CN114096559A - 工程化iga抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含修饰的IgA重链恒定区的工程化抗体、药物组合物及使用方法。本文描述的工程化抗体包含IgA结构域的恒定区中的一个或更多个氨基酸取代或缺失。本文还提供了通过施用本文描述的工程化IgA抗体来治疗紊乱包括癌症的方法。

Description

工程化IGA抗体及其使用方法
交叉引用
本申请要求2019年3月27日提交的美国临时申请第62/824,864号的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
本公开内容背景
靶向肿瘤抗原的IgG同种型(isotype)单克隆抗体已被证明对治疗各种癌症有效。多年来，越来越多的靶向不同肿瘤抗原的单克隆抗体已被批准用于癌症治疗。然而，它们的临床疗效和副作用，特别是作为单一疗法时，仍有不足。因此，开发具有增加的临床疗效、新型靶向方式或作用模式和/或降低的副作用数量和严重程度的新抗体疗法是令人感兴趣的。
本公开内容概述
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：抗原结合结构域；和恒定结构域，其中恒定结构域包含免疫球蛋白A(IgA)重链恒定区，其中IgA重链恒定区包含IgA CH2区和IgA CH3区，其中，IgA重链恒定区与对应的野生型(WT)IgA重链恒定区相比包含至少两个天然存在的糖基化位点的修饰，并且其中至少两个天然存在的糖基化位点中的每一个位于IgA CH2区或IgA CH3区。
在一些实施方案中，至少两个天然存在的糖基化位点是两个天然存在的N-连接的糖基化位点。在一些实施方案中，本文公开的工程化抗体中的至少两个天然存在的糖基化位点中的一个或更多个与对应的野生型IgA相比包含被修饰的天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰包括至少两个天然存在的糖基化位点中的一个或两个的氨基酸取代或氨基酸缺失。在一些实施方案中，氨基酸取代是非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含以下处的氨基酸取代：i.N114和N135，ii.N114和N15.2，或iii.N135和N15.2，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的对应的WT IgA重链恒定区包含：i.N114T氨基酸取代和N135Q氨基酸取代，ii.N114T氨基酸取代和来自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，或iii.N135Q氨基酸取代和来自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少三个天然存在的糖基化位点的修饰。在一些实施方案中，至少三个天然存在的糖基化位点是三个N-连接的糖基化位点。在一些实施方案中，本文描述的抗体中的三个天然存在的糖基化位点各自包含被修饰的天冬酰胺(N)氨基酸残基。
在一些实施方案中，修饰是氨基酸取代或氨基酸缺失。在一些实施方案中，氨基酸取代是非保守取代。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含以下处的氨基酸取代：N114、N135和N15.2，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含：i.N114T氨基酸取代，ii.N135Q氨基酸取代，和iii.选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA重链恒定区还包含IgA CH1区。在一些实施方案中，重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含以下：IgA CH2区中至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的修饰、IgA CH3区中至少一个天然存在的糖基化位点的修饰和IgA CH1区内至少一个天然存在的糖基化位点的修饰。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含以下处的氨基酸取代：i.N45.2、N114和N135，或ii.N45.2、N15.2和N135，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WTIgA重链恒定区包含：i.N45.2G氨基酸取代、N114T氨基酸取代和N135Q氨基酸取代；或ii.N45.2G氨基酸取代、N135Q氨基酸取代和选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含以下：IgA CH2区中至少两个天然存在的N-连接的糖基化位点的修饰和IgA CH1区内至少一个天然存在的糖基化位点的修饰。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含以下处的氨基酸取代：i.N45.2、N114和N15.2G，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，本文描述的IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含：i.N45.2G氨基酸取代，ii.N114T氨基酸取代，和iii.选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出更长的循环半衰期。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的聚集。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与包含IgG重链恒定区的可比抗体相比诱导增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出增加的热稳定性。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的糖基化。
在一些实施方案中，IgA重链恒定区与对应的WT IgA抗体相比表现出以增加的亲和力与免疫效应细胞上表达的FcαR结合。在一些实施方案中，IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少四个天然存在的糖基化位点的修饰。在一些实施方案中，至少四个天然存在的糖基化位点是四个天然存在的N-连接的糖基化位点。在一些实施方案中，至少四个天然存在的糖基化位点各自包含天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基。在一些实施方案中，重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含以下：IgA CH2区内至少两个天然存在的N-连接的糖基化位点的修饰、IgA CH3区内至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的修饰和IgACH1区内至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的修饰。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含以下氨基酸残基处的氨基酸取代：N45.2、N114、N135和N15.2，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA重链恒定区包含以下氨基酸残基处的非保守氨基酸取代：N45.2、N114、N135和N15.2，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WTIgA重链恒定区包含：i.N45.2G氨基酸取代，ii.N114T氨基酸取代，iii.N135Q氨基酸取代，和iv选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与包含至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的对应的IgA抗体相比表现出更长的循环半衰期。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与包含IgG CH2结构域和IgG CH3结构域的对应的可比抗体相比诱导增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与包含至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的对应的IgA抗体相比表现出增加的热稳定性。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与包含至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的对应的IgA抗体相比表现出减少的糖基化。在一些实施方案中，IgA重链恒定区与包含至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的对应的IgA抗体相比表现出以增加的亲和力与免疫效应细胞上表达的FcαR结合。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的修饰。在一些实施方案中，修饰是至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的氨基酸取代或氨基酸缺失。在一些实施方案中，氨基酸取代是至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个天然存在的半胱氨酸氨基酸残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的C147或C86，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C86S氨基酸取代，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C147的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体或其功能性片段相比表现出减少的聚集。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA构建体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少两个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的修饰。在一些实施方案中，修饰包括至少两个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基中的一个或两个的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰包括至少两个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基中的一个或两个的缺失。
在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含至少两个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基中的一个的氨基酸取代，以及至少两个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基中的一个的缺失。在一些实施方案中，至少两个天然存在的半胱氨酸氨基酸残基相对于包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的是C147和C86，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C147的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C86的氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含天然存在的C86氨基酸残基的氨基酸取代以及天然存在的C147氨基酸残基的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C86S氨基酸取代，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的聚集。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基的修饰。在一些实施方案中，修饰是至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基的氨基酸取代或缺失。在一些实施方案中，氨基酸取代是与WT IgA抗体相比至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基的非保守氨基酸突变。在一些实施方案中，至少一个酪氨酸残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的Y148，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，氨基酸Y148相对于包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区被缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的聚集。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA重链恒定区与对应的野生型IgA抗体相比包含至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的修饰。在一些实施方案中，修饰与对应的野生型IgA抗体相比包括至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的氨基酸取代或缺失。在一些实施方案中，氨基酸取代是至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个天然存在的苏氨酸氨基酸残基是相对于包含SEQID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的T116或T16，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的聚集。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。在一些实施方案中，IgA重链恒定区与对应的野生型IgA抗体相比包含至少两个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的修饰。在一些实施方案中，修饰包括至少两个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基中的一个或两个的氨基酸取代或缺失。在一些实施方案中，氨基酸取代是至少两个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基中的一个或两个的非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，至少两个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的T116或T16，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含T116S氨基酸取代，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含T16S氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的修饰。在一些实施方案中，修饰包括至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的氨基酸取代或缺失。在一些实施方案中，氨基酸取代包括至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个天然存在的异亮氨酸(I)残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的I115，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含I115L氨基酸取代，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区与对应的野生型IgA抗体相比包含至少一个天然存在的亮氨酸(L)氨基酸残基的修饰。在一些实施方案中，修饰包括至少一个天然存在的亮氨酸(L)氨基酸残基的氨基酸取代或缺失。在一些实施方案中，氨基酸取代是至少一个天然存在的亮氨酸(L)氨基酸残基的非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个天然存在的亮氨酸(L)残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的L15.3，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含L15.3I氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的修饰。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的氨基酸取代或缺失。在一些实施方案中，氨基酸取代是至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个天然存在的脯氨酸(P)残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的P124，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含P124R氨基酸取代，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出更大的稳定性。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出重链与轻链之间更大的稳定性。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段具有重链与轻链之间的共价连接。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段包含重链的半胱氨酸(C)氨基酸残基与轻链的半胱氨酸(C)氨基酸残基之间的二硫键。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文描述的抗体包含同种异型(allotype)IgA2m(1)抗体或IgA2m(2)的修饰的IgA的重链区。在一些实施方案中，抗体是同种异型高加索人(Caucasian)IgA2m(1)抗体。在一些实施方案中，IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含C末端IgA尾段(tail piece)的修饰。在一些实施方案中，修饰包括C末端25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、12个、10个、8个、6个、4个或2个氨基酸的缺失。在一些实施方案中，修饰包括C末端18个氨基酸的缺失。在一些实施方案中，修饰包括相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的C末端氨基酸残基131-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C末端氨基酸残基P131-Y148的缺失，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA重链恒定区包含IgA1恒定区，所述IgA1恒定区包含IgA1 CH2区和IgA1 CH3区。在一些实施方案中，IgA1恒定区还包含IgA1 CH1区。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含IgA2恒定区，所述IgA2恒定区包含IgA2 CH2区和IgA2 CH3区。在一些实施方案中，IgA2恒定区还包含IgA2 CH1区。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段表现出在对应的抗体的循环半衰期的1％、5％、10％、20％或30％内的循环半衰期，所述对应的抗体包含抗原结合结构域和包含IgG CH2区和IgG CH3区的IgA重链恒定区。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：抗原结合结构域；和恒定结构域，其中恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区；其中IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含N135Q氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区还包含以下：N45.2G氨基酸取代、N114T氨基酸取代、I115L氨基酸取代、T116S氨基酸取代和选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区还包含以下：C86S氨基酸取代、P124R氨基酸取代、C147的缺失、Y148的缺失、L15.3I氨基酸取代、T16S氨基酸取代或其组合，根据IMGT方案编号。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：抗原结合结构域；和恒定结构域，其中恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH2区和IgA2 CH3区，并且其中IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含以下：C86S氨基酸取代、N114T氨基酸取代、I115L氨基酸取代、T116S氨基酸取代和N135Q氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：抗原结合结构域；和恒定结构域，其中恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA CH3区，并且其中IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含以下：N45.2G氨基酸取代、C86S氨基酸取代、N114T氨基酸取代、I115L氨基酸取代、T116S氨基酸取代、N135Q氨基酸取代、C147的缺失和Y148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA2重链恒定区包含与SEQ ID NO:16至少95％相同的氨基酸序列。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：抗原结合结构域；和恒定结构域，其中恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区，并且其中IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含以下：N45.2G氨基酸取代、C86S氨基酸取代、N114T氨基酸取代、I115L氨基酸取代、T116S氨基酸取代和C末端尾段的缺失，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，C末端尾段的缺失包括相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的C末端氨基酸残基P131-Y148的缺失，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的IgA2重链恒定区包含与SEQ ID NO:17至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的氨基酸序列。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：抗原结合结构域；和恒定结构域，其中恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区；其中IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含：N45.2G氨基酸取代、N114T氨基酸取代、I115L氨基酸取代、T116S氨基酸取代、N135Q氨基酸取代，选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代、L15.3I氨基酸取代以及T16S氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：抗原结合结构域；和恒定结构域，其中恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区，并且其中IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含：N45.2G氨基酸取代、N114T氨基酸取代、I115L氨基酸取代、T116S氨基酸取代、选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，L15.3I氨基酸取代、T16S氨基酸取代和C末端氨基酸P131-Y148的缺失，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其功能性片段相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含：C86S氨基酸取代、P124R氨基酸取代、C147的缺失、Y148的缺失或其组合，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA2重链恒定区包含与选自SEQ ID NO:18-21中的任一个的序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段是非糖基化的。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的IgA相比具有增加的循环半衰期，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2、L15.3、T16或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其功能性片段与包含IgG重链恒定结构域的对应的抗体相比诱导增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与与对应的IgA相比表现出增加的热稳定性，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2、L15.3、T16或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的IgA相比表现出减少的糖基化，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2、L15.3、T16或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区与对应的IgA相比表现出以增加的亲和力与免疫效应细胞上表达的FcαR结合，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2、L15.3、T16或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，IgA重链恒定区还包含铰链区。在一些实施方案中，铰链区包含IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。在一些实施方案中，铰链区包含人类IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。在一些实施方案中，铰链是IgA1铰链或IgA2铰链或其变体或片段。在一些实施方案中，恒定结构域还包含轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ轻链恒定区，其中κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:31的序列。在一些实施方案中，IgA重链恒定区还包含一个或更多个白蛋白结合区。在一些实施方案中，一个或更多个白蛋白结合结构域被融合至CH3区的C末端。在一些实施方案中，恒定区包含轻链恒定区，并且一个或更多个白蛋白结合结构域被融合至轻链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与不包含一个或更多个白蛋白结合结构域的对应的IgA抗体相比具有更长的循环半衰期。在一些实施方案中，当在合适的体外CDC测定中测量时，抗体或其功能性片段与包含IgG重链恒定结构域的对应的抗体相比表现出减少的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一些实施方案中，当在合适的体外抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定中测量时，本文描述的抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出增加的ADCC。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，本文描述的抗体的重链可变区包含以下互补决定区(CDR)中的至少一个：包含选自SEQ IDNO:33-40中的任一个的氨基酸序列的HC-CDR1，包含选自SEQ ID NO:41-48中的任一个的氨基酸序列的HC-CDR2；和包含选自SEQ ID NO:49-56中的任一个的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的轻链可变区包含以下互补决定区(CDR)中的至少一个：包含选自SEQ ID NO:57-64中的任一个的氨基酸序列的LC-CDR1；包含选自SEQID NO:65-72中的任一个的氨基酸序列的LC-CDR2；和包含选自SEQ ID NO:73-80中的任一个的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，所描述的抗体的重链可变区包含与选自SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:81-86中的任一个的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:95-100中的任一个的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，重链CDR和轻链CDR中的每一个均来源于IgG抗体。在一些实施方案中，重链可变区还包含以下四个框架区(FW)：HC-FW1、HC-FW2、HC-FW3和HC-FW4。在一些实施方案中，轻链可变区还包含以下四个框架区(FW)：LC-FW1、LC-FW2、LC-FW3和LC-FW4。
在一些实施方案中，重链FW区和轻链FW区中的每一个均来源于IgG抗体。在一些实施方案中，重链FW区和轻链FW区中的每一个均来源于IgA抗体。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其功能性片段是嵌合抗体、重链抗体、单链抗体、人源化抗体、人类抗体、单克隆抗体、去免疫化抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、多价抗体或其组合。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)、VHH结构域或由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，可变结构域特与GD2、CD20、CD47、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1或CD25特异性地结合。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段还包括酶、底物、辅因子、萦光标志物、化学发光标志物、肽标签、磁性颗粒、药物、毒素、放射性核素、第二抗体的结合位点、金属结合结构域或其组合。
本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含以上任一方面的抗体或其功能性片段以及药学上可接受的载体。
本文提供了一种治疗有相应需要的受试者的方法或用于治疗有相应需要的受试者的组合物，包括向受试者施用治疗剂量的以上任一方面的抗体或其功能性片段或以上公开的药物组合物。
在一些实施方案中，抗体或其功能性片段或药物组合物对靶细胞是细胞裂解性的。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段或药物组合物抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段或药物组合物通过皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内施用。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段或药物组合物与第二治疗剂组合施用至受试者。在一些实施方案中，第二治疗剂包括抗癌剂、化学治疗剂、放射疗法、细胞毒性剂、NSAID、皮质类固醇、膳食补充剂诸如抗氧化剂或其组合。在一些实施方案中，第二治疗剂在施用抗体或其功能性片段或药物组合物之前、同时或之后施用。
本文提供了一种分离的核酸，所述分离的核酸编码以上任一方面所述的抗体或其功能性片段。
本文提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码重链多肽，分离的核酸分子包含编码IgA重链恒定区的第一核酸序列，其中第一核酸序列选自SEQ ID NO:25-32中的任一个。在一些实施方案中，以上方面的分离的核酸分子还包含编码重链可变区的第二核酸序列，其中第二核酸序列选自SEQ ID NO:87-84中的任一个。
本文提供了一种载体，所述载体包含以上任一方面的分离的核酸分子。
本文提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含以上任一方面的分离的核酸分子。在一些实施方案中，以上任一方面的宿主细胞还包含编码轻链多肽的分离的核酸分子，其中编码轻链多肽的分离的核酸分子包含编码轻链可变区的核酸序列，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:101-108中的任一个。在一些实施方案中，编码轻链多肽的分离的核酸分子还包含编码κ轻链恒定区的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:32的序列。
本文提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达以上任一方面的抗体或其功能性片段。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞或HEK293细胞。
本文提供了一种产生抗体或其功能性片段的方法，所述方法包括：(a)将以上任一方面的宿主细胞在允许表达由分离的核酸分子编码的多肽和组装抗体或其功能性片段的条件下在培养基中培养；并且(b)从所培养的宿主细胞或宿主细胞的培养基中纯化抗体或其功能性片段。在一些实施方案中，纯化通过尺寸排阻层析进行。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与CD20多肽或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：(a)IgA重链恒定区，其中IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列；和(b)重链可变区，其中重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:33的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:41的HC-CDR2、和SEQ ID NO:49的HC-CDR3；(c)轻链可变区，其中轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:57的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:65的LC-CDR2和SEQ ID NO:73的LC-CDR3；或(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。在一些实施方案中，可变重链包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且可变轻链包含与SEQ ID NO:95的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与GD2蛋白或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：(a)IgA重链恒定区，其中IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列；和(b)重链可变区，其中重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:34的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:42的HC-CDR2、和SEQ ID NO:50的HC-CDR3；(c)轻链可变区，其中轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:58的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:66的LC-CDR2、和SEQ IDNO:74的LC-CDR3；或(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。在一些实施方案中，可变重链包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且可变轻链包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与Her2蛋白或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：(a)IgA重链恒定区，其中IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21的氨基酸序列；和(b)重链可变区，其中重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:35的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:43的HC-CDR2、和SEQ ID NO:51的HC-CDR3；(c)轻链可变区，其中轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ IDNO:59的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:67的LC-CDR2、和SEQ ID NO:75的LC-CDR3；或(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。在一些实施方案中，可变重链包含与SEQ IDNO:82的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且可变轻链包含与SEQ IDNO:96的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与gp75蛋白或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：(a)IgA重链恒定区，其中IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21的氨基酸序列；和(b)重链可变区，其中重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:36的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:44的HC-CDR2、和SEQ ID NO:52的HC-CDR3；(c)轻链可变区，其中轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ IDNO:60的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:68的LC-CDR2、和SEQ ID NO:76的LC-CDR3；或(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。在一些实施方案中，可变重链包含与SEQ IDNO:83的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且可变轻链包含与SEQ IDNO:97的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与CTLA4蛋白或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：(a)IgA重链恒定区，其中IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21的氨基酸序列；和(b)重链可变区，其中重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:37的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:45的HC-CDR2、和SEQ ID NO:53的HC-CDR3；(c)轻链可变区，其中轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQID NO:61的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:69的LC-CDR2和SEQ ID NO:77的LC-CDR3；或(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。在一些实施方案中，可变重链包含与SEQ IDNO:84的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且所述可变轻链包含与SEQID NO:98的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与CD47蛋白或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：(a)IgA重链恒定区，其中IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21的氨基酸序列；和(b)重链可变区，其中重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:38的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:46的HC-CDR2、和SEQ ID NO:54的HC-CDR3；(c)轻链可变区，其中轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ IDNO:62的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:70的LC-CDR2、和SEQ ID NO:78的LC-CDR3；或(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。在一些实施方案中，可变重链包含与SEQ IDNO:85的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且可变轻链包含与SEQ IDNO:99的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：抗原结合结构域；和恒定结构域，其中恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区，并且其中IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含以下：N45.2G氨基酸取代、N135Q氨基酸取代、C147的缺失和Y148的缺失，根据IMGT方案编号。
本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：抗原结合结构域；和恒定结构域，其中恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区，并且其中IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含以下：N45.2G氨基酸取代、N114T氨基酸取代、I115L氨基酸取代、T116S氨基酸取代、选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代和C末端氨基酸P131-Y148的缺失，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，以上方面的抗体或其功能性片段相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区还包含以下：C86S氨基酸取代、P124R氨基酸取代、C147的缺失、Y148的缺失、L15.3I氨基酸取代、T16S氨基酸取代或其组合，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，IgA2重链恒定区包含与选自SEQ ID NO:18-21中的任一个的序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段是非糖基化的。
在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的IgA相比具有增加的循环半衰期，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与包含IgG重链恒定结构域的对应的抗体相比诱导增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的IgA相比表现出增加的热稳定性，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与对应的IgA相比表现出减少的糖基化，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用被并入本文，其程度如同每一单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示通过引用并入。
附图简述
本公开内容的特征特别地在所附权利要求书中阐述。通过参考以下详述以及附图将获得对本公开内容的特征和优点的更佳的理解，详述阐述了其中使用了本公开内容的原理的说明性实施方案，在附图中：
