CN114105879B - 新型异佛尔酮衍生物的制备及其在细胞器标记和粘度检测领域的应用 - Google Patents

新型异佛尔酮衍生物的制备及其在细胞器标记和粘度检测领域的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了新型异佛尔酮衍生物的制备及其在细胞器标记和粘度检测领域的应用，将化合物(3,5,5‑三甲基环己‑2‑烯亚基)丙二腈与含有醛基的不同砌块反应，得到四种异佛尔酮衍生物，通过引入砌块增加共轭程度，使得化合物能够达到近红外光区。本发明所得化合物能够标记线粒体，溶酶体，内质网或脂滴。本发明首次公开了一类具有细胞器靶向能力的异佛尔酮衍生物荧光染料，公开解决了异佛尔酮衍生物荧光染料在细胞器靶向能力不明确的问题，并且此类化合物对粘度敏感，在粘性环境中荧光显著增强。本发明公开异佛尔酮衍生物能进行细胞器靶向能力的调节，使得通过使用单一基本骨架结构设计具有不同细胞器靶向能力的荧光标记物成为可能。

Description

新型异佛尔酮衍生物的制备及其在细胞器标记和粘度检测领 域的应用
技术领域
本发明属于荧光标记技术领域，尤其是指新型异佛尔酮衍生物的制备及其在细胞器标记和粘度检测领域的应用。
背景技术
细胞内微环境(包括pH、温度、极性、粘度等)的变化会破坏细胞器的稳态和功能(参见:Chem.Sci.,2020,11,596–601)。特别的是，有研究已经证明线粒体粘度异常与神经退行性疾病、动脉硬化和糖尿病有关(参见:Chem.Commun.,2019,55,7410-7413)。溶酶体生理状态异常会导致溶酶体贮积病、肺结核、代谢紊乱、炎症，神经退行性疾病(参见:J.Mater.Chem.B,2018,6,6592-6598)。内质网出现紊乱很容易引起记忆力衰退，心脏病以及肾病(参见:J.Mater.Chem.B,2021,9,5664-5669)。多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂贮存性疾病往往都伴随着脂滴的功能异常(参见:ACSSens.2021,6,(1),22–26)。合适的粘度环境是维持各个细胞器平稳运行的重要因素，细胞器的粘度变化也被认为是反应其工作状态的重要指标。
迄今为止，基于扭曲的分子内电荷转移(TICT)机理，已经有许多小分子粘度探针被开发出来，在粘性环境中，分子内旋转受到抑制，非辐射衰变减弱，荧光显著增强(参见:Anal.Chem.2020,92,(5),3517–3521)。但是，它们仍然有很多改进的空间。第一，许多粘度探针容易受到亲核试剂的干扰，选择性并不理想。第二，大多数粘度探针发射波长较短，无法达到近红外区域。几乎所有近红外粘度探针均为盐类化合物，虽然发射波长达到了近红外光区，但是盐类化合物的高毒性仍然无法很好地解决。第三，没有明确的细胞器靶向功能。目前报道具有明确细胞器靶向的粘度探针大多为阳离子粘度探针，它们大多进入线粒体，这是由于线粒体的负电荷膜电位，使得阳离子探针容易进入线粒体，然而这不可避免地破坏了生物体的微环境(参见:Anal.Chem.2019,91,(13),8415–8421)。虽然粘度探针近些年发展迅速，但是关于其它细胞器粘度探针的报道仍然十分有限。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了新型异佛尔酮衍生物的制备及其在细胞器标记和粘度检测领域的应用。
一种异佛尔酮衍生物，所述衍生物结构式为：
其中，R选自以下结构式(1)-(4)：
权利要求1所述的异佛尔酮衍生物的制备方法，包括以下步骤：
取(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈与化合物M溶解于有机溶剂中，在催化剂作用下，在80℃-120℃反应12小时得到所述异佛尔酮衍生物；
其中，化合物M为1H-吲唑-5-甲醛、4-(4-羟基哌啶-1-基)苯甲醛、4-羟基-1-萘甲醛或1-芘甲醛。
在本发明的一个实施例中，所述(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈与化合物M的摩尔比为1:0.7～1:2.0。
在本发明的一个实施例中，所述有机溶剂为乙醇或DMF。
在本发明的一个实施例中，所述催化剂包括羟醛缩合的碱性催化剂和酸性催化剂；
在本发明的一个实施例中，所述酸性催化剂为哌啶。
在本发明的一个实施例中，所述碱性催化剂为三甲基氯硅烷。
所述的异佛尔酮衍生物在制备细胞器荧光试剂中的应用。
