CN114099574A - 一种用于降糖的黄连提取物的提取方法和其提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物活性成分提取技术领域，具体涉及一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法和该提取物的用途。针对现有技术中缺少针对生物碱含量较高的特定黄连属植物中有效成分的提取方法优化研究的问题，本发明的技术方案是：[1]取三角叶黄连药材的干燥粉末；[2]采用数种不同极性的溶剂依次萃取步骤[1]中的干燥粉末，所述溶剂包括正丁醇；[3]收集步骤[2]中通过正丁醇萃取得到的提取液，浓缩后获得浸膏即为提取物。本发明用于提取三角叶黄连中具有降糖作用的活性成分的提取，并且该产品能够进一步用于降糖组合药物的制备。

Description

一种用于降糖的黄连提取物的提取方法和其提取物
技术领域
本发明属于药物活性成分提取技术领域，具体涉及一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法及该提取物的用途。
背景技术
毛莨科黄连属植物为多年生草本,分布于北温带。古代文献《名医别录》记载：“主治五藏冷热，久下泄澼、脓血，止消渴，大惊，除水利骨，调胃厚肠，益胆，疗口疮”。而《新修本草》记载：“黄连，蜀道者粗大，味极浓苦，疗渴为最；江东者节如连珠，疗痢大善”。可见，古代医家在长期的临床实践中，已认识到黄连具有较佳的“疗渴”效用。植物化学和药理研究表明黄连药材中的生物碱类成分是其发挥降糖作用的主要活性物质。现有技术中，少有研究基于不同基源黄连药材中生物碱类成分的含量差异。且缺少针对生物碱含量较高的特定黄连属植物中有效成分的提取方法进行优化的研究。
其中，三角叶黄连主要分布于中国四川峨眉及洪雅一带。生长于海拔1600-2200米间的山地林下，常栽培，野生的已不多见。现有技术中已报导三角叶黄连含小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱、掌叶防己碱等生物碱，可治急性结膜炎、急性细菌性痢疾、急性肠胃炎、吐血、痈疖疮疡等症。然而目前缺少关于三角叶黄连的降糖作用相关的报导。
发明内容
针对现有技术中缺少不同基源黄连药材中生物碱类成分的含量差异且缺少针对生物碱含量较高的特定黄连属植物中有效成分的提取优化研究的问题。本发明提供一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法及该提取物的用途。其目的在于：优选黄连药材的种类，并且优化提取方法，增强黄连药材提取物降糖作用。
一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法，包括如下步骤：
[1]取三角叶黄连药材的干燥粉末；
[2]采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂依次萃取步骤[1]中的干燥粉末；所述三种溶剂为具有不同极性的溶剂，这样不同的溶剂在对三角叶黄连进行萃取时，能够提取出不同的活性成分；
[3]收集步骤[2]中正丁醇部位提取液，浓缩后获得浸膏即为提取物。
优选的，三角叶黄连是毛莨科黄连属植物三角叶黄连C.deltoidea的干燥根茎；优选的，所述三角叶黄连中格兰地新的含量高于其他黄连属植物。
优选的，步骤[1]中所述干燥药粉的制备方法为：取三角叶黄连的根茎，洗净，在空气中干燥后，烘干至恒重，然后研磨成100目粉。
优选的，步骤[2]中所述石油醚的沸程为60-90。
优选的，步骤[2]中所述萃取的过程采用快速溶剂萃取仪进行。
进一步优选的，步骤[2]具体包括如下步骤：
[2-1]依次泵入快速溶剂萃取仪数种不同极性的溶剂制备不同极性的提取部位，所述溶剂包括正丁醇；
[2-2]在快速溶剂萃取仪的萃取池底部依次设置垫片和玻璃纤维滤纸，然后将样品置入萃取池，之后填充石英砂；
[2-3]开启溶剂萃取仪进行萃取。
进一步优选的，步骤[2-2]中所述加入萃取池的三角叶黄连药材的干燥粉末的质量为0.5-2.0g，所述萃取池的规格为40ml，所述加入萃取池的石英砂的量为40-60g。
进一步优选的，步骤[2-3]中，所述萃取过程中温度为90℃，压力为100bar。
进一步优选的，步骤[2-3]中，正丁醇作为萃取溶剂循环四次，第1次循环过程为升温1-2min、保持0min和释放5min，第2-4次循环过程为升温1-2min、保持2-4min和释放5min；除正丁醇之外的其他萃取溶剂各循环三次，每次循环过程为升温1-2min、保持2-4min和释放5min。
