CN114099464A - 一种治疗白血病的靶向纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种治疗白血病的靶向纳米粒子及其制备方法与应用，将ABT‑199包覆在纳米载体PEG‑b‑PTMC上，形成了PEG‑b‑PTMC@ABT‑199纳米粒子，具有良好的分散性和包封率、良好的ABT‑199释放能力和较高的载药率，mPEG‑b‑PTMC@ABT‑199(PEG‑ABT)纳米颗粒来选择性地靶向线粒体膜，比纯ABT‑199具有显著的抗白血病能力，PEG‑b‑PTMC@ABT‑199纳米粒有望通过线粒体靶向递送ABT‑199治疗白血病，减少化疗药物对体内细胞毒性和副作用，可提高细胞对ABT‑199的摄取，延长ABT‑199的滞留时间，同时可促进线粒体膜电位的崩溃，从而增强ABT‑199的促凋亡诱导作用，提高抗白血病能力。

Description

一种治疗白血病的靶向纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种治疗白血病的靶向纳米粒子及其制备方法与应用。
背景技术
聚碳酸三亚甲酯(PTMC)是一种疏水性聚酯，因其良好的生物相容性和生物降解性而被广泛应用于生物医学领域。聚乙二醇(PEG)是一种亲水性聚酯，通过促进组织分布和药代动力学，是无毒、生物相容性和非免疫原性材料。PTMC及其与PEG的嵌段共聚物在水中稳定，但在接近人体温度的熔融温度下可在体内降解。因此，这些独特的特性推动了PTMC-PEG聚合物作为药物载体的发展。
Bcl-2(B-celllymphoma-2)蛋白具有抑制细胞凋亡的效果，其与肿瘤的发生和发展具有重要的关联，很多研究均已证明其作用机制。在治疗方面，Bcl-2蛋白也是一个非常热门的肿瘤抑制靶点，已有很多针对性的先导药物化合物被开发出来。其中ABT-199就是AbbVie研发的一种Bcl-2抑制剂，目前已进入了临床试验阶段，其I期试验入组84例复发型/难治型CLL/SLL患者和44例复发型/难治型非霍奇金淋巴瘤患者，经过ABT-199治疗，CLL/SLL的应答率为79％，其中完全应答率为22％，中位持续应答时间为20.5个月；针对非霍奇金淋巴瘤的应答率为48％，其中完全应答率为7.5％。ABT-199的疗效能够obinutuzumab、idelalisib、ibrutinib等新的抗肿瘤药物媲美，有望成为第一个上市的Bcl-2抑制剂，目前ABT-199正在进行III期临床研究。但是ABT-199的水溶性非常差。此外，作为Bcl-2抑制剂，还存在一定的毒副作用，这些问题都严重的阻碍了它的进一步开发和应用。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种治疗白血病的靶向纳米粒子及其制备方法与应用，实现药物递送，减少化疗药物对体内细胞毒性和副作用。
本发明采用的技术解决方案是：一种治疗白血病的靶向纳米粒子,所述的纳米粒子由两亲性聚合物mPEG-b-PTMC通过自组装包裹化疗药物组成。
所述的靶向纳米粒子靶向线粒体膜。
所述的化疗药物为BCL2抑制剂ABT-199。
一种所述的治疗白血病的靶向纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)mPEG-b-PTMC两嵌段共聚物的制备：将2-6g甲氧基聚乙二醇(MPEG)、三亚甲基碳酸酯(TMC)2-8g和5-7mg异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)在氮气保护下，加入到30-70mL安瓿瓶中，然后将上述混合物在130℃的条件下反应24-48h，粗品溶解于二氯甲烷中，用正己烷沉淀3次，除去未反应的单体，在室温下真空干燥24小时，得到的mPEG-b-PTMC两嵌段共聚物；
(2)PEG-b-PTMC纳米粒子的制备：将5-15mg的mPEG-b-PTMC两嵌段共聚物溶解在0.8-1.2mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后将混合溶液滴加到3-5mL的H2O中，剧烈搅拌，用透析膜对去离子水进行透析48-72h以去除二甲基亚砜(DMSO)，得到PEG-b-PTMC纳米粒子；
(3)PEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子的制备：将得到的PEG-b-PTMC纳米粒子和0.5-1.5mg ABT-199，混合滴加到3-5mL H2O中，猛烈搅拌，自组装得到PEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子。
所述的步骤(1)中甲氧基聚乙二醇的Mn＝5000。
所述的步骤(2)中透析所用的透析膜的截留分子量为3500。
一种所述的靶向纳米粒子在制备治疗白血病靶向药物上的应用。
所述的治疗白血病靶向药物靶向线粒体膜。