所述的异佛尔酮衍生物在非诊断治疗目的的细胞器荧光成像中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述细胞器为溶酶体、线粒体、内质网或脂滴。
本发明还提供了一种非诊断非治疗目的的细胞荧光成像的方法，包括以下步骤：将细胞与含有所述异佛尔酮衍生物在培养基中共培养，再进行细胞成像，完成细胞荧光成像。本发明中，细胞、培养基都为常规产品，对发明技术效果没有影响。
在本发明的一个实施例中，所述所述异佛尔酮衍生物在培养基中的浓度为10～20μM。
本发明还提供了一种非诊断非治疗目的的细胞荧光成像的方法，包括以下步骤：将细胞与所述异佛尔酮衍生物和离子载体在培养基中共培养，再进行细胞成像，完成细胞荧光成像，所述异佛尔酮衍生物能进行不同细胞器的荧光标记。
在本发明的一个实施例中，可以分别将线粒体、溶酶体、内质网、脂滴荧光标记物加入培养基中，分别得到含有线粒体、溶酶体、内质网、脂滴荧光标记物的培养基；可以分别将线粒体、溶酶体、内质网、脂滴荧光标记物和离子载体(莫能霉素、***、制霉菌素)加入培养基中，得到含有所述荧光标记物和离子载体的培养基；优选的，含有线粒体、溶酶体、内质网、脂滴荧光标记物的培养基中，所述荧光标记物在培养基中的浓度分别为10μM，14μM，10μM，20μM；含有所述荧光标记物和离子载体的培养基中，所述荧光标记物在培养基中的浓度均为2μM，离子载体的浓度均为10μM。
在本发明的一个实施例中，细胞成像可以利用激光共聚焦显微镜进行，比如绿光通道选用488nm波长激发，收集468-550nm波长范围内的荧光信号，红光通道可用561nm波长激发，收集570-800nm波长范围内的荧光信号；细胞成像结果显示本发明包含的四种异佛尔酮衍生物荧光染料分别能够很好地标记线粒体、溶酶体、内质网或脂滴，可作为线粒体绿色标记物，溶酶体红色标记物，内质网红色标记物，脂滴红色标记物。通过加入离子载体使细胞粘度增加后，所述荧光染料在其对应细胞器中荧光显著增强。
在本发明的一个实施例中，共培养为在饱和湿度，37℃，5％CO2培养箱共同培养5分钟；优选的分别加入线粒体、溶酶体、内质网、脂滴荧光标记物再培养5分钟，然后用PBS缓冲液洗涤，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。
在本发明的一个实施例中，所述离子载体为莫能霉素、***或制霉菌素。
在本发明的一个实施例中，所述异佛尔酮衍生物在培养基中的浓度为1～2μM；所述离子载体浓度均为5～20μM。
本发明根据异佛尔酮衍生物结构的改变，既具有高浓度下荧光标记细胞器的能力；又具有在低浓度下，通过荧光强度对细胞器粘度进行检测。
本发明还提供了所述的异佛尔酮衍生物在检测粘度中的应用。
在本发明的一个实施例中，通过异佛尔酮衍生物的荧光强度对细胞器粘度进行检测。
本发明公开了一系列异佛尔酮衍生物荧光染料，它们不仅具有不同的细胞器靶向能力，并且同时能够检测粘度。由于强分子内电荷转移(ICT)效应，这四种中性荧光染料大部分仍能够达到近红外(NIR)光区。得益于中性荧光染料，细胞毒性与盐类荧光染料相比显著降低。本发明首次解决了异佛尔酮衍生物荧光染料细胞器靶向能力不明确的问题，并且同时能够监测粘度。本发明通过价格低廉的砌块参与合成，使得使用单一基本骨架结构设计具有不同细胞器靶向能力的粘度探针成为可能，并且将成本以及难度显著降低，具有重要的科学意义和商业价值。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明公开了四种异佛尔酮衍生物荧光染料，与细胞共培养后，可以分别标记不同的细胞器；同时，四种荧光染料都对粘度敏感，离子载体和荧光染料与细胞共同培养后，荧光染料在对应细胞器中的荧光显著增强，可对对应的细胞器粘度进行检测。本发明使用一种基础结构进行改进设计，通过廉价的不同砌块参与合成，改善了荧光标记物的光学性质和生物活性，并且能够调节细胞器靶向的能力，这具有重要的科学意义和商业价值。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为本发明设计的染料的合成路线。