图1是示出IgA2重链的氨基酸序列(UniProt参考号：A0A0G2JMB2)(SEQ ID NO:1)的图解。突出显示的氨基酸描绘了在本文描述的一些实施方案中经历取代的氨基酸。加下划线的序列指示尾段，在本文描述的一些实施方案中，尾段的全部或部分可以被缺失。
图2是示出IgA2重链的氨基酸序列(UniProt参考号：P01877)(SEQ ID NO:2)的图解。突出显示的氨基酸描绘了在本文描述的一些实施方案中经历取代的氨基酸。加下划线的序列指示尾段，在本文描述的一些实施方案中，尾段的全部或部分可以被缺失。
图3是示出代表性IgA2重链的氨基酸序列(UniProt参考号：A0A286YEY5)(SEQ IDNO:3)的图解。突出显示的氨基酸描绘了在本文描述的一些实施方案中经历取代或缺失的氨基酸。在一些另外的实施方案中，在可比IgA抗体或具有IgA2恒定区的可比嵌合抗体中对应的氨基酸可以缺失。
图4A-图4D示出了相对于野生型IgA(IgA2(m1))的工程化IgA变体的示意性表示。图4A示出野生型(WT)IgA；IgA2m1抗体的表示。野生型(WT)IgA(IgA2m1)在其CH结构域中包含三个N-糖基化位点，并且在其尾段中包含1个糖基化位点。
图4B示出了工程化IgA3.0+(plus)变体的表示。工程化IgA3.0+变体通过以下产生：将IgA2m1抗体工程化为包含经由CH1-P124R突变稳定的重链和轻链连接，去除两个游离半胱氨酸，其中1个突变为丝氨酸(CH2-C86S)，并且第二个(CH3-CHS-C147del)通过尾段的两个最终氨基酸的缺失被去除。此外，三个N-连接的糖基化位点通过取代三个N-糖基化基序中的关键氨基酸被去除。这三个N-糖基化基序中的突变包括CH1-N45.2G；CH2-N114T-I115L-T116S；CH3-CHS-N135Q。
图4C示出了包含整个尾段的缺失(CH3-CHS-P131-Y148del)的工程化IgA3.0-或IgA3.0min变体的表示。IgA3.0min变体包含稳定的重链和轻链连接(CH1-P124R突变)、整个尾段的缺失(CH3-CHS-P131-Y148del)，缺少两个游离半胱氨酸，其中1个突变为丝氨酸(CH2-C86S)，并且第二个(CH3-CHS-C147del)是尾段缺失。此外，三个N-连接的糖基化位点通过以下被去除：取代2个N-糖基化基序中的关键氨基酸，即，CH1-N45.2G和CH2-N114T-I115L-T116S，并且通过尾段缺失使CH3-CHS-N135Qdel缺失。
图4D示出了工程化IgA4.0变体的表示，其包含IgA3.0min的全部特征，并且还包含最终的N-连接的糖基化基序CH2-N15.2中的突变。因此，IgA4.0变体包含稳定的重链和轻链连接(CH1-P124R突变)、整个尾段的缺失(CH3-CHS-P131-Y148del)，缺少两个游离半胱氨酸，其中1个突变为丝氨酸(CH2-C86S)，并且第二个(CH3-CHS-C147del)是尾段缺失。此外，四个N-连接的糖基化位点通过以下被去除：取代四个N-糖基化基序中的关键氨基酸(CH1-N45.2G；CH2-N114T-I115L-T116S；CH3-CHS-N135Q；以及CH2-N15.2G、CH2-N15.2Q、CH2-N15.2T或CH2-N15.2T-L15.3I-T16S之一)。IgA4.0变体是非糖基化的IgA。
图5A和图5B展示了IgA3.0min抗体变体的产率。
图5A示出了对用不同重链(HC):轻链(LC):pAdvantage比例转染的HEK293F细胞的上清液通过ELISA确定的抗Her2 IgA抗体(即IgA2-Her2)的浓度。
图5B示出了对用不同重链(HC):轻链(LC):pAdvantage比例转染的HEK293F细胞的上清液通过ELISA确定的抗CD47 IgA3.0min抗体(即，包含抗CD47可变结构域(IgA3.0min-C47A8-CQ)的IgA3.0min抗体)的浓度。可变结构域从C47A8-CQ抗体获得。
图6A-图6C示出了以ELISA确定的HEK293F细胞与ExpiCHO-S细胞中IgA3.0min抗体变体的抗体产率的比较。
图6A示出了HEK293F细胞与ExpiCHO细胞中抗CD20IgA3.0min-Obi抗体的产率的比较。IgA3.0min-Obi抗体包含IgA3.0min与奥妥珠单抗(Obinutuzumab，Obi)可变结构域。
图6B示出了HEK293F细胞与ExpiCHO细胞中抗Her2IgA3.0min-Her2抗体的产率的比较。IgA3.0min-Her2抗体包含IgA3.0min与抗Her2可变结构域。
图6C示出了HEK293F细胞与ExpiCHO细胞中抗mCTLA4IgA3.0min-mCTLA4抗体的产率的比较。IgA3.0min-mCTLA4包含IgA3.0min与抗mCTLA4可变结构域。
图7A-图7D展示了用不同重链(HC):轻链(LC):pAdvantage比例转染的ExpiCHO-S细胞中IgA3.0min抗体变体的浓度。
图7A示出了抗GD2 IgA3.0min-ch14.18抗体的浓度。IgA3.0min-ch14.18抗体包含IgA3.0min与ch14.18可变结构域。
图7B示出了抗gp75 IgA3.0min-TA99抗体的浓度。IgA3.0min-TA99抗体包含IgA3.0min与TA99可变结构域。
图7C示出了抗Her2 IgA3.0min-Her2抗体的浓度。IgA3.0min-Her2抗体包含IgA3.0min与抗Her2可变结构域(抗Her2可变结构域来源于抗Her2抗体曲妥珠单抗)。
图7D示出了抗CD20 IgA3.0min-Obi抗体的浓度。IgA3.0min-Obi抗体包含IgA3.0min与奥妥珠单抗(Obi)可变结构域。
图8A-图8D示出了用不同重链(HC):轻链(LC):pAdvantage比例转染的ExpiCHO-S细胞中IgA4.0抗体变体的产率。
图8A示出了抗CD20 IgA4.0_NG-Obi变体的产生。IgA4.0_NG-Obi变体包含在糖基化位点中具有CH2-N15.2G突变的IgA4.0和来自Obi的可变结构域。
图8B示出了抗CD20 IgA4.0_NT-Obi变体的产生。IgA4.0_NT-Obi变体包含在糖基化位点中具有CH2-N15.2T突变的IgA4.0和来自Obi的可变结构域。
图8C示出了抗CD20 IgA4.0_NQ-Obi变体的产生。IgA4.0_NQ-Obi变体包含在糖基化位点中具有CH2-N15.2Q突变的IgA4.0和来自Obi的可变结构域。
图8D示出了抗CD20 IgA4.0_NLT-TIS-Obi变体的产生。IgA4.0_NLT-TIS-Obi变体包含在糖基化位点中具有N15.2T-L15.3I-T16S突变的IgA4.0和来自Obi的可变结构域。
图9A-图9B示出了使用KappaSelect柱(GE Healthcare)从来自生产细胞系ExpiCHO-S(图9A)和HEK293F(图9B)的上清液的IgA3.0min-Obi的洗脱谱。
图9C-图9D示出了来自生产细胞系ExpiCHO-S(图9C)和HEK293F(图9D)的IgA3.0min-Obi的SEC分离谱，在SEC分离时未观察到聚集物。
图10A-图10B示出了使用KappaSelect柱(GE Healthcare)从来自生产细胞系ExpiCHO-S(图10A)和HEK293F(图10B)的上清液的IgA3.0min-Her2的洗脱谱。
图10C-图10D示出了来自生产细胞系ExpiCHO-S(图10C)和HEK293F(图10D)的IgA3.0min-Her2的SEC洗脱谱，在SEC分离时未观察到聚集物。
图11A示出了使用KappaSelect柱(GE Healthcare)从来自生产细胞系ExpiCHO-S的上清液的IgA4.0-Obi的典型洗脱谱。
图11B示出了来自生产细胞系ExpiCHO-S的IgA4.0-Obi的SEC洗脱谱，在SEC分离时未观察到聚集物。
图12A-图12E示出了通过流式细胞术分析的IgA3.0+-Obi和IgA3.0min-Obi与CD20阳性Daudi细胞的结合。
图12A示出了未染色的CD20+Daudi细胞对照。
图12B示出了仅用二级抗体染色的Daudi细胞阴性对照。
图12C示出用抗CD20 IgA Obi(5ug/mL)染色的阳性对照。
图12D示出了用IgA3.0+-Obi(上清液)染色的Daudi细胞。图12E示出了用IgA3.0min-Obi(上清液)染色的Daudi细胞。图12D-图12E示出了用来自用IgA3.0min-Obi或IgA3.0+-Obi转染的HEK293F细胞的上清液染色的Daudi细胞。两种变体IgA3.0+-Obi(图12D)和IgA3.0min-Obi(图12E)以与IgA Obi(图12C)相同的程度结合CD20阳性Daudi。
图13示出了通过PMN结合测定评价的IgA3.0min-Obi的Fc部分与PMN的结合。将PMN添加至用以不同浓度抗体包被的ELISA板孔中。一系列的洗涤确定了IgA3.0min-Obi和IgA2的Fc部分与PMN的结合强度。第6次洗涤之后，绘制结合图。与野生型IgA2相比，IgA3.0min-Obi显示出等同至更佳的对PMN的结合。
图14示出了IgA3.0min与野生型IgA2相比等同的包被浓度。
图15示出了IgA4.0变体的结合分析。评价了来自用IgA4.0变体(IgA4.0_NT-Obi、IgA4.0_NQ-Obi、IgA4.0_NG-Obi和IgA4.0_NLT-TIS-Obi)转染的ExpiCHO-S细胞的上清液对表达CD20的SKBR3细胞的结合。所有IgA4.0-Obi变体以与来自用IgA3.0min-Obi转染的ExpiCHO-S细胞的上清液或纯化的IgA3.0min-Obi相同的程度结合SKBR3-CD20。
图16A-图16D示出了IgA变体诱导的PMN介导的针对靶细胞的ADCC。
图16A示出了如通过铬释放测定确定的，IgA3.0min-Her2抗体以与IgA2-Her2相似或更佳的程度诱导针对SKBR3细胞的ADCC。
图16B-图16C示出了如通过铬释放测定评价的，由HEK293F细胞或ExpiCHO-S细胞产生的IgA3.0min-Obi抗体诱导了相似水平的针对Ramos细胞(图16B)和Daudi细胞(图16C)的ADCC。
图16D示出了IgA变体诱导的针对Daudi细胞的ADCC。与纯化的IgG1-Obi相比，纯化的IgA3.0min-Obi、来自用IgA3.0min-Obi转染的细胞的上清液、来自用IgA4.0_NG-Obi转染的细胞的上清液、来自用IgA4.0_NQ-Obi转染的细胞的上清液、来自用IgA4.0_NT-Obi转染的细胞的上清液和来自用IgA4.0_NLT-TIS-Obi转染的细胞的上清液显示出增加的ADCC。与纯化的IgA3.0min-Obi、来自用IgA-3.0min-Obi转染的细胞的上清液相比，IgA4.0-obi变体(IgA4.0_NG-Obi、IgA4.0_NQ-Obi、IgA4.0_NT-Obi和IgA4.0_NLT-TIS-Obi)显示出相似水平的ADCC诱导。
图17A-图17C示出了IgA变体的热稳定性。使用SYPRO Orange热位移测定(SYPROOrange thermal shift assay)确定了IgA3.0min和IgA4.0的热稳定性。图17A展示了与野生型IgA2(m1)(即，具有ch14.18可变结构域的IgA2和具有Her2可变结构域的IgA2)相比，工程化IgA3.0min变体(具有Obi可变结构域的IgA3.0min和具有2.3D11可变结构域的IgA3.0min)显示出增加的热稳定性。
图17A还展示了与野生型IgA2(m1)(即，具有ch14.18可变结构域的IgA2和具有Her2可变结构域的IgA2)相比，工程化IgA4.0min变体(全部都具有Obi可变结构域的IgA4.0NQ、IgA4.0 NT、IgA4.0 NLT-TIS和IgA4.0NG)显示出增加的热稳定性。工程化IgA3.0min变体和工程化IgA4.0变体相对于野生型IgA2(m1)增加的热稳定性通过向更高温度的位移来指示。
图17B示出了相对于野生型IgA2(m1)分析的工程化IgA3.0min变体和工程化IgA4.0变体的平均Tm值的图。该图示出了工程化IgA3.0min变体和工程化IgA4.0变体与野生型IgA2相比更耐热。
图17C示出了测试暴露于递增温度的抗体在针对表达CD20的Raji细胞的PMN-ADCC中的功能性。野生型IgA2(m1)从47℃开始显示出递减的功效，而IgA3.0min-Obi和IgA4.0_NT-Obi两者仍然有效。在71℃时，IgA3.0min-Obi以及IgA4.0_NT-Obi两者提供了多于50％的杀伤功效，而IgA2(m1)在此温度是无功能的。
图18示出了PNGase F处理对工程化IgA3.0min变体和工程化IgA4.0变体与野生型IgA2相比的去糖基化的效果。野生型IgA2(IgA2(m1)-UMAB10)显示出最大的迁移，而与野生型IgA2相比，工程化IgA3.0min变体(IgA3.0min-Obi)显示出微小的迁移，表明糖基化降低。与工程化IgA3.0min变体和野生型IgA2相比，工程化IgA4.0变体(IgA4.0_NG-Obi)没有显示出迁移，表明糖基化降低。
图19A-图19G示出了用MALDI-TOF-MS确定的野生型IgA2和工程化IgA变体的总体糖基化谱
图19A示出了HEK293细胞产生的野生型IgA2(IgA2-Her2)的总体糖基化谱。
图19B示出了HEK293细胞产生的工程化IgA3.0min变体(IgA3.0min-Her2)的总体糖基化谱。该谱示出了来自存在于工程化IgA3.0min变体中的单个糖基化位点的全部信号。
图19C示出了HEK293F和ExpiCHO-S中产生的工程化IgA3.0min变体(IgA3.0min-Obi)的糖基化位点特异性分析。ExpiCHO-S中产生的IgA3.0min-Obi显示出较少的游离半乳糖，这意味着在肝中对ASGPR依赖性清除的较少敏感性。
图19D-图19G示出了以下四种IgA4.0变体的非变性MS分析：IgA4.0_NG-Obi(图19D)、IgA4.0_NQ-Obi(图19E)、IgA4.0_NT-Obi(图19F)和IgA4.0_NLT-TIS-Obi(图19G)。大图展示了抗体的宽质量范围，插图放大了最高峰值。观察到的质量实际上等于理论质量，排除了大的(bulky)N-聚糖的存在，表明IgA4.0变体中不存在糖基化。
图20A-图20B示出了工程化IgA变体的药代动力学和药物分布分析。将100μg的量的野生型-IgG1-dinutuximab、野生型-IgA2-dinutuximab和IgA3.0min-dinutuximab、IgA3.0min-奥妥珠单抗、IgA4.0-奥妥珠单抗注射到BALB/c小鼠中，并且在指示的时间点通过ELISA分析血液。
图20A示出了IgA3.0min变体(IgA3.0min-dinutuximab)与其野生型IgA2对应物相比显示出延长的半衰期。
图20B示出了奥妥珠单抗形式的IgA3.0min与IgA4.0之间的比较。工程化IgA4.0变体(IgA4.0-奥妥珠单抗)显示出比工程化IgA3.0min变体(IgA3.0min-奥妥珠单抗)更佳的半衰期谱。奥妥珠单抗IgA4.0在120小时之后仍可以检测到。
图21A-图21B示出了IgG1 dinutuximab和包含来自dinutuximab的可变结构域的工程化IgA3.0min变体(IgA3.0min dinutuximab)的生物分布。将铟-111放射性标记的IgG1dinutuximab和工程化IgA3.0min变体(IgA3.0min dinutuximab)静脉内(i.v.)注射到小鼠中用于生物分布分析。监测小鼠以追踪抗体在24小时之后(图21A)和48小时之后(图21B)的分布。观察到IgG1和工程化IgA3.0min变体两者对肿瘤的明显浸润。
图22示出了来自图21A-图21B的小鼠中放射标记的IgG1 dinutuximab和工程化IgA3.0min变体(IgA3.0min dinutuximab)的分布的定量。确定了肿瘤信号与肝信号的比率，以调整背景信号。该图示出了工程化IgA3.0min变体(IgA3.0min dinutuximab)与IgG1dinutuximab相比显示出增加的肿瘤/肝比率。
图23示出了在已建立的肿瘤模型中施用工程化IgA3.0min变体(IgA3.0min-Her2)后对肿瘤生长的抑制。将A431-Luc2-Her2细胞在第0天腹膜内注射到hCD89转基因或非转基因SCID小鼠中，随后在第6天皮下注射pegG-CSF。从第6天开始测量生物发光信号，并且在这一天将小鼠随机分为不同的处理组，并且测量到显著的信号。处理从第7天开始，每天腹膜内注射10ug IgA3.0min-Her2，持续10天。在指示的时间点测量生物发光信号。
本公开内容详述
以下描述和实例详细说明了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文描述的特定实施方案，并且本身可以变化。本领域技术人员将认识到，本公开内容存在许多变化和修改，这些变化和修改都被包括在本公开内容范围内。
所有术语都意图被理解为它们将被本领域技术人员所理解的。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
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尽管本公开内容的各个特征可以在单种实施方案的上下文中被描述，但是该特征也可以单独地或以任何合适的组合被提供。相反，尽管为了清楚起见，本公开内容可以在本文单独实施方案的上下文中被描述，但是本公开内容也可以在单个实施方案中实现。
定义
以下定义补充了本领域中的定义，并且针对本申请，而不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于测试本公开内容的实践，但本文描述了优选的材料和方法。相应地，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图是限制性的。
在本申请中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。必须注意，除非上下文另外清楚地指示，否则如本说明书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代。在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括/包含(including)”以及其他形式诸如“包括/包含(include)”、“包括/包含(includes)”和“包括/包含(included)”的使用不是限制性的。
说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一种实施方案”或“其他实施方案”的提及意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一些实施方案中，但不必包含在全部实施方案中。
如本说明书和一项或更多项权利要求(claim(s))中使用的，词语“包含/包括(comprising)”(和包含/包括(comprising)的任何形式，诸如“包含/包括(comprise)”和“包含/包括(comprises)”)、“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括/包含(including)”(和包括/包含(including)的任何形式，诸如“包括/包含(includes)”和“包括/包含(include)”)或“包含/含有(containing)”(和“包含/含有(containing)”的任何形式，诸如“包含/含有(contains)”和“包含/含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。设想本说明书中讨论的任何实施方案可以参考本公开内容的任何方法或组合来实现，并且反之亦然。此外，本公开内容的组合可以用于实现本公开内容的方法。
术语“约(about)”或“约(approximately)”意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围以内，其将部分地取决于值如何被测量或确定，即，测量***的局限性。例如，“约”可以根据本领域的实践意指1个或多于1个标准差以内。可选地，“约”可以意指特定值的最多20％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。在其他实例中，“约10”的量包括10和9至11的任何量。
在又其他的实例中，涉及参考数值的术语“约”也可以包括该值的正或负10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值范围。可选地，特别是涉及生物***或过程，术语“约”可以意指在值的一个数量级以内，优选地在值的5倍以内，且更优选地在值的2倍以内。当在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另外说明，否则术语“约”应被假定意指特定值的可接受的误差范围以内。
如本文使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)(不管是天然的还是部分或全部合成产生的)。该术语还涵盖任何具有结合结构域的多肽或蛋白，所述结合结构域是抗原结合结构域或与之同源。该术语还包括“抗原结合片段”或“其功能性片段”、或“抗体的片段(fragment of an antibody)”、“抗体片段(antibody fragment)”、“抗体的功能性片段”以及诸如下文描述的类似结合片段的其他可互换术语。
抗体包括，例如，单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、重组抗体、化学工程化抗体、去免疫化抗体、亲和成熟抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体和多反应性抗体)、异源缀合的抗体、抗体片段及其组合(例如，也是去免疫化的单克隆抗体、也是去免疫化的人源化抗体等)。
抗体可以是例如鼠(murine)抗体、嵌合抗体、人源化抗体、异源缀合的抗体、双特异性抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)或四抗体(tetrabody)。抗原结合片段可以包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG、scFv、hcAb(重链抗体)、单结构域抗体、VHH、VNAR、sdAb或纳米抗体(nanobody)。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指由B细胞的单个克隆产生并与同一表位结合的抗体。相比之下，“多克隆抗体”是指由不同的B细胞产生并与同一抗原的不同表位结合的抗体群。完整的抗体通常由四个多肽组成：两个相同拷贝的重(H)链多肽和两个相同拷贝的轻(L)链多肽。每个重链包含一个N末端可变(VH)区和三个C末端恒定(CH1、CH2和CH3)区，并且每个轻链包含一个N末端可变(VL)区和一个C末端恒定(CL)区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。VH区和VL区具有相似的一般结构，其中每个区包含四个框架区，框架区的序列相对保守。框架区由三个互补决定区(CDR)连接。这三个称为CDR1、CDR2和CDR3的CDR形成抗体的负责抗原结合的“高变区”。
如本文使用的，“嵌合抗体”是包含来源于两种不同物种或两种不同来源的氨基酸序列的抗体并且包括合成分子。通过非限制性实例的方式，抗体包含非人类CDR和人类可变区框架或恒定区或Fc区、抗体具有来自两种不同单克隆抗体的结合结构域、或者抗体包含一个或更多个氨基酸残基突变以增加或减少抗体一部分的生物活性或结合。在某些实施方案中，重组抗体由重组DNA分子产生或者被合成。在某些实施方案中，本文描述的抗体是由一种或更多种多核苷酸编码的一种或更多种多肽。
如本文使用的，“识别”是指抗原结合结构域与抗原之间的缔合或结合。如本文使用的，“抗原”是指能够在宿主中触发免疫应答的抗原物质。抗原物质可以是分子，诸如能够在宿主中触发免疫应答的共刺激分子。
如本文使用的，“抗体构建体”是指包含抗原结合结构域和Fc结构域的构建体。
如本文使用的，“结合结构域”是指抗体或非抗体结构域。
如本文使用的，“抗原结合结构域”是指来自抗体或来自非抗体的能够与抗原结合的结合结构域。抗原结合结构域可以是肿瘤抗原结合结构域或能够与抗原呈递细胞上的抗原(诸如分子)结合的结构域结合。当特定缀合物或抗体构建体中存在多于一个抗原结合结构域时，可以对抗原结合结构域进行编号(例如，第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域、第三抗原结合结构域等)。同一缀合物或构建体中的不同抗原结合结构域可以靶向同一抗原或不同抗原(例如，能够与肿瘤抗原结合的第一抗原结合结构域、能够与抗原呈递细胞上的分子(APC抗原)结合的第二抗原结合结构域以及能够与APC抗原结合的第三抗原结合结构域)。术语“抗原结合结构域”是指抗体的包含与表位特异性地结合并且与抗原的一部分或全部互补的区域的片段。抗原结合结构域可以由例如一个或更多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。特别地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文使用的，术语“抗原”意指能够与抗体上的识别位点反应的分子或分子的一部分。术语“抗原”还包括能够本身独自(by itself)或与佐剂或载体结合一起引发免疫应答的分子或分子的一部分(也称为“免疫原”)。如本文使用的术语“抗原”包括能够引发抗体产生或能够与抗体结合的分子或分子部分(表位)。该术语包括与抗体反应强和具有高特异性的物质，并且也包括与抗体反应弱和/或具有低亲和力的物质。
如本文使用的术语“表位”是指与抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点(成为互补位，paratope)相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同的抗体可能与抗原的不同区域结合，并且可以具有不同的生物学效应。表位可以是构象性的或线性的。构象性表位由来自线性多肽链不同区段的氨基酸空间并列产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖类、磷酰基基团或磺酰基基团的部分。本领域普通技术人员已知的各种技术可以用于确定抗体的抗原结合结构域是否与多肽或蛋白中的“一个或更多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括，例如，常规交叉阻断测定，诸如Antibodies,Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中描述的，丙氨酸扫描突变分析，肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)和肽裂解分析。此外，可以采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。另一种可以用于鉴定多肽内与抗体的抗原结合结构域相互作用的氨基酸的方法是通过质谱术检测的氢/氘交换。一般来说，氢/氘交换方法包括氘标记感兴趣的蛋白，随后将抗体与氘标记的蛋白结合。接下来，将蛋白/抗体复合物转移至水中，以允许除了被抗体保护的残基(该残基保持氘标记)之外的所有残基处发生氢-氘交换。抗体解离之后，使靶蛋白经历蛋白酶裂解和质谱术分析，从而揭示氘标记的残基，所述氘标记的残基对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见，例如，Ehring(1999)Analytical Biochemistry267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。抗原/抗体复合物的X射线晶体学也可以用于表位作图(epitopemapping)目的。
如本文使用的，“抗体抗原结合结构域”是指来自抗体的能够与抗原结合的结合结构域。
如本文使用的，“Fc结构域”是指来自抗体或来自非抗体的能够与Fc受体结合的Fc结构域。如本文使用的，“Fc结构域”和“包含Fc的结构域”可以互换使用。
如本文使用的，“靶结合结构域”是指包含来自抗体或来自非抗体的抗原结合结构域的能够与抗原结合的构建体。
如本文使用的，天然1-对映异构体氨基酸的缩写是常规的，并且可以如下：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gin)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，He)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；甲硫氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)。除非另外指定，否则X可以指示任何氨基酸。在一些方面，X可以是天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)。
本文采用措辞“药学上可接受的”以指在合理医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比率相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
如本文使用的措辞“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物质。每种载体必须是“可接受的”，其意义在于与制剂的其他成分相容并且对患者不是有害的。可以用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)Ringer溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；以及(21)药物制剂中采用的其他无毒性相容物质。
术语“癌症”、“肿瘤”、“增生性疾病”、“恶性肿瘤”或“恶性疾病”涉及哺乳动物中以失调的细胞生长为特征的生理状况。癌症是其中一组细胞表现出不受控制的生长或不想要的生长的一类疾病。癌细胞也可以扩散至其他位置，这可能导致形成转移。例如，癌细胞在体内的扩散可以经由淋巴或血液发生。不受控制的生长、侵袭和转移形成也被称为癌症的恶性特性。这些恶性特性将癌症与良性肿瘤区分开，良性肿瘤通常不侵袭或转移。
“抗原识别部分”或“抗体识别结构域”是指与抗原特异性地结合的分子或分子的一部分。在一种实施方案中，抗原识别部分是抗体、抗体样分子或其片段，并且抗原是肿瘤抗原或感染性疾病抗原。
术语“抗体的片段”、“抗体片段”、“抗体的功能性片段”、“抗原结合部分”或它们的语法等同物在本文中可互换使用，意指保留与抗原特异性地结合能力的抗体的一个或更多个片段或部分(通常参见，Holliger等人，Nat.Biotech.,23(9):1126-1129(2005))。抗体片段期望地包含例如一个或更多个CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其组合。抗体片段的实例包括，但不限于，(i)Fab片段，Fab片段是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，F(ab’)2片段是包含在茎区(stalk region)处通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)单链Fv(scFv)，单链Fv(scFv)是由Fv片段的两个结构域(即VL和VH)通过合成接头连接而组成的单价分子，该合成接头使两个结构域能够合成为单个多肽链(例如，参见，Bird等人，Science，242:423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883(1988)；以及Osbourn等人，Nat.Biotechnol.,16:778(1998))和(v)双抗体，双抗体是多肽链的二聚体，其中每个多肽链包含通过肽接头与VL连接的VH，该肽接头太短而不允许同一多肽链上的VH与VL之间配对，从而驱动不同VH-VL多肽链上的互补结构域之间配对，以产生具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子。抗体片段是本领域已知的，并且在例如美国专利第8,603,950号中被更详细描述。其他抗体片段可以包括重链抗体的可变片段(VHH)。
术语“保守氨基酸取代”或“保守突变”是指一个氨基酸被另一个具有共同特性的氨基酸替代。定义个体氨基酸之间的共同特性的一种功能性方法是分析同源生物体的对应蛋白之间氨基酸改变的归一化频率(Schulz,G.E.和Schirmer,R.H.,Principles ofProtein Structure,Springer-Verlag,New York(1979))。根据这样的分析，可以定义氨基酸的组，其中一个组内的氨基酸优先彼此交换，并且因此在它们对整个蛋白结构的影响方面彼此最相似(Schulz,G.E.和Schirmer,R.H.，同上)。保守突变的实例包括以上亚组中氨基酸的氨基酸取代，例如，赖氨酸取代精氨酸，并且反之亦然，使得可以维持正电荷；谷氨酸取代天冬氨酸，并且反之亦然，使得可以维持负电荷；丝氨酸取代苏氨酸，使得可以维持游离的-OH；以及谷氨酰胺取代天冬酰胺，使得可以维持游离的-NH2。可选地或另外地，治疗性IgA抗体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的参考蛋白的氨基酸序列。
术语“非保守突变”或“非保守氨基酸取代”涉及不同组之间的氨基酸取代，例如，赖氨酸取代色氨酸或苯丙氨酸取代丝氨酸等。在这种情况下，优选的是非保守氨基酸取代不干扰或抑制治疗性IgA抗体的生物活性。非保守氨基酸取代可以增强治疗性IgA抗体的生物活性，使得治疗性IgA抗体的生物活性与野生型治疗性IgA抗体相比被增加。
如本文使用的，“人源化”抗体是指包含最少的来源于非人类免疫球蛋白的序列的特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合亚序列)的非人类(例如鼠)抗体的形式。人源化抗体的大部分是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(诸如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的具有所期望的特异性、亲和力和能力的CDR的残基所替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人类残基替代。此外，人源化抗体可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于输入的CDR或框架序列中但被包括在内以进一步改进和优化抗体性能的残基。通常，人源化抗体将大体上包含至少一个并且通常两个可变结构域的全部，其中全部或大体上全部CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，并且全部或大体上全部FR区是人类免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白(通常是人类免疫球蛋白)恒定区或结构域(Fc)的至少一部分。其他形式的人源化抗体具有相对于初始抗体被改变的一个或更多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，这些CDR也被称为“来源于”来自初始抗体的一个或更多个CDR的一个或多个CDR。
如本文使用的，“分离的抗体”是已经与其自然环境的组分分开和/或从其自然环境的组分中回收的抗体。其自然环境中的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质性组分。在优选的实施方案中，抗体被纯化至以下程度：(1)按抗体重量计大于95％，并且最优选地按重量计大于99％，如通过Lowry法确定的；(2)通过使用旋转杯测序仪(spinning cup sequenator)足以获得至少15个N末端或内部氨基酸序列的残基的程度；或(3)如通过在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE并且使用考马斯蓝或优选地银染色显示的均一性。分离的抗体包括在重组细胞内原位的抗体，因为该抗体的自然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
“大体上纯化的”意指抗体或其功能性片段大体上不含来自其来源于的细胞或组织来源的细胞物质或其他污染蛋白，或者在化学合成时大体上不含化学前体或其他化学物质。该语言包括抗体的制品(preparations)，所述抗体与该抗体所分离自或重组产生自的细胞的细胞组分分开。因此，大体上不含细胞物质的抗体包括具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)污染蛋白和培养基的制品。在一些实施方案中，抗体可以通过层析，例如，尺寸排阻层析或离子交换层析纯化。
如本文使用的，术语“互补决定区”(CDR，即，CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。每个可变结构域通常具有被鉴定为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR区。可变重链的CDR可以是CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。可变轻链的CDR可以是CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。示例性高变环出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基24-34处、L2的氨基酸残基50-56处、L3的氨基酸残基89-97处、H1的氨基酸残基31-35B处、H2的氨基酸残基50-65处和H3的氨基酸残基95-102处(Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版(1991))。因此，HV可以被包含在对应的CDR内，并且除非另外指示，否则本文对VH结构域和VL结构域的“高变环(hypervariableloop)”的提及应解释为也包含对应的CDR，并且反之亦然。可变结构域中更高度保守的区域被称为框架区(FR)，如下文定义的。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采用由三个高变环连接的[β]-折叠构型。每个链中的高变环被FR极为接近地保持在一起，并且与来自另一条链的高变环一起促成抗体的抗原结合位点的形成。抗体的结构分析揭示了互补决定区形成的结合位点的序列与形状之间的关系(Chothia等人，J.Mol.Biol.227:799-817(1992))；Tramontano等人，J.Mol.Biol,215:175-182(1990))。尽管它们高的序列可变性，但六个环中的五个仅采用一小部分的主链构象，称为“典型结构”。这些构象首先由环的长度决定，并且其次由环和框架区中某些位置处的关键残基的存在决定，所述关键残基通过它们的堆积、氢键合或采用独特的主链构象的能力决定构象。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区各自由被三个互补决定区(CDR)(也被称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成。每个链中的CDR被FR极为接近地保持在一起，并且与来自另一个链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列可变性(cross-species sequence variability)的方法(即Kabat等人Sequences of Proteinsof Immunological Interest,(第5版，1991,National Institutes of Health,BethesdaMd.))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Allazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。CDR可以指由任一方法或两种方法的组合定义的CDR。
抗体的“恒定区”是指单独或组合的抗体轻链的恒定区(即轻链恒定区)或抗体重链的恒定区(即重链恒定区)。恒定区相对于抗原特异性没有变化。
如本文使用的，术语“重链区”包含来源于免疫球蛋白重链恒定结构域的氨基酸序列。包含重链区的多肽包含以下的至少一种：CH1结构域、铰链(例如，上铰链区、中铰链区和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。在一种实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以包含免疫球蛋白重链的Fc区(例如，铰链部分、CH2结构域和CH3结构域)。在另一种实施方案中，抗体或其抗原结合片段缺少恒定结构域的至少一个区域(例如，CH2结构域的全部或部分)。在某些实施方案中，恒定结构域中的至少一个并且优选地全部来源于人类免疫球蛋白重链。例如，在一种优选的实施方案中，重链区包含完全人类铰链结构域。在其他优选的实施方案中，重链区包含完全人类Fc区(例如，来自人类免疫球蛋白的铰链、CH2结构域和CH3结构域序列)。在某些实施方案中，重链区的组成恒定结构域来自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链区可以包含来源于IgA分子的结构域和来源于IgA1分子或IgA2分子的铰链区。在其他实施方案中，恒定结构域是包含不同免疫球蛋白分子区域的嵌合结构域。例如，铰链可以包括来自IgA1分子的第一区域和来自IgA2分子的第二区域。如以上阐述的，本领域普通技术人员将理解，重链区的恒定结构域可以被修饰，使得它们在氨基酸序列方面与天然存在的(野生型)免疫球蛋白分子不同。即，本文公开的本发明多肽可以包含对一个或更多个重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2或CH3)和/或轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。示例性修饰包括一个或更多个结构域中一个或更多个氨基酸的添加、缺失或取代。在一些实施方案中，修饰选自表2中的修饰。
本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以包含长度为至少约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸长度的CDR3区。本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以包含长度为至少约18个氨基酸的CDR3区。
如本文使用的，术语“铰链区”包括重链分子的将CH1结构域与CH2结构域连接的区域。铰链区可以包含大约25个残基，并且是柔性的，由此允许两个N末端抗原结合区独立地移动。铰链区可以细分为三个不同的结构域：上铰链结构域、中铰链结构域和下铰链结构域(Roux等人J.Immunol.1998 161:4083)。
如本文使用的，术语“Fv”是包含完整抗原识别位点和完整抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。
由这两个结构域的折叠产生六个高变环(来自H链和L链的各三个环)，它们贡献用于抗原结合的氨基酸残基，并且赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个抗原特异性CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
关于抗体的“重链可变区”或“VH”是指重链的包含***称为框架区的侧翼延伸段(stretches)之间的三个CDR的片段，这些框架区通常比CDR更高度保守，并且形成支持CDR的支架。
关于抗体的“轻链可变区”或“VL”是指轻链的包含***称为框架区的侧翼延伸段之间的三个CDR的片段，这些框架区通常比CDR更高度保守，并且形成支持CDR的支架。
六个高变环(来自重链和轻链各三个环)贡献用于抗原结合的氨基酸残基，并且赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个抗原特异性CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
“框架”或FR残基是除了高变区残基之外的那些可变结构域残基。
本领域中理解，抗体是具有通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白或其抗原结合部分。重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1、CH2和CH3)。轻链包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链两者的可变区包含框架区(FR或FWR)和高变区(HVR)。HVR是抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自互补决定区(CDR)的具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别的氨基酸残基。除了VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含是接触抗原的残基的“特异性决定残基”或“SDR”。SDR被包含在称为简要CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR的CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基31-34处、L2的氨基酸残基50-55处、L3的氨基酸残基89-96处、H1的氨基酸残基31-35B处、H2的氨基酸残基50-58处和H3的氨基酸残基95-102处(参见，例如，Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。
除非另外指示，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人(同上)进行编号。可变区是抗体重链或轻链的参与抗体结合抗原的结构域。(参见，例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版，W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合特定抗原的抗体的VH结构域或VL结构域分别筛选互补VL结构域或VH结构域的文库来分离结合该抗原的抗体。(参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991))。四个FWR区通常更保守，而CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)表示高变区域，并且从NH2末端至COOH末端如下排列：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3和FWR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域，而根据同种型，恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。抗体还包括嵌合抗体、人源化抗体、和重组抗体、从转基因非人类动物产生的人类抗体，以及使用技术人员可用的富集技术从文库中选择的抗体。
