白肽、15份的低聚异麦芽糖、15份的麦芽糊精、8份的姜粉和20份的牡蛎粉。
制备方法：将上述原料混合即可。
银杏肽由以下工艺制备而成：
a将银杏果匀浆，向匀浆后的银杏果中加入2.5倍体积pH 5的0.05M磷酸缓冲液及为匀浆重量1.8％的纤维素酶(≥5000U/g，源于木霉属)，于39℃酶解20h；
b将上述酶解后的匀浆液用1％NaOH调pH至8.5，在40～50℃超声波震荡55min，再加入匀浆重量比为1.2％的碱性蛋白酶Alcalase(诺维信)进行酶解，在47℃震荡水浴酶解70min。在6000r/min转速离心15min，取上清液，冷冻干燥；
c将b步骤冷冻干燥所获的产物与2.5倍体积pH 5的0.01M磷酸缓冲液混合后，用干燥产物重量的1.5％的复合酶进行酶解，在37℃震荡水浴酶解60min，所述复合酶的总酶活为300U/mg；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶、酸蛋白酶按活力单位比为5：4：1比例混合；酶解后在6000r/min转速离心15min，得上清液；
d用截留分子量为4000Da的超滤膜分离器分离上清液，取透过超滤膜的液体；
e通过Sephadex LH-20分子筛层析柱，按每管1ml收集洗脱峰，取第19～25管进行冷冻干燥；将每个洗脱峰配成终浓度为1mg/ml，测定各组分的DPPH自由基清除率(SephadexLH-20分子筛层析分离结果如图1)；
f将e步骤所得到的具有DPPH清除作用的冷冻干燥物(第19～25管的冷冻干燥物)制备成20mg/ml的去离子水溶液，于8000rpm、4℃条件下离心10min，用0.22μm水膜过滤，得到上样上清液；
g使用ddH2O配制5％甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45μm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A；使用ddH2O配制95％甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45μm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0～20min，流动相A100％；20.5～40min，流动相A50％，流动相B50％；40.5～60min,流动相B100％；将上液上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，收集紫外检测波长280nm的吸收峰，得到收集物；
h.挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到银杏肽制品。
牡蛎粉由如下工艺制备而成：
a将全牡蛎(含脏器)匀质后，向匀浆中加入2.5倍体积pH 7的0.01M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为1.5％的复合酶，于37℃酶解24h；所述复合酶的总酶活为300U/mg；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶按活力单位比为5：4：1比例混合；
b酶解后在沸水浴中煮15min；
c在6000r/min转速离心15min，取上清液，喷雾干燥，得牡蛎粉；
d经检测牡蛎粉中肽含为45％，多糖含量为51％。
将实施例2中的银杏肽制备成5～10mg/ml的去离子水溶液，使用液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪，经过一级质谱和二级质谱解析，结果同实施例1。
实施例3
对实施例1所得银杏肽清除DPPH自由基能力测定
将实施例1所得银杏肽用生理盐水配成不同浓度(2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml)的溶液，分别取2ml不同浓度样品溶液于试管中，加入2ml所配置的DPPH溶液(0.004g DPPH粉末加到50mL容量瓶，用95％乙醇定容，4℃下避光保存)，混合均匀，室温避光30min。在10000rpm离心10min，取上清于517nm下测定吸光度Aj，同时测2ml不同样品溶液加2ml的95％乙醇的吸光度Ai，2mlDPPH加2mL蒸馏水的吸光度A0。
DPPH自由基清除率(％)＝[A0-(Aj-Ai)]/A0×100％
式中：A0空白对照的吸光值；Aj样液的吸光值；Ai本身的吸光值
结果如图4所示，银杏肽具有较好的清除DPPH自由基的能力。
实施例4