图2为本发明染料1a-1d分别在甘油和二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。其中(a)为1a在甘油中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，(b)为1a在二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，(c)为1b在甘油中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，(d)为1b在二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，(e)为1c在甘油中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，(f)为1c在二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，(g)为1d在甘油中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，(f)为1d在二甲基亚砜中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；
图3为本发明染料1a-1d分别在HeLa细胞中的细胞成像图。其中(a1-a6)为1a在HeLa细胞中的细胞成像图，(b1-b6)为1b在HeLa细胞中的细胞成像图，(c1-c6)为1c在HeLa细胞中的细胞成像图，(d1-d6)为1d在HeLa细胞中的细胞成像图。
图4为本发明染料1a-1d分别在HeLa细胞中加离子载体前后的细胞成像图。其中(A)为1a在HeLa细胞中加离子载体前后的细胞成像图，(B)为1b在HeLa细胞中加离子载体前后的细胞成像图，(C)为1c在HeLa细胞中加离子载体前后的细胞成像图，(D)为1d在HeLa细胞中加离子载体前后的细胞成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
取化合物1((3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，1.7毫摩尔，254毫克)，化合物a(1H-吲唑-5-甲醛，1.7毫摩尔，200毫克)，溶解于10毫升无水乙醇中，向其中加入100微升的哌啶。氮气保护下在80℃反应回流12小时。反应结束降至室温后，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂。纯净产物经柱层析分离后得到，洗脱剂：二氯甲烷，橙黄色固体染料1a，317.83毫克，产率57％。
染料1a的核磁共振氢谱(300MHz,DMSO-d6)1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)13.24(s,1H,NH),8.13(d,J＝20.77Hz 2H,CH),7.82(d,J＝8.48Hz,1H,Ar-H),7.58(d,J＝7.77Hz,1H,Ar-H),7.43(s,1H,Ar-H),5.76(s,1H,CH),2.62(d,J＝11.74Hz,CH3),1.04(s,1H,CH2)。染料1a的核磁共振碳谱(600MHz,DMSO-d6),13C NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm)143.24,129.33,113.13,111.70,107.41,101.66,100.60,98.05,96.23,94.87,86.94,86.12,83.67,48.28,27.81,15.22,11.12,4.61.HRMS(ESI+):m/z计算值：C20H20N4 +[M+H]+:315.1604,实测值：315.1707。
实施例2
取化合物1((3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，1.0毫摩尔，186毫克)，化合物b(4-(4-羟基哌啶-1-基)苯甲醛，1.0毫摩尔，205毫克)，溶解于10毫升无水乙醇中，向其中加入100微升哌啶，氮气保护下反应回流12小时。反应结束降至室温后，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂。纯净产物经柱层析分离后得到，洗脱剂：二氯甲烷，棕红色固体染料1b，194.40毫克，产率52％。