术语“抗体重链”是指存在于抗体分子中的在其天然存在的构象中的两种类型的多肽链中较大的一种，并且抗体重链通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指存在于抗体分子中的在其天然存在的构象中的两种类型的多肽链中较小的一种。kappa(“κ”)和lambda(“λ”)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如果抗体或其抗原结合片段以比其与不相关多肽上的表位结合更大的亲和力(affinity)和/或亲合性(avidity)结合靶，则该抗体或其抗原结合片段与靶“特异性地结合”或“优先结合”。抗体或其抗原结合片段或其部分的特异性可以基于亲和力和/或亲合性来确定。确定这样的特异性结合的方法也是本领域熟知的。根据本公开内容的某些实施方案，抗体或其抗原结合片段可以与人类癌症抗原结合，但不与来自其他物种的癌症抗原结合。可选地，在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段与人类癌症抗原和来自一种或更多种非人类物种的癌症抗原结合。例如，抗体或其抗原结合片段可以与人类癌症抗原结合，并且可以视具体情况与以下的一种或更多种结合或不结合：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、犬、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、食蟹猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩的癌症抗原。
由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)表示的亲和力是抗原决定簇与抗原结合蛋白上的抗原结合位点之间结合强度的量度：KD的值越小，抗原决定簇与抗原结合分子之间的结合强度越强。可选地，亲和力也可以表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD。技术人员将会清楚，亲和力可以根据感兴趣的特定抗原，以本身已知的方法确定。因此，当如本文定义的抗体或其抗原结合片段与第一靶或抗原结合的亲和力(如以上描述的，并适当表述为例如KD值)比所述氨基酸序列或多肽与另一靶或多肽结合的亲和力大至少50倍，诸如至少100倍，并且优选地至少1000倍，并且多达10,000倍或更多倍时，与第二靶或抗原相比，该抗体或其抗原结合片段被称为对第一靶或抗原是“特异性的”。优选地，当与另一靶或抗原相比，抗体或其抗原结合片段对靶或抗原是“特异性的”时，该抗体或其抗原结合片段可以结合该靶或抗原，但不结合另一靶或抗原。然而，如本领域普通技术人员理解的，在一些实施方案中，在靶上的结合位点被多个不同的配体共享或部分共享的情况下，抗体或其抗原结合片段可以与靶(诸如癌症相关抗原)特异性地结合，并具有例如抑制/预防肿瘤进展的功能性效果。
在一些实施方案中，本文提供的抗体具有约1μM、100nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、或0.001nM或更小(例如，10-8M或更小，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。本发明的另一方面提供了对其靶具有增加的亲和力的抗体或其抗原结合片段，例如，亲和力成熟的抗体(affinity matured antibody)。亲和力成熟的抗体是在一个或更多个高变区(HVR)具有一个或更多个改变的抗体，与不具有这样的改变的亲本抗体相比，这样的改变导致抗体对抗原的亲和力的改进。这些亲和力成熟的抗体能够以约5×10-9M、2×10-9M、1×10-9M、5×10-10M、2×10-10M、1×10-10M、5×10-11M、1×10-11M、5×10-12M、1×10-12M或更小的KD与抗原结合。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与包含重链序列和轻链序列或两者的WT IgA抗体或WT IgG抗体相比具有增加至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或更高的亲和力。在其他实施方案中，本文提供的抗体或其功能性片段与可变结构域来源的对应抗体竞争结合相同表位。在一些实施方案中，与抗体结合相同表位和/或与抗体竞争结合相同表位的抗体或其抗原结合片段表现出效应子功能活性，诸如，例如，Fc介导的细胞毒性，包括ADCC活性。
KD可以通过任何合适的测定来测量。例如，KD可以通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)；Presta等人，CancerRes.57:4593-4599(1997))。例如，KD可以使用表面等离子共振测定(例如，使用
Figure BDA0003381014890000401
或
Figure BDA0003381014890000402
)来测量。例如，KD可以使用竞争性ELISA来测量。
亲合性是抗原结合分子与相关抗原之间结合强度的量度。亲合性与抗原决定簇及其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力以及抗原结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。通常，抗原结合蛋白将以解离常数(10-5至10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7至10-12摩尔/升或更小并且更优选地10-8至10-12摩尔/升的KD(即，以105至1012升/摩尔或更大、并且优选地107至1012升/摩尔或更大并且更优选地108至1012升/摩尔的结合常数(KA))与其同源抗原或特异性抗原结合。任何大于10-4摩尔/升的KD值(或任何低于104M-1的KA值)通常被认为指示非特异性结合。被认为有意义(例如，特异性)的生物相互作用的KD通常在10-10M(0.1nM)至10-5M(10000nM)的范围内。相互作用越强，其KD越低。优选地，本文描述的抗LAP抗体或其抗原结合片段上的结合位点将以小于500nM、优选地小于200nM，更优选地小于10nM、诸如小于500pM的亲和力结合。抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何合适方法来确定，包括，例如，斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合测定，诸如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，以及它们在本领域中本身已知的不同变化形式(variants)；以及本文提到的其他技术。
如本文使用的，术语“kon”意图指抗体或其抗原结合片段与抗原缔合的速率常数。
如本文使用的，术语“Koff”意图指抗体或其抗原结合片段从抗体/抗原复合物解离的速率常数。
如本文使用的，术语“重组人类抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的全部人类抗体，诸如(a)从人类免疫球蛋白基因的转基因或转染色体(transchromosomal)动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中分离的抗体，(b)从被转化表达人类抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤(transfectoma)分离的抗体，(c)从重组组合人类抗体文库中分离的抗体，以及(d)通过包括人类免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。如本文公开的，这样的重组人类抗体具有其中框架区和CDR区来源于免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，这样的重组人类抗体可以经历体外诱变(或者，当人类Ig序列的转基因动物用于体内体细胞诱变时)，并且因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列，该序列虽然来源于人类免疫球蛋白VH序列和VL序列并与之相关，但在体内不可能天然存在于人类抗体种系库内。
在抗体或其抗原结合片段的上下文中，术语“特异性”或“对...特异性的”是指特定抗体或其抗原结合片段能够结合的不同类型抗原或抗原决定簇的数目。抗体或其抗原结合片段或部分的特异性可以基于亲和力和/或亲合性来确定。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)表示的亲和力是抗原决定簇与抗原结合蛋白上的抗原结合位点之间结合强度的量度：KD的值越小，抗原决定簇与抗原结合分子之间的结合强度越强。可选地，亲和性也可以表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD。技术人员将会清楚，亲和力可以根据感兴趣的特定抗原，以本身已知的方法确定。因此，当如本文定义的抗体或其抗原结合片段与第一靶或抗原结合的亲和力(如以上描述的，并适当表述为例如KD值)比所述氨基酸序列或多肽与另一靶或多肽结合的亲和力大至少50倍，诸如至少100倍，并且优选地至少1000倍，并且多达10,000倍或更多倍时，与第二靶或抗原相比，该抗体或其抗原结合片段被称为对第一靶或抗原是“特异性的”。优选地，当与另一靶或抗原相比，抗体或其抗原结合片段对靶或抗原是“特异性的”时，该抗体或其抗原结合片段可以结合该靶或抗原，但不结合另一靶或抗原。
然而，如本领域普通技术人员所理解的，在一些实施方案中，在靶上的结合位点被多个不同的配体共享或部分共享的情况下，抗体或其抗原结合片段可以与靶抗原特异性地结合，并具有例如抑制/预防肿瘤进展的功能性效果。
亲合性是抗原结合分子与相关抗原之间结合强度的量度。亲合性与抗原决定簇及其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力以及抗原结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。通常，抗原结合蛋白将以解离常数(10-5至10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7至10-12摩尔/升或更小并且更优选地10-8至10-12摩尔/升的KD(即，以105至1012升/摩尔或更大、并且优选地107至1012升/摩尔或更大并且更优选地108至1012升/摩尔的结合常数(KA))与其同源抗原或特异性抗原结合。任何大于10-4摩尔/升的KD值(或任何低于104M-1的KA值)通常被认为指示非特异性结合。被认为有意义(例如，特异性)的生物相互作用的KD通常在10-10M(0.1nM)至10-5M(10000nM)的范围内。相互作用越强，其KD越低。优选地，本文描述的抗LAP抗体或其抗原结合片段上的结合位点将以小于500nM、优选地小于200nM，更优选地小于10nM、诸如小于500pM的亲和力结合。抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何合适方法来确定，包括，例如，斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合测定，诸如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，以及它们在本领域中本身已知的不同变化形式(variants)；以及本文提到的其他技术。
如本文使用的术语“融合蛋白”是指包含抗体或其片段的氨基酸序列和异源多肽(即，不相关的多肽)的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段是单个结构域抗体。表述“单个结构域抗体”(sdAb)或“单个可变结构域(SVD)抗体”通常指其中可以赋予抗体-抗原结合的单个可变区(VH或')。换言之，单个可变结构域不需要通过与另一个可变区相互作用来识别靶抗原。单个结构域抗体单体单个臂抗原通过每个抗体可变区(VH*VJ组合)来结合。单个结构域抗体的实例包括来源于骆驼科动物(camelids)(骆驼和美洲驼)和软骨鱼(例如护士鲨)抗体的那些抗体以及通过重组方法来自人类抗体和小鼠抗体的那些抗体(Ward等人,Nature(1989)341:544-546；Dooley和Flajnik,Dev Comp Immunol(2006)30:43-56；Muyldermans等人，TrendBiochem Sci(2001)26:230-235；Holt等人TrendsBiotechnol(2003):21:484-490；W02005/035572；TO 03/035694；Davies和Riechmann,FebsLett(1994)339:285-290；W000/29 004；W0 02/051870)，并且抗体的单个可变区可以不同于单个结构域抗体可变区，或者可变结构域存在于抗原结合臂中(例如，同源或异源多聚体在一起)。
如本文使用的，术语“修饰”是指与WT抗体的WT重链恒定区相比，抗体重链恒定区中一个或更多个氨基酸残基的氨基酸取代或氨基酸缺失。在一些实施方案中，修饰在重链恒定区的IgA CH1区中的氨基酸残基中。在一些实施方案中，修饰在重链恒定区的IgA CH2区中的氨基酸残基中。在一些实施方案中，修饰在重链恒定区的IgA CH3区中的氨基酸残基中。在一些实施方案中，修饰选自表2。在一些实施方案中，与对应的WT抗体相比，本文公开的一个或更多个修饰导致包含该一个或更多个修饰的抗体的特性改进。
术语“改进的特性”意指与包含本文公开的一个或更多个修饰的抗体相关的、与不包含该一个或更多个修饰的亲本WT抗体相比被改进的特性。这样的改进的特性包括，但不限于，增加的热稳定性、增加的循环半衰期、增加的ADCC、减少的聚集、减少的与血清蛋白的聚集、增加的肿瘤靶向性、增加的稳定性、减少的糖基化、增加的与免疫细胞上表达的FcαR的结合。在一些实施方案中，与对应的WT IgA相比，改进的特性是抗体或其功能性片段的一种或更多种效应子功能的增加。效应子功能是可归因于抗体Fc区的生物活性，Fc区随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其功能性片段(例如，包含本文公开的在IgA重链恒定区中的一个或更多个修饰)与对应的WT IgA抗体或对应的WT IgG抗体相比具有至少2％、3％、4％、5％、7％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或至少100％的一种或更多种改进的特性。
如本文使用的，术语“对应的”未修饰抗体意指与包含本文公开的一个或更多个选择的修饰的抗体序列相同的野生型抗体，但没有本文描述的一个或更多个选择的修饰，特别是在重链恒定区中。在一些实施方案中，对应的抗体可以是包含WT IgA重链恒定区的WTIgA抗体。在一些实施方案中，对应的抗体可以是包含WT IgG重链恒定区的WT IgG抗体。在一些实施方案中，对应的WT IgA抗体是WT IgA1抗体。在一些实施方案中，对应的WT IgA抗体是WT IgA2抗体。在一些实施方案中，对应的WT IgA抗体包含含有SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的野生型IgA重链恒定区。在一些实施方案中，对应的WT IgA2抗体包含含有SEQID NO:1中列出的氨基酸序列的野生型IgA2重链恒定区。在一些实施方案中，对应的WT IgA抗体包含含有SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的野生型IgA重链恒定区。在一些实施方案中，对应的WT IgA抗体包含含有SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的野生型IgA重链恒定区。在一些实施方案中，WT IgA重链恒定区包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，WT IgA2重链恒定区包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的氨基酸修饰是相对于包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区(例如，WT IgA2重链恒定区)中的选择的位置处的氨基酸残基，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，WT IgA重链恒定区包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，WT IgA2重链恒定区包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的氨基酸修饰是相对于包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区(例如，WT IgA2重链恒定区)中的选择的位置处的氨基酸残基，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，WT IgA重链恒定区包含SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，WT IgA2重链恒定区包含SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的氨基酸修饰是相对于包含SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区(例如，WT IgA2重链恒定区)中的选择的位置处的氨基酸残基，根据IMGT方案编号。
如本文使用的术语“Fab”意图指包含每个重链和轻链的一个恒定结构域和一个可变结构域的抗体的区域(单价抗原结合片段)，但是其中重链被截短，使得它缺少CH2结构域和CH3结构域(即VH、CH1、VL和CL)，并且还可以缺少铰链区的一些或全部。Fab可以通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体来产生。Fab可以单独指这个区域，或者在全长抗体、免疫球蛋白构建体或Fab融合蛋白的上下文中指这个区域。
如本文使用的术语Fab’可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体，随后还原，以产生由完整轻链和包含VH和单个恒定结构域的重链部分组成的分子来获得。以这种方式处理的每个抗体获得两个Fab’片段。
“scFv”意指包含抗体的VFI结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。参见，例如，美国专利第4,946,778号、第5,260,203号、第5,455,030号和第5,856,456号。通常，Fv多肽还在VH结构域与VL结构域之间包含多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun(1994)ThePharmacology of Monoclonal Antibodies第113卷，Rosenburg和Moore编著(Springer-Verlag,New York)第269-315页。Fv片段的VFI结构域和VL结构域复合物也可以通过二硫键来稳定(美国专利第5,747,654号)。
如本文使用的术语“体内半衰期”或“循环半衰期”是指抗体或其功能性片段在特定动物中的循环，并且被表示为动物中施用的量的一半从循环中清除所需的时间。
如本文使用的术语“增加的循环半衰期”意指在血清或血浆中，相对于根据本发明提供的WT IgA抗体包含一个或更多个修饰的抗体相对于不包含相同修饰的相同抗体(即，WT抗体，例如WT IgA抗体)具有更大的持久性和/或花费更长的时间段来降低至最大测量血清或血浆浓度的一半。
术语“增加的热稳定性”意指在一定温度孵育一定时间段之后，相对于对应的WTIgA抗体，本文公开的抗体或功能性片段的生物活性(例如，ADCC、与抗原的结合、与FcαR的结合)的更高保留。增加的热稳定性可以例如在一个或更多个(例如，数个)温度的条件下评价。例如，一个或更多个(例如，数个)温度可以是任何温度或45℃至95℃范围内的温度，例如45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或95℃(或其间，例如，62℃、68℃、72℃等)，在3至9的范围内的一个或更多个(例如，数个)pH，例如3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0(或其间)，持续合适的孵育时间段(时间)，例如，1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟或60分钟(或其间，例如，23分钟、37分钟等)，使得变体保留残余活性。然而，也可以使用更长的孵育时间段。术语“增加的热稳定性”可以与“改进的热稳定性”可互换使用。
如本文使用的，术语“天然存在的”在其涉及IgA重链恒定区中的糖基化位点或氨基酸残基时，是指这样的事实，即，糖基化位点或氨基酸残基可以存在于自然界中的IgA重链恒定区中，例如，可以从自然界中的来源分离并且没有被人类(包括病毒)在实验室中有意修饰。生物体中存在的多肽或多核苷酸序列是天然存在的序列。
术语“疾病”、“紊乱”或“状况”在本文中可互换使用，指身体或一些器官的状态的任何改变，功能执行的中断或干扰，和/或引起患者(person afflicted)或与患者接触的人的症状，诸如不适、功能异常、痛苦或甚至死亡。疾病或紊乱也可以与瘟热、患病(ailing)、小病(ailment)、病(malady)、紊乱、患病(sickness)、疾患(illness)、抱怨(complaint)或做作(affectation)相关。
当在治疗性治疗或预防性治疗的上下文中使用时，术语“有相应需要”意指患有疾病、被诊断为患有疾病或需要预防疾病，例如，对于处于发展疾病风险中的人。因此，有相应需要的受试者可以是需要治疗或预防疾病的受试者。
如本文使用的，术语“施用”是指通过导致在期望部位处至少部分递送剂的方法或途径，将化合物(例如，如本文公开的抗体或其抗原结合片段)置于受试者中。本文公开的包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物可以通过在受试者中导致有效治疗的任何适当的途径施用，包括但不限于静脉内、动脉内注射或直接输注到组织实质中等。在必要或期望的情况下，施用可以包括例如脑室内(“icv”)施用、鼻内施用、颅内施用、体腔内(intracelial)施用、小脑内施用或鞘内施用。
术语“癌症”是指以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴***扩散至身体的其他部位。
术语“抗肿瘤效应”是指可以通过包括但不限于以下的各种方式体现的生物学效应：例如，肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数目的减少、转移数目的减少、预期寿命的增加、肿瘤细胞增殖的减少、肿瘤细胞存活的减少或与癌性状况相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤效应”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来体现。
如本文使用的，“受试者”、“患者”、“个体”等术语可互换使用，并且是指脊椎动物、哺乳动物、灵长类动物或人类。哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、啮齿动物、野生动物或家养动物，包括未驯服动物(feral animals)、农场动物、运动动物和宠物。灵长类动物包括，例如，黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴(spider monkey)和猕猴，例如，恒河猴。啮齿动物包括，例如，小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括，例如，牛、马、猪、鹿、野牛(bison)、水牛(buffalo)、猫科动物物种例如家猫以及犬科动物物种例如犬、狐狸、狼、禽类物种(例如，鸡、鸸鹋、鸵鸟)以及鱼类(例如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可以是雄性/男性或雌性/女性。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛，但不限于这些实例。除了人类之外的哺乳动物可以有利地用作代表与不受控制的细胞生长相关的状况或紊乱(例如，癌症)的动物模型的受试者。非限制性实例包括鼠肿瘤模型。此外，本文描述的组合物和方法可以用于治疗家养动物和/或宠物。受试者可以是先前被诊断为患有或被鉴定为罹患癌症的受试者。受试者可以是被诊断为特定紊乱(例如癌症)并且目前正在被治疗，或正在寻求治疗、监测、调整或修改现有治疗性治疗的受试者，或处于发展特定紊乱(例如癌症)的风险中的受试者。
“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性和/或细胞抑制效应的剂。“细胞毒性效应”是指靶细胞的消耗、消除和/或杀伤。“细胞抑制效应(cytostatic effect)”是指对细胞增殖的抑制。
如本文使用的，术语“蛋白”、“肽”和“多肽”可互换使用，以指通过相邻残基的α-氨基基团和羧基基团之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。术语“蛋白”、“肽”和“多肽”是指氨基酸(包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化氨基酸、糖化氨基酸、糖基化氨基酸等)和氨基酸类似物)的不管其尺寸或功能的聚合物。“蛋白”和“多肽”通常用于指相对较大的多肽，而术语“肽”通常用于指小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用重叠。当述及基因产物及其片段时，术语“蛋白”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。这些术语包括，例如，天然蛋白和人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物(诸如突变蛋白、变体和融合蛋白)，以及翻译后修饰的蛋白、或以其他方式共价或非共价修饰的蛋白。肽、多肽或蛋白可以是单体或多聚体。多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。这样的天然序列多肽可以从自然界中分离，或者可以通过重组或合成手段产生。在一些实施方案中，多肽是“变体”。“变体”意指在对齐序列并引入空位(如有必要)以实现最大序列同一性百分比之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽。这样的变体包括，例如，其中在多肽的N末端或C末端处添加或缺失一个或更多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体将具有至少约80％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将具有至少约90％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将与天然序列多肽具有至少约95％的氨基酸序列同一性。多肽的“衍生物”是已经被化学修饰的多肽(例如，抗体)，所述化学修饰例如，经由缀合至另一个化学部分(诸如例如，聚乙二醇或白蛋白，例如，人类血清白蛋白)、磷酸化和糖基化。
术语“增加的(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”在本文中一般都用来意指增加统计学上显著的量；为避免疑问，术语“增加的(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”意指与参考水平相比至少10％的增加，例如与参考水平相比至少约10％、至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％或至少约90％的增加、或多达并包括100％的增加、或10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或2倍与10倍之间的任何增加或更大的增加。
如本文使用的术语“融合蛋白”是指包含抗体或其片段的氨基酸序列和异源多肽(即，不相关的多肽)的氨基酸序列的多肽。
术语“减少(decrease)”、“降低(reduce)”、“降低(reduction)”、“降低(lower)”、“降低(lowering)”或“抑制(inhibit)”在本文中一般都用来意指减少统计学上显著的量。例如，“减少(decrease)”、“降低(reduce)”、“降低(reduction)”或“抑制(inhibit)”意指与参考水平相比减少至少10％，例如与参考水平相比减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或多达并包括100％的减少(例如，治疗之后的肿瘤尺寸与治疗之前的参考水平相比)或在10％-100％之间的任何减少。在标志物或症状的上下文中，这些术语意指这样的水平的统计学上显著的减少。减少可以是例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选地下降至接受的没有特定疾病的个体的正常范围内的水平。降低或抑制可以涉及，例如，正在治疗的紊乱的症状、转移或微转移的存在或尺寸、原发肿瘤的尺寸、休眠肿瘤的存在或尺寸。
如本文使用的术语“合成多核苷酸”、“合成基因”或“合成多肽”意指对应的多核苷酸序列或其部分、或氨基酸序列或其部分，来源于与等同的天然存在的序列相比已经被设计或从头合成或修饰的序列。合成多核苷酸(抗体或抗原结合片段)或合成基因可以通过本领域已知的方法制备，包括但不限于核酸序列或氨基酸序列的化学合成。合成基因通常在氨基酸水平或多核苷酸水平(或两者)与天然存在的基因不同，并且通常位于合成表达控制序列的背景内。与天然基因相比，合成基因多核苷酸序列可以不必编码具有不同氨基酸的蛋白；例如，它们也可以包括掺入不同的密码子但编码相同氨基酸(即，核苷酸改变代表在氨基酸水平上的沉默突变)的合成多核苷酸序列。
IgA抗体
IgA具有两个亚类(IgA1和IgA2)，并且可以以单体形式以及以二聚形式和分泌形式产生。在一些实施方案中，IgA抗体可以是单体的。在一些实施方案中，IgA抗体可以包含一个或更多个IgA1氨基酸序列。在一些实施方案中，IgA抗体可以包含一个或更多个IgA2氨基酸序列。在一些实施方案中，IgA抗体可以包含一个或更多个IgA1氨基酸序列和一个或更多个IgA2氨基酸序列。
在一些实施方案中，IgA抗体是同种异型的IgA2抗体：IgA2m(1)、IgA2(m)2或IgA2n。在一些实施方案中，IgA2m(1)抗体是高加索人IgA2m(1)抗体。在一些实施方案中，IgA2m(2)抗体是非洲人IgA2m(2)抗体或亚洲人IgA2m(2)抗体。
在一些实施方案中，IgA抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的IgA氨基酸。在一些实施方案中，IgA抗体包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的IgA氨基酸。
在一些实施方案中，IgA抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含IgA CH3区、IgA CH2区或IgA CH1区中的一个或更多个或其任何组合。
在一些实施方案中，IgA抗体包含轻链区，所述轻链区包含IgA CH1区。
在一些实施方案中，IgA抗体包含轻链区，所述轻链区包含κ轻链恒定区。
在一些实施方案中，IgA抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含IgG CH3区、IgG CH2区或IgG CH1区的氨基酸中的一个或更多个或其任何组合。在一些实施方案中，IgA抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含IgA CH3区、IgA CH2区和IgA CH1区或其任何组合。在一些实施方案中，IgA抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含IgA CH3区、IgA CH2区和IgG CH1区或其任何组合。在一些实施方案中，IgA2抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含IgA2 CH3区、IgA2 CH2区或IgA2 CH1区中的一个或更多个或其任何组合。
在一些实施方案中，IgA抗体包含IgG轻链可变区。在一些实施方案中，IgA抗体包含IgG重链可变区。在一些实施方案中，IgA抗体包含IgG轻链可变区和IgG重链可变区。
在一些实施方案中，IgA抗体可以是人源化抗体。在一些实施方案中，IgA抗体可以是嵌合抗体。在一些实施方案中，IgA抗体可以是人类抗体。
在一些实施方案中，IgA抗体可以是单特异性抗体。在一些实施方案中，IgA抗体可以是双特异性抗体。在一些实施方案中，IgA抗体可以是三特异性抗体。在一些实施方案中，IgA抗体可以是多特异性抗体。
在一些实施方案中，IgA抗体可以是双特异性抗体。在一些实施方案中，IgA抗体在细胞表面处共接合两种抗原。在一些实例中，IgA抗体与两种不同抗原的结合是顺序的。例如，IgA抗体与第一抗原的结合首先发生，并且从而限制第二抗体臂探索的空间。因此，第二抗原的局部浓度可以存在显著增加，这可以促进第二抗体臂的结合。
在一些实施方案中，IgA抗体可以包含Fc结构域的至少一部分。在一些实施方案中，IgA抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含CH3结构域、CH2结构域和CH1结构域。在一些实施方案中，IgA抗体包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含CH1。
在一些实施方案中，IgA抗体诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，IgA抗体诱导多形核中性粒细胞(PMN)介导的肿瘤细胞裂解。在一些实施方案中，IgA抗体经由胱天蛋白酶非依赖性途径诱导程序性细胞死亡(PCD)。在一些实施方案中，IgA抗体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，IgA抗体诱导由中性粒细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在一些实施方案中，与对应的IgG抗体相比，IgA抗体可以具有更高的募集用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的中性粒细胞的能力。在一些实施方案中，IgA抗体可以仅需要较低的效应子:靶(E:T)比率。在一些实施方案中，与其他类型的抗体(例如，IgG)相比，IgA抗体可以仅需要更低的肿瘤调理性抗体浓度。在一些实施方案中，IgA抗体可以在IgA抗体-中性粒细胞接合后触发中性粒细胞介导的对肿瘤细胞的吞噬或胞啃(trogocytosis)。这种杀伤肿瘤细胞的机制主要通过与IgA的Fc受体(FcαRI；CD89)相互作用来介导，所述Fc受体(FcαRI；CD89)是被表征得最好的IgA受体。FcαRI在单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞亚群和库普弗细胞上表达，并且以中等亲和力结合单体和二聚体IgA亚型两者。IgA与FcαRI的结合介导效应子功能，诸如吞噬、氧化爆发、细胞因子释放、抗原呈递和ADCC。在人类中，已经区分了两种IgA同种型，IgA1和IgA2，以及三种同种异型，IgA2m(1)、IgA2m(2)和IgA2n。在一些实施方案中，IgA抗体比IgG抗体更有效地触发多形核细胞(PMN)介导的ADCC。
在一些实施方案中，IgA不结合B细胞、T细胞、血小板和/或红细胞。例如，在一些实施方案中，IgA抗体可以具有低免疫原性。
在一些实施方案中，IgA抗体是治疗性抗体。在一些实施方案中，IgA抗体可以是重组抗体。在一些实施方案中，IgA抗体在细胞系中制备。在一些实施方案中，细胞系是CHO。在一些实施方案中，细胞系是SP20。在一些实施方案中，细胞系是HEK 239细胞系。在一些实施方案中，HEK293细胞系是HEK 293F。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或其功能性片段包含IgA重链恒定区，所述IgA重链恒定区与SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文提供的抗体或其功能性片段包含来自IgG抗体的可变重链结构域。在一些实施方案中，本文提供的抗体或其功能性片段包含来自IgG抗体的可变轻链结构域。可变结构域可以来源于，例如，Dinutuximab、奥妥珠单抗、Unituxin、TA99、2.3D11、C47A8-CQ、UMAB10、和曲妥珠单抗和Rituxan(利妥昔单抗)，本发明范围内包括的具有治疗活性的其他抗体包括，但不限于，Avastin、Herceptin、3F8、8H9、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、Actoxumab、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、Aducanumab、阿非莫单抗(Afelimomab)、Afutuzumab、培戈-阿拉赛珠单抗(Alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿利库单抗(Alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)、阿麦妥单抗(Amatuximab)、Anatumomab mafenatox、Anifrolumab、Anrukinzumab、Apolizumab、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿替奴单抗(Atinumab)、Atlizumab、阿托木单抗(Atorolimumab)、Bapineuzumab、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维妥昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利单抗(Belimumab)、Benralizumab、柏替木单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、Bezlotoxumab、比西单抗(Biciromab)、Bimagrumab、Bivatuzumabmertansine、博纳吐单抗(Blinatumomab)、Blosozumab、Brentuximab vedotin、Briakinumab、Brodalumab、康纳单抗(Canakinumab)、Cantuzumab mertansine、Cantuzumabravtansine、Caplacizumab、Capromab pendetide、Carlumab、卡妥索单抗(Catumaxomab)、cBR96-多柔比星免疫缀合物、CC49、Cedelizumab、Certolizumab pegol、西妥昔单抗(Cetuximab)、Ch.14.18、Citatuzumab bogatox、西妥木单抗(Cixutumumab)、Clazakizumab、Clenoliximab、Clivatuzumab tetraxetan、Conatumumab、Concizumab、CR6261、Crenezumab、达西珠单抗(Dacetuzumab)、Daclizumab、Dalotuzumab、达雷木单抗(Daratumumab)、Demcizumab、地诺单抗(Denosumab)、地莫单抗(Detumomab)、Dorlimomabaritox、曲齐妥单抗(Drozitumab)、Duligotumab、Dupilumab、Dusigitumab、Ecromeximab、依库丽单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(Edrecolomab)、依法利珠(Efalizumab)、依芬古单抗(Efungumab)、Eldelumab、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、Elsilimomab、Enavatuzumab、培戈赖莫单抗(Enlimomab pegol)、Enokizumab、Enoticumab、Ensituximab、Epitumomab cituxetan、依帕珠单抗(Epratuzumab)、Erlizumab、Ertumaxomab、伊瑞西珠(Etaracizumab)、Etrolizumab、依伏库单抗(Evolocumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、Fanolesomab、法拉莫单抗(Faralimomab)、Farletuzumab、Fasinumab、FBTA05、Felvizumab、Fezakinumab、Ficlatuzumab、Figitumumab、Flanvotumab、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、Foralumab、Foravirumab、非苏木单抗(Fresolimumab)、Fulranumab、夫妥昔单抗(Futuximab)、加利昔单抗(Galiximab)、Ganitumab、Gantenerumab、Gavilimomab、Gemtuzumab ozogamicin、Gevokizumab、Girentuximab、Glembatumumab vedotin、戈利木单抗(Golimumab)、Gomiliximab、Guselkumab、Ibalizumab、Ibritumomab tiuxetan、Icrucumab、伊戈伏单抗(Igovomab)、IMAB362、英西单抗(Imciromab)、Imgatuzumab、Inclacumab、Indatuximab ravtansine、英夫利昔(Infliximab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、Inotuzumab ozogamicin、英妥木单抗(Intetumumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、伊妥木单抗(Iratumumab)、Itolizumab、Ixekizumab、凯利昔单抗(Keliximab)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、Lambrolizumab、Lampalizumab、Lebrikizumab、Lemalesomab、Lerdelimumab、来沙木单抗(Lexatumumab)、利韦单抗(Libivirumab)、Ligelizumab、林妥珠单抗(Lintuzumab)、Lirilumab、Lodelcizumab、Lorvotuzumabmertansine、卢卡木单抗(Lucatumumab)、鲁昔单抗(Lumiliximab)、马帕木单抗(Mapatumumab)、Margetuximab、马司莫单抗(Maslimomab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、Mavrilimumab、美泊利单抗(Mepolizumab)、美替木单抗(Metelimumab)、米拉妥珠单抗(Milatuzumab)、明瑞莫单抗(Minretumomab)、米妥莫单抗(Mitumomab)、Mogamulizumab、莫罗木单抗(Morolimumab)、Motavizumab、Moxetumomab pasudotox、Muromonab-CD3、Nacolomab tafenatox、那美芦单抗(Namilumab)、Naptumomab estafenatox、Narnatumab、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、奈瑞莫单抗(Nerelimomab)、奈伐苏单抗(Nesvacumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、纳武单抗(Nivolumab)、巯诺莫单抗(Nofetumomab merpentan)、奥卡妥珠单抗(Ocaratuzumab)、Ocrelizumab、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥拉木单抗(Olaratumab)、奥洛珠单抗(Olokizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、奥那妥珠单抗(Onartuzumab)、Ontuxizumab、莫妥珠单抗(Oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥替苏单抗(Orticumab)、奥昔珠单抗(Otelixizumab)、奥乐妥珠单抗(Otlertuzumab)、奥塞芦单抗(Oxelumab)、奥扎珠单抗(Ozanezumab)、Ozoralizumab、帕昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、Pankomab、帕巴库单抗(Panobacumab)、帕萨妥珠单抗(Parsatuzumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、帕利珠单抗(Pateclizumab)、Patritumab、Pemtumomab、佩拉珠单抗(Perakizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、培克珠单抗(Pexelizumab)、匹地利珠单抗(Pidilizumab)、维汀-匹那妥珠单抗(Pinatuzumab vedotin)、Pintumomab、普拉鲁单抗(Placulumab)、Polatuzumabvedotin、泊奈珠单抗(Ponezumab)、普立昔单抗(Priliximab)、瑞托萨昔单抗(Pritoxaximab)、普林木单抗(Pritumumab)、PRO 140、奎利珠单抗(Quilizumab)、雷妥莫单抗(Racotumomab)、雷曲妥单抗(Radretumab)、雷韦单抗(Rafivirumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、瑞西巴库(Raxibacumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、Reslizumab、利妥木单抗(Rilotumumab)、利妥昔单抗、罗妥木单抗(Robatumumab)、罗来度单抗(Roledumab)、Romosozumab、隆利珠单抗(Rontalizumab)、罗维珠单抗(Rovelizumab)、卢利珠单抗(Ruplizumab)、沙马珠单抗(Samalizumab)、Sarilumab、Satumomab pendetide、苏金单抗(Secukinumab)、瑟瑞妥单抗(Seribantumab)、瑟托萨昔单抗(Setoxaximab)、司韦单抗(Sevirumab)、SGN-CD19A、SGN-CD33A、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗(Sifalimumab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、辛妥珠单抗(Simtuzumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、Sirukumab、Solanezumab、索利托单抗(Solitomab)、Sonepcizumab、松妥珠单抗(Sontuzumab)、司他芦单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、舒维珠单抗(Suvizumab)、他贝芦单抗(Tabalumab)、Tacatuzumabtetraxetan、他度珠单抗(Tadocizumab)、Talizumab、他尼珠单抗(Tanezumab)、Taplitumomab paptox、替非珠单抗(Tefibazumab)、Telimomab aritox、替妥莫单抗(Tenatumomab)、替奈昔单抗(Teneliximab)、替利珠单抗(Teplizumab)、替妥木单抗(Teprotumumab)、TGN1412、Ticilimumab、替加珠单抗(Tigatuzumab)、Tildrakizumab、TNX-650、托珠单抗(Tocilizumab)、托利珠单抗(Toralizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、Tovetumab、曲罗芦单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗、TRBS07、曲利珠单抗(Tregalizumab)、Tremelimumab、Tucotuzumab celmoleukin、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌妥昔单抗(Ublituximab)、乌瑞芦单抗(Urelumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、Ustekinumab、Vantictumab、伐利昔单抗(Vapaliximab)、伐利珠单抗(Vatelizumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维森库单抗(Vesencumab)、维西珠单抗(Visilizumab)、Volociximab、Vorsetuzumab mafodotin、伏妥莫单抗(Votumumab)、扎鲁木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、Zatuximab、Ziralimumab、hu14.18K322A、Zolimomab aritox、利妥昔单抗(