进一步优选的，步骤[2-3]中，各萃取溶剂萃取完成后溶剂冲刷时间为2min，气体冲刷时间为3min。
本发明还提供一种采用上述提取方法获得的提取物。
本发明还提供一种上述用于降糖的黄连药材活性成分的提取物在制备降糖药物组合物中的用途。
采用本发明的技术方案后，选用正丁醇对三角叶黄连进行萃取后得到的提取物。根据α-葡萄糖苷酶抑制实验的结果可知，相比于其他种类的黄连药材或用其他溶剂提取三角叶黄连得到的提取物，该提取物具有更加优异的α-葡萄糖苷酶抑制活性，因而具有更好作为降糖药物或者用于制备降糖组合药物的价值。根据超滤快筛实验和分子对接模拟的结果，三角叶黄连正丁醇部位的提取物中含有木兰花碱、格兰地新、黄连碱和小檗碱等生物碱作为潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂。尤其是格兰地新在三角叶黄连中含量显著高于其他三种黄连药材，这进一步增强了三角叶黄连正丁醇部位提取物的α-葡萄糖苷酶抑制作用。进一步的，本发明还提供了对三角叶黄连中的活性成分进行提取时的各项工艺参数的优化方案，能够进一步提高提取率，提高提取物中活性成分的含量。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明实施例中各黄连药材的石油醚和正丁醇部位提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值；
图2本发明实施例中各黄连药材的石油醚和正丁醇部位提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的抑制曲线；
图3本发明实施例的超滤色谱图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本申请的技术方案作进一步的说明。
实施例1不同黄连品种及其不同极性溶剂的提取物的提取
本实施例提取黄连(Coptis chinensis)、三角叶黄连(C.deltoidea)、峨眉野连(C.omeiensis)和云南黄连(C.teeta)四种黄连属植物中的活性成分，并分析它们的提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果。
本实施例采用的化学药品如下：
磷酸盐缓冲片和α-葡萄糖苷酶(EC:3.2.1.20)均购自西格玛奥德里奇公司。对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)和阿卡波糖来自东京化学工业有限公司。碳酸钠来自上海泰坦科技有限公司。化学标准品黄连碱、药根碱、木兰花碱、表小檗碱、格兰地新、巴马汀和非洲防己碱的化学标准购自成都克洛玛生物技术有限公司，小檗碱购自中国国家食品药品监督管理局。色谱级的乙腈和甲酸购自赛默飞科技公司。提取物制备所用的分析级有机试剂均来自成都科隆有限公司。去离子水产自密理博纯水***。
本实施例提取活性成分的具体过程如下：
(1)对4种黄连的根茎进行分离，并用清水冲洗，在空气中干燥后，放入烘箱60℃烘干至恒重，然后利用粉碎机将其磨成100目粉。最后，将这些粉末收集到相应样品名的塑封袋中，并保持干燥。
(2)称取黄连药材干燥粉末各0.5-2.0g，然后用E-916快速萃取器提取。依次泵入石油醚、乙酸乙酯和正丁醇制备三种不同极性的提取部位。先将一张玻璃纤维滤纸和一块金属垫片放入40mL萃取池底部，置入样品后，往内填充40-60g石英砂。在提取过程中，温度和压力持续设定为90℃和100bar。提取参数详见表1。
表1 E-916快速萃取仪参数设置
Figure BDA0002659596290000041
(3)萃取后，收集相应的部位，用旋转蒸发仪旋干溶剂。
四种黄连药材分别按照上述方式进行提取后，得到了四种黄连药材的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位的提取物。将石油醚和乙酸乙酯提取物分别溶于10％二甲亚砜，并配制成浓度为0.2g/mL的溶液，正丁醇提取物溶于50％甲醇，并配置成浓度为0.2g/mL的溶液。最后，将这些溶液通过孔径为0.45μm的滤膜，作为后续测试的样品溶液备用。
实施例2不同黄连品种及其不同极性溶剂的提取物的降糖活性实验
下面针对实施例1得到的各样品的降糖作用进行α-葡萄糖苷酶抑制实验。实验的具体过程为：