染料1b的核磁共振氢谱(300MHz,DMSO-d6)1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)7.56(d,J＝8.36Hz,2H,Ar-H),7.21(m,J＝16.02Hz,2H,CH),6.96(d,J＝8.50Hz,2H,Ar-H),6.77(s,1H,CH),4.72(d,J＝3.75Hz,1H,OH),3.71(d,J＝9.77Hz,2H,CH2),3.03(t,J＝10.44Hz,2H,CH2),2.58(d,4H,CH2),1.81(d,J＝9.48Hz,2H,CH2),1.43(m,J＝9.50Hz,2H,CH2),1.01(s,3H,CH3)。染料1b的核磁共振碳谱(600MHz,DMSO-d6),13C NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm)142.57,129.70,124.08,111.33,102.26,97.59,97.52,93.21,86.93,86.11,46.11,38.40,17.56,14.87,10.76,6.08,4.18.HRMS(ESI+):m/z计算值：C24H28N3O+[M+H]+:374.2227,实测值：374.2498。
实施例3
取化合物1((3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，1.0毫摩尔，186毫克)，化合物c(4-羟基-1-萘甲醛，1.0毫摩尔，172毫克)溶解于10毫升无水乙醇中，向其中加入100微升哌啶，氮气保护下反应回流12小时。反应结束降至室温后，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂。纯净产物经柱层析分离后得到，洗脱剂：二氯甲烷，棕红色固体染料1c，270.4毫克，产率61％。
染料1c的核磁共振氢谱(300MHz,CDCl3)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.29(d,J＝7.82Hz,1H,Ar-H),8.14(d,J＝8.14Hz,1H,Ar-H),7.82(d,J＝15.95Hz,2H,CH),7.72(d,J＝7.88Hz,1H,Ar-H),7.62(m,J＝8.00Hz,2H,Ar-H),7.02(d,J＝15.72Hz,1H,Ar-H),6.90(m,J＝7.99Hz,2H,Ar-H),5.93(s,1H,OH),2.62(d,J＝11.42Hz,4H,CH2),1.12(s,6H,CH3)。染料1c的核磁共振碳谱(600MHz,DMSO-d6),13C NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm)164.73,142.78,129.43,128.21,106.49,104.90,101.96,100.88,99.72,98.78,97.47,96.94,95.71,95.16,94.26,86.69,85.86,81.17,80.13,47.34,14.92,10.66,4.23.HRMS(ESI+):m/z计算值：C23H20N2NaO+[M+Na]+:363.1468,实测值：363.1662。
实施例4
取化合物1((3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，0.86毫摩尔，161毫克)，化合物d(1-芘甲醛，0.86毫摩尔，200毫克)溶解于10毫升无水乙醇中，向其中加入100微升哌啶，氮气保护下反应回流12小时。反应结束降至室温后，有大量沉淀析出，抽滤出沉淀，并用无水乙醇洗涤，即得最终纯净产物，红色固体染料1d，178.0毫克，产率52％。
染料1d的核磁共振氢谱(300MHz,DMSO-d6)1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.80(d,J＝9.17Hz,1H,Ar-H),8.66(d,J＝8.27Hz,1H,Ar-H),8.39(m,J＝8.14Hz,4H,Ar-H),8.24(J＝5.04Hz,2H,Ar-H),8.14(t,J＝7.95Hz,1H,Ar-H),7.78(d,J＝16.41Hz,2H,CH),7.02(s,1H,CH),2.81(2H,CH2),2.62(2H,CH2),1.09(6H,CH3。因1d溶解性较差，核磁共振碳谱未能得到。HRMS(ESI+):m/z计算值：C29H22N2Na+[M+Na]+:421.1675,实测值：421.2039。
测试例1
对实施例1-实施例4制备的染料(浓度均为10μM)在甘油和二甲基亚砜中测试其紫外吸收和荧光发射光谱，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度或荧光强度，结果如图2。