Figure BDA0003381014890000551
CD20)、曲妥珠单抗
Figure BDA0003381014890000552
阿仑单抗(
Figure BDA0003381014890000553
CD52)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(
Figure BDA0003381014890000554
CD20)、托西莫单抗-I-131(
Figure BDA0003381014890000555
Cd20)、西妥昔单抗(cetuximab)
Figure BDA0003381014890000556
贝伐单抗(VEGF)、帕尼单抗(
Figure BDA0003381014890000557
EGFR)、奥法木单抗(
Figure BDA0003381014890000558
CD20)、伊匹单抗(
Figure BDA0003381014890000559
CTLA-4)、brentiuximab vedotin(
Figure BDA00033810148900005510
CD30)、帕妥珠单抗(
Figure BDA0003381014890000561
HER2)、adotrastuzumab、ematansine(
Figure BDA0003381014890000562
HER2)、奥妥珠单抗(
Figure BDA0003381014890000563
CD20)、纳武单抗和派姆单抗(pembrolizumab)(抗PD-1)。
在一方面，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)序列，所述重链可变区(VH)序列与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:81-86中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体保留了如WT抗体结合相同抗原的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:81-86中的任一个的氨基酸序列中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:81-86的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的一个或更多个翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:33-40中的任一个的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:41-48中的任一个的氨基酸序列的HC-CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:49-56中的任一个的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:95-100中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了如WT抗体结合相同抗原的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:95-100中的任一个的氨基酸序列的任一个中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:95-100中的任一个的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:57-64中的任一个的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NOS:65-72中的任一个的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NOS:73-80中的任一个的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中VH包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:81-86中的任一个的氨基酸序列，并且其中VL包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:95-100中的任一个的氨基酸序列，并且任选地包括这些序列的翻译后修饰。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自表9中任何VH的VH。在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自表9中任何VL的VL。在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自表9中任何VH的VH和选自表9中任何VL的VL。在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自表9中任何VH的VH和选自表9中任何VL的VL，其中所选择的VH和VL根据表9配对。在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自表5中任何HC-CDR3的HC-CDR3和选自表6中任何LC-CDR3的LC-CDR3，其中所选择的HC-CDR3和LC-CDR3根据表9配对。在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自表5中任何CDR-H2的HC-CDR2和选自表6中任何CDR-L2的LC-CDR2，其中所选择的HC-CDR2和LC-CDR2根据表9配对。在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自表5中任何HC-CDR1的HC-CDR1和选自表6中任何LC-CDR1的LC-CDR1，其中所选择的HC-CDR1和LC-CDR1根据表9配对。在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含选自表5中的任何HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，以及选自表6中的任何LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所选择的HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3根据表9配对。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自表5中的任何HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3中的任一个以及选自SEQ ID NO:16-21的任何IgA重链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自表6中的任何LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3中的任一个以及选自SEQ ID NO:16-21的任何IgA重链恒定区。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自表5中任何HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3中的任一个和选自表6中任何LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3中的任一个以及选自SEQ ID NO:16-21的任何IgA重链恒定区，其中所选择的HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、所选择的LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3以及所选择的IgA重链恒定区根据表9配对。
IgA抗体修饰
本文描述了包含一个或更多个氨基酸取代和/或一个或更多个氨基酸缺失的IgA抗体。
在一些实施方案中，本文描述的IgA抗体的氨基酸编号根据用于C-DOMAIN和C-LIKE-DOMAIN的IMGT独特编号指示(如以下中公开的：“IMGT unique numbering forimmunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-likedomains.”Dev Comp Immunol.2005；29(3):185-203，该文献的全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方案中，本文公开的氨基酸修饰是相对于包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区(例如，WT IgA2重链恒定区)中的选择的位置处的氨基酸残基，根据IMGT方案编号。值得注意的是，以其整体并入本文的US62/824,864还包括抗体和抗体构建体，该抗体和抗体构建体包含根据IMGT编号方案编号的修饰的IgA重链恒定区。其中一些氨基酸无意中被错误标记，并且如US62/824,864中描述的特定氨基酸位置对应于如本文提供的以下特定氨基酸位置。如US62/824,864中提及的位置C92、N120、I121和T122对应于本文描述的抗体中的氨基酸残基C86、N114、I115和T116，它们根据IMGT编号方案(表11中描绘的IMGT编号，仅用于参考位置编号)被正确标记。如US62/824,864中公开的这些抗体的参考野生型重链恒定区序列和本申请相同，即，如图1中示出的SEQ ID NO:1。因此，在US62/824,864中无意中将以IMGT命名方案的残基C86、N114、I115和T116错标为C92、N120、I121和T122对技术人员来说是明显的。
在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体包含恒定区内至少四个糖基化位点的缺失。在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体包含抗体恒定区中至少三个N连接的糖基化位点的缺失。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体恒定区中至少三个N连接的糖基化位点和抗体恒定区中至少一个O连接的糖基化位点的缺失。在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体或功能性片段在IgA重链恒定区中包含本文公开的一个或更多个修饰(例如，表2)。在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体或功能性片段在IgA1重链恒定区中包含本文公开的一个或更多个修饰(例如，表2)。在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体或本文公开的功能性片段在IgA2重链恒定区中包含本文公开的一个或更多个修饰(例如，表2)。在一些实施方案中，一个或更多个修饰位于IgA1重链恒定区的CH1区、CH2区和/或CH3区内的氨基酸残基中。在一些实施方案中，
在一些实施方案中，IgA抗体包含缺失的尾段。在一些实施方案中，一个或更多个修饰位于IgA2重链恒定区的CH1区、CH2区和/或CH3区内的氨基酸残基中。在一些实施方案中，IgA CH1区包含与SEQ ID NO:109中列出的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IgA CH2区包含与SEQ ID NO:110中列出的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IgA CH2区包含与SEQ ID NO:111中列出的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，如本文公开的IgA抗体或其功能性片段包含3-20个、3-19个、3-18个、3-17个、3-16个、3-15个、3-14个、3-13个、3-12个、3-11个、3-10个、3-9个、3-8个、3-7个、3-6个、3-5个、3-4个C末端氨基酸的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含3-20个、3-19个、3-18个、3-17个、3-16个、3-15个、3-14个、3-13个、3-12个、3-11个、3-10个、3-9个、3-8个、3-7个、3-6个、3-5个、3-4个C末端氨基酸的缺失。在一些实施方案中，C末端氨基酸来自IgA2抗体的氨基酸131-148，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸131-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸147-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸146-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸145-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸144-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸143-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸142-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸141-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸140-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸139-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸138-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸137-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸136-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸135-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸134-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸133-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸132-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸131-148的缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸P131-Y148的缺失。
在一些实施方案中，IgA抗体包含C末端天冬酰胺氨(N)基酸的突变。在一些实施方案中，突变是非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，突变使IgA的C末端天冬酰胺(N)氨基酸的糖基化位点缺失。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的N135的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的N135的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的N135Q突变。
在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体或其功能性片段包含IgA重链恒定区中至少两个天然存在的糖基化位点中的修饰。在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体或其功能性片段包含IgA重链恒定区中至少三个天然存在的糖基化位点中的修饰。在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体或其功能性片段包含至少四个天然存在的糖基化位点中的修饰。在一些实施方案中，糖基化位点包括N连接的糖基化位点。在一些实施方案中，糖基化位点包含天然存在的天冬酰胺残基。在一些实施方案中，糖基化位点位于CH2区、CH3区和/或CH1区中。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含根据IMGT方案编号的N45.2G、N15.2、L15.3、T16、N114、I115、T116、N135或其组合处的修饰。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含根据IMGT方案编号的N45.2G、N45.2A、N15.2G、N15.2Q、N15.2T、L15.3I、T16S、N114T、I115L、T116S、N135Q或其组合的氨基酸取代。在一些实施方案中，本文提供了非糖基化的抗体或其功能性片段。在一些实施方案中，非糖基化的抗体包含在IgA2重链恒定区中所有四个天然存在的糖基化位点处的修饰。在一些实施方案中，本文提供的非糖基化的抗体包含以下残基处的修饰：N45.2、N15.2、L15.3、T16、N114、I115、T116和N135，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，本文提供的非糖基化的抗体包含以下残基处的修饰：N45.2、N15.2、N114、I115、T116和N135，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文提供的非糖基化的抗体包含根据IMGT方案编号的残基N45.2、N15.2、L15.3、T16、N114、I115、T116处的修饰以及C末端尾段残基P131-Y148的缺失。在一些实施方案中，本文提供的非糖基化的抗体包含以下残基处的修饰：N45.2、N15.2、N114、I115、T116和P131-Y148，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含根据IMGT方案编号的残基N45.2、N15.2、L15.3、T16、N114、I115、T116和N135处的修饰。在一些实施方案中，本文提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含根据IMGT方案编号的残基N45.2、N15.2、N114、I115、T116和N135处的修饰。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含根据IMGT方案编号的N45.2G、N45.2A、N15.2G、N114T、I115L、T116S和N135Q的氨基酸取代。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含N45.2G、N45.2A、N15.2Q、L15.3I、T16S、N114T、I115L、T116S和N135Q的氨基酸取代。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含根据IMGT方案编号的N45.2G、N45.2A、N15.2G、N15.2T、N114T、I115L、T116S和N135Q的氨基酸取代。在一些实施方案中，包含IgA重链恒定区中根据IMGT方案编号的N45.2G、N45.2A、N15.2G、N114T、I115L、T116S和N135Q的氨基酸取代的组合的抗体为非糖基化的抗体。在一些实施方案中，非糖基化的抗体包含N45.2G、N45.2A、N15.2G、T16S、N114T、I115L、T116S的氨基酸取代的组合以及C末端尾段的缺失。
在一些实施方案中，包含IgA重链恒定区中根据IMGT方案编号的N45.2G、N45.2A、N15.2Q、N114T、I115L、T116S和N135Q的氨基酸取代的组合的抗体为非糖基化的抗体。在一些实施方案中，非糖基化的抗体包含N45.2G、N45.2A、N15.2Q、T16S、N114T、I115L、T116S的氨基酸取代的组合以及C末端尾段的缺失。在一些实施方案中，包含IgA重链恒定区中根据IMGT方案编号的N45.2G、N45.2A、N15.2T、N114T、I115L、T116S和N135Q的氨基酸取代的组合的抗体为非糖基化的抗体。在一些实施方案中，非糖基化的抗体包含N45.2G、N45.2A、N15.2T、T16S、N114T、I115L、T116S的氨基酸取代的组合以及C末端尾段的缺失。在一些实施方案中，包含IgA重链恒定区中为根据IMGT方案编号的N45.2G、N45.2A、N15.2T、L15.3I、T16S、N114T、I115L、T116S和N135Q的氨基酸取代的组合的抗体为非糖基化的抗体。在一些实施方案中，非糖基化的抗体包含N45.2G、N45.2A、N15.2T、L15.3I、T16S、T16S、N114T、I115L、T116S的氨基酸取代的组合以及C末端尾段的缺失。
在一些实施方案中，非糖基化的抗体相对于包含至少一个糖基化位点(例如，根据IMGT方案编号的WT残基N45.2、N114、N15.2和N135)的对应的抗体或对应的WT IgA抗体，表现出增加的循环半衰期。在一些实施方案中，非糖基化的抗体相对于包含至少一个糖基化位点(例如，根据IMGT方案编号的WT残基N45.2、N114、N15.2和N135)的对应的抗体或WT IgA抗体，表现出减少的聚集。在一些实施方案中，非糖基化的抗体相对于包含至少一个糖基化位点(例如，根据IMGT方案编号的WT残基N45.2、N114、N15.2和N135)的对应的抗体或对应的WT IgA抗体，表现出减少的与血清蛋白的聚集。在一些实施方案中，非糖基化的抗体相对于包含至少一个糖基化位点(例如，根据IMGT方案编号的WT残基N45.2、N114、N15.2和N135)的对应的抗体或对应的WT IgA抗体，表现出减少的聚集。在一些实施方案中，非糖基化的抗体相对于包含至少一个糖基化位点(例如，根据IMGT方案编号的WT残基N45.2、N114、N15.2和N135)的对应的抗体或对应的WT IgA抗体，表现出增加的热稳定性。在一些实施方案中，非糖基化的抗体相对于对应的WT IgA表现出以增加的结合亲和力与Fc受体结合。在一些实施方案中，非糖基化的抗体诱导对靶细胞的ADCC。在一些实施方案中，非糖基化的抗体特异性地结合靶抗原。在一些实施方案中，非糖基化的抗体特异性地结合靶细胞。
在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的N45.2的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的N45.2的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的N45.2G。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有N45.2氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的P124的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的P124的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的P124R。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有P124氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有P124氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的稳定性。
在一些实施方案中，如本文描述的抗体包含根据IMGT方案编号的C86的突变(如以上描述的，在以其整体并入本文的US 62/824,864中无意中被称为C92)。在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的C86的非保守突变。在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的C86S。在一些实施方案中，该抗体与不具有C86氨基酸的突变的抗体相比具有减少的聚集。在一些实施方案中，该抗体与不具有C86氨基酸的突变的抗体相比具有减少的与血清蛋白的聚集。在一些实施方案中，该抗体与不具有C86氨基酸的突变的抗体相比在体外或体内具有减少的聚集。
在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案的C86的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的C86的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的C86S。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有C86氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有减少的聚集。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有C86氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有减少的与血清蛋白的聚集。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有C86氨基酸的突变的IgA2抗体相比在体外或体内具有减少的聚集。
在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的N114的突变(如以上描述的，在以其整体并入本文的US 62/824,864中无意中被称为N120)。在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的N114的非保守突变。在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的N114T。在一些实施方案中，该抗体与不具有N114氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的I115的突变(如以上描述的，在以其整体并入本文的US 62/824,864中无意中被称为I121)。在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的I115的非保守突变。在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的I115L。在一些实施方案中，该抗体与不具有I115氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的T116的突变(如以上描述的，在以其整体并入本文的US 62/824,864中无意中被称为T122)。在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的T116的非保守突变。在一些实施方案中，抗体包含根据IMGT方案编号的T116S。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有T116氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的N114的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的N114的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的N14T。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有N114氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案的I115的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的I115的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的I115L。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有I115氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的T116的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的T116的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的T116S。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有T116氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案的N15.2的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的N15.2的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的N15.2G、N15.2Q或N15.2T。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有N15.2氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案的L15.3的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的L15.3的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的L15.3I。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有L15.3氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案的T16的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的T16的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的T16S。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有T16S氨基酸突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的C147的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的C147的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸C147的缺失。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不具有C147氨基酸的突变的IgA2抗体相比具有减少的聚集。
在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的Y148的突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的Y148的非保守突变。在一些实施方案中，IgA2抗体包含根据IMGT方案编号的氨基酸Y148的缺失。
在一些实施方案中，IgA抗体包含一个或更多个白蛋白结合结构域。在一些实施方案中，一个或更多个白蛋白结合结构域与IgA恒定区的轻链或重链融合。在一些实施方案中，一个或更多个白蛋白结合结构域与IgA恒定区的重链融合。在一些实施方案中，一个或更多个白蛋白结合结构域与IgA恒定区的重链的CH3区的C末端区融合。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不包含一个或更多个白蛋白结合结构域的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。在一些实施方案中，IgA2抗体包含一个或更多个白蛋白结合结构域，并且具有在对应的IgG抗体的1％、5％或10％的循环半衰期以内的循环半衰期。在一些实施方案中，IgA2抗体包含一个或更多个白蛋白结合结构域，并且具有大于对应的IgG抗体的循环半衰期的循环半衰期。
在一些实施方案中，IgA抗体包含以下中描述的一个或更多个突变：Lohse S.等人Cancer Res.2015；76(2):403-17；Meyer S.等人mAbs.2016；8(1):87-98；或Leusen J.等人Molecular Immunology.2015；68:35-39。
在一些实施方案中，一个或更多个突变或缺失导致IgA抗体的循环半衰期增加或减少。在一些实施方案中，一个或更多个突变或缺失导致IgA抗体的循环半衰期增加。例如，一个或更多个突变可以使IgA抗体在人类中的血清半衰期增加至多达21天或更长。此外，一个或更多个突变可以使IgA抗体在小鼠中的血清半衰期增加至多达9天或更长。在一些实施方案中，一个或更多个突变可以使IgA抗体的血清半衰期增加至与免疫球蛋白G(IgG)分子的血清半衰期相当的水平。在一些实施方案中，一个或更多个突变或缺失导致IgA抗体的循环半衰期减少。
在一些实施方案中，一个或更多个突变可以使IgA抗体的血清半衰期增加至少约7天至约30天或更长。在一些实施方案中，一个或更多个突变可以使IgA抗体的血清半衰期增加至少约7天。在一些实施方案中，一个或更多个突变可以使IgA抗体的血清半衰期增加至多约30天。在一些实施方案中，一个或更多个突变可以使IgA抗体的血清半衰期增加约7天至约8天、约7天至约9天、约7天至约10天、约7天至约15天、约7天至约20天、约7天至约25天、约7天至约30天、约8天至约9天、约8天至约10天、约8天至约15天、约8天至约20天、约8天至约25天、约8天至约30天、约9天至约10天、约9天至约15天、约9天至约20天、约9天至约25天、约9天至约30天、约10天至约15天、约10天至约20天、约10天至约25天、约10天至约30天、约15天至约20天、约15天至约25天、约15天至约30天、约20天至约25天、约20天至约30天或约25天至约30天。在一些实施方案中，一个或更多个突变可以使IgA抗体的血清半衰期增加约7天、约8天、约9天、约10天、约15天、约20天、约25天或约30天。因此，在一些实施方案中，本文公开的抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比，表现出更长的循环半衰期。在一些实施方案中，该抗体表现出相对于对应的WT IgA抗体大至少约2％、5％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、65％、70％、75％、85％、90％、95％、99％、100％、150％和200％的循环半衰期。
在一些实施方案中，IgA抗体表现出增加的稳定性。在一些实施方案中，与不包含一个或更多个突变和/或一个或更多个缺失的对应的IgA抗体相比，一个或更多个突变和/或一个或更多个缺失导致IgA抗体的稳定性增加。
在一些实施方案中，IgA抗体表现出减少的聚集。抗体聚集是物理不稳定的更常见表现。蛋白聚集物通常具有降低的活性，并且更重要地，由于表位的多重性(multiplicity)和/或构象改变而具有更大的免疫原性潜力。已知免疫球蛋白聚集物会引起严重的肾衰竭和过敏反应，诸如头痛、发热和寒颤。因此，减少抗体治疗剂中的聚集是有利的。此外，根据世界卫生组织(WHO)的标准，商业静脉内免疫球蛋白产品的聚集物水平被限制到少于5％。在一些实施方案中，一个或更多个突变导致减少的聚集。在一些实施方案中，与不包含一个或更多个突变和/或一个或更多个缺失的对应的IgA抗体相比，一个或更多个突变和/或一个或更多个缺失导致IgA抗体的聚集减少。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的聚集。在一些实施方案中，该抗体表现出相对于对应的WT IgA抗体减少至少约2％、至少5％、至少10％、至少12％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少150％和至少200％的聚集。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。在一些实施方案中，该抗体表现出相对于对应的WT IgA抗体减少至少2％、至少5％、至少10％、至少12％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少150％和至少200％的聚集。
在一些实施方案中，本文提供的IgA抗体具有范围为至少约0.1％至至多约5％的聚集物水平。在一些实施方案中，本文提供的IgA抗体具有范围为至少约0.1％的聚集物水平。在一些实施方案中，本文提供的IgA抗体具有范围为至多约5％的聚集物水平。在一些实施方案中，本文提供的IgA抗体具有范围为约0.1％至约0.5％、约0.1％至约1％、约0.1％至约2％、约0.1％至约3％、约0.1％至约4％、约0.1％至约5％、约0.5％至约1％、约0.5％至约2％、约0.5％至约3％、约0.5％至约4％、约0.5％至约5％、约1％至约2％、约1％至约3％、约1％至约4％、约1％至约5％、约2％至约3％、约2％至约4％、约2％至约5％、约3％至约4％、约3％至约5％或约4％至约5％的聚集物水平。在一些实施方案中，本文提供的IgA抗体具有范围为约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％或约5％的聚集物水平。
本文公开的治疗性抗体可以包含合成氨基酸来替代一种或更多种天然存在的氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
取代或缺失氨基酸的方法是本领域已知的。例如，氨基酸取代或缺失可以通过定点诱变来实现(例如，Zoller和Smith Nucl.Acids Res.10:6487(1982))。诱变可以通过合成在待修饰的抗体的恒定结构域序列内具有一个或更多个修饰的寡核苷酸来进行。本公开内容的抗体(例如，在IgA重链恒定区中包含一个或更多个修饰)可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备，诸如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、混编(shuffling)等。定点诱变允许通过以下来产生突变体：使用编码所期望的突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数目的相邻寡核苷酸，以提供足够尺寸和序列复杂性的引物序列，以在被横越的缺失接界(deletion junction)的两侧上形成稳定的双链体。通常，长度为约17个至约75个核苷酸或更多核苷酸的引物是优选的，在被改变的序列的接界的两侧上约10个至约25个或更多的残基。可以使用许多这样的引物在一个或更多个位置处引入各种不同突变来产生突变体文库。
定点诱变技术是本领域已知的(参见例如，Kunkel等人，Methods Enzymol.,154:367-82,1987)。通常，定点诱变通过首先获得单链载体或使双链载体的两条链解链分开来进行，所述单链载体或双链载体在其序列中包含编码所期望的肽的DNA序列。制备携带所期望的突变序列的寡核苷酸引物，通常合成地制备。然后，将该引物与单链载体退火，并且经受DNA聚合酶诸如T7 DNA聚合酶，以完成携带突变的链的合成。由此形成异源双链体，其中一条链编码初始的非突变序列，并且第二条链携带所期望的突变。然后使用该异源双链体载体转化或转染合适的细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)细胞，并且选择包含携带突变序列排列的重组载体的克隆。如将理解的，该技术通常采用以单链和双链两种形式存在的噬菌体载体。可用于定点诱变的典型载体包括诸如M13噬菌体的载体。这些噬菌体是容易地商业上可获得的，并且它们的用途通常是本领域技术人员熟知的。双链质粒也常规地用于定点诱变，这取消了将感兴趣的基因从质粒转移至噬菌体的步骤。定点诱变也被用于鉴定影响鼠IgG1铰链-Fc片段的血浆清除的氨基酸残基，如以下中描述的：Kim Jin-Kyoo等人，(1994)Eur.J.Immunol.24:542-548)。
可选地，使用通过商业上可获得的热稳定酶(诸如Taq DNA聚合酶)进行PCR的用途可以用于将诱变性寡核苷酸引物掺入扩增的DNA片段中，然后可以将该DNA片段克隆到合适的克隆或表达载体中。关于PCR介导的诱变程序，参见，例如，Tomic等人，Nucleic AcidsRes.,18(6):1656,1987，以及Upender等人，Biotechniques,18(1):29-30,32,1995。除了热稳定聚合酶之外，采用热稳定连接酶的PCR也可以用于将磷酸化的诱变性寡核苷酸掺入扩增的DNA片段中，然后可以将DNA该片段克隆到合适的克隆或表达载体中(参见，例如，Michael,Biotechniques,16(3):410-2,1994)。
可以使用本领域技术人员已知的产生抗体的Fc区或其FcR结合结构域的序列变体的其他方法。例如，编码抗体的恒定结构域氨基酸序列或其片段的重组载体可以用诱变剂诸如羟胺处理，以获得序列变体。导致期望的特性(例如，增加的ADCC、减少的聚集、增加的对FcR的亲和力和/或增加的体内半衰期)的突变体可以使用常规测定(诸如下文描述的那些)来筛选。
合成基因构建体要求体外合成设计的编码感兴趣的多肽的多核苷酸分子。基因合成可以利用许多技术进行，诸如由Tian等人(2004,Nature432:1050-1054)描述的其中寡核苷酸被合成并在光可编程微流体芯片上组装的基于多重微芯片的技术以及类似技术。单个或多于一个氨基酸取代、缺失和/或***可以使用以下已知方法来进行和测试：诱变、重组和/或混编，随后是相关的筛选程序，诸如由以下描述的那些：Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991,Biochemistry 30:10832-10837；美国专利第5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人，1986,Gene 46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/混编方法可以与检测宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性的高通量自动化筛选方法组合(Ness等人，1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以从宿主细胞中被回收，并且使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中的个体氨基酸残基的重要性。
半合成基因构建通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或混编的方面来完成。半合成构建的典型特征是利用合成的多核苷酸片段结合PCR技术的过程。因此，基因的特定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物扩增，而又其他的区域可以经历易错PCR或非易错PCR扩增。然后多核苷酸子序列可以被混编。
其他共价修饰
抗体的共价修饰也包括在本发明的范围内。如果适用，则抗体的共价修饰可以通过化学合成或通过抗体的酶促裂解或化学裂解来进行。抗体的其他类型的共价修饰通过使抗体的被靶向的氨基酸残基与能够与选择的侧链或N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应来引入分子中。
半胱氨酰基残基最通常地与卤乙酸(和对应的胺)诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以提供羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰基残基也通过与以下反应来衍生化：溴三氟丙酮、α-溴-(5咪唑基)丙酸(alpha-bromo-(5imidozoyl)propionic acid)、氯乙酰磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸盐(p-chloromercuribenzoate)、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑。
组氨酰基残基通过在pH 5.5-7.0与二乙基焦碳酸酯反应来衍生化，因为这种剂对组氨酰基侧链是相对特异性的。对溴苯酰基溴化物(Para-bromophenacyl bromide)也是有用的；反应优选地在pH 6.0的0.1M二甲砷酸钠中进行。赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。用这些剂衍生化具有逆转赖氨酰基残基的电荷的作用。用于衍生化含α-氨基残基的其他合适试剂包括亚氨酸酯(imidoesters)，诸如甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、甲基异脲、2,4-戊二酮，以及转氨酶催化的与乙醛酸(glyoxylate)的反应。
精氨酰基残基通过与一种或数种常规试剂反应来修饰，其中包括苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。因为胍官能团的高pKa，因此精氨酸残基的衍生化要求反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基基团反应。