对实施例1牡蛎粉清除DPPH自由基能力测定
将本发明实施例1所得牡蛎粉用生理盐水配成不同浓度(0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml)的溶液，分别取2ml不同浓度样品溶液于试管中，加入2ml所配置的DPPH溶液(0.004g DPPH粉末加到50mL容量瓶，用95％乙醇定容，4℃下避光保存)，混合均匀，室温避光30min。在10000rpm离心10min，取上清于517nm下测定吸光度Aj，同时测2ml不同样品溶液加2ml的95％乙醇的吸光度Ai，2mlDPPH加2mL蒸馏水的吸光度A0。
DPPH自由基清除率(％)＝[A0-(Aj-Ai)]/A0×100％
式中：A0空白对照的吸光值；Aj样液的吸光值；Ai本身的吸光值
结果如图5所示，牡蛎粉具有较好的清除DPPH自由基的能力。
实施例5
基于HILIC UHPLC-Q-TOFMS技术对小鼠粪便样本在代谢组学方面进行研究，考察含银杏肽粉的特殊医学用配方食品具有的降血脂作用。将50只昆明种小鼠(雄性)分为5组，分别为正常组、高血脂模型组、银杏肽复合粉组(分为低、中、高3个剂量组)。除正常组饲喂基础饲料，其它组喂食高脂饲料20d，建立高脂动物模型。建模后，银杏肽复合粉低、中、高浓度组分别饲喂银杏肽复合粉200mg/(kg·d)、400mg/(kg·d)、度800mg/(kg·d)，高脂模型组继续饲喂高脂饲料。连续灌胃6周后，收集正常组10只、高脂模型组10只、银杏肽复合粉组低、中、高浓度分别为3只、3只、4只小鼠的粪便，共计30个样品，放入液氮中保存待测。
将小鼠粪便样本中的蛋白质除去，再将提取的上清液冻干，最后进行LC-MS/MS质谱检测。通过色谱***对样品进行分离，对分离后的样品在电喷雾电离(ESI)正、负离子模式下进行一级四级杆-飞行时间质谱检测，检测完之后通过一二级四级杆-飞行时间质谱对代谢物进行鉴定。将一级原始数据先转换格式、通过特定程序提取峰面积，保留时间；根据m/z、RT两个数据，将样本检测列表与代谢物鉴定结果进行匹配；对得到的数据进行标准化、归一化，然后使用软件进行单维、多维统计分析。
从30个粪便样品鉴定到的大量代谢物中筛选出具有显著性差异的代谢物，并在此基础上解释银杏肽复合粉对小鼠粪便代谢组学的影响及银杏肽复合粉降血脂作用的机制。主成分分析(PCA)得分图、PLS-DA模型得分图、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型得分图说明模型稳定性较好。
表1是银杏肽复合粉组与高脂模型组相比的差异代谢物。在正离子模式中，D-脯氨酸D-Proline、L-瓜氨酸L-Citrulline、N-乙酰腐胺N-Acetylputrescin、尿嘧啶Uracil、5-甲基胞嘧啶5-Methylcytosine、N6-甲基腺嘌呤N6-Methyladenine等6个代谢物极显著增加，β高脯氨酸beta-Homoproline、L-肉碱L-Carnitine、β***beta-Estradiol、6-羟多巴胺6-Hydroxydopamine、二甲基氨基嘌呤Dimethylaminopurine、胆酸Cholic acid等6个代谢物显著差异。在负离子模式中，15-酮-***素115-keto-PGE1、L-乙酰基肉碱Acetylcarnitine、D-脯氨酸D-Proline、甘油酸Glyceric acid等4种代谢物有极显著差异，丙酸Propionic acid、腺嘌呤Adenine、琥珀酸Succinate等3种代谢物显著差异。
与高脂模型组相比，银杏肽复合粉组的肉碱类物质L-肉碱L-Carnitine、L-乙酰基肉碱Acetylcarnitine水平回调，表明线粒体的功能与结构的改善。胆固醇在肝细胞中代谢生成胆酸、鹅脱氧胆酸和次级胆汁酸胆酸。粪便中胆酸Cholic acid水平回调，说明银杏肽复合粉通过调控胆汁酸代谢以清除体内过多的胆固醇，调节脂肪堆积。脯氨酸在体内参与精氨酸代谢，而精氨酸代谢产生的NO可以降低脂肪与糖原合成的相关基因表达。饲喂银杏肽复合粉小鼠体内脯氨酸水平回调，有助于调节脂肪的堆积。
表1银杏肽复合粉组与高脂模型组相比正、负离子模式显著差异代谢物
对比例1
以本发明实施例1中制备的银杏肽与市售银杏肽(购于淘宝)做对比，进行抑制ACE酶作用的实验。
血管紧张素转换酶(Angiotesin-converting enzyme，ACE)是一种多功能的二肽羧肽酶。它作用于无活性的血管紧张素I使其变为有活性的血管紧张素II，进而引起血管收缩，引发高血压。通过底物马尿酸-L-组氨酸-L-亮氨酸可以检测ACE的活性。在ACE的抑制剂作用下，底物马尿酸-L-组氨酸-L-亮氨酸不被ACE水解，进而可以筛选ACE的抑制剂。