在紫外-可见吸收光谱中，染料1a在424nm处有最大吸收；在荧光发射光谱中，染料1a在565nm处有最高的荧光强度且在甘油中最高，此时激发波长为424nm，狭缝宽度为5nm/5nm，分别见图2-(a)(b)。
在紫外-可见吸收光谱中，染料1b在493nm处有最大吸收；在荧光发射光谱中，染料1b在685nm处有最高的荧光强度且在甘油中最高，此时激发波长为545nm,狭缝宽度为10nm/1.5nm，分别见图2-(c)(d)。
在紫外-可见吸收光谱中，染料1c在473nm处有最大吸收；在荧光发射光谱中，染料1c在659nm处有最高的荧光强度且在甘油中最高，此时激发波长为506nm，狭缝宽度为10nm/3nm，分别见图2-(e)(f)。
在紫外-可见吸收光谱中，染料1d在476nm处有最大吸收；在荧光发射光谱中，染料1d在660nm处有最高的荧光强度且在甘油中最高，此时激发波长为507nm，狭缝宽度为5nm/5nm，分别见图2(g)(h)。
测试例2
使用DMSO(二甲基亚)将染料1a配置成母液，随后加入常规细胞培养基中，使得染料1a在细胞培养基中的浓度为10μM，再与HeLa细胞在饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱共同培养(以下实验相同)10分钟，随后加入商业线粒体红色标记物Mito Tracker Red CMXRos(2μM)再培养10分钟；然后经PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。绿光通道选用488nm波长激发，收集468-550nm范围内的荧光信号。红光通道使用561nm波长激发，收集600-750nm范围内的荧光信号。细胞成像显示染料1a在HeLa细胞中能够很好地标记线粒体，可做线粒体绿色标记物。结果如图3所示，其中(a1)为明场成像图，(a2)为染料1a的细胞成像图，(a3)为商业线粒体红色标记物的细胞成像图，(a4)为绿光通道和红光通道的叠加图，(a5)为共定位实验，共定位系数为0.92，(a6)为叠加图中ROI线的荧光强度。
测试例3
染料1b在细胞培养基中的浓度为14μM，随后加入商业溶酶体绿色标记物LysoTracker Green(2μM)再培养10分钟；PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561nm波长激发，收集600-750nm范围内的荧光信号，绿光通道选用488nm波长激发，收集468-550nm范围内的荧光信号。细胞成像显示染料1b在HeLa细胞中能够很好地标记溶酶体，可做溶酶体红色标记物。结果如图3所示，其中(b1)为明场成像图，(b2)为商业溶酶体绿色标记物的细胞成像图，(b3)为染料1b的细胞成像图，(b4)为绿光通道和红光通道的叠加图，(b5)为共定位实验，共定位系数为0.94，(b6)为叠加图中ROI线的荧光强度。
测试例4
染料1c在细胞培养基中的浓度为10μM，随后加入商业内质网绿色标记物ERTracker Green(6μM)再培养10分钟；PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561nm波长激发，收集600-750nm范围内的荧光信号，绿光通道选用488nm波长激发，收集468-550nm范围内的荧光信号。细胞成像显示染料1c在HeLa细胞中能够很好地标记内质网，可做内质网红色标记物。结果如图3所示，其中(c1)为明场成像图，(c2)为商业内质网绿色标记物的细胞成像图，(c3)为染料1c的细胞成像图，(c4)为绿光通道和红光通道的叠加图，(c5)为共定位实验，共定位系数为0.96，(c6)为叠加图中ROI线的荧光强度。
测试例5
染料1d在细胞培养基中的浓度为20μM，随后加入商业脂滴绿色标记物LDsTracker Green(4μM)再培养10分钟；PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561nm波长激发，收集600-750nm范围内的荧光信号，绿光通道选用488nm波长激发，收集468-550nm范围内的荧光信号。细胞成像显示染料1d在HeLa细胞中能够很好地标记脂滴，可做脂滴红色标记物。结果如图3所示，其中(d1)为明场成像图，(d2)为商业脂滴绿色标记物的细胞成像图，(d3)为染料1d的细胞成像图，(d4)为绿光通道和红光通道的叠加图，(d5)为共定位实验，共定位系数为0.90，(d6)为叠加图中ROI线的荧光强度。