一种两亲性聚合物mPEG-b-PTMC在制备增强ABT-199抗白血病治效果的化疗药物上的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种治疗白血病的靶向纳米粒子及其制备方法与应用，将ABT-199包覆在纳米载体PEG-b-PTMC上，形成了PEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子，具有良好的分散性和包封率、良好的ABT-199释放能力和较高的载药率，mPEG-b-PTMC@ABT-199(PEG-ABT)纳米颗粒来选择性地靶向线粒体膜，比纯ABT-199具有显著的抗白血病能力，mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒有望通过线粒体靶向递送ABT-199治疗白血病，减少化疗药物对体内细胞毒性和副作用，可提高细胞对ABT-199的摄取，延长ABT-199的滞留时间，同时可改善线粒体膜电位的崩溃，从而增强ABT-199的促凋亡诱导作用，提高抗白血病能力。
附图说明
图1为mPEG-b-PTMC聚合物的合成路线图。
图2为聚合物mPEG-b-PTMC17的核磁共振氢谱图。
图3为聚合物mPEG-b-PTMC36的核磁共振氢谱图。
图4为聚合物mPEG-b-PTMC80的核磁共振氢谱图。
图5为聚合物mPEG-b-PTMC169的核磁共振氢谱图。
图6为mPEG和mPEG-b-PTMC嵌段聚合物的凝胶渗透色谱(GPC)图
图7为mPEG和mPEG-b-PTMC嵌段聚合物的傅立叶变换红外光谱图。
图8为mPEG-b-PTMC17、mPEG-b-PTMC36、mPEG-b-PTMC80、mPEG-b-PTMC169纳米粒子粒径图。
图9为mPEG-b-PTMC169和mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子粒径图。
图10为mPEG-b-PTMC和mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米颗粒的zeta电位图。
图11为mPEG-b-PTMC纳米粒子的透射电镜图。
图12为mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子的透射电镜图。
图13为mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米颗粒在PBS中的流体力学直径变化(PH＝7.4)。
图14为mPEG-b-PTMC、mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子在水中的吸收光谱，ABT-199在DMSO中的吸收光谱。
图15为不同浓度(1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、、100μg/mL)的ABT-199在DMSO中的吸收光谱。
图16为mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米颗粒在体外释放ABT-199的研究。
图17为ABT-199和PEG-ABT在不同浓度MV4-11和MOLM-13细胞作用48h后的IC50。
图18为PEG、ABT-199、PEG-ABT白血病细胞作用48小时，流式细胞仪检测代表凋亡的Annexin V+细胞图。
图19为PEG、ABT-199、PEG-ABT与MV4-11和MOLM-13细胞作用48小时后的细胞的集落数量图。
图20为PEG、ABT-199、PEG-ABT处理后的的骨髓母细胞第2、4、6天计数活细胞数量图。
图21为PEG、ABT-199、PEG-ABT处理的骨髓母细胞中后的集落数据图。
图22为流式检测ABT-199、PEG-ABT、PEG处理后的白血病细胞的GFP+细胞。
图23为BM细胞旋体的Wright-Giemsa染色实验图。
图24为PEG、ABT-199、PEG-ABT治疗后的肝脏重量和脾重。
图25为PEG、ABT-199、PEG-ABT治疗后的脾脏HE染色图及存活率(OS)图。
图26为PEG、ABT-199、PEG-ABT与MV4-11和Molm-13作用后检测MMP。
图27为PEG、ABT-199和PEG-ABT处理GFP+细胞后的半胱氨酸蛋白酶-3活性图。
图28为PEG、ABT-199和PEG-ABT对HSPC细胞的毒性图。
图29为PEG、ABT-199和PEG-ABT处理小鼠后的体重图及WBC、RBC和PLT指标。
图30为PEG、ABT-199和PEG-ABT处理后的小鼠骨髓细胞总数。