(1)取磷酸缓冲片一片放入200mL水中，配置成pH 7.4，浓度10mmol/L的磷酸盐缓冲液。在96孔板中加入20μL样品溶液，20μL浓度为0.3U/mL的α-糖苷酶溶液和100μL的磷酸盐缓冲液，置于37℃恒温箱中孵化15分钟后取出；
(2)添加20μL浓度为10mmol/L的PNPG溶液，再次孵化15分钟后取出；
(3)加入80μL浓度为0.2mol/L的碳酸钠溶液终止反应，放入SpectraMax iD3酶标标仪中于405nm下测定吸光度。
抑制率(％)的计算公式为：抑制率(％)＝[1-(ASG-ABAG)/(ACG-ABLG)]×100％(其中ASG为添加样品溶液和α-葡萄糖苷酶的吸光度；ABAG为不添加α-葡萄糖苷酶的样品溶液的吸光度；ACG为不添加样品溶液时α-葡萄糖苷酶的吸光度；ABLG样品溶液和α-葡萄糖苷酶均不添加时的吸光度。缺失的溶液用磷酸缓冲液替代补充)。所有分析重复三次。采用Origin 9.1软件计算半抑制浓度(IC50)并绘制抑制曲线。
各样品半抑制浓度(IC50)如图1所示，抑制曲线如图2所示。乙酸乙酯部位由于没有抑制活性，因而图中并未示出。通过比较其他两种部位的IC50值，发现石油醚部位四种黄连提取物的IC50值约为正丁醇部位的2-7倍。因此，可确定正丁醇馏分对于α-葡萄糖苷酶的抑制作用最强，可作为高活性萃取部位。
阿卡波糖是现有技术中一种有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，IC50值为4.24±0.04mg/mL(见图2)。虽然阿卡波糖比黄连各正丁醇提取物表现出更好的抑制活性，但其最大抑制率低于90％，而四种黄连正丁醇提取物均高于95％。可见，阿卡波糖与因此，从三角叶黄连的正丁醇部位中找寻潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂是有意义的。三角叶黄连的正丁醇部位的提取物用于与其他活性物质共同制成降糖药物组合物也是有价值的。
进一步观察四种黄连降糖活性最好的正丁醇部位提取物，从四种黄连的抑制率曲线发现三角叶黄连正丁醇部位提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高，其次是黄连、云南黄连和峨眉野连，它们的IC50值分别为24.95±2.14、28.24±0.12、28.64±0.21和29.11±0.02mg/mL。
由此可见，通过实施例1制备的四种黄连药材的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位的提取物中，三角叶黄连的正丁醇部位的提取物具有最高的抑制活性。
实施例3三角叶黄连中对降糖具有活性的成分及其含量的鉴别
为了进一步识别实施例1的提取物中抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分，下面进行超滤快筛实验。实验的具体过程为：
(1)超滤样品液制备：将三角叶黄连正丁醇部位提取物制成的样品溶液稀释至6mg/mL，混合样品液备用。
(2)取1U/mL的α-葡萄糖苷酶100μL与等体积的混合样品液混合作为实验组。37℃孵育30min后，转移至30kDa的超滤管中，10000g下离心10min。然后加入200μL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，10000g下离心10min，洗去未结合的化合物，该操作重复两次。得到配体-酶复合物。
(3)接着在配体-酶复合物中加入200μL甲醇-水(50:50,v/v,pH＝3.30)，静置10min后，于10000g下离心10min，重复2次。最后收集洗脱液进行UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。以变性酶代替活性酶与样品液反应作为空白对照组。变性酶的制备过程为：将1U/mL的α-葡萄糖苷酶放入60℃干式恒温器中3min，即可得到失活酶。
上述实验重复三次。
得到的超滤色谱图如图3所示，其中实线(实验组)代表与酶发生特异性结合的化合物，虚线为空白对照组用以监测与酶发生非特异性结合的化合物。以实验组的峰面积高于空白对照组的峰面积为筛选标准，来识别潜在活性抑制剂。