采用HPLC方法检测实施例1的样品或者市售银杏肽对ACE的抑制活性：0mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL浓度实施例1的样品或者市售银杏肽做ACE活性抑制实验。
由表2可知，实施例1的银杏肽ACE抑制率高于市售银杏肽的ACE抑制率，因此，本发明具有更好的降血压作用。
表1 ACE活性抑制结果
| 浓度(mg/mL) | 实施例1的抑制率(％) | 市售银杏肽抑制率(％) |
| 0 | 0 | 0 |
| 10 | 83.56 | 73.44 |
| 20 | 94.67 | 82.87 |
| 40 | 98.71 | 89.67 |
对比例2
以本发明实施例1的牡蛎粉与市售的牡蛎粉进行ACE抑制实验，发现实施例1的牡蛎粉ACE抑制率高于市售牡蛎粉的ACE抑制率，因此，本发明的牡蛎粉具有更好的降血压作用(表2)。
表3 ACE抑制率结果
| 浓度(mg/mL) | 实施例1的抑制率(％) | 市售牡蛎粉抑制率(％) |
| 0 | 0 | 0 |
| 10 | 67.87 | 56.77 |
| 20 | 76.45 | 67.96 |
| 40 | 91.32 | 80.54 |
对比例3
将50只昆明种小鼠(雄性)分为5组，分别为正常组、高血脂模型组、银杏肽复合粉组(实施例1)、去掉银杏肽的实施例1(对照组1)、去掉牡蛎粉的实施例1(对照组2)。除正常组饲喂基础饲料，其它组喂食高脂饲料20d，建立高脂动物模型。建模后，银杏肽复合粉低、中、高浓度组分别饲喂银杏肽复合粉200mg/(kg·d)、400mg/(kg·d)、度800mg/(kg·d)，对照组1分别饲喂去掉银杏肽(银杏肽部分由鱼胶原蛋白肽补充)的实施例1复合粉200mg/(kg·d)、400mg/(kg·d)、度800mg/(kg·d)，对照组2分别饲喂去掉牡蛎粉(牡蛎粉部分由鱼胶原蛋白肽补充)的实施例1复合粉200mg/(kg·d)、400mg/(kg·d)、度800mg/(kg·d)，高脂模型组继续饲喂高脂饲料。连续灌胃6周后，眼球取血，测定血脂指标(表4)。在实验期间，所有涉及动物的程序均严格按照中国有关实验动物的相关饲养规范和法律规定进行。
血清总胆固醇TC、甘油三酯TG、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C均使用南京建成生物工程研究所购买的试剂盒测定，根据试剂盒的说明书进行相关操作及结果计算。
由表4可以看出，只有本发明银杏肽与牡蛎粉都在复合粉里时，复合粉才发挥其最好的降血脂作用。
表4血脂指标结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 大连海洋大学
<120> 一种银杏肽和含所述银杏肽的特殊医学用配方食品及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Gln Ile Val Ala Ile Ala Asp Thr Ser Asn His Gln Asn Gln Leu
1 5 10 15
Asp Gln Thr Tyr Arg Pro Phe
20
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Leu Ala Gly Thr Ala Gln Thr Thr Glu Asp Arg Lys
1 5 10
Claims (6)
1.一种银杏肽复合粉在制备降血脂的产品中的应用，其特征在于，以质量份计，所述银杏肽复合粉包括10~20份的银杏肽、20~40份的鱼胶原蛋白肽、10~30份的低聚异麦芽糖、5~15份的麦芽糊精、2~10份的姜粉和10~20份的牡蛎粉；所述银杏肽的制备方法，包括以下步骤：
1）将匀浆后的银杏果与纤维素酶混合，39℃酶解12~48h，得到酶解后的匀浆液；
2）将步骤1）得到的酶解后的匀浆液在pH值为8.5的条件下，40~50℃超声震荡50~100min，得到震荡后的匀浆液；将震荡后的匀浆液和碱性蛋白酶混合，40~50℃震荡酶解50~100min，离心取上清，干燥，得到脱脂粉；
3）将步骤2）得到的脱脂粉与复合酶混合，30~50℃震荡酶解50~100min，离心，取上清，得到酶解液；所述复合酶包括海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶，海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶的活力单位比为（5~7）：（4~6）：（1~3）；