图31为本发明机理示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：在氮气保护下，将4g甲氧基聚乙二醇(MPEG)、三亚甲基碳酸酯(TMC)2g和6.48mg异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)加入50mL干安瓿瓶中。然后将上述混合物在130℃的温度下反应24h，粗品溶解于二甲基甲烷中，用正己烷沉淀3次，除去未反应的单体。室温下真空干燥24小时，得到mPEG-b-PTMC17两嵌段共聚物，分子量(Mn)为6735。用1HNMR谱表征了mPEG-b-PTMC17两嵌段共聚物(图2)。
实施例2：在氮气保护下，将4g甲氧基聚乙二醇(MPEG)、三亚甲基碳酸酯(TMC)4g和6.48mg异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)加入50mL干安瓿瓶中。然后将上述混合物在130℃的温度下反应24h，粗品溶解于二甲基甲烷中，用正己烷沉淀3次，除去未反应的单体，室温下真空干燥24小时，得到mPEG-b-PTMC36两嵌段共聚物，分子量(Mn)为8675。用1HNMR谱表征了mPEG-b-PTMC36两嵌段共聚物(图3)。
实施例3：在氮气保护下，将4g甲氧基聚乙二醇(MPEG)、三亚甲基碳酸酯(TMC)6g和6.48mg异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)加入50mL干安瓿瓶中。然后将上述混合物在130℃的温度下反应24h，粗品溶解于二甲基甲烷中，用正己烷沉淀3次，除去未反应的单体。室温下真空干燥24小时，得到mPEG-b-PTMC80两嵌段共聚物，分子量(Mn)为13167。用1HNMR谱表征了mPEG-b-PTMC80两嵌段共聚物(图4)。
实施例4：在氮气保护下，将4g甲氧基聚乙二醇(MPEG)、三亚甲基碳酸酯(TMC)8g和6.48mg异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)加入50mL干安瓿瓶中。然后将上述混合物在130℃的温度下反应24h，粗品溶解于二甲基甲烷中，用正己烷沉淀3次，除去未反应的单体。室温下真空干燥24小时，得到mPEG-b-PTMC169两嵌段共聚物，分子量(Mn)为22253。用1HNMR谱表征了mPEG-b-PTMC169两嵌段共聚物(图5)。
实施例5：将实施例1-4中的聚合物样品，进行傅立叶变换红外光谱仪的测试，测试结果如图7所示。此外，我们对实施例1中的聚合物样品进行了凝胶渗透色谱(GPC)测试，所得结果如图6所示。实施例1-4中的聚合物样品，进行形貌和尺寸测试，所得结果如图8所示。其中mPEG-b-PTMC169直径约为145nm，具有合适的流体力学直径，可用于包埋抗癌药物ABT-199。
实施例6：将mPEG-b-PTMC169两嵌段共聚物与疏水药物(ABT-199)共组装制备了mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子。根据DLS数据(图9)，mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子的流体力学直径从145.0nm(PDI＝0.295)增加到169.5nm(PDI＝0.101)，表明mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子包覆成功。
实施例7：本发明对mPEG-b-PTMC169纳米颗粒和mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米颗粒进行了Zeta电位检测。如图10所示，mPEG-b-PTMC169纳米颗粒的zeta电位为-16.1mV，而mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米颗粒的Zeta电位为-10.5mV。Zeta电位的提高可能归功于正电荷ABT-199的成功包裹。
实施例8：用透射电子显微镜(TEM)对mPEG-b-PTMC169纳米粒子和mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米粒子的形貌进行了表征。mPEG-b-PTMC169纳米颗粒和mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米颗粒均呈球形(图11-12)。透射电镜图像显示mPEG-b-PTMC纳米粒子和mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米粒子的平均粒径分别为61.0nm和117.2nm，这是由于纳米粒子在干燥状态下的收缩和塌陷所致。
实施例9：对mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米粒子在PBS(pH＝7.4)中室温下14天的直径进行检测。如图13所示，mPEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子的流体力学直径无明显变化。