可以对酪氨酰基残基进行特定的修饰，特别感兴趣的是通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应，将谱标记物引入酪氨酰基残基中。最通常地，N-acetylimidizole和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。酪氨酰基残基使用125I或131I来碘化，以制备用于放射免疫测定的标记蛋白。羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R-N.dbd.C.dbd.N-R')反应进行选择性修饰，其中R和R'是不同的烷基基团，诸如l-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或l-乙基-3-(4-氮鎓(azonia)-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基常常分别脱酰胺为对应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。这些残基在中性或碱性条件下脱酰胺。这些残基的脱酰胺形式落入本发明的范围内。其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α氨基基团的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,第79-86页(1983))，N末端胺的乙酰化，以及任何C末端羧基基团的酰胺化。
另一类型的共价修饰包括将糖苷化学或酶促偶联至抗体。这些程序的优点在于，它们不要求在具有用于N-连接的糖基化或O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生抗体。根据使用的偶联方式，糖可以被附接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基基团，(c)游离巯基基团，诸如半胱氨酸的那些巯基基团，(d)游离羟基基团，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些游离羟基基团，(e)芳香族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些芳香族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法在以下中描述：1987年9月11日公布的W087I 05330，以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.,第259-306页(1981)。
抗体上存在的任何糖类(carbohydrate)部分的去除可以通过化学或酶促来完成。化学去糖基化要求将抗体暴露于化合物三氟甲烷磺酸或等同化合物。这种处理导致除了连接性糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖的裂解，而抗体保持完整。化学去糖基化由以下描述：Hakimuddin等人Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)以及Edge等人Anal.Biochem.,118:131(1981)。抗体上糖类部分的酶促裂解可以通过使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，如由以下描述的：Thotakura等人Meth.Enzymol.138:350(1987)。
抗体的另一种类型的共价修饰包括将抗体连接至各种非蛋白质性聚合物中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油、聚氧化烯或多糖聚合物诸如右旋糖酐。这样的方法是本领域已知的，参见，例如，美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号；第4,179,337号；第4,766,106号；第4,179,337号；第4,495,285号；第4,609,546号或EP 315 456。
IgA抗体靶
本文描述的IgA抗体可以用于靶向细胞表面上表达的抗原。在一些实施方案中，IgA抗体包含与靶细胞(例如，癌细胞)表面上表达的抗原特异性地结合的抗原结合区。在一些实施方案中，抗原是人类抗原。在一些实施方案中，靶细胞是人类细胞。在一些实施方案中，IgA抗体包含与以下蛋白之一的抗原特异性地结合的抗原结合结构域：CD20、GD2、CD47、CD38、EGFR、HER2、PD-L1、CD25、CD33、BCMA、CD44、CD21、CD64、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER3、叶酸-结合蛋白、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123、VEGF-R2、BCMA、CD19、CD22、CD30、CD33、CD123、CD38、CD44、CD70、CD274、CD45、CD123、CD138、CD171、ROR1、EGFR、EphA2、FBP、FAP、CEA、EGP2、EGP40、TAG72、PSMA、PSA、PAP、hsp70-2、M-CSF、LAGE-la、p53、NKG2D配体、B7-H6、IL-13Rα2、IL-11Rα、MUC1、MUC16、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AIMAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSC1、PCTA-1、MAGE、ELF2M、IGF-I、IGF-II、IGF-I受体、hTERT、WT1、MUC1、LMP2、HPV16、HPV18、RGL4、MelanA、MART、ML-IAP、AFP、BCR、ABL、CYP1B1、PLAC1、BORIS、NY-BR-1、RGS5、SART3、EphA2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)、5T4、8H9、ανβ6整联蛋白、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CSPG4、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、KDR、MCSP、Mucl、Mucl6、NCAM、PRAME、ROR1、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF-R、TAG72、RAGE-1、MN-CA IX、RU1、RU2(AS)、胎儿AchR、TEM1、TEM8、PAX5、OY-TES1、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、tie 2、PDGFR-β、激肽释放酶4、PBF、PRAME、HSDL1、CA125、TADG-12、MUC16、甘露聚糖-MIC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、SP17、SSX4、TAG1、TAG2、ENAH、乳腺珠蛋白-A、NY-BR-1、BAGE-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-KN-1、LAGE1、MAGE1A、MAGEA2、mucink、TRAG3、c-myc、周期蛋白B1、p62、DKK1、RU2AS、k-ras、ME1、NFYC、STEAP1、FGF5、RU2AS、hsp70-2、ARTC1、B-RAF、β连环蛋白、CDC27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLPP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-岩藻糖转移酶、MART2、MATN、MUM1、MUM2、MUM3、neo-PAP、肌球蛋白、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、OA1、RAB38、TRP1、TRP2、melan-A、BAGE1、GAGE1、GAGE2、GAGE8、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GNTVF、LY6K、TRAG3、CASP8、SAGE、DEK-CAN、EFTUD2、FLT3-ITD、周期蛋白A1、FNDC3B、MAGEAG、G250、hepsin、肠羧基酯酶、PBF、CASP5、COA1、OGT、OS9、CALCA、MDM2、α-辅肌动蛋白4、延伸因子2、fos相关抗原1、豆荚蛋白(legumain)、***蛋白17、碳酸酐酶IX、叶酸受体-α、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、神经胶质瘤相关抗原、β-人类绒毛膜***、甲胎蛋白、甲状腺球蛋白、端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、prostein或存活蛋白(survivin)。
神经节苷脂G2
在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体或其功能性片段(即，在IgA重链恒定区中包含本文公开的一个或更多个修饰的抗体)特异性地结合GD2。在一些实施方案中，IgA抗体结合O-乙酰化GD2。在一些实施方案中，IgA抗体结合GD2，而不结合O-乙酰化GD2。在一些实施方案中，IgA抗体结合O-乙酰化GD2，而不结合GD2。在一些实施方案中，抗体结合GD2并且结合O-乙酰化GD2。在一些实施方案中，本文公开的抗体或功能性片段特异性地结合人类GD2多肽。人类来源的GD2和许多动物来源的GD2的多肽和编码核酸序列是公开可获得的，例如，从NCBI网站可获得。
在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体ch14.18重链的至少CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体ch14.18重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体ch14.18轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体ch14.18重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个，以及抗体ch14.18轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体ch14.18重链的CDR1、CDR2或CDR3，以及抗体ch14.18轻链的CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体ch14.18重链的至少CDR3和IgA铰链。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体ch14.18重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体ch14.18重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区和CH2 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体ch14.18重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区、CH2 IgA区和CH3IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含重链可变区，该重链可变区包含氨基酸序列：EVQLLQSGPELEKPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSS[SEQ ID NO:4]。在一些实施方案中，IgA抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK[SEQID NO:5]。在一些实施方案中，IgA抗体包含重链可变区以及轻链可变区，该重链可变区包含氨基酸序列：EVQLLQSGPELEKPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSS[SEQ ID NO:4]，该轻链可变区包含氨基酸序列：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK[SEQ ID NO:5]。
在一些实施方案中，IgA抗体包含可变重链，该可变重链包含以下的一个或更多个：CDR1，该CDR1包含氨基酸序列：EFTFTDYY[SEQ ID NO:10]；CDR2，该CDR2包含氨基酸序列：IRNRANGYTT[SEQ ID NO:11]；CDR3，该CDR3包含氨基酸序列：ARVSNWAFDY[SEQ ID NO:12]。在一些实施方案中，IgA抗体包含可变轻链，该可变轻链包含以下的一个或更多个：CDR1，该CDR1包含氨基酸序列：QSLLKNNGNTFL[SEQ ID NO:13]；CDR2，该CDR2包含氨基酸序列：KVS[SEQ ID NO:14]；CDR3，该CDR3包含氨基酸序列：SQSTHIPYT[SEQ ID NO:15]。
在一些实施方案中，IgA抗体包含可变重链，该可变重链包含以下的一个或更多个：CDR1，该CDR1包含氨基酸序列：EFTFTDYY[SEQ ID NO:10]；CDR2，该CDR2包含氨基酸序列：IRNRANGYTT[SEQ ID NO:11]；CDR3，该CDR3包含氨基酸序列：ARVSNWAFDY[SEQ ID NO:12]；以及可变轻链，该可变轻链包含以下的一个或更多个：CDR1，该CDR1包含氨基酸序列：QSLLKNNGNTFL[SEQ ID NO:13]；CDR2，该CDR2包含氨基酸序列：KVS[SEQ ID NO:14]；CDR3，该CDR3包含氨基酸序列：SQSTHIPYT[SEQ ID NO:15]。
在一些实施方案中，抗GD2 IgA抗体包含3F8抗体的HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3中的一个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)。在一些实施方案中，抗GD2抗体包含3F8抗体的可变重链和/或可变轻链。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的一个或更多个可变区：(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH，(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL和(c)其组合。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3；以及(d)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3；以及包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3；和包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本文公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3。在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，抗体或其抗原结合片段包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQID NO:4的氨基酸序列中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:5的氨基酸序列的任一个中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:5的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH，和SEQ ID NO:5中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的IgA重链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:31的κ轻链恒定区。
CD20
在一些实施方案中，IgA抗体特异性地结合CD20。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含II型或I/II型CD20结合区。在一些实施方案中，本文公开的抗体或功能性片段特异性地结合人类CD20多肽。人类来源的CD20和许多动物来源的CD20的多肽和编码核酸序列是公开可获得的，例如，从NCBI网站可获得。在一些实施方案中，IgA抗体包含与CD20表位特异性地结合的抗原结合结构域，其中所述CD20表位在以下氨基酸序列内：YNCEPANPSEKNSPSTQYCYS[SEQ ID NO:6]。
在一些实施方案中，CD20抗体的可变区描述于PCTNL2017050581中，将其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，重链可变区包含以下氨基酸序列内的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个：QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNLHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARSNSYGSTYWYFDVWGTGTTVTVSS[SEQ IDNO:7]。在一些实施方案中，轻链可变区包含以下氨基酸序列内的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个：QIVLSQSPAVLFASPGEKVTMTCRARSSVSYMDWYQQKPRSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS[SEQ ID NO:8]。
在一些实施方案中，重链可变区包含以下氨基酸序列：QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNLHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARSNSYGSTYWYFDVWGTGTTVTVSS[SEQ ID NO:7]。在一些实施方案中，轻链可变区包含以下氨基酸序列：QIVLSQSPAVLFASPGEKVTMTCRARSSVSYMDWYQQKPRSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS[SEQ ID NO:8]。
在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体奥妥珠单抗的重链的至少CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体奥妥珠单抗的重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体奥妥珠单抗的轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体奥妥珠单抗的重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个，以及抗体奥妥珠单抗的轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体奥妥珠单抗的重链的CDR1、CDR2或CDR3，以及抗体奥妥珠单抗的轻链的CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体奥妥珠单抗的重链的至少CDR3和IgA铰链。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体奥妥珠单抗的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体奥妥珠单抗的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区和CH2 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体奥妥珠单抗的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区、CH2 IgA区和CH3 IgA区。
在一些实施方案中，IgA抗体特异性地结合CD20表位EPANPSEK。
在一些实施方案中，IgA抗体特异性地结合CD20并且与具有相同同种型恒定区的利妥昔单抗相比具有增加的程序性细胞死亡(PCD)功能。在一些实施方案中，IgA抗体特异性地结合CD20并且与具有相同同种型恒定区的利妥昔单抗相比具有增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)功能。在一些实施方案中，IgA抗体特异性地结合CD20并且与具有相同同种型恒定区的利妥昔单抗相比具有增加的补体依赖性细胞毒性(CDC)功能。
在一些实施方案中，IgA抗体与对应的IgG抗体相比具有更短的循环半衰期。在一些实施方案中，与对应的IgG抗体相比，抗CD20 IgA抗体的施用与较少的来自B细胞消耗的副作用相关。在一些实施方案中，与对应的IgG抗体相比，抗CD20抗体的施用与更快的B细胞补充相关。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的一个或更多个可变区：(a)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH，(b)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL，和(c)其组合。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ IDNO:49的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR3；以及(d)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:73的氨基酸序列的LC-CDR3；以及包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR3；和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本文公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:73的氨基酸序列的LC-CDR3。在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，抗体或其抗原结合片段包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:81的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:81的氨基酸序列中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与SEQ ID NO:95的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:95的氨基酸序列的任一个中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:95的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH，和SEQ ID NO:95中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的IgA重链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:31的κ轻链恒定区。
在一些实施方案中，本文提供了特异性地结合CD47的抗体或其功能性片段。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体UMAB10的重链的至少CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体UMAB10的重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体UMAB10的轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体UMAB10的重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个，以及抗体UMAB10的轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体UMAB10的重链的CDR1、CDR2或CDR3，以及抗体UMAB10的轻链的CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体UMAB10的重链的至少CDR3和IgA铰链。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体UMAB10的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体UMAB10的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区和CH2 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体UMAB10的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区、CH2 IgA区和CH3IgA区。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的一个或更多个可变区：(a)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH，(b)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL，和(c)其组合。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3；以及(d)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:80的氨基酸序列的LC-CDR3；以及包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3；和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本文公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:80的氨基酸序列的LC-CDR3。在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：(a)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQID NO:64的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，抗体或其抗原结合片段包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQID NO:7的氨基酸序列中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HC-CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:8的氨基酸序列的任一个中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:8的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH，和SEQ ID NO:8中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的IgA重链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:31的κ轻链恒定区。
Her2
在一些实施方案中，本文提供了特异性地结合Her2的抗体或其功能性片段。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体曲妥珠单抗的重链的至少CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体曲妥珠单抗的重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体曲妥珠单抗的轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体曲妥珠单抗的重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个，以及抗体曲妥珠单抗的轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体曲妥珠单抗的重链的CDR1、CDR2或CDR3，以及抗体曲妥珠单抗的轻链的CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体曲妥珠单抗的重链的至少CDR3和IgA铰链。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体曲妥珠单抗的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体曲妥珠单抗的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区和CH2 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体曲妥珠单抗的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区、CH2 IgA区和CH3 IgA区。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的一个或更多个可变区：(a)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH，(b)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL，和(c)其组合。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ IDNO:51的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:51的氨基酸序列的HC-CDR3；以及(d)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:75的氨基酸序列的LC-CDR3；以及包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HC-CDR3；和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本文公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:75的氨基酸序列的LC-CDR3。在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：(a)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，抗体或其抗原结合片段包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:82的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:82的氨基酸序列中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与SEQ ID NO:96的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:96的氨基酸序列的任一个中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:96的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的LC-CDR3；
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH，和SEQ ID NO:96中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的IgA重链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:31的κ轻链恒定区。
gp75
在一些实施方案中，本文提供了特异性地结合gp75或酪氨酸相关蛋白1的抗体或其功能性片段。在一些实施方案中，本文公开的抗体或功能性片段特异性地结合人类gp75多肽。人类来源的gp75和许多动物来源的gp75的多肽和编码核酸序列是公开可获得的，例如，从NCBI网站可获得。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体TA99的重链的至少CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体TA99的重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体TA99的轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体TA99的重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个，以及抗体TA99的轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体TA99的重链的CDR1、CDR2或CDR3，以及抗体TA99的轻链的CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体TA99的重链的至少CDR3和IgA铰链。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体TA99的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体TA99的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区和CH2 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体TA99的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区、CH2IgA区和CH3IgA区。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的一个或更多个可变区：(a)包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH，(b)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL，和(c)其组合。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:52的氨基酸序列的HC-CDR3；以及(d)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:76的氨基酸序列的LC-CDR3；以及包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HC-CDR3；和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本文公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:60氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:76的氨基酸序列的LC-CDR3。在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：(a)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQID NO:60的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，抗体或其抗原结合片段包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:83的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:83的氨基酸序列中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HC-CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与SEQ ID NO:97的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:97的氨基酸序列的任一个中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:97的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH，和SEQ ID NO:97中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的IgA重链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:31的κ轻链恒定区。
CTLA4
在一些实施方案中，本文提供了特异性地结合细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)的抗体或其功能性片段。在一些实施方案中，本文公开的抗体或功能性片段特异性地结合人类CTLA4多肽。在一些实施方案中，本文公开的抗体或功能性片段特异性地结合小鼠CTLA4多肽。人类来源的CTLA4和许多动物来源的CTLA4的多肽和编码核酸序列是公开可获得的，例如，从NCBI网站可获得。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的一个或更多个可变区：(a)包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH，(b)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL，和(c)其组合。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:53的氨基酸序列的HC-CDR3；以及(d)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:77的氨基酸序列的LC-CDR3；以及包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HC-CDR3；和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本文公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:77的氨基酸序列的LC-CDR3。在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQID NO:61的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，抗体或其抗原结合片段包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:84的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:84的氨基酸序列中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HC-CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与SEQ ID NO:98的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:98的氨基酸序列的任一个中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:98的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH，和SEQ ID NO:98中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的IgA重链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:31的κ轻链恒定区。
CD47
在一些实施方案中，IgA抗体特异性地结合CD47。在一些实施方案中，本文公开的抗体或功能性片段特异性地结合人类CD47多肽。人类来源的CD47和许多动物来源的CD47的多肽和编码核酸序列是公开可获得的，例如，从NCBI网站可获得。在一些实施方案中，IgA抗体使SIRPα与癌细胞表面上表达的CD47的结合降低。在一些实施方案中，IgA抗体与对应的野生型抗体相比以范围为约0.5μM至约999μM的结合亲和力(Kd)与CD47结合。在一些实施方案中，IgA抗体与对应的野生型抗体相比以范围为约1mM至约1000mM的结合亲和力(Kd)与CD47结合。在一些实施方案中，IgA抗体抑制人类CD47与信号调节蛋白α(SIRPα)的相互作用。在一些实施方案中，抑制所述人类CD47与所述SIRPα之间的相互作用使所述IgA抗体的潜力增加。在一些实施方案中，抑制所述人类CD47与所述SIRPα之间的相互作用使肿瘤部位处癌细胞的吞噬和清除增加。在一些实施方案中，癌细胞是IgA调理的癌细胞。在一些实施方案中，IgA抗体包含结合CD47的抗原结合结构域和特异性地结合肿瘤相关抗原的抗原结合结构域(例如，本文描述的抗原结合结构域)。
在一些实施方案中，IgA抗体结合CD47。在一些实施方案中，IgA抗体降低CD47对癌细胞的结合。例如，IgA抗体可以抑制人类CD47与信号调节蛋白α(SIRPα)的相互作用。此外，抑制人类CD47与SIRPα之间的相互作用可以增加IgA抗体的潜力。抑制人类CD47与SIRPα之间的相互作用可以增加肿瘤部位处癌细胞的吞噬和清除。例如，癌细胞可以是IgA调理的癌细胞。在一些实施方案中，本文描述的IgA抗体与CD47具有低亲和力的结合，这防止了IgA抗体与癌细胞之外的细胞上的CD47的结合。在一些实施方案中，本文描述的IgA抗体的低亲和力CD47臂与表达CD47的肿瘤细胞结合。在一些实例中，本文描述的IgA抗体的低亲和力CD47臂不与表达CD47的非肿瘤细胞结合。在一些实施方案中，IgA抗体以至少约0.01微摩尔/升(μM)至约999μM或更大的结合亲和力(Kd)与CD47结合。在一些实施方案中，IgA抗体以至少约0.01μM的结合亲和力(Kd)与CD47结合。在一些实施方案中，IgA抗体以至多约999μM的结合亲和力(Kd)与CD47结合。在一些实施方案中，IgA抗体以以下的结合亲和力(Kd)与CD47结合：约0.01μM至约0.1μM、约0.01μM至约0.5μM、约0.01μM至约1μM、约0.01μM至约5μM、约0.01μM至约10μM、约0.01μM至约50μM、约0.01μM至约100μM、约0.01μM至约200μM、约0.01μM至约300μM、约0.01μM至约500μM、约0.01μM至约999μM、约0.1μM至约0.5μM、约0.1μM至约1μM、约0.1μM至约5μM、约0.1μM至约10μM、约0.1μM至约50μM、约0.1μM至约100μM、约0.1μM至约200μM、约0.1μM至约300μM、约0.1μM至约500μM、约0.1μM至约999μM、约0.5μM至约1μM、约0.5μM至约5μM、约0.5μM至约10μM、约0.5μM至约50μM、约0.5μM至约100μM、约0.5μM至约200μM、约0.5μM至约300μM、约0.5μM至约500μM、约0.5μM至约999μM、约1μM至约5μM、约1μM至约10μM、约1μM至约50μM、约1μM至约100μM、约1μM至约200μM、约1μM至约300μM、约1μM至约500μM、约1μM至约999μM、约5μM至约10μM、约5μM至约50μM、约5μM至约100μM、约5μM至约200μM、约5μM至约300μM、约5μM至约500μM、约5μM至约999μM、约10μM至约50μM、约10μM至约100μM、约10μM至约200μM、约10μM至约300μM、约10μM至约500μM、约10μM至约999μM、约50μM至约100μM、约50μM至约200μM、约50μM至约300μM、约50μM至约500μM、约50μM至约999μM、约100μM至约200μM、约100μM至约300μM、约100μM至约500μM、约100μM至约999μM、约200μM至约300μM、约200μM至约500μM、约200μM至约999μM、约300μM至约500μM、约300μM至约999μM或约500μM至约999μM。在一些实施方案中，IgA抗体以以下的结合亲和力(Kd)与CD47结合：约0.01μM、约0.1μM、约0.5μM、约1μM、约5μM、约10μM、约50μM、约100μM、约200μM、约300μM、约500μM或约999μM。
在一些实施方案中，IgA抗体以约1mM至约1,000毫摩尔/升(mM)的结合亲和力(Kd)与CD47结合。在一些实施方案中，IgA抗体以至少约1mM的结合亲和力(Kd)与CD47结合。在一些实施方案中，IgA抗体以至多约1,000mM的结合亲和力(Kd)与CD47结合。在一些实施方案中，IgA抗体以以下的结合亲和力(Kd)与CD47结合：约1mM至约5mM、约1mM至约10mM、约1mM至约50mM、约1mM至约100mM、约1mM至约200mM、约1mM至约300mM、约1mM至约400mM、约1mM至约500mM、约1mM至约600mM、约1mM至约800mM、约1mM至约1,000mM、约5mM至约10mM、约5mM至约50mM、约5mM至约100mM、约5mM至约200mM、约5mM至约300mM、约5mM至约400mM、约5mM至约500mM、约5mM至约600mM、约5mM至约800mM、约5mM至约1,000mM、约10mM至约50mM、约10mM至约100mM、约10mM至约200mM、约10mM至约300mM、约10mM至约400mM、约10mM至约500mM、约10mM至约600mM、约10mM至约800mM、约10mM至约1,000mM、约50mM至约100mM、约50mM至约200mM、约50mM至约300mM、约50mM至约400mM、约50mM至约500mM、约50mM至约600mM、约50mM至约800mM、约50mM至约1,000mM、约100mM至约200mM、约100mM至约300mM、约100mM至约400mM、约100mM至约500mM、约100mM至约600mM、约100mM至约800mM、约100mM至约1,000mM、约200mM至约300mM、约200mM至约400mM、约200mM至约500mM、约200mM至约600mM、约200mM至约800mM、约200mM至约1,000mM、约300mM至约400mM、约300mM至约500mM、约300mM至约600mM、约300mM至约800mM、约300mM至约1,000mM、约400mM至约500mM、约400mM至约600mM、约400mM至约800mM、约400mM至约1,000mM、约500mM至约600mM、约500mM至约800mM、约500mM至约1,000mM、约600mM至约800mM、约600mM至约1,000mM或约800mM至约1,000mM。在一些实施方案中，IgA抗体以以下的结合亲和力(Kd)与CD47结合：约1mM、约5mM、约10mM、约50mM、约100mM、约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约800mM或约1,000mM。