4）将步骤3）得到的酶解液进行超滤分离，取截留分子量为4000 Da以下的液体，得到超滤液；
5）将步骤4）得到的超滤液进行分子筛层析，收集具有DPPH清除作用的洗脱峰组分，进行高效液相色谱分离，得到银杏肽；
所述牡蛎粉的制备方法包括以下步骤：
将全牡蛎和复合酶混合，37℃酶解12~48h，得到牡蛎酶解物；所述复合酶包括海洋碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，海洋碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活力单位比为（5~7）：（4~6）：（1~3）；
将牡蛎酶解物在100℃下处理15min，离心，取上清，干燥，得到牡蛎粉。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1）所述纤维素酶的添加重量为匀浆后的银杏果的0.5~2%；所述碱性蛋白酶的添加重量为酶解后的匀浆液的0.5~2%。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1）所述混合前，还包括将匀浆后的银杏果与磷酸盐缓冲液混合，所述磷酸盐缓冲液的pH值为4~6，物质的量浓度为0.01~0.1M，体积为匀浆后的银杏果的1~3倍；
步骤3）所述混合前，还包括将脱脂粉与磷酸缓冲液混合，所述磷酸盐缓冲液的pH值为4~6，物质的量浓度为0.01~0.1M，体积为脱脂粉的1~3倍。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤5）所述分子筛层析包括以下步骤：通过Sephadex LH-20分子筛层析柱进行分子筛层析，所述分子筛层析采用磷酸盐缓冲液进行洗脱，所述磷酸盐缓冲液的pH值为4~6，物质的量浓度为0.01~0.1M。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤5）所述高效液相色谱分离包括以下步骤：
将具有DPPH清除作用洗脱峰组分冷冻干燥，用去离子水配置成10~50mg/ml的去离子水溶液，离心取上清，得到上样上清液；
将上样上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，以甲醇的体积百分含量为5%的甲醇水溶液为流动相A，以甲醇的体积百分含量为95%的甲醇水溶液为流动相B，以1ml/min的流速进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：0~20min，流动相A为100%；20.5~40min，流动相A为50%，流动相B为50%；40.5~60min，流动相B为100%，得到银杏肽。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述全牡蛎与复合酶混合前，还包括将全牡蛎匀浆，得到全牡蛎匀浆液，将全牡蛎匀浆液与磷酸缓冲液混合；所述磷酸缓冲液的pH值为7~8，物质的量浓度为0.01~0.1M，体积为全牡蛎匀浆液的1~3倍；所述复合酶的添加重量为全牡蛎匀浆液的0.5~2%。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN109293740A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-02-01 | 大连深蓝肽科技研发有限公司 | 一种牡蛎来源的ace抑制及抗肿瘤活性肽 |
| CN110105430A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-08-09 | 合肥工业大学 | 一种具有血管紧张素转化酶抑制活性的银杏果蛋白肽及其制备方法 |
| CN111685286A (zh) * | 2020-05-14 | 2020-09-22 | 中国海洋大学 | 一种具有降血脂功能的牡蛎肽及其制备方法和应用 |
-
2021
- 2021-11-29 CN CN202111432494.7A patent/CN114106125B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "海参肠肽与银杏肽制备研究";史佳欣;《中国硕士学位论文全文数据库》;第1-52页 * |
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