实施例10：对小分子ABT-199在二甲基亚砜、mPEG-b-PTMC169纳米粒子和mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米粒子中的紫外-可见吸收光谱进行了表征。如图14所示，与纯ABT-199相比，由于ABT-199在mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米粒子中的聚集，mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米粒子在425nm处出现了宽吸收峰。这一现象也证实了ABT-199的成功封装。
实施例11：用紫外-可见分光光度计测定了mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米粒中ABT-199的载药量和包封率。测定了不同浓度(1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)ABT-199在二甲亚砜中的吸收光谱。如图15所示，随着ABT-199浓度的增加，425nm处的吸光度逐渐增加。
实施例12：将mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米粒与脂肪酶孵育24h后，通过0.45μmPVDF滤膜去除游离ABT-199药物。如图16所示，无脂肪酶孵育的mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米粒的ABT-199释放率为39.85±1.31％。而脂肪酶孵育的mPEG-b-PTMC169@ABT-199纳米粒的ABT-199释放率为60.04±1.28％。
实施例13：将ABT-199和PEG-ABT与MV4-11和MOLM-13细胞作用48h后测定IC50。如图17所示，与纯ABT-199相比，PEG-ABT显著降低了MV4-11和MOLM-13细胞的IC50。
实施例14：将ABT-199和PEG-ABT与MV4-11和MOLM-13细胞作用48小时后，如图17所示，与纯ABT-199相比，PEG-ABT显著降低了MV4-11和MOLM-13细胞的IC50。
实施例15：将ABT-199和PEG-ABT与白血病细胞作用48小时，流式细胞仪检测代表凋亡的Annexin V+细胞。如图18所示，PEG-ABT组的凋亡细胞数是单纯ABT-199组的2倍以上。聚乙二醇处理的细胞没有发现明显的凋亡细胞，这表明聚乙二醇作为载体对白血病细胞几乎没有毒性作用。
实施例16：将PEG、ABT-199、PEG-ABT与MV4-11和MOLM-13细胞作用48小时后，如图19所示，PEG-ABT处理的细胞的集落数量减少了2倍以上。
实施例17：将PEG、ABT-199、PEG-ABT处理的骨髓母细胞(2×104/ml)接种于完全培养基中，分别于第2、4、6天计数活细胞数。如图20所示，与未经处理的细胞相比，单纯的ABT-199和PEG-ABT显著减少了细胞数量，而PEG-ABT处理的原始细胞比单纯ABT-199处理的原始细胞活性更低。
实施例18：将PEG、ABT-199、PEG-ABT处理的骨髓母细胞中，计数集落形成。如图21所示，与未经处理的细胞相比，纯ABT-199和PEG-ABT分别显著减少了集落数量。PEG-ABT处理导致在所有三个原代母细胞中的集落数均少于ABT-199处理。
实施例19：将PEG、ABT-199、PEG-ABT治疗MLL-AF9转导的小鼠白血病，首次检测到代表白血病细胞的BM GFP+细胞。如图22所示，纯ABT-199和PEG-ABT处理后的小鼠都比未处理的小鼠的GFP+细胞有减少；然而，在AML小鼠中，PEG-ABT处理比纯ABT-199减少了一半的GFP+细胞。
实施例20：如图23所示，BM细胞旋体的Wright-Giemsa染色实验中，纯ABT-199和PEG-ABT组均比未处理的小鼠白血病细胞有减少。然而，与纯ABT-199相比，PEG-ABT显著减少了白血病原始细胞。
实施例21：如图24所示，PEG-ABT治疗导致脾重比单纯ABT-199治疗减轻约40％。此外，PEG-ABT治疗导致肝脏重量比单纯ABT-199治疗减轻约30％。
实施例22：如图25所示，在对照组和PEG处理组小鼠中，HE染色发现白血病细胞的浸润几乎破坏了脾脏的正常结构。然而，ABT-199和PEG-ABT部分恢复了脾脏的破坏结构。与纯ABT-199相比，PEG-ABT治疗的小鼠脾脏中的白血病母细胞浸润较少。最后，尽管纯ABT-199和PEG-ABT都延长了总存活率(OS)，但PEG-ABT治疗的小鼠比纯ABT-199治疗的小鼠有更长的存活率。
实施例23：如图26所示，通过测量代表MMP的JC-1探针，PEG-ABT处理导致了比纯ABT-199更强的MMP崩塌。相反，对照组和PEG处理的细胞显示正常的MMP。此外，用PEG-ABT处理比单纯ABT-199处理会导致半胱氨酸蛋白酶-3更强的激活。