在一些实施方案中，本文提供了特异性地结合CD47的抗体或其功能性片段。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的重链的至少CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的重链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个，以及抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的一个、两个或三个。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的重链的CDR1、CDR2或CDR3，以及抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的轻链的CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的重链的至少CDR3和IgA铰链。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区和CH2 IgA区。在一些实施方案中，IgA抗体包含抗体2.3D11或抗体C47A8-CQ的重链的至少CDR3、IgA铰链、CH1 IgA区、CH2 IgA区和CH3 IgA区。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的一个或更多个可变区：(a)包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH，(b)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VL，和(c)其组合。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR3；以及(d)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VL。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:78的氨基酸序列的LC-CDR3；以及包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR3；和包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本文公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:62氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:78的氨基酸序列的LC-CDR3。在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQID NO:62的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，抗体或其抗原结合片段包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:85的氨基酸序列中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HC-CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:99的氨基酸序列的任一个中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:99的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH，和SEQ ID NO:99中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的IgA重链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:31的κ轻链恒定区。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的一个或更多个可变区：(a)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH，(b)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL，和(c)其组合。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR3；以及(d)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:79的氨基酸序列的LC-CDR3；以及包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR3；和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，本文公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:63氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQID NO:79的氨基酸序列的LC-CDR3。在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，本公开内容提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR1；(b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HC-CDR2；(c)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR3；(d)包含SEQID NO:63的氨基酸序列的LC-CDR1；(e)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的LC-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，抗体或其抗原结合片段包含VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO:86的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:86的氨基酸序列中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR1，(b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HC-CDR2，和(c)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与SEQ ID NO:100的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留了与抗原结合的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:100的氨基酸序列的任一个中总共1个至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。在一些实施方案中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:100的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的LC-CDR1；(b)包含SEQ IDNO:71的氨基酸序列的LC-CDR2；和(c)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH，和SEQ ID NO:100中的VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的IgA重链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:31的κ轻链恒定区。
改进的IgA抗体特性和功能
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其功能性片段相对于对应的野生型IgA抗体表现出改进的稳定性。如本文使用的术语“增加的稳定性”包括增加的热稳定性和/或减少的聚集。增强或改进的稳定性可以通过例如加速稳定性研究来确定。示例性加速稳定性研究包括但不限于以储存温度增加为特征的研究。与对应的WT IgA抗体相比观察到的抗体聚集物形成的减少表明稳定性增加。本公开内容的抗体及其功能性片段的稳定性可以通过测量抗体与对应的野生型IgA抗体免疫球蛋白相比的解链温度转变(melting temperaturetransition)的改变来测试。在这样的实施方案中，抗体或其功能性片段相对于对应的WTIgA或其功能性片段增加的稳定性或增加的热稳定性随着的解链温度转变的增加将变得明显。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段比对应的WT IgA抗体具有更高的温度。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其功能性片段的解链温度比对应的WT IgA抗体高至少约0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.8倍、1.0倍或更高。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其功能性片段的解链温度比对应的WT IgA抗体高至少约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、12℃、15℃或更多。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其功能性片段具有至少约60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或更高的解链温度。在一些实施方案中，这种增加的稳定性是由于不存在另外的二硫键。特别地，增加的稳定性是由于IgA重链恒定区中不存在另外的二硫键。在一种实施方案中，本文公开的抗体的CH3结构域与野生型CH3结构域相比不包含另外的二硫键。在可选的实施方案中，本文公开的抗体的CH3结构域与野生型CH3结构域相比包含至少一个二硫键。
用于测量蛋白聚集的其他方法描述于美国专利申请序列号10/176,809和US20030022243A1中，所述专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。各种用于测量蛋白稳定性的分析技术是本领域可获得的，诸如下文概述的那些技术：Peptide and ProteinDrug Delivery,247-301,Vincent Lee编著，Marcel Dekker,Inc.,New York,New York,Pubs.,1991；和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90,1993。稳定性可以在选择的温度持续选择的时间来测量。稳定性以各种不同的方式定性地和/或定量地确定，包括确定聚集物形成(例如，使用尺寸排阻层析或通过测量浊度和/或目视检查)。它可以。方法如下：使用阳离子交换层析或毛细管区带电泳评价电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列的分析；质谱术分析；比较还原或完整的抗体的SDS-PAGE分析；肽图谱(例如，胰蛋白酶或LYS-C)分析；确定抗体的生物活性或抗原结合功能。不稳定性包括以下任何一种或更多种：聚集、氧化(例如Met氧化)、异构化(例如Asp异构化)、剪切/水解/片段化(例如，铰链区的片段化)、琥珀酰亚胺形成、不成对的半胱氨酸、N末端延伸、C末端加工等。术语“降低的聚集”是指与对应的WT IgA抗体表现出的聚集相比，本公开内容的抗体或其功能性片段与其他抗体分子和/或包括血清蛋白(诸如白蛋白)在内的其他大分子的聚集降低。
抗体相对于对应的WT IgA抗体或其变体增加的热稳定性可以通过差示扫描量热法(DSC)使用本领域标准的方法(参见，例如，Sturtevant,1987,Annual Review ofPhysical Chemistry 38:463-488)来确定。抗体相对于对应的WT IgA抗体或其变体增加的热稳定性也可以使用蛋白热解折叠分析(thermal unfolding analysis)来确定。可选地，抗体相对于对应的WT IgA抗体或其变体增加的热稳定性可以使用用于抗体的任何应用测定来确定，其中抗体的性能与WT进行比较。例如，对靶细胞的ADCC、与抗原的结合或与免疫细胞上的FcαR的结合。
IgA抗体的免疫效应子功能
本文提供了工程化IgA变体或抗体，所述工程化IgA变体或抗体在其重链恒定区内相对于包含WT重链恒定区的对应的WT IgA抗体包含一个或更多个修饰。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其功能性片段(例如，包含本文公开的一个或更多个修饰的抗体)表现出改进的特性。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体或其功能性片段相比，表现出至少一种效应子功能的增加。效应子功能是可归因于抗体Fc区的生物活性，Fc区随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬。例如，本文公开的抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体或其功能性片段或对应的WT IgG抗体相比，表现出至少一种效应子功能的增加。抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是抗体的IgA Fab部分与细胞表面上的抗原之间形成复合物以及Fc部分与免疫效应细胞上的Fc受体(FcαR)结合的结果。例如，效应子功能的增加可以是增加的与Fc受体(例如，FcαR)的结合亲和力，增加的ADCC；增加的细胞介导的免疫；增加的与细胞毒性CD8 T细胞的结合；增加的与NK细胞的结合；增加的与巨噬细胞的结合；增加的与多形核细胞的结合；增加的与单核细胞的结合；增加的与巨噬细胞的结合；增加的与大颗粒淋巴细胞的结合；增加的与粒细胞的结合；诱导凋亡的直接信号传导；增加的树突细胞成熟；或增加的T细胞启动、增加的调理作用或增加的调理吞噬。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段诱导癌细胞裂解。裂解可以通过任何机制诱导，诸如通过介导效应子功能，诸如C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬或直接诱导细胞凋亡。
ADCC
“ADCC活性”是指抗体引发ADCC反应的能力。ADCC是细胞介导的反应，其中表达FcR的抗原非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合至靶细胞表面的抗体，并随后引起靶细胞(例如，癌细胞)的裂解(即“杀伤”)。主要的介体细胞(mediator cell)可以是自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞。ADCC活性可以使用体外测定直接评价，例如，使用外周血单个核细胞(PBMC)和/或NK效应细胞进行的51Cr释放测定(如实施例和Shields等人(2001)J.Biol.Chem.,276:6591-6604中描述的)或本领域已知的其他合适的方法。ADCC活性可以表示为靶细胞的裂解为半最大值时的抗体浓度。因此，在一些实施方案中，与野生型对照的半最大裂解水平相同的裂解水平的本公开内容的抗体或其抗原结合片段的浓度比野生型对照本身的浓度低至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。
此外，在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其功能性片段与对应的野生型IgA相比可以表现出更高的最大靶细胞裂解。例如，本公开内容的抗体或其功能性片段的最大靶细胞裂解可以比对应的WT IgA抗体或对应的WT IgG抗体的最大靶细胞裂解高2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或更多。在一些实施方案中，本文公开内容的抗体或其功能性片段与包含IgG重链恒定结构域的对应的WT IgG抗体相比诱导的ADCC增加。在一些实施方案中，相对于对应的WT IgG抗体，ADCC增加至少2％、至少5％、至少10％、至少12％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％、至少150％和至少200％。
CDC
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在的情况下，分子裂解靶(例如癌细胞)的能力。补体激活途径通过补体***第一组分(C1q)结合与同源抗原复合的分子(例如抗体)而启动。为了评价补体激活，可以进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人J.Immunol.Methods 202:163(1996)中描述的。
Fc受体结合
在一些实施方案中，抗体或其功能性片段结合Fc受体。在一些实施方案中，Fc受体在免疫效应细胞上表达。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其功能性片段结合免疫效应细胞上的Fc受体并诱导效应子功能，诸如ADCC、CDC和/或靶细胞(例如癌细胞)的细胞裂解。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段结合IgA受体。在一种实施方案中，IgA受体是Fc-α受体(FcαR)，诸如人类IgA的FcαR。在一些实施方案中，FcαR在免疫效应细胞上表达。FcαR存在于免疫效应细胞，例如，单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和其他髓样细胞(myeloid cell)上。FcαR也可以存在于晚幼粒细胞(metamyelocyte)、髓细胞、早幼粒细胞和一些来自例如骨髓的成髓细胞上。这样的受体也可以存在于髓样细胞系，例如，U937、PLB985和HL60细胞上。还已提出，FcαR存在于淋巴细胞上。FcαR的表达可以通过激活髓样细胞来增加。例如，用乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)刺激U937细胞和PLB985细胞使FcαR的细胞表面水平增加了数倍(Maliszewski等人(1990)J Exp.Med.172:1665)。其他能够增加FcαR表面水平的剂包括骨化三醇、1-25二羟基维生素D3和干扰素-γ(IFN-γ)。
FcαR能够以单体、二聚体和聚合物的形式与IgAl和IgA2相互作用。本公开内容的抗体或其功能性片段与携带这些受体的免疫效应细胞(例如，中性粒细胞)的结合诱导多种效应子功能，诸如吞噬、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、炎症介体释放、溶菌酶产生和超氧阴离子产生(Maliszewski等人(1990)J Exp.Med.172:1665)。
因此，本公开内容的抗体或其功能性片段(例如，包含本文公开的一个或更多个修饰的抗体)能够触发至少一种Fc受体介导的效应细胞功能。术语“Fc受体介导的效应细胞功能”意图包括效应子功能，诸如上文列出的，效应子功能通过免疫球蛋白例如IgA与效应免疫细胞上的Fc受体的结合而触发。效应免疫细胞是参与与免疫应答的认知和激活期(cognitive and activation phase)相对的免疫应答效应期的细胞。效应免疫细胞包括淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞，包括细胞裂解性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。效应免疫细胞可以吞噬靶抗原、靶细胞或微生物。效应免疫细胞也可以裂解靶细胞或微生物。
在一些实施方案中，效应免疫细胞是能够诱导ADCC(例如，中性粒细胞能够诱导ADCC)依赖性细胞的细胞。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞将特异性地杀伤靶细胞，参与向免疫***的其他组成部分呈递抗原或与抗原呈递细胞结合。在另一种实施方案中，效应免疫细胞可以是诱导对靶抗原、靶细胞或微生物的吞噬的细胞。效应免疫细胞可以是诱导针对靶抗原或靶细胞或可溶物(soluble)的巨噬细胞活性的巨噬细胞。
如本文使用的术语“靶细胞”是指可以被本公开内容的抗体或其功能性片段靶向的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是表达或过表达被本公开内容的抗体或其功能性片段特异性识别的抗原的细胞。靶细胞涉及任何细胞。在其他实施方案中，靶细胞包括肿瘤细胞。肿瘤细胞可以是例如任何类型的癌症中的肿瘤细胞，包括乳腺癌、卵巢癌、***癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、CNS癌、肾癌、头部癌、颈部癌、血癌和淋巴癌。除了肿瘤细胞之外，靶细胞可以是例如产生IgE的淋巴细胞，用于治疗自身抗体靶向或用于产生淋巴细胞、过敏或用于治疗自身免疫性疾病。此外，靶可以是微生物(细菌或病毒)或可溶性抗原(诸如类风湿性因子、类似或不同的自身抗体和毒素)。微生物包括病原体(例如，病毒、细菌、真菌、原生动物)。在一些实施方案中，靶细胞可以是淋巴细胞，例如，表达CD20的B细胞。
在一些实施方案中，本文公开的抗体相对于对应的WT IgA，表现出对效应免疫细胞上的Fc受体的结合亲和力增加至少约2％、至少5％、至少10％、至少12％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或更多。
与靶抗原的结合
在一些实施方案中，本公开内容的抗体及其功能性片段结合特定靶抗原。术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质、免疫原性物质的片段或部分、肽表位或半抗原(hapten)。同样，术语“抗原”也以非免疫原性的形式包括在非复合物质中，并且当复合时具有免疫原性。术语“非复合”涉及形成本发明的分子复合物，包括物质的转移。术语“复合物(composite)”涉及包括形成本发明分子复合物的物质。在一些实施方案中，靶抗原在靶细胞上表达或过表达。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段与靶抗原的结合诱导Fc介导的对表达靶抗原的靶细胞的细胞裂解(例如，通过ADCC)。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其功能性片段与靶抗原的结合诱导对靶抗原的“中和活性”。如本文使用的术语“中和活性”是指抗体或其功能性片段阻断同源配体与靶抗原结合的能力。
降低的糖基化
在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其功能性片段与对应的WT IgA相比表现出降低的糖基化。抗体可以是完全非糖基化的或部分非糖基化的。术语“糖基化”是指一种或更多种糖类与多肽的共价连接。通常，糖基化是翻译后事件，可以发生在细胞的胞内环境或细胞提取物中。术语糖基化包括，例如，N-连接的糖基化(其中一个或更多个糖连接至天冬酰胺残基)和/或O-连接的糖基化(其中一个或更多个糖连接至具有羟基基团的氨基酸残基(例如，丝氨酸或苏氨酸))。在优选的实施方案中，糖基化是指N-连接的糖基化。在一些实施方案中，降低的糖基化可以通过修饰天然存在的糖基化位点中的天冬酰胺残基来实现。在一些实施方案中，降低的糖基化通过修饰天然存在的糖基化基序或天然存在的糖基化位点(例如，包含氨基酸序列NXT或NXS的N-连接的糖基化位点)附近或之内的氨基酸残基来实现。在一些实施方案中，降低的糖基化通过修饰至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个天然存在的糖基化位点来实现。在一些实施方案中，天然存在的糖基化位点在CH2区中。在一些实施方案中，天然存在的糖基化位点在CH3区中。在一些实施方案中，天然存在的糖基化位点在CH1区中。已经描述了共有基序，即，被各种糖基转移酶识别的氨基酸序列。例如，N-连接的糖基化基序的共有基序通常是NXT或NXS，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，为了鉴定抗体或含Fc片段内的潜在糖基化位点，抗体的序列通过以下来检查，例如，使用公开可获得的数据库，诸如生物序列分析中心(Center for BiologicalSequence Analysis)提供的网站(对于预测N-连接的糖基化位点参见www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/，并且对于预测O-连接的糖基化位点参见www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)。测量糖基化的方法是本领域已知的，例如，参见Roth等人，InternationalJournal of Carbohydrate Chemistry,第2012卷,Article ID 640923和WO2003102018A2，将其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本文公开的抗体相对于对应的WT IgA表现出糖基化降低至少约2％、至少5％、至少10％、至少12％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或更多。在一些实施方案中，本文公开的抗体或功能性片段相对于对应的WT IgA抗体被部分糖基化，例如，少于100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更少。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其功能性片段相对于对应的WT IgA抗体被完全糖基化。
生物分布
在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体或其功能性片段相对于对应的WT IgA抗体表现出增加的生物分布。如本文使用的，术语“生物分布”是指施用或递送至受试者的本文公开的IgA抗体或其功能性片段的细胞分布和/或组织分布和/或器官分布。如本文所用，术语“增加的生物分布”通常指与由媒介物或对应的WT IgA抗体引起的反应相比，本文公开的IgA抗体或其功能性片段具有向靶位点(例如，靶向肿瘤或肿瘤细胞)的增加的分布。技术人员已知的各种方法可以用于评价增加的细胞或组织的生物分布，所述方法包括但不限于：核医学、全身放射自显影、显微放射自显影；萦光成像、冷冻成像、纳米二次离子质谱(nanoSIMS)、基质辅助激光解吸成像(matrix-assisted laser desorption imaging，MALDI-MS)、射线照相(X射线)、磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、微超声单光子发射CT(SPECT)、正电子发射断层扫描(PET)等。抗体向靶位点的增加的生物分布，包括与媒介物或WT IgA抗体相比至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％或更大的增加。“增加的”或“增强的”组织分布或生物分布通常是“统计学上显著的”增加，并且可以包括为媒介物或对照组合物的分布的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括其间和高于1的所有整数和十分位数，例如1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍等)的增加。
制备抗体的方法：
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段在宿主细胞中制备。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段从宿主细胞中分离。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段在无细胞***中制备。编码本公开内容的抗体、部分或多肽的分离的核酸分子可以根据常规技术与载体DNA(例如，表达载体)重组，常规技术包括用于连接的平末端化或交错末端化末端、提供合适末端的限制性酶消化、适当时填充粘性末端、避免不期望的连接的碱性磷酸酶处理以及用合适的连接酶连接。用于这些操作的技术公开于以下中：例如，Maniatis等人，Molecular Cloning,Lab.Manual(Cold Spring Harbor Lab.Press,NY,1982和1989)以及Ausubel,1987,1993，并且可以用于构建编码抗体分子或其抗原结合区的核酸序列。因此，本公开内容提供了包含本文列出的分离的核酸的载体或表达载体。在一种实施方案中，编码轻链的核酸和编码重链的核酸通过上述程序单独分离。在一种实施方案中，编码轻链的分离的核酸和编码重链的分离的核酸可以被***到单独的表达质粒中，或者一起***到同一质粒中，条件是每一个都处于合适的启动子和翻译控制下。
在分离的核酸分子被置于表达载体中后，然后它们被转染到宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、人类胚胎肾293细胞(例如293E细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞(这些细胞不以其他方式产生免疫球蛋白蛋白)，以在重组宿主细胞中获得抗体或其抗原结合片段的合成。抗体的重组产生是本领域熟知的。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一个或更多个：信号序列、复制起点、一个或更多个选择标志物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
分离的核酸分子可操作地连接至载体DNA中的表达控制序列。表达控制序列是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列包括，例如，启动子、任选地操作序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调节序列与异源核酸序列之间的功能性连接，这导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列被置于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的DNA序列可以彼此是连续的，并且例如，在需要连接两个蛋白编码区的情况下，处于同一阅读框中。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能性关系中时，核酸被可操作地连接。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接意味着被连接的DNA序列是连续的，和/或可以是连续的并且处于阅读相中(in reading phase)。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点处连接来完成。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
细胞、细胞系和细胞培养物通常可互换使用，并且本文中所有这样的命名都包括子代。转化体和转化细胞包括原代受试细胞和来源于其的培养物，而不考虑传代数(numberof transfer)。还应理解，由于有意或无意的突变，所有子代的DNA内容可能不是精确地相同。在初始转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物活性的突变体子代被包括在内。在意图使用不同命名的情况下，不同命名根据上下文将是清楚的。在可选的实施方案中，基于感兴趣的免疫球蛋白的已知氨基酸序列，可以根据通用密码子表设计合适的编码核酸序列。
期望的抗体的氨基酸序列变体可以通过将合适的核苷酸改变引入编码DNA中或通过肽合成来制备。这样的变体包括，例如，抗体氨基酸序列中残基的缺失和/或***和/或取代。进行缺失、***和取代的任何组合以实现最终的构建体，条件是最终的构建体具有所期望的特征。氨基酸的改变也可以改变单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体或变体抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子通过各种方法来制备。这些方法包括但不限于，从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况下)，或通过对抗体的先前制备变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒诱变来制备。
本公开内容还提供了编码本文描述的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子(其任选地可操作地连接至由宿主细胞识别的调节控制序列，载体和宿主细胞包含该核酸)，以及用于产生抗体的重组技术，所述重组技术可以包括培养宿主细胞使得核酸被表达，以及任选地，从宿主细胞培养物或培养培养基回收抗体。
对于重组产生抗体或其抗原结合片段，可以分离编码抗体或其抗原结合片段的核酸分子并***到可复制的载体中，用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。相应地，本文提供了分离的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以是重组抗体。术语“重组抗体”是指由转染了包含抗体编码序列的表达载体(或可能多于一种表达载体，通常是两种表达载体)的细胞或细胞系中表达的抗体，其中所述编码序列不与细胞天然相关。在一种实施方案中，重组抗体具有的糖基化模式不同于具有相同序列的抗体如果存在于自然界中时的糖基化模式。在一种实施方案中，重组抗体在非人类宿主细胞的哺乳动物宿主细胞中表达。值得注意的是，单独哺乳动物宿主细胞具有独特的糖基化模式。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体或抗原结合片段是合成的。本公开内容的多肽可以通过蛋白质化学领域通常已知的蛋白的分离/纯化方法来纯化。
在一方面，本文提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含本文描述的分离的核酸分子或包含本文描述的分离的核酸分子的载体。载体可以是克隆载体或表达载体。用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适的宿主细胞是上文描述的原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏杆菌属(Escherichia)例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)以及杆菌纲(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis，例如，1989年4月12日公布的DD266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其他菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌Xl 776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些实例是说明性的，而不是限制性的。
除了原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株在本文通常也是可用的和有用的，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)宿主，诸如，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、K.bulgaricus(ATCC 16,045)、K.wickeramii(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果萧克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如，例如，脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及来自以下宿主的对应的容许性昆虫宿主细胞：诸如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果萧(Drosophila melanogaster)(果萧)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的各种病毒株是公开可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NP\7的Bm-5株，并且这样的病毒可以在此用作根据本发明的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、碧冬茄属(petunia)、番茄、烟草、浮萍属(lemna)的植物细胞培养物和其他植物细胞也可以用作宿主。然而，在脊椎动物细胞方面兴趣最大，并且脊椎动物细胞在培养中的繁殖(组织培养)已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是中国仓鼠卵巢细胞，包括CHOKl细胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；通过SV40转化的猴肾CVl系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人类胚胎肾系(293细胞或用于在悬浮培养基中生长的亚克隆的293细胞，[Graham等人，J.Gen Viral.36:59(1977)]；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL 10)；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CVlATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类***细胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞和人类肝细胞瘤系(Hep G2)。
宿主细胞用以上描述用于抗体产生的表达或克隆载体转化或转染，并且在常规营养培养基中培养，所述培养基经适当修改以诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。此外，具有由选择标志物隔开的多个拷贝的转录单元的新型载体和转染细胞系对于本文描述的抗体的表达特别有用且是优选的。
为了转染表达载体和产生本文描述的嵌合、人源化或复合的人类抗体，受者细胞系可以是骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可以合成、组装和分泌由转染的免疫球蛋白核酸序列编码的免疫球蛋白，并且具有免疫球蛋白糖基化的机制。例如，在一些实施方案中，受者细胞是重组产生Ig的骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC#CRL 8287)。SP2/0细胞仅产生由转染的基因编码的免疫球蛋白。骨髓瘤细胞可以在培养物中或小鼠腹膜腔中生长，在腹膜腔中可以从腹水获得分泌的免疫球蛋白。其他合适的受者细胞包括淋巴细胞，诸如人类或非人类来源的B淋巴细胞、人类或非人类来源的杂交瘤细胞或种间异源杂交瘤细胞。本文描述的携带嵌合、人源化或复合的人类抗体构建体或抗体多肽的表达载体可以通过各种合适方法中的任一种引入适当的宿主细胞中，所述方法包括诸如转化、转染、接合(conjugation)、原生质体融合、磷酸钙沉淀和应用聚阳离子诸如二乙基氨基乙基(DEAE)右旋糖酐的生化方法，以及诸如电穿孔、直接显微注射和微弹射轰击(microprojectile bombardment)的机械方法。如本领域普通技术人员已知的Johnston等人,240Science 1538(1988)。
对于产生免疫球蛋白H链和L链，酵母相比于细菌提供了某些优点。酵母进行翻译后肽修饰，包括糖基化。存在许多重组DNA策略，它们利用强启动子序列和高拷贝数质粒，这可用于在酵母中产生所期望的蛋白。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物的前导序列，并且分泌携带前导序列的肽(即，前肽(pre-peptide))。Hitzman等人，11th Intl.Conf.Yeast,Genetics&Molec.Biol.(Montpelier,France,1982)。可以常规评价酵母基因表达***的抗体多肽或其抗原结合片段肽以及组装的嵌合、人源化或复合的人类抗体、其片段及区域的产生、分泌和稳定性的水平。当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，可以利用一系列掺入了来自编码大量产生的糖酵解酶的活跃表达基因的启动子和终止元件酵母基因表达***中的任一种。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的启动子和终止子信号。可以采用许多方法来评价用于在酵母中表达克隆的免疫球蛋白cDNA的最佳表达质粒。
细菌菌株也可以用作产生本文描述的抗体分子或其片段的宿主，可以使用大肠杆菌K12菌株诸如大肠杆菌W3110(ATCC 27325)，芽孢杆菌属(Bacillus)物种，肠细菌诸如鼠伤寒沙门氏菌或粘质沙雷氏菌，以及各种假单胞菌属物种。包含来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些细菌宿主结合使用。载体携带复制位点以及能够在转化细胞中提供表型选择的特定基因。可以采用许多方法来评价用于在细菌中产生由克隆的免疫球蛋白cDNA或CDR编码的嵌合、人源化或复合人源化的抗体及其片段的表达质粒(参见Glover,1985；Ausubel,1987,1993；Sambrook,1989；Colligan,1992-1996)。
宿主哺乳动物细胞可以在体外或体内生长。哺乳动物细胞对免疫球蛋白蛋白分子提供翻译后修饰，包括前导肽去除、H链和L链的折叠和组装、抗体分子的糖基化以及功能性抗体蛋白的分泌。除了以上描述的淋巴来源的细胞之外，可以用作产生抗体蛋白的宿主的哺乳动物细胞包括成纤维细胞来源的细胞，诸如Vero(ATCC CRL 81)或CHO-K1(ATCC CRL61)细胞。可以用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于，COS细胞，包括COS7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S细胞和DG44细胞；PER.C6.RTM.细胞(Crucell)和NSO细胞。在一些实施方案中，特定的真核宿主细胞基于其对可变重链和/或可变轻链进行所期望的翻译后修饰的能力来选择。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生的多肽比293细胞中产生的相同多肽具有更高水平的唾液酸化。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段的多肽可以根据任何合适的方法在用一种或更多种编码多肽的核酸分子工程化或转染的动物中体内产生。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段在无细胞***中产生。非限制性的示例性无细胞***描述于以下中：例如，Sitaraman等人，Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。
许多载体***可用于在哺乳动物细胞中表达H链和L链核酸序列(参见Glover,1985)。可以遵循不同的方法来获得完整的H2L2抗体。如以上讨论，可以在同一细胞中共表达H链和L链，以实现H链和L链的胞内缔合和连接为完整的四聚体H2L2抗体和/或抗原结合片段肽。共表达可以通过在同一宿主中使用相同或不同的质粒而发生。H链和L链两者和/或CDR3区肽的基因可以置于同一质粒中，然后将质粒转染到细胞中，从而直接选择表达这两条链的细胞。可选地，可以首先用编码一条链(例如L链)的质粒转染细胞，随后用包含第二选择标志物的H链质粒转染所得细胞系。经由任一途径产生抗原结合肽片段和/或H2L2分子的细胞系可以用结合另外的选择标志物的编码肽、H链、L链或H链加L链的另外拷贝的质粒来转染，以产生具有增强特性的细胞系，诸如组装的H2L2抗体分子的更高产量或转染细胞系的增强的稳定性。
此外，植物已经成为用于重组抗体生产的基于大规模培养微生物或动物细胞的主流表达***的方便、安全且经济的替代。抗体可以在植物细胞培养物或常规生长的植物中表达。在植物中的表达可以是***的，限于亚细胞质体，或限于种子(胚乳)。数种植物来源的抗体已经达到研发的高级阶段(参见例如，Biolex,NC)。
在一些方面，本文提供了用于产生人源化抗体的方法和***，人源化抗体通过包括以下的方法制备：将用编码人源化抗体轻链的第一表达载体和编码人源化抗体重链的第二表达载体转化的宿主维持在使得每条链均被表达的条件下，并且分离由此表达的链组装形成的人源化抗体。第一表达载体和第二表达载体可以是相同的载体。本文还提供了编码人源化抗体的轻链或重链的DNA序列；掺入所述DNA序列的表达载体；和用所述表达载体转化的宿主。根据本文提供的序列和信息产生人源化抗体可以由本领域普通技术人员实践而无需过度实验。在一种方法中，存在四个一般步骤用于将单克隆抗体人源化。这四个一般步骤是：(1)确定起始抗体轻链可变结构域和重链可变结构域的核苷酸并预测氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即，决定在人源化过程中使用哪个抗体框架区；(3)实际人源化方法/技术；和(4)转染并表达人源化抗体。
纯化
术语“分离的”意指从自然状态改变或取出。例如，天然存在于活动物中的核酸或多肽(例如本文公开的抗体或其抗原结合片段)不是“分离的”，但是部分或完全与其天然状态的共存物质分开的相同核酸或多肽是“分离的”。分离的核酸分子或多肽可以以大体上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(诸如，例如宿主细胞)中。分离的多肽是已经与其自然环境中的组分分开和/或从其回收的抗体。其自然环境中的污染物组分是会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性组分。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以通过合适的方法纯化。在优选的实施方案中，多肽被纯化至以下程度：(1)按多肽重量计大于95％，并且最优选地按重量计大于99％，如通过Lowry法确定的；(2)通过使用旋转杯测序仪足以获得至少15个N末端或内部氨基酸序列的残基的程度；或(3)如通过在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE并且使用考马斯蓝或优选地银染显示的均一性。分离的抗体包括在重组细胞内原位的多肽，因为该多肽的自然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。在一方面，本文公开了如本文提供的纯化的抗体或抗原结合片段。