由图可知8个峰显示了差异，并将其作为潜在的抑制剂，这些化合物全部属于生物碱类化合物，分别为木兰花碱、格兰地新、药根碱、表小檗碱、非洲防己碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱。已有前人的研究，通过离线超滤技术，从黄连中筛选出药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱作为α-葡萄糖苷酶抑制剂。在本研究中，首次从三角叶黄连中筛选出了木兰花碱、格兰地新和非洲防己碱也可作为潜在抑制剂。其中，格兰地新在三角叶黄连中含量显著高于其他三种黄连药材。即，本发明方法得到的提取物中，三角叶黄连中具有降糖活性的成分种类更多且部分成分(格兰地新)的含量更高，这进一步证明了本发明提取方法提取得到的提取物具有更高的降糖活性。
通过上述实验可以推知，本实施例提供的三角叶黄连正丁醇部位的提取物由于生物碱类化合物种类丰富且含量高，因而能够作为潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂。尤其是格兰地新在三角叶黄连中含量显著高于其他三种黄连药材，这进一步增强了三角叶黄连正丁醇部位的提取物更好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。

Claims (10)

1.一种用于降糖的黄连提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
[1]取三角叶黄连药材的干燥粉末；
[2]采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂依次萃取步骤[1]中的干燥粉末；
[3]收集步骤[2]中正丁醇萃取部位提取液，浓缩后获得浸膏即为提取物。
2.按照权利要求1所述的一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法，其特征在于：所述三角叶黄连是毛莨科黄连属植物三角叶黄连C.deltoidea的干燥根茎；优选的，所述三角叶黄连中格兰地新的含量高于其他黄连属植物。
3.按照权利要求1或2所述的一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法，其特征在于，步骤[1]中所述干燥药粉的制备方法为：取三角叶黄连的根茎，洗净，在空气中干燥后，烘干至恒重，然后研磨成100目粉。
4.按照权利要求1所述的一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法，其特征在于，步骤[2]中所述石油醚的沸程为60-90。
5.按照权利要求1或4所述的一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法，其特征在于：步骤[2]中所述萃取的过程采用快速溶剂萃取仪进行。
6.按照权利要求4所述的一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法，其特征在于，步骤[2]具体包括如下步骤：
[2-1]依次泵入快速溶剂萃取仪数种不同极性的溶剂制备不同极性的提取部位，所述溶剂包括正丁醇；
[2-2]在快速溶剂萃取仪的萃取池底部依次设置垫片和玻璃纤维滤纸，然后将样品置入萃取池，之后填充石英砂；
[2-3]开启溶剂萃取仪进行萃取；
优选的，步骤[2-3]中，正丁醇作为萃取溶剂循环四次，第1次循环过程为升温1-2min、保持0min和释放5min，第2-4次循环过程为升温1-2min、保持2-4min和释放5min；除正丁醇之外的其他萃取溶剂各循环三次，每次循环过程为升温1-2min、保持2-4min和释放5min；各萃取溶剂萃取完成后溶剂冲刷时间为2min，气体冲刷时间为3min。
7.按照权利要求6所述的一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法，其特征在于：步骤[2-2]中所述加入萃取池的三角叶黄连药材的干燥粉末的质量为0.5-2.0g，所述萃取池的规格为40ml，所述加入萃取池的石英砂的量为40-60g。
8.按照权利要求6所述的一种用于降糖的黄连药材活性成分的提取方法，其特征在于：步骤[2-3]中，所述萃取过程中温度为90℃，压力为100bar。
9.一种采用如权利要求1～8任意一项所述提取方法制备得到的提取物。
10.如权利要求9所述的提取物在制备降糖药物中的用途。
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