实施例24：如图27所示，进一步用空白对照、PEG、ABT-199和PEG-ABT处理MLL-AF9转化的小鼠白血病GFP+细胞，对照组和PEG处理均未引起MMP的崩解。相比之下，在小鼠白血病细胞中，PEG-ABT处理导致比纯ABT-199更强的MMP崩塌。此外，与纯ABT-199相比，PEG-ABT处理的小鼠白血病细胞中半胱氨酸蛋白酶-3会有更强的裂解。
实施例25：如图28所示，为了排除纳米载体或PEG-ABT对正常HSPC产生严重毒性作用的可能性，从健康志愿者中分离出CD34+细胞，分别与不同浓度的PEG、ABT-199或PEG-ABT孵育24和48h，根据药物/载体比～6.1％(w/w)设定PEG浓度。PEG、ABT-199和PEG-ABT没有显著降低正常CD34+细胞的细胞活力。
实施例26：如图29所示，在PEG、ABT-199和PEG-ABT治疗后，每周测量小鼠的体重共四次。与对照组相比，PEG、ABT-199或PEG-ABT治疗组小鼠的体重没有明显下降。测量PEG、ABT-199和PEG-ABT治疗后最后一周的白细胞、红细胞和血小板总数。与空白对照组相比，PEG、ABT-199和PEG-ABT治疗并未显著降低WBC、RBC和PLT。
实施例27：如图30所示，处死小鼠后计数骨髓细胞。与对照组相比，PEG、ABT-199或PEG-ABT处理组小鼠的骨髓细胞总数没有显著变化，表明纳米载体和纳米ABT-199对正常HSPC的毒性很小。
结论
(1)与纯ABT-199相比，PEG-ABT在体外和体内的抗白血病能力显著提高。
(2)与纯ABT-199相比，PEG和PEG-ABT对正常HSPC(小鼠造血干细胞)的毒性作用较小。
(3)与纯ABT-199相比，PEG-ABT可靶向线粒体膜，与线粒体通过静电相互作用有效结合，导致线粒体膜崩解，最终比纯ABT-199更大程度地启动细胞凋亡过程。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种治疗白血病的靶向纳米粒子,其特征在于,所述的纳米粒子由两亲性聚合物mPEG-b-PTMC通过自组装包裹化疗药物组成。
2.根据权利要求1所述的一种治疗白血病的靶向纳米粒子，其特征在于，所述的靶向纳米粒子靶向线粒体膜。
3.根据权利要求1所述的一种治疗白血病的靶向纳米粒子，其特征在于，所述的化疗药物为BCL2抑制剂ABT-199。
4.一种权利要求1所述的治疗白血病的靶向纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)mPEG-b-PTMC两嵌段共聚物的制备：将2-6g甲氧基聚乙二醇(mPEG)、2-8g三亚甲基碳酸酯(TMC)和5-7mg异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)在氮气保护下，加入到30-70mL安瓿瓶中，然后将上述混合物在130℃的条件下反应24-48h，粗品溶解于二氯甲烷中，用正己烷沉淀3次，除去未反应的单体，在室温下真空干燥24小时，得到的mPEG-b-PTMC两嵌段共聚物；
(2)PEG-b-PTMC纳米粒子的制备：将5-15mg的mPEG-b-PTMC两嵌段共聚物溶解在0.8-1.2mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后将混合溶液滴加到3-5mL的H2O中，剧烈搅拌，用透析膜对去离子水进行透析48-72h以去除二甲基亚砜(DMSO)，得到PEG-b-PTMC纳米粒子；
(3)PEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子的制备：将得到的PEG-b-PTMC纳米粒子和0.5-1.5mgABT-199，混合滴加到3-5mL H2O中，猛烈搅拌，自组装得到PEG-b-PTMC@ABT-199纳米粒子。
5.根据权利要求1所述的治疗白血病的靶向纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中甲氧基聚乙二醇的Mn＝5000。
6.根据权利要求1所述的治疗白血病的靶向纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中透析所用的透析膜的截留分子量为3500。
7.一种权利要求1所述的靶向纳米粒子在制备治疗白血病靶向药物上的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的治疗白血病靶向药物靶向线粒体膜。
9.一种两亲性聚合物mPEG-b-PTMC在制备增强ABT-199抗白血病治效果的化疗药物上的应用。
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