在表达后，本发明的完整抗体、其二聚体、单独轻链和重链或其他免疫球蛋白形式可以通过已知技术回收和纯化，例如，免疫吸附或免疫亲和层析、层析方法诸如HPLC(高效液相层析)、硫酸铵沉淀、凝胶电泳或这些方法的任何组合。通常，参见，Scopes,PROTEINPURIF.(Springer-Verlag,NY,1982)。至少约90％至95％同质性的大体上纯的免疫球蛋白是有利的，具有98％至99％或更高同质性的免疫球蛋白也是有利的，特别是对于药物用途。当使用重组技术时，抗体可以在胞内、周质间隙中产生，或者直接分泌到培养基中，包括从微生物培养物中产生。如果抗体在胞内产生，则作为第一步，去除无论是宿主细胞还是裂解的碎片的微粒残余，例如通过离心或超滤。Better等人Science 240:1041-1043(1988)；ICSU Short Reports10:105(1990)；和Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:457-461(1993)描述了一种用于分离分泌至大肠杆菌周质间隙的抗体的方法。(另参见，[Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)]。
从微生物或哺乳动物细胞分离的抗体组合物可以使用，例如，羟基磷灰石层析、阳离子或鸟类交换层析和亲和层析来纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的合适性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fe结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人类y1、y2或y4重链的抗体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人类y3(Guss等人，EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体附接的基质最通常是琼脂糖，但其他基质也是可用的。机械稳定的基质，诸如受控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖可以实现的更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH 3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。取决于待回收的抗体，其他用于蛋白纯化技术也是可用的，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子交换树脂或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、聚焦层析、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在部分纯化或纯化至期望的同质性后，然后人源化或复合的人类抗体可以用于治疗或研发并进行测定程序、免疫萦光染色等。通常，参见，卷I&IIImmunol.Meth.(Lefkovits&Pernis，编著，Acad.Press,NY,1979和1981)。
本文公开的抗体或抗原结合片段的功能性活性。这样的功能性活性包括生物活性和与癌细胞抗原结合的能力。此外，具有功能性活性的多肽意指该多肽表现出与本文描述的抗体的活性相似但不必相同的活性，包括成熟形式，如在特定测定(诸如，例如具有或不具有剂量依赖性的生物测定)中测量的。在剂量依赖性确实存在的情况下，它不需要与本公开内容的抗体的剂量依赖性相同，而是与本文阐述的抗体相比，在特定的活性方面大体上相似的剂量依赖性(即，候选多肽相对于本文描述的抗体将表现出更大的活性，或小于不超过约25倍、小于约10倍或小于约3倍的活性)。
编码抗体的核酸分子
使用本文提供的信息，例如，抗体的核酸和氨基酸序列；技术人员可以容易地获得编码抗体或其抗原结合片段的核酸分子。这样的核酸分子可以例如使用本领域公开的常规方法获得。本公开内容的核酸分子可以呈RNA的形式，诸如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式，或者呈DNA的形式，包括但不限于，通过克隆获得或合成产生的cDNA和基因组DNA或其任何组合。DNA可以是三链体、双链体或单链的或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以是编码链，也称为有义链，或者它可以是反义链，也称为反义链。
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸分子”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者可以通过DNA聚合酶或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。核酸分子可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，则核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后被赋予。核苷酸序列可以被非核苷酸组分***(interrupt)。在聚合之后，多核苷酸可被进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括，例如，“加帽(cap)”，用类似物取代一个或更多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，诸如，例如，具有不带电荷的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些修饰，包含侧基部分的那些修饰，诸如，例如，蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)，具有嵌入剂的那些修饰(例如，吖啶、补骨脂素等)，包含螯合剂的那些修饰(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)，含有烷化剂的那些修饰，具有修饰的连接(例如，α异头核酸等)的那些修饰，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，糖中通常存在的任何羟基基团可以被替换，例如被膦酸酯基团、磷酸酯基团替代，被标准保护基团保护，或者被激活以制备与另外的核苷酸的另外的连接，或者可以与固体支持物缀合。5’和3’末端OH可以被磷酸化或被1个至20个碳原子的胺或有机加帽基团部分取代。其他羟基也可以被衍生化为标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域中通常已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括，例如，2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟-核糖或2′-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构体糖诸如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或更多个磷酸二酯连接可以被替代的连接基团替换。这些替代的连接基团包括但不限于，其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫代酯(dithioate)”)、“(O)NR2(“酰胺酯(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)替换的实施方案，其中每个R或R独立地是H或任选地包含醚(—O—)连接的被取代或未被取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都需要相同。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括分离的核酸、RNA和DNA。
在本发明的上下文中，使用以下通常存在的核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。在一些实施方案中，核酸分子包括分离的核酸。
核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中或以部分纯化或大体上纯的形式存在。当通过标准技术(包括但不限于碱性/SDS处理、CsCl条带化(CsCl banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术)从其他细胞组分或其他污染物(例如，其他细胞核酸或蛋白)中纯化出来时，核酸分子被“分离”或“赋予大体上纯的”。参见，F.Ausubel等人,编著(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and WileyInterscience,New York。根据本公开内容的至少一些实施方案的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含内含子序列或可以不包含内含子序列。在优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
本公开内容的另一方面涉及核酸分子，所述核酸分子包含编码本文描述的抗体多肽或其功能性片段或其抗原结合片段的核酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码修饰的IgA重链恒定区的核酸序列。在一些实施方案中，编码修饰的IgA重链恒定区的核酸序列包含选自SEQ ID NO 25-32中的任一个的序列。在一些实施方案中，编码可变重链多肽的核酸序列选自SEQ ID NO:87-84。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码抗体轻链可变区多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码轻链可变区多肽的核酸序列选自SEQ ID NO:101-108。
在获得编码VH和VL区段的DNA片段后，这些DNA片段可以通过标准重组DNA技术进一步操作，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白(诸如抗体恒定区或柔性接头)的另一个DNA片段可操作地连接。如本文上下文中使用的术语“可操作地连接”意图意指两个DNA片段连接在一起，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。编码VH区的分离的DNA可以通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一种DNA分子可操作地连接而转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)，并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgA1或IgA2恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一种DNA分子可操作地连接。
编码VL区的分离的DNA可以通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一种DNA分子可操作地连接而转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)，并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选地是κ恒定区。
为了产生scFv基因，编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头(例如，编码氨基酸序列(Gly-4-Ser)3)的另一个片段可操作地连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白，其中VL区和VH区通过柔性接头连接(参见，例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人,(1990)Nature348:552-554)。
根据本公开内容分离的核酸分子可以包括以下核酸分子：包含开放阅读框(ORF)的核酸分子，任选地具有一个或更多个内含子，例如，但不限于，至少一个CDR的至少一个特定部分，如至少一条轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3；包含本文公开的癌症相关抗体的编码序列或可变区(例如，轻链的可变区)的编码序列的核酸分子；以及包含与以上描述大体上不同的核苷酸序列的核酸分子，但是由于遗传密码的简并性，所述核酸分子仍然编码如本文描述和/或本领域已知的至少抗体或其抗原结合片段。当然，遗传密码是本领域熟知的。因此，对于本领域技术人员来说，产生这样的编码本公开内容的特异性抗体的简并核酸变体将是常规的。参见，例如，Ausubel等人(同上)，并且这样的核酸变体被包括在本发明中。
本文提供了包含编码抗体的一条或更多条链的核酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体的重链或轻链的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体重链的核酸序列和编码抗体轻链的核酸序列两者。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一核酸序列，并且第二核酸分子包含编码轻链的第二核酸序列。
在一些实施方案中，重链和轻链由一种核酸分子表达，或者由两种单独的核酸分子表达为两个单独的多肽。在一些实施方案中，诸如当抗体是scFv时，单个核酸序列编码包含连接在一起的重链和轻链两者的单个多肽。
在一些实施方案中，编码本文公开的抗体的重链或轻链的核酸序列包含编码本文提供的CDR中的至少一个的核酸序列。在一些实施方案中，编码本文公开的抗体的重链或轻链的核酸序列包含编码本文提供的CDR中的至少3个的序列。在一些实施方案中，编码抗体的重链或轻链的核酸序列包含编码本文提供的CDR中的至少6个的序列。在一些实施方案中，编码抗体的重链或轻链的核酸序列包含编码前导序列的核苷酸序列，当翻译时，前导序列位于重链或轻链的N末端处。前导序列可以是天然重链或轻链前导序列，或者可以是另一种异源前导序列。术语“前导序列”是指位于多肽的N末端处的促进多肽从哺乳动物细胞中分泌的氨基酸残基序列。前导序列可以在多肽从哺乳动物细胞输出后被裂解，形成成熟的蛋白。前导序列可以是天然的或合成的，并且它们可以与它们所附接的蛋白异源或同源。
在一些实施方案中，核酸分子是编码本文表7-8中可变轻链和可变重链的任何氨基酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸序列是与编码本文表7-8中可变轻链和可变重链的任何氨基酸序列的核酸至少80％相同，例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，核酸是与本文提供的任何一种或更多种核酸序列杂交的核酸。在一些实施方案中，杂交处于中等条件下。在一些实施方案中，杂交处于高度严格的条件下，诸如：至少约在65℃、6×SSC和1％SDS，在约42℃在0.1×SSC中的约20％(v/v)甲酰胺第一次洗涤10分钟，并且随后在65℃用0.2×SSC和0.1％SDS洗涤。
核酸分子可以使用本领域常规的重组DNA技术构建。在一些实施方案中，将核酸分子被置于适合在选择的宿主细胞中表达的表达载体中。
本文提供了包含编码本文抗体或抗原结合片段的核酸分子的载体。还提供了包含编码重链和/或轻链的核酸分子的载体。这样的载体包括，但不限于，DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一种实施方案中，编码轻链的核酸和编码重链的核酸通过以上概述的程序单独分离。在一种实施方案中，编码轻链的分离的核酸和编码重链的分离的核酸可以被***到单独的表达质粒中，或者一起***到同一质粒中，条件是每一个都处于合适的启动子和翻译控制下。在一些实施方案中，重链和轻链被表达为单个多肽的一部分，诸如，例如，当抗体是scFv时。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的核酸分子，并且第二载体包含编码轻链的核酸分子。在一些实施方案中，第一载体和第二载体以相似的量(诸如相似的摩尔量或相似的质量量)转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，将5:1与1:5之间的摩尔比或质量比的第一载体和第二载体转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，使用1:1与1:5之间的质量比的编码重链的载体和编码轻链的载体。在一些实施方案中，使用1:2的质量比的编码重链的载体和编码轻链的载体。在一些实施方案中，选择被优化用于在CHO细胞或CHO来源的细胞或NSO细胞中表达多肽的载体。示例性的这样的载体描述于以下中：例如，RunningDeer等人，Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)。
在一方面，本公开内容提供了用于通过基因疗法的方式治疗或预防癌症的方法，所述方法包括施用核酸分子，其中所述核酸分子编码VH、VL、VH的CDR3区或VL的CDR 3区或其抗原结合片段，其中所述核酸分子包含本文公开的序列(例如表3或表4)。基因疗法是指通过向受试者施用表达或可表达的核酸来进行的治疗。在本发明的该实施方案中，核酸产生其编码的介导预防或治疗作用的蛋白。根据本文的实施方案，可以使用本领域中可用的任何基因疗法方法。
关于基因疗法方法的综述，参见Goldspiel等人,1993,Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science260:926-932；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May,1993,TIBTECH 11(5):155-215。可以使用的重组DNA技术领域通常已知的方法描述于以下中：Ausubel等人(编著)，1993,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY；和Kriegler,1990,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY.。治疗性抗体向适当细胞的递送可以通过使用本领域已知的任何合适的方法经由基因疗法离体、原位或在体内实现，包括通过使用物理DNA转移方法(例如，脂质体或化学处理)或通过使用病毒载体(例如，腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒)。例如，对于体内疗法，可以将编码期望抗体的核酸单独或与载体、脂质体或沉淀物结合直接注射到受试者中，并且在一些实施方案中，可以在期望表达抗体化合物的部位处注射。对于离体治疗，取出受试者的细胞，将核酸引入这些细胞中，并且将修饰的细胞直接或例如包封在植入到患者中的多孔膜内返回至受试者。参见，例如，美国专利第4,892,538号和第5,283,187号。存在可用于将核酸引入到存活细胞中的多种技术。技术根据核酸是转移到体外培养的细胞中还是转移到预期宿主的体内细胞中而不同。适用于将核酸转移到体外哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖酐和磷酸钙沉淀。用于核酸离体递送的常用载体是逆转录病毒。
如本文使用的术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的特定受试细胞以及这样的细胞的子代或潜在子代。这样的细胞的子代可能由于在随后世代中可能发生的突变或环境影响或者核酸分子整合到宿主细胞基因组中而与用核酸分子转染的亲代细胞不相同。
其他体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、单纯疱疹I型病毒或腺相关病毒)和基于脂质的***来转染。核酸和转染剂任选地与微粒缔合。示例性转染剂包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转染、季铵两亲物DOTMA((二油酰氧基丙基)三甲基溴化铵，由GIBCO-BRL商业化为Lipofectin)(Felgner等人,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413-7417；Malone等人(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 866077-6081)；具有侧基三甲基铵头的亲脂性谷氨酸二酯(Ito等人(1990)Biochem.Biophys.Acta 1023,124-132)；可代谢的亲代脂质，诸如阳离子脂质双十八烷基酰胺甘氨酰精胺(cationic lipid dioctadecylamido glycylspermine，DOGS，Transfectam,Promega)和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺精胺(dipalmitoylphosphatidylethanolamylspermine，DPPES)(J.P.Behr(1986)Tetrahedron Lett.27,5861-5864；J.P.Behr等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6982-6986)；可代谢的季铵盐(DOTB，N-(1-[2,3-二油酰氧基]丙基)-N,N,N-甲基硫酸三甲铵(DOTAP)(Boehringer Mannheim)，聚乙烯亚胺(PEI)，二油酰酯，ChoTB,ChoSC,DOSC)(Leventis等人(1990)Biochim.Inter.22,235-241)；3β[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)/3β[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇DC-Chol的一比一混合物(Gao ct al.,(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065,8-14)，精胺，亚精胺，脂多胺(Behr等人，Bioconjugate Chem,1994,5:382-389)，亲脂性聚赖氨酸(LPLL)(Zhou等人，(1991)Biochim.Biophys.Acta 939,8-18)，[[(1,1,3,3四甲基丁基)甲苯氧基]乙氧基]乙基]二甲基苄基氢氧化铵(DEBDA氢氧化物)与过量的磷脂酰胆碱/胆固醇(Ballas等人，(1988)Biochim.Biophys.Acta 939,8-18)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/DOPE混合物(Pinnaduwage等人，(1989)Biochim.Biophys.Acta 985,33-37)，谷氨酸的亲脂性二酯(TMAG)与DOPE、CTAB、DEBDA、双十二烷基溴化铵(didodecylammonium bromide，DDAB)，以及与磷脂酰乙醇胺混合的硬脂酰胺(Rose等人，(1991)Biotechnique 10,520-525)，DDAB/DOPE(TransfectACE,GIBCO BRL)，和携带低聚半乳糖的脂质。增加转移效率的示例性转染增强剂包括，例如，DEAE-右旋糖酐、凝聚胺(polybrene)、溶酶体破坏肽(Ohmori N I等人，Biochem Biophys Res Commun Jun.27,1997；235(3):726-9)，基于软骨素(chondroitan)的蛋白聚糖，硫酸化蛋白聚糖，聚乙烯亚胺，聚赖氨酸(Pollard H等人J Biol Chem,1998273(13):7507-11)，整联蛋白结合肽CYGGRGDTP，线性右旋糖酐低聚九糖(nonasaccharide)，甘油，栓系在寡核苷酸3'-末端核苷间连接处的胆固醇基基团(Letsinger,R.L.1989Proc Natl Acad Sci USA 86:(17):6553-6)，溶血磷脂，溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰乙醇胺和1-油酰溶血磷脂酰胆碱。
在一些情况下，用将包含核酸的载体指导至靶细胞的剂递送核酸可能是期望的。这样的“靶向”分子包括对靶细胞上的细胞表面膜蛋白或靶细胞上受体的配体特异性的抗体。在采用脂质体的情况下，结合与胞吞相关的细胞表面膜蛋白的蛋白可以用于靶向和/或促进摄取。这样的蛋白的实例包括对特定细胞类型向性(tropic)的衣壳蛋白及其片段、针对在循环中经历内化的蛋白的抗体以及靶向细胞内定位和增强胞内半衰期的蛋白。在其他实施方案中，可以利用受体介导的胞吞。这样的方法描述于以下中：例如，Wu等人，1987或Wagner等人，1990。对于当前已知的基因标记和基因疗法方案的综述，参见Anderson 1992。另参见WO 93/25673和其中引用的参考文献。
嵌合抗原受体
在一方面，本文公开内容提供了包含本文公开的抗原结合片段、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体。如本文使用的术语“嵌合抗原受体”(CAR)、“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”是指将任意特异性移植到免疫效应细胞上的工程化受体。CAR通常具有包含抗原结合结构域的胞外结构域(胞外域)、跨膜结构域和胞内结构域(胞内域)。术语“信号传导结构域”是指蛋白的通过以下发挥作用的功能性部分：通过在细胞内传递信息，以通过产生第二信使或通过响应这样的信使作为效应子发挥功能，经由确定的信号传导通路来调节细胞活性。
如本文使用的术语“胞内信号传导结构域”是指分子的胞内部分。胞内信号传导结构域产生促进含CAR细胞(例如，CART细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的实例，例如，在CART细胞中，包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在一种实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括来源于负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些胞内信号传导结构域。在一种实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或不依赖于抗原的刺激的分子的那些胞内信号传导结构域。例如，在CART的情况下，初级胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级胞内信号传导结构域可以包括信号传导基序，该信号传导基序被称为免疫受体酪氨酸基活化基序或ITAM。包含初级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括，但不限于，来源于CD3δ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、和CD66d、DAP10和DAP12的那些。
术语“δ”或可选地“δ链”、“CD3-δ”或“TCR-δ”被定义为如GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白，或者来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基，并且“δ刺激结构域”或可选地“CD3-δ刺激结构域”或“TCR-δ刺激结构域”被定义为来自δ链胞质结构域的足以功能性地传递T细胞激活必需的初始信号的氨基酸残基。在一方面，δ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等同残基(它们是其功能性直系同源物)。
术语“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激响应(诸如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体之外的细胞表面分子或其配体，是有效免疫应答所需的。共刺激分子包括但不限于，MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD2、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。
共刺激胞内信号传导结构域可以来源于共刺激分子的胞内部分。共刺激分子可以由以下蛋白家族表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和活化性NK细胞受体。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3以及与CD83特异性地结合的配体等。
胞内信号传导结构域可以包括其来源分子的整个胞内部分，或整个天然胞内信号传导结构域或其功能性片段。
在另一方面，抗原结合片段包括人源化抗体或抗体片段。在一种实施方案中，抗原结合片段包含本文描述的抗体的一个或更多个(例如，一个、两个或全部三个)轻链互补决定区1(LC-CDR1)、轻链互补决定区2(LC-CDR2)和轻链互补决定区3(LC-CDR3)，以及本文描述的抗体的一个或更多个(例如，一个、两个或全部三个)重链互补决定区1(HC-CDR1)、重链互补决定区2(HC-CDR2)和重链互补决定区3(HC-CDR3)。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施方案中，CAR可以被设计为包含附接至CAR胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包含一个或更多个与跨膜区相邻的另外的氨基酸，例如，一个或更多个与跨膜来源蛋白的胞外区相关的氨基酸(例如，胞外区的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个多达至15个氨基酸)和/或一个或更多个与跨膜蛋白来源蛋白的胞内区相关的另外的氨基酸(例如，胞内区的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个多达至15个氨基酸)。在一方面，跨膜结构域是与所使用的CAR的其他结构域之一缔合的结构域。在一些情况下，跨膜结构域可以通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以使与受体复合物其他成员的相互作用最小化。在一方面，跨膜结构域能够与CAR T细胞表面上的另一CAR同源二聚化。在不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便使与存在于同一CAR-T细胞的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
跨膜结构域可以来源于天然来源或来源于重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一方面，每当CAR与靶结合时，跨膜结构域能够向胞内结构域发送信号。例如，跨膜结构域可以包括至少例如T细胞受体的α链、β链或δ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜区。
在一些情况下，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人类蛋白的铰链)附接至CAR的胞外区(例如，CAR的抗原结合结构域)。例如，在一种实施方案中，铰链可以是人类Ig(免疫球蛋白)铰链，例如，IgG4铰链或CD8a铰链。在一方面，铰链或间隔序列(spacer)包括IgG4铰链。
胞质结构域
CAR的胞质结构域或区域包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责激活已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能(effectorfunction)”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白中转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的部分。虽然通常可以采用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，没有必要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分的程度而言，只要它转导效应子功能信号，这样的截短部分就可以被用来代替完整的链。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包括胞内信号传导结构域的任何足以转导效应子功能信号的截短部分。
用于在本发明CAR中使用的胞内信号传导结构域的实例包括协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列、以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
已知，通过单独的TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，T细胞激活可以被认为是由两类不同的胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的胞质信号传导序列(初级胞内信号传导结构域)，以及以不依赖抗原的方式作用以提供次级或共刺激信号的胞质信号传导序列(次级胞质信号传导结构域，例如，共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级胞内信号传导结构域可以包含称为免疫受体酪氨酸基激活基序或ITAM的信号传导基序。
在本发明中特别有用的包含ITAM的初级胞内信号传导结构域的实例包括TCRδ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一种实施方案中，本发明的CAR，例如，CAR包含胞内信号传导结构域，例如，CD3-δ的初级信号传导结构域。在一种实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如，与天然ITAM结构域相比具有改变(例如，增加或减少)的活性的突变的ITAM结构域。在一种实施方案中，初级信号传导结构域包括包含修饰的ITAM的初级胞内信号传导结构域，例如，包含优化的和/或截短的ITAM的初级胞内信号传导结构域。在一种实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
CAR的胞内信号传导结构域可以包括单独的CD3δ信号传导结构域，或者CD3δ信号传导结构域可以与在本发明的CAR的情况下有用的任何其他期望的胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包括CD3δ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR的包含共刺激分子的胞内结构域的一部分。共刺激分子是除了抗原受体之外的细胞表面分子或其配体，是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性地结合的配体等。例如，CD27共刺激已被展示在体外增强人类CART细胞的扩增、效应子功能和存活，并且加强人类T细胞在体内的持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.2012；119(3):696-706)。
本发明的CAR的胞质部分中的胞内信号传导序列可以以随机或特定顺序相互连接。任选地，长度在例如2个与10个氨基酸之间(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸)的短的寡肽或多肽接头可以形成胞内信号传导序列之间的连接。在一种实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双体(doublet)可以用作合适的接头。在一种实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸可以用作合适的接头。
在一方面，胞内信号传导结构域被设计为包含两个或更多个，例如，2个、3个、4个、5个或更多个共刺激信号传导结构域。在一种实施方案中，两个或更多个，例如，2个、3个、4个、5个或更多个共刺激信号传导结构域，被接头分子(例如，本文描述的接头分子)分开。在一种实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。
在一些实施方案中，CAR实际上不识别整个抗原；相反，CAR仅与抗原表面的一部分(称为抗原决定簇或表位的区域)结合。
在一些实施方案中，本文描述的CAR包括(包括其功能性部分和功能性变体)糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫桥环化或转化为酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合或缀合。
免疫缀合物
在本公开内容的一方面，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以启动针对肿瘤的有效免疫应答和/或能够指导细胞毒性。在这方面，本文的抗体或其抗原结合片段可以通过补体介导的细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)机制引发肿瘤细胞裂解，这两种机制都需要免疫球蛋白分子的完整Fe部分，用于与效应细胞Fe受***点或补体蛋白相互作用。此外，对肿瘤生长发挥直接生物学效应的抗体可用于本公开内容的实践。这样的直接细胞毒性抗体可能藉以发挥作用的潜在机制包括抑制细胞生长、调节细胞分化、调节肿瘤血管生成因子谱和诱导凋亡。本文公开的特定抗体或其抗原结合片段藉以发挥抗肿瘤作用的机制可以使用如本领域通常已知的任何数目的体外测定来评价，所述体外测定被设计为用于确定ADCC、ADMMC、补体介导的细胞裂解等。
本文公开的抗体或其抗原结合片段可以以其“裸(naked)”或非缀合形式施用，或者可以具有与其缀合的治疗剂。在一种实施方案中，抗体或其抗原结合片段被用作辐射敏化剂。在这样的实施方案中，抗体或抗原结合片段与辐射敏化剂缀合。如本文使用的，术语“辐射敏化剂(radiosensitizer)”被定义为以治疗有效量施用至动物以增加待被辐射敏化的细胞对电磁辐射的灵敏度和/或促进可用电磁辐射治疗的疾病的治疗的分子，优选地低分子量分子。可用电磁辐射治疗的疾病包括赘生性疾病、良性和恶性肿瘤以及癌性细胞。
如本文使用的术语“电磁辐射”和“辐射”包括但不限于具有10-20米至100米波长的辐射。本公开内容的优选的实施方案可以利用例如以下电磁辐射：γ辐射(10-20m至10-13m)、X射线辐射(10-12m至10-9m)、紫外光(10nm至400nm)、可见光(400nm至700nm)、红外辐射(700nm至1.0mm)和微波辐射(1mm至30cm)。
已知辐射敏化剂增加癌性细胞对电磁辐射毒性效应的灵敏度。当前许多癌症治疗方案采用由X射线电磁辐射激活的辐射敏化剂。X射线激活的辐射敏化剂的实例包括但不限于以下：甲硝唑、米索硝唑(misonidazole)、去甲基米索硝唑(desmethylmisonidazole)、哌莫硝唑(pimonidazole)、依他硝唑(etanidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、丝裂霉素C、RSU1069、SR 4233、E09、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FUdR)、羟基脲、顺铂及其治疗有效的类似物和衍生物。
癌症的光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)采用可见光作为敏化剂的辐射激活剂。光动力辐射敏化剂的实例包括但不限于以下：血卟啉衍生物、
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苯并卟啉衍生物、NPe6、初卟啉锡(tin etioporphyrin)(SnET2)、pheoborbide-a、细菌叶绿素-a、萘酞菁(naphthalocyanines)、酞菁(phthalocyanines)、酞菁锌及其治疗有效的类似物和衍生物。
在另一种实施方案中，抗体可以与受体(诸如链霉抗生物素蛋白)缀合，用于肿瘤预靶向，其中抗体-受体缀合物被施用至患者，随后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物，并且然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核素)缀合的配体(例如，抗生物素蛋白)。
本公开内容还提供了可检测标记形式的以上描述的抗体或其抗原结合片段。抗体可以通过使用以下被可检测地标记：放射性同位素、亲和标记物(诸如生物素、抗生物素蛋白等)、酶促标记物(诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、萦光或发光或生物发光标记物(诸如FITC或罗丹明等)、顺磁性原子等。完成这样标记的程序是本领域熟知的；例如，参见(Sternberger,L.A.等人，J.Histochem.Cytochem.18:315(1970)；Bayer,E.A.等人，Meth.Enzym.62:308(1979)；Engval,E.等人，Immunol.109:129(1972)；Goding,J.W.J.Immunol.Meth.13:215(1976))。
“标记物”是指直接或间接与抗体缀合的可检测的化合物或组合物。标记物本身可以通过其本身可检测(例如，放射性同位素标记物或萦光标记物)，或者在酶促标记物的情况下，可以催化底物化合物或组合物的可检测的化学改变。可选地，标记物本身可以不是可检测的，但可以是被另一种可检测的剂结合的元件(例如表位标签或结合配偶体对之一，诸如生物素-抗生物素蛋白等)。相应地，抗体可以包含促进其分离的标记物或标签，并且本发明鉴定抗体的方法包括通过与标记物或标签相互作用来分离抗原/抗体的步骤。
示例性的治疗性免疫缀合物包括与以下缀合的本文描述的抗体：细胞毒性剂诸如化学治疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。融合蛋白在下文进一步详细描述。
在一些实施方案中，本文公开的抗体及其抗原结合片段可以与治疗剂缀合，所述治疗剂诸如化学治疗性细胞毒素，诸如细胞抑制剂或杀细胞剂(例如，紫杉醇(paclitaxol)、细胞松弛素B或白喉毒素、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽酮类(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***(propranolol)和嘌呤霉素及其类似物或同系物)，抗代谢药(例如氨甲蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)，烷化剂(例如，二氯甲基二乙胺、噻替哌苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式-二氯二氨基铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类药物(例如，柔红霉素(原道诺霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，更生霉素(原放线菌素)，博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))，以及抗有丝***剂，血栓形成剂或抗血管生成剂或放射性标记物。用于形成免疫缀合物的合适的细胞毒性剂和化学治疗剂的实例是本领域已知的，参见，例如，WO05/103081。在另一种实施方案中，本文公开的抗体及其抗原结合片段与可检测的底物(诸如，例如，酶、萦光标志物、化学发光标志物、生物发光物质或放射性物质)缀合。在本文描述方面的一些实施方案中，本文公开的抗体及其抗体片段与以下缀合：毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)、小分子、siRNA、纳米颗粒、靶向剂(例如，微泡(microbubble))或放射性同位素(即，放射性缀合物)。这样的缀合物在本文中被称为“免疫缀合物”。这样的免疫缀合物可以用于例如诊断方法、治疗诊断方法或靶向方法。
可以使用的酶促活性的毒素及其片段包括，白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-八叠球菌素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物抗体。实例包括但不限于212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
本文描述的抗体或其抗原结合片段与细胞毒性剂的缀合物可以使用各种双官能蛋白偶联剂中的任一种来制备，所述双官能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮化合物衍生物(诸如双-(对-二重氮基苯甲酰基)-乙二胺(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))、二异氰酸酯类(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitetta等人，238Science 1098(1987)中描述来制备。碳14标记的l-异硫氰苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
在其他实施方案中，抗体或其部分可以与“受体”(例如，链霉抗生物素蛋白)缀合，用于肿瘤预靶向，其中抗体-受体缀合物被施用至受试者，随后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物，并且然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段可以与生物素缀合，并且生物素缀合的抗体或其抗体片段还可以与链霉抗生物素蛋白结合或包被的剂(诸如链霉抗生物素蛋白包被的微泡)缀合或连接，用于例如血管生成的分子成像。
用于将这样的治疗性部分与抗体缀合的技术是熟知的，参见例如，MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编著),第243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)中的Amon等人，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy"；Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson等人(编著),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)中的Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery"；Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编著),第475-506页(1985)中的Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:AReview"；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy,Baldwin等人(编著),第303-16页(Academic Press 1985)中的"Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy"；以及Thorpe等人,"The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