测试例6
染料1a在细胞培养基中的浓度为2μM，离子载体莫能霉素的浓度为10μM，共同培养30分钟，PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。绿光通道选用488nm波长激发，收集500-550nm范围内的荧光信号。细胞成像显示，通过加入莫能霉素使线粒体粘度增加后，染料1a的荧光信号显著增强。结果如图4(A)所示，其中(a)为明场成像图，(b)为染料1a的细胞成像图，(c)为(a)和(b)的叠加图，(d)为明场成像图，(e)为染料1a和莫能霉素的细胞成像图，(f)为(d)和(e)的叠加图，(g)为平均荧光强度。
测试例7
染料1b在细胞培养基中的浓度为2μM，离子载体***的浓度为10μM，共同培养30分钟，PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561nm波长激发，收集600-800nm范围内的荧光信号。细胞成像显示，通过加入***使溶酶体粘度增加后，染料1b的荧光信号显著增强。结果如图4(B)所示，其中(a)为明场成像图，(b)为染料1b的细胞成像图，(c)为(a)和(b)的叠加图，(d)为明场成像图，(e)为染料1b和***的细胞成像图，(f)为(d)和(e)的叠加图，(g)为平均荧光强度。
测试例8
染料1c在细胞培养基中的浓度为2μM，离子载体莫能霉素的浓度为10μM，共同培养30分钟，PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561nm波长激发，收集600-800nm范围内的荧光信号。细胞成像显示，通过加入莫能霉素使内质网粘度增加后，染料1c的荧光信号显著增强。结果如图4(C)所示，其中(a)为明场成像图，(b)为染料1c的细胞成像图，(c)为(a)和(b)的叠加图，(d)为明场成像图，(e)为染料1c和莫能霉素的细胞成像图，(f)为(d)和(e)的叠加图，(g)为平均荧光强度。
测试例9
染料1d在细胞培养基中的浓度为2μM，离子载体制霉菌素的浓度为10μM，共同培养30分钟，PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561nm波长激发，收集600-800nm范围内的荧光信号。细胞成像显示，通过加入制霉菌素使脂滴粘度增加后，染料1d的荧光信号显著增强。结果如图4(D)所示，其中(a)为明场成像图，(b)为染料1d的细胞成像图，(c)为(a)和(b)的叠加图，(d)为明场成像图，(e)为染料1d和制霉菌素的细胞成像图，(f)为(d)和(e)的叠加图，(g)为平均荧光强度。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种异佛尔酮衍生物，其特征在于，所述衍生物结构式为：
其中，R选自以下结构式(1)：
2.权利要求1所述的异佛尔酮衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈与化合物M溶解于有机溶剂中，在催化剂作用下，加热反应得到所述异佛尔酮衍生物；
其中，所述化合物M为1H-吲唑-5-甲醛。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈与化合物M的摩尔比为1:0.7～1:2.0。
4.权利要求1所述的异佛尔酮衍生物在制备细胞器荧光试剂中的应用。
5.权利要求1所述的异佛尔酮衍生物在非诊断治疗目的的细胞器荧光成像中的应用；所述细胞器为溶酶体、线粒体、内质网或脂滴。
6.一种非诊断非治疗目的的细胞荧光成像的方法，其特征在于，包括以下步骤：将细胞与含有权利要求1所述异佛尔酮衍生物在培养基中共培养，再进行细胞成像，完成细胞荧光成像，所述异佛尔酮衍生物能进行不同细胞器的荧光标记。
7.一种非诊断非治疗目的的细胞荧光成像的方法，其特征在于，包括以下步骤：将细胞与含有权利要求1所述异佛尔酮衍生物和离子载体在培养基中共培养，再进行细胞成像，完成细胞荧光成像。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述离子载体为莫能霉素、***或制霉菌素。
9.权利要求1所述的异佛尔酮衍生物在检测粘度中的应用。
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