免疫缀合物的产生描述于美国专利第6,306,393号中。免疫缀合物可以通过将治疗剂与抗体组分间接缀合来制备。一般技术描述以下中：Shih等人，Int.J.Cancer 41:832-839(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46:1101-1106(1990)；和Shih等人，美国专利第5,057,313号。一般方法包括使具有氧化的糖类部分的抗体组分与载体聚合物反应，该载体聚合物具有至少一个游离胺官能团，并且装载有多于一个药物、毒素、螯合剂、硼添加物(boron addends)或其他治疗剂。该反应产生初始Schiff碱(亚胺)连接，该连接可以通过还原为仲胺来稳定以形成最终缀合物。
载体聚合物优选地是氨基右旋糖酐或至少50个氨基酸残基的多肽，尽管也可以使用其他大体上等同的聚合物载体。优选地，最终免疫缀合物可溶于水性溶液诸如哺乳动物血清中，以便于施用和有效靶向，以用于疗法。因此，载体聚合物上的增溶性官能团将增强最终免疫缀合物的血清溶解度。特别地，氨基右旋糖酐将是优选的。
用于制备具有氨基右旋糖酐载体的免疫缀合物的方法通常从右旋糖酐聚合物(有利地约10,000-100,000的平均分子量的右旋糖酐)开始。右旋糖酐与氧化剂反应，以实现其糖类环的一部分的受控制氧化，以生成醛基团。氧化根据常规程序用糖分解化学试剂诸如NaIO4方便地实现。
然后氧化的右旋糖酐与多胺(优选地二胺，并且更优选地单羟基二胺或多羟基二胺)反应。合适的胺包括乙二胺、丙二胺或其他类似的聚亚甲基二胺、二乙三胺或类似的多胺、1,3-二氨基-2-羟基丙烷或其他类似的羟基化二胺或多胺等。使用相对于右旋糖酐的醛基团过量的胺来确保醛官能团大体上完全转化为Schiff碱基团。
使用还原剂诸如NaBH4、NaBH3CN等实现所得Schiff碱中间体的还原稳定化。所得加合物可以通过常规的尺寸柱(sizing column)纯化以去除交联的右旋糖酐。也可以使用衍生化右旋糖酐以引入胺官能团的其他常规方法，例如与溴化氰反应，随后与二胺反应。然后氨基右旋糖酐与待装载的特定药物、毒素、螯合剂、免疫调节剂、硼添加物或其他治疗剂的通过常规方法(例如，使用二环己基碳二亚胺(DCC)或其水溶性变体)制备的活化形式的衍生物(优选地羧基活化衍生物)反应以形成中间体加合物。
可选地，多肽毒素，诸如美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)或蓖麻毒素A链等，可以通过戊二醛缩合或通过蛋白上的活化的羧基基团与氨基右旋糖酐上的胺反应，从而与氨基右旋糖酐偶联。放射性金属或磁共振增强剂的螯合剂是本领域熟知的。典型的是乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙三胺五乙酸(DTPA)的衍生物。这些螯合剂通常在侧链上具有基团，螯合剂可以通过这些基团附接至载体。这样的基团包括例如苄基异硫氰酸酯，通过该基团DTPA或EDTA可以与载体的胺基偶联。可选地，螯合剂上的羧基基团或胺基团可以通过活化或预先衍生化以及然后偶联而与载体偶联，全部这些都是通过熟知的方法。
硼添加物，诸如碳硼烷，可以通过常规方法附接至抗体组分。例如，碳硼烷可以用侧基侧链上的羧基官能团制备，如本领域熟知的。这样的碳硼烷与载体例如氨基右旋糖酐的附接可以通过活化碳硼烷的羧基基团并与载体上的胺缩合以产生中间体缀合物来实现。然后将这样的中间体缀合物附接至抗体组分，以产生治疗上有用的免疫缀合物，如下文描述的。
可以使用多肽载体替代氨基右旋糖酐，但是多肽载体应当在链中具有至少50个氨基酸残基，优选地100-5000个氨基酸残基。至少一些氨基酸应当是赖氨酸残基或谷氨酸残基或天冬氨酸残基。赖氨酸残基的侧胺以及谷氨酰胺和天冬氨酸的侧羧化物便于附接药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼添加物或其他治疗剂。合适的多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物以及这些氨基酸和其他氨基酸例如丝氨酸(以赋予所得的装载载体和免疫缀合物期望的溶解度)的混合聚合物。
中间体缀合物与抗体组分的缀合通过氧化抗体组分的糖类部分并使所得醛(和酮)羰基与装载药物、毒素、螯合剂、免疫调节剂、硼添加物或其他治疗剂之后保留在载体上的胺基反应来实现。可选地，中间体缀合物可以经由装载治疗剂之后引入中间体缀合物中的胺基团附接至氧化的抗体组分。氧化被方便地化学实现(例如，用NaIO4或其他糖分解试剂)或酶促实现(例如，用神经氨酸酶和半乳糖氧化酶)。在氨基右旋糖酐的情况下，并非氨基右旋糖酐的全部胺都典型地用于装载治疗剂。氨基右旋糖酐的剩余胺与氧化的抗体组分缩合以形成Schiff碱加合物，并且然后还原稳定化，通常使用硼氢化物还原剂。
使用类似的程序来产生根据本发明的其他免疫缀合物。装载的多肽载体优选地具有剩余的游离赖氨酸残基，以用于与抗体组分的氧化的糖类部分缩合。如果需要，则多肽载体上的羧基可以通过例如用DCC活化并与过量的二胺反应来转化为胺。
最终免疫缀合物使用常规技术纯化，诸如Sephacryl S-300上的尺寸层析或使用一个或更多个CD84Hy表位的亲和层析。可选地，免疫缀合物可以通过将抗体组分与治疗剂直接缀合来制备。除了治疗剂直接附接至氧化的抗体组分之外，一般程序类似于间接缀合方法。应当理解，其他治疗剂可以取代本文描述的螯合剂。本领域技术人员将能够设计出缀合方案而无需过度实验。
作为另外的说明，治疗剂可以经由二硫键形成而附接在还原的抗体组分的铰链区处。例如，破伤风类毒素肽可以用单个半胱氨酸残基构建，该单个半胱氨酸残基用于将肽附接至抗体组分。作为替代方案，这样的肽可以使用异双官能交联剂(诸如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP))附接至抗体组分。Yu等人，Int.J.Cancer56:244(1994)。用于这样的缀合的一般技术是本领域熟知的。参见，例如，Wong,Chemistry Of ProteinConjugation and Cross-Linking(CRC Press 1991)；Monoclonal Antibodies:Principles and Applications,Birch等人(编著),第187-230页(Wiley-Liss,Inc.1995)中的Upeslacis等人，"Modification of Antibodies by Chemical Methods"；MonoclonalAntibodies:Production,Engineering and Clinical Application,Ritter等人(编著),第60-84页(Cambridge University Press 1995)中的Price,"Production andCharacterization of Synthetic Peptide-De-rived Antibodies"。
抗体与细胞毒性剂的缀合物使用多种双官能蛋白偶联剂来制备，所述双官能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮化合物衍生物(诸如双-(对-二重氮基苯甲酰基)-乙二胺(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))、二异氰酸酯类(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitetta等人，Science 238:1098(1987)中描述来制备。碳14标记的1-异硫氰苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂(参见，例如，WO94/11026)。
如以上描述的，抗体的Fc区中的糖类部分可以用于缀合治疗剂。然而，如果抗体片段用作免疫缀合物的抗体组分，则Fc区可以不存在。但是可以将糖类部分引入抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154:5919(1995)；Hansen等人，美国专利第5,443,953号。然后，工程化糖类部分用于附接治疗剂。[0404]此外，本领域技术人员将认识到缀合方法的许多可能的变化。例如，糖类部分可以用于附接聚乙二醇，以便延长完整的抗体或其抗原结合片段在血液、淋巴或其他细胞外液中的半衰期。此外，可以通过将治疗剂附接至糖类部分和游离巯基基团来构建“二价免疫缀合物”。这样的游离巯基基团可以位于抗体组分的铰链区。
在一些实施方案中，本文提供了用于诊断或治疗与靶抗原相关的状况的方法。在一些实施方案中，与抗原相关的状况由于该抗原的表达或生物活性的增加而导致。在一些实施方案中，与抗原相关的状况由于该抗原的表达或生物活性的减少而导致。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段结合抗原，并且从而部分或大体上抑制该抗原的表达和/或至少一种生物活性。部分或优选地大体上抑制本文公开的抗原的表达和/或至少一种生物活性的抗体或其特定部分或变体可以结合蛋白抗原或其片段，并且从而抑制通过抗原与特定抗原结合(例如抗原与本领域已知的一种或更多种受体或配体结合)介导的活性。在一些实施方案中，抗体可以将抗原活性抑制约20％-120％，优选地至少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多。部分或优选地大体上增加本文公开的抗原的表达和/或至少一种生物活性的抗体或其特定部分或变体可以结合蛋白抗原或其片段，并且从而增加通过抗原介导的活性。在一些实施方案中，抗体可以使抗原活性增加约20％-120％，优选地至少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多。
抗体增加抗原依赖性活性的能力优选地通过如本文描述和/或本领域已知的至少一种合适的测定来评价。在一些实施方案中，抗原相关的状况可以是免疫相关疾病、心血管疾病、感染性疾病、恶性疾病或神经***疾病。
治疗方法
在一些实施方案中，本文公开了治疗有相应需要的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗剂量的本文描述治疗性IgA抗体或包含本文描述的所述治疗性IgA抗体的药物组合物。在一些实施方案中，受试者患有癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，受试者患有炎症性紊乱。在一些实施方案中，癌症与本文描述的肿瘤相关抗原的表达相关。在一些实施方案中，癌症与以下的表达相关：CD47、CD20、GD2、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1、CD25、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER3、叶酸结合蛋白、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2。
在一些实施方案中，本文公开了向患有与CD20过表达相关的癌症的受试者施用本文描述的治疗性IgA抗体或药物组合物的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与GD2过表达相关的癌症的受试者施用本文描述的治疗性IgA抗体或药物组合物的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与间皮素过表达相关的癌症的受试者施用本文描述的治疗性IgA抗体或药物组合物的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与以下过表达相关的癌症的受试者施用修饰的效应细胞的方法：CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1、CD25、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2。
在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在其他实施方案中，癌症是复发性或难治性癌症。在一些实施方案中，癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在其他实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，癌症是复发性或难治性癌症。
在一些实施方案中，癌症是实体瘤。示例性实体瘤包括，但不限于，***癌、阑尾癌、胆道癌(bile duct cancer)(即，胆管癌(cholangiocarcinoma))、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、***、结肠癌、不明原发癌(CUP)、食道癌、眼癌、输卵管癌、胃肠道癌、肾癌、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺疾病、***癌、垂体瘤、***癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宫癌、***癌、外阴癌或胶质母细胞瘤。
在一些实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤包括淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。在一些实施方案中，示例性血液恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高风险CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、前淋巴细胞白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高阶段B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B成淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤包括髓性白血病。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤包括急性髓性白血病或慢性髓性白血病。
在一些实施方案中，抗体或其片段结合GD2、ALK、hNET,GD3和CD20中的一个或更多个。在一些实施方案中，GD2阳性肿瘤是成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、黑素瘤、小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤及其任何组合。在一方面，抗体或其片段结合成神经细胞瘤细胞。在一些实施方案中，ALK(间变性淋巴瘤激酶)阳性肿瘤是间变性大细胞淋巴瘤、肺腺癌、成神经细胞瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、肾细胞癌、食管鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠腺癌、多形性胶质母细胞瘤或甲状腺未分化癌。在一些实施方案中，hNET(人类去甲肾上腺素转运蛋白)阳性肿瘤是***、乳腺肿瘤、***肿瘤、癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤或成视网膜细胞瘤。在一些情况下，GD3阳性肿瘤是中枢神经***的神经外胚层肿瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、室管膜瘤、肉瘤、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、尤文氏肉瘤或小细胞肺癌。在一些实施方案中，CD20阳性肿瘤是白血病、淋巴瘤或成神经细胞瘤。
在其他实施方案中，本文公开了向患有由感染性疾病引起的感染的受试者施用的方法。感染性疾病可以是由细菌、病毒或真菌感染引起的疾病。在其他实施方案中，示例性病毒病原体包括以下科的那些：腺病毒科(Adenoviridae)、EB病毒(EBV)科、巨细胞病毒科(CMV)、呼吸道合胞病毒科(RSV)、JC病毒科、BK病毒科、HSV病毒科、HHV病毒科、小RNA病毒科(Picornaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、多瘤病毒(Polyomavirus)科、弹状病毒科(Rhabdoviridae)和披膜病毒科(Togaviridae)。示例性病原性病毒引起天花、流感、腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉(ebola)和风疹。示例性病原性真菌包括假丝酵母属、曲霉菌属、隐球酵母属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫属(Pneumocystis)和葡萄穗霉属(Stachybotrys)。示例性病原性细菌包括链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属、志贺氏菌属、弯曲杆菌属(Campylobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、螺杆菌属(Helicobacter)、大肠杆菌、立克次体(Rickettsia)、芽孢杆菌属、鲍特菌属(Bordetella)、衣原体属(Chlamydia)、螺旋体(Spirochetes)和沙门氏菌属。
在一些实施方案中，IgA抗体与一种或更多种另外的治疗剂一起施用。在一些实施方案中，IgA抗体和一种或更多种另外的治疗剂共施用。在一些实施方案中，IgA抗体和一种或更多种另外的治疗剂顺序施用。
在一些实施方案中，组合疗法可以包括本公开内容的一种或更多种抗体与一种或更多种另外的治疗剂共配制和/或共施用，所述另外的治疗剂例如，化学治疗剂或抗肿瘤剂，诸如细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、和/或细胞毒性剂或细胞抑制剂。在该上下文中的术语“组合”意指大体上同时(contemporaneously)、同时(simultaneously)或顺序给予剂。示例性化学治疗剂包括，但不限于，阿地白介素(aldesleukin)、六甲蜜胺、氨磷汀、天冬酰胺酶、博莱霉素、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、克拉屈滨、西沙必利、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、多西他赛、多柔比星、屈***酚、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、格拉司琼、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、甲酰四氢叶酸、甲地孕酮、美司钠、氨甲蝶呤、甲氧氯普胺、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥美拉唑、昂丹司琼、紫杉醇(paclitaxol)(TaxolTM)、匹鲁卡品、丙氯拉嗪、saproin、他莫昔芬、紫杉醇(taxol)、盐酸拓扑替康、长春花碱、长春新碱和酒石酸长春瑞滨。
在一些实施方案中，本文描述的IgA抗体可以与有效剂量的已用于治疗癌症的其他抗体组合，包括，但不限于以下FDA批准的单克隆抗体：利妥昔单抗(
Figure BDA0003381014890001471
CD20：嵌合IgG1)、曲妥珠单抗(
Figure BDA0003381014890001472
HER2：嵌合IgG1)、阿仑单抗(
Figure BDA0003381014890001473
CD52：人源化IgG1)、替伊莫单抗(
Figure BDA0003381014890001474
CD20：鼠，IgG1、放射性标记的(钇90))、托西莫单抗-I-131(
Figure BDA0003381014890001475
CD20，鼠，IgG2a，放射性标记的(碘131))、西妥昔单抗(
Figure BDA0003381014890001476
EGFR：嵌合，IgG1)、贝伐单抗(VEGF：人源化，IgG4)、帕尼单抗(
Figure BDA0003381014890001477
EGFR:人类IgG2)、奥法木单抗(
Figure BDA0003381014890001478
CD20：人类IgG1)、伊匹单抗(
Figure BDA0003381014890001479
CTLA-4：人类IgG1)、brentiuximabvedotin((
Figure BDA00033810148900014710
CD30：嵌合，IgG1，药物缀合物)、帕妥珠单抗(
Figure BDA00033810148900014711
HER2：人源化IgG1，药物缀合物)、adotrastuzumab ematansine(
Figure BDA00033810148900014712
HER2：人源化，IgG1，药物缀合物)、奥妥珠单抗(
Figure BDA00033810148900014713
CD20：人源化和乙二醇工程化)、纳武单抗和派姆单抗(抗PD-1)等。曲妥珠单抗靶向HER-2抗原。
在一些实施方案中，抗CD47 IgA抗体与HER2抑制剂、抗HER2抗体、EGFR抑制剂、抗EGFR抗体组合施用。在一些实施方案中，抗CD47IgA抗体与曲妥珠单抗组合施用。在一些实施方案中，抗CD47 IgA抗体与c-kit抑制剂组合施用。
剂量
本文提供了用于治疗(包括预防)疾病(例如，癌症)的包含IgA抗体或其抗原结合片段的组合物。在一些实施方案中，组合物是包含药学上可接受的载体的药物组合物。组合物以有效治疗(包括预防)癌症的量施用。在一些实施方案中，组合物(例如，抗体或其抗原结合片段或编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子)以有效增强受试者的免疫应答和/或增加受试者的T细胞激活的量施用。组合物将通过任何可用的方法，诸如肠胃外施用，用于向受试者的体内施用。对于向受试者的施用，包含本文描述的抗体或其抗原结合片段的组合物或药物可以是无菌的，无菌可以通过无菌过滤膜过滤或本领域技术人员已知的其他方法容易地实现。在一种实施方案中，组合物或药物被处理为无热原或内毒素。测试药物组合物或药物的热原或内毒素以及制备无热原或内毒素的药物组合物或药物或制备具有临床可接受水平的内毒素的药物组合物或药物是本领域普通技术人员熟知的。商业试剂盒可用于测试药物组合物或药物的热原或内毒素。
在本文描述的方法中用于体内施用(诸如肠胃外施用)的组合物可以是无菌的，无菌通过无菌过滤膜过滤或本领域技术人员已知的其他方法容易地实现。
本文描述的IgA抗体或其抗原结合片段以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在本文上下文中考虑的因素包括被治疗的特定紊乱、被治疗的特定受试者、个体受试者的临床状况、紊乱的原因、剂的递送部位、施用方法、施用的时间表和医疗从业者已知的其他因素。物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发所期望响应的能力等因素而变化。治疗有效量也是物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。治疗有效量可以以一次或更多次施用来递送。治疗有效量是指以必要的剂量和时间段内达到期望的治疗和/或预防结果的有效量。待施用的“治疗有效量”将受这样的考虑支配，并且指改善、治疗或稳定癌症；增加直至进展的时间(无进展存活期的持续时间)或治疗或预防肿瘤、休眠肿瘤或微转移的发生或复发所需的最小量。本文公开的抗体或其抗原结合片段任选地与一种或更多种当前用于预防或治疗癌症或发展癌症的风险的另外的治疗剂一起配制。这样的其他剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或其抗原结合片段的量、紊乱或治疗的类型以及以上讨论的其他因素。这些通常以与如之前本文使用相同的剂量和施用途径或在此之前所采用剂量的约1％至99％来使用。
抗体的剂量可以根据待施用的受试者的年龄和尺寸、靶疾病、状况、施用途径等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积计算。当本文公开的抗体或其抗原结合片段用于治疗成年患者的状况或疾病时，通常以约0.01mg/kg至约20mg/kg体重，更优选地约0.02mg/kg至约7mg/kg、约0.03mg/kg至约5mg/kg、或约0.05mg/kg至约3mg/kg、约5mg/kg、约7.5mg/kg、约10mg/kg或约15mg/kg体重的单剂量静脉内施用本发明的抗体可能是有利的。根据状况的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。用于施用的有效剂量和方案可以凭经验确定；例如，可以通过定期评价来监测患者进展，并相应调整剂量。此外，可以使用本领域熟知的方法进行剂量的物种间缩放(例如，Mordenti等人,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
在一些实施方案中，本文的组合物可以包括预防有效量，例如，当向处于癌症风险或处于疾病早期阶段的受试者施用时。“预防有效量”是指以必要的剂量和时间段内达到期望的预防结果的有效量。通常，由于预防剂量是在疾病之前或早期阶段用于受试者，因此预防剂量低于治疗剂量。
有利地，以上描述的用于口服或肠胃外使用的药物组合物以适于适合活性成分剂量的单位剂量制备为剂型。这样的单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。
施用可以，例如，通过一次或更多次单独施用，或通过连续输注。根据状况，对于数天或更长时间内的重复施用，治疗持续直至例如癌症得到治疗，如通过本领域已知的方法所测量的。然而，其他剂量方案也可以是有用的。在一种非限制性实例中，本文公开的抗体或其抗原结合片段以范围为约5mg/kg至约15mg/kg，包括但不限于5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg的剂量每周一次、每两周一次或每三周一次被施用。使用本文描述的方法的进展可以通过常规技术和测定容易地监测。使用本文描述的方法的疗法的持续时间将持续医学指示一样长的时间，或者直至达到期望的治疗效果(例如，本文描述的那些)。在某些实施方案中，本文描述的一种或更多种抗体或其抗原结合片段或组合物的施用持续1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、1年、2年、3年、4年、5年、10年、20年或最多至受试者终身的时间段。
治疗功效
例如用于癌症的治疗方法(包括施用本公开内容的IgA抗体或其抗原结合片段或药物组合物)的功效可以通过通常用于评价癌症治疗的各种终点来测量，包括但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸收缩、进展时间、存活期持续时间、无进展存活期、总响应率、响应持续时间和生活质量。本文公开的抗体或其抗原结合片段可能需要对药物的临床响应的独特测量和定义。在癌症的情况下，本文公开的抗体、其抗原结合片段或包含其的组合物的治疗有效量可以降低癌细胞的数目；降低肿瘤尺寸；抑制(即，在一定程度上减缓并优选地停止)癌细胞向外周器官中的浸润；抑制(即，在一定程度上减缓并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与紊乱相关的一种或更多种症状。在一定程度上，本文公开的抗体或其抗原结合片段发挥阻止现有癌细胞的生长和/或杀伤现有癌细胞的作用；它可以是细胞抑制和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以例如通过评价存活期的持续时间、无进展存活期(PFS)的持续时间、响应率(RR)、响应的持续时间和/或生活质量来测量。在一些实施方案中，相对于未治疗的受试者，本文公开的IgA抗体或其功能性片段抑制肿瘤生长至少约2％、3％、5％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，相对于未治疗的受试者，本文公开的IgA抗体或其功能性片段抑制肿瘤移植至少约2％、3％、5％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体或其功能性片段诱导肿瘤细胞的细胞裂解。在一些实施方案中，本文公开的IgA抗体或其功能性片段相对于对应的WT IgA诱导肿瘤细胞的细胞裂解增加至少约2％、3％、5％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在其他实施方案中，本文描述了用于增加易患或被诊断为患有癌症(例如皮肤癌，诸如皮肤黑素瘤)的人类受试者的无进展生存期的方法。疾病进展时间被定义为从施用药物直至疾病进展或死亡的时间。在优选的实施方案中，当与用单独的化学疗法治疗相比时，使用本文公开的抗体或其抗原结合片段和一种或更多种化学治疗剂的本发明的组合治疗可以使无进展生存期显著增加至少约1个月、1.2个月、2个月、2.4个月、2.9个月、3.5个月，诸如约1至约5个月。在另一种实施方案中，本文描述的方法可以显著增加一组易患或被诊断为患有癌症的用多种治疗剂治疗的人类受试者的响应率。响应率被定义为对治疗有响应的治疗受试者的百分比。在一种实施方案中，与用单独的化学疗法治疗的组相比，使用本文公开的抗体或其抗原结合片段(诸如重组抗体或其抗原结合片段)和一种或更多种化学治疗剂的本文描述的组合治疗使治疗受试者组的响应率显著增加。
如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“改善(amelioration)”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或紊乱相关的状况的进展或严重程度。术语“治疗(treating)”包括减少或减轻与慢性免疫状况(诸如但不限于慢性感染或癌症)相关的状况、疾病或紊乱的至少一种不利影响或症状。如果一种或更多种症状或临床标志物降低，则治疗一般是“有效的”。可选地，如果疾病进展降低或停止，则治疗是“有效的”。即，“治疗(treatment)”不仅包括症状或标志物的改善，还包括停止或至少减缓预期在不存在治疗的情况下将有的症状进展或恶化。有益或期望的临床结果包括，但不限于，可检测到的或无法检测到的一种或更多种症状的减轻、疾病程度的降低、疾病的稳定化(例如，不恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(部分的或全部的)。术语疾病的“治疗(treatment)”还包括提供从疾病的症状或副作用的缓解(包括姑息治疗)。
例如，在一些实施方案中，本文描述的方法包括向受试者施用有效量的本文描述的抗体或其抗原结合片段，以便减轻疾病例如癌症的症状。如本文使用的，“减轻癌症的症状”是指改善或降低与疾病相关的任何状况或症状。与等同的未治疗对照相比，这样的降低或预防程度为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％，如通过任何标准技术测量的。理想地，如通过本领域已知的任何标准方法检测的，癌症被完全清除，在这种情况下，认为癌症已经被治疗。正在治疗癌症的患者是被医疗从业者已经诊断为具有这样的状况的患者。诊断可以通过任何合适的方法进行。诊断和监测可以包括，例如，检测生物样品(例如，组织或***活检、血液测试或尿液测试)中癌细胞的水平，检测生物样品中癌症的代表性标志物的水平，检测与特定癌症相关的症状或检测参与这样的癌症的典型免疫应答的免疫细胞。
如本文使用的术语“有效量”是指减轻疾病或紊乱的至少一种或更多种症状所需的抗体或其抗原结合片段或包含其的组合物的量，并且涉及提供期望效果的药理学组合物的足够的量。因此，术语“治疗有效量”是指本文公开的抗体或其抗原结合片段当向典型受试者施用时足以实现特定效果的量。如本文使用的有效量还将包括足以延迟疾病症状发展、改变疾病症状进程(例如但不限于减缓疾病症状进展)或逆转疾病症状的量。因此，明确指出确切的“有效量”是不可能的。然而，对于任何特定情况，适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。
有效量、毒性和治疗功效可以通过标准制药学程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如，确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％治疗有效的剂量)。剂量可以根据采用的剂型和利用的施用途径而变化。剂量的毒性作用和治疗作用之间的比率为治疗指数，并且可以表示为LD50/ED50比率。表现出大的治疗指数的组合物和方法是优选的。治疗有效剂量可以根据细胞培养测定初始估计。此外，可以在动物模型中配制剂量，以达到包括IC50(即，抗体或其抗原结合片段的浓度)的循环血浆浓度范围，IC50实现在细胞培养中或在适当的动物模型中确定的症状的半最大抑制。血浆中的水平可以通过例如高效液相层析来测量。任何特定剂量的作用都可以通过合适的生物测定来监测。剂量可以由医师确定，并且根据需要进行调整，以适应观察到的治疗作用。
癌症的治疗和/或预防包括，但不限于，减轻与癌症相关的症状、抑制癌症的进展、促进癌症的消退、促进免疫应答、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤尺寸、抑制转移、抑制癌细胞生长、抑制癌细胞增殖或引起癌细胞死亡。
施用模式
本文描述的IgA抗体或其抗原结合片段可以通过任何适当的途径向有相应需要的受试者施用，从而在受试者中产生有效的治疗。如本文使用的，术语“施用(administering)”和“引入(introducing)”可互换使用，并且是指通过一种方法或途径将抗体或其抗体部分置于受试者中，该方法或途径导致这样的剂至少部分定位于期望的部位，诸如炎症或癌症部位处，使得产生期望的作用。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段或包含其的组合物通过以下任何模式被施用至患有待被抑制的癌症的受试者：将剂全身递送或递送至期望的表面或靶的施用，并且可以包括，但不限于，注射、输注(infusion)、滴注(instillation)和吸入施用。本文也设想了口服施用形式。“注射”包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、颅内、脊柱内、脑脊内(intracerebro spinal)和胸骨内注射和输注。
如本文使用的措辞“肠胃外施用(parenteral administration)”和“肠胃外施用(administered parenterally)”是指除了肠内和表面施用之外的施用模式，通常通过注射施用。如本文使用的措辞“全身施用(systemic administration)”、“全身施用(administered systemically)”、“外周施用(peripheral administration)”和“外周施用(administered peripherally)”是指双特异性或多特异性多肽剂除了直接施用到靶部位、组织或器官，诸如肿瘤部位中以外的施用，使得其进入受试者的循环***，并且由此经历代谢和其他类似过程。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段或包含其的组合物可以如下施用：作为团注(bolus)经由静脉内施用或通过在一定时间段内连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面(topical)或吸入途径施用。如果广泛的副作用或毒性与本文描述的抗体或其抗原结合片段或包含其的组合物的使用相关，则特别期望的是局部施用，例如，向正在发生血管生成的肿瘤或癌症部位施用。在一些实施方案中，离体策略也可以用于治疗性应用。离体策略包括用本文公开的核酸序列转染或传导从受试者获得的细胞。然后将转染或传导的细胞返回至受试者。细胞可以是广泛范围的类型中的任一种，包括，但不限于，造血细胞(例如，骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌细胞。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段或包含其的组合物通过任何合适的方法施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内施用，并且如果期望局部免疫抑制治疗，还包括病灶内施用。
肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段或组合物合适地通过脉冲输注(pulse infusion)施用，特别是用递减剂量的抗体。优选地给药通过注射给予，最优选地静脉内注射或皮下注射，部分地取决于施用是短暂的还是长期的。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段或组合物被局部施用，例如，当紊乱或肿瘤的位置允许时，通过直接注射，并且注射可以定期重复。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段或组合物也可以被全身递送至受试者或直接递送至肿瘤细胞，例如，递送至肿瘤或在手术切除肿瘤后递送至肿瘤床，以便预防或降低例如休眠肿瘤或微转移的局部复发或转移。
为了增强包含本文提供的抗体及其抗原结合片段的治疗性组合物的功效和潜能，设想将抗体靶向的声穿孔(sonoporation)方法用于本文描述的抑制肿瘤的方法的一些实施方案中。如本文使用的，“声穿孔”是指使用声音，优选地以超声波频率，或超声与造影剂(例如，稳定的微泡)的相互作用，用于暂时改变细胞质膜的通透性，从而允许摄取大分子，例如治疗剂。由声穿孔引起的膜通透性是短暂的，在超声暴露后使剂捕集留在细胞内。声穿孔采用微泡的声空化(acoustic cavitation)来增强大分子的递送。
因此，在该方法的一些实施方案中，与超声造影剂诸如微泡混合的本文描述的抗体或其抗原结合片段可以局部或全身注射到需要治疗癌症的受试者中，并且超声可以被偶联并且均等聚焦到限定区域(例如，肿瘤部位)中，以实现靶向递送。在一些实施方案中，该方法使用聚焦超声方法来实现靶向递送。如本文使用的，HIFU或“高强度聚焦超声”是指使用高强度超声来加热和破坏恶性或病原性组织而不会对覆盖或周围的健康组织造成损害的非侵入式治疗方法。如Khaibullina等人，49J.Nucl.Med.295(2008)和WO 2010127369中描述的，HIFU也可以用作递送治疗剂诸如抗体或其抗体片段的方法。
使用超声造影(Contrast-enhanced ultrasound，CEUS)的方法也被设想与本文描述的抗体或其抗原结合片段一起使用。超声造影(CEUS)是指将超声造影媒介和超声造影剂应用于传统医学超声检查。超声造影剂是指依赖于声波从物质之间的界面反射的不同方式的剂。各种微泡造影剂可用于与本文描述的组合物和方法一起使用。微泡可以在其壳组成、气体核心组成以及其是否被靶向方面不同。与血管生成紊乱特征性受体结合的靶向配体，可以缀合至微泡，使得微泡复合物能够选择性地积累在感兴趣的区域，诸如患病或异常组织。这种被称为靶向超声造影的分子成像形式将仅在靶向微泡结合在感兴趣区域时才会产生强超声信号。靶向超声造影在医学诊断和医学治疗方面具有许多应用。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段使用靶向超声递送被施用至需要癌症或肿瘤治疗的受试者。
药物组合物和剂型
本文在某些实施方案中公开了用于在受试者中施用的包含本文公开的IgA抗体或其功能性片段的药物组合物。
在一些实施方案中，包含本文描述的IgA抗体的药物组合使用一种或更多种生理学上可接受的载体(包括，赋形剂和辅剂)以常规方式配制，所述载体有利于将活性化合物加工成可以被药学上使用的制品。合适的制剂取决于所选择的施用途径。本文描述的药物组合物的概述可见于以下中：例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.，编著，Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,NewYork,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版(Lippincott Williams&Wilkins 1999)。
药物组合物任选地以常规方式来制备，常规方式诸如，仅通过例示的方式，通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或压缩方法。
在某些实施方案中，组合物还可以包括一种或更多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸以及盐酸；碱诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠以及三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲剂诸如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。这样的酸、碱和缓冲剂以维持组合物的pH在可接受的范围内所需的量被包括在内。
在其他实施方案中，组合物还可以包括使组合物的重量渗透摩尔浓度(osmolality)在可接受范围内所需的量的一种或更多种盐。这样的盐包括具有钠阳离子、钾阳离子或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根阴离子、抗坏血酸根阴离子、硼酸根阴离子、磷酸根阴离子、碳酸氢根阴离子、硫酸根阴离子、硫代硫酸根阴离子或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；适合的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
本文描述的药物组合物通过任何合适的施用途径施用，包括，但不限于，口服、肠胃外(例如、静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、含服、舌下或直肠施用途径。在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于肠胃外(例如、静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)施用。
本文描述的药物组合物被配制为任何合适的剂型，包括，但不限于，水性口服分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆剂、悬浮液等，用于由待治疗个体口服摄入，固体口服剂型、气雾剂、受控释放制剂、速融制剂、泡腾制剂、冻干制剂、片剂、粉末、丸剂、糖衣丸、胶囊、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂以及混合立即释放和受控释放制剂。
在一些实施方案中，药物组合物被配制为胶囊。在一些实施方案中，药物组合物被配制为溶液(例如，用于静脉内(IV)施用)。在一些实施方案中，组合物组合物被配制为输注剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制为注射剂。
本文描述的药物固体剂型任选地包含本文描述的化合物和一种或更多种药学上可接受的添加剂，诸如相容的载体、粘合剂、填充剂、助悬剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂(moistening agen)、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或更多种组合。
在又其他方面，使用标准包衣程序，诸如在Remington's PharmaceuticalSciences，第20版(2000)中描述的那些包衣程序，围绕组合物提供膜包衣。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如用于通过胶囊施用)，并且一些或全部颗粒被包衣。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如用于通过胶囊施用)，并且一些或全部颗粒被微囊化。在一些实施方案中，组合物被配制为颗粒(例如用于通过胶囊施用)，并且一些或全部颗粒未被微囊化并且未被包衣。
在某些实施方案中，本文提供的组合物还可以包含一种或更多种防腐剂，以抑制微生物活性。适合的防腐剂包括含汞物质，诸如merfen和硫柳汞；稳定的二氧化氯；以及季铵化合物诸如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵以及氯化十六烷基吡啶。
如本文提及的“增生性疾病”意指提出的细胞过度增殖和细胞基质周转对数种疾病(包括癌症)的发病机制有重要贡献的统一概念。
如本文使用的“患者”或“受试者”是指被诊断为具有或疑似具有或发展生理状况(例如癌症或自身免疫性状况或感染)的哺乳动物受试者。在一些实施方案中，术语“患者”是指具有高于平均可能性发展癌症的哺乳动物受试者。示例性患者可以是人类、猿、犬、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物和能够得益于本文公开的疗法的其他哺乳动物。示例性人类患者可以是男性和/或女性。“有相应需要的患者”或“有相应需要的受试者”在本文中是指被诊断为患有或疑似患有疾病或紊乱(例如但不限于增生性紊乱诸如癌症)的患者。在一些实施方案中，癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在其他实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，癌症是复发性或难治性癌症。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。示例性实体瘤包括，但不限于，***癌、阑尾癌、胆道癌(即，胆管癌)、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、***、结肠癌、不明原发癌(CUP)、食道癌、眼癌、输卵管癌、胃肠道癌、肾癌、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺疾病、***癌、垂体瘤、***癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宫癌、***癌、外阴癌或胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，白血病可以是，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓性白血病(CML)。
“施用”在本文中是指向患者提供本公开内容的组合物。通过例示而非限制的方式，组合物施用，例如，注射，可以通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌内(i.m.)注射来进行。可以采用一种或更多种这样的途径。肠胃外施用可以是，例如，通过团注注射或随着时间的推移逐渐灌注。可选地，或同时，可以通过口服途径施用。此外，施用也可以通过外科手术沉积细胞团(bolus)或细胞球(pellet)，或定位医疗装置。在实施方案中，本公开内容的组合物可以包含有效治疗或预防增生性紊乱的量的表达本文描述的核酸序列的工程化细胞或宿主细胞或含有至少一种本文描述的核酸序列的载体。药物组合物可以包含与一种或更多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文描述的靶细胞群。这样的组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)和防腐剂。
如本文使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”及其语法等同物是指获得期望的药理学和/或生理学作用。在实施方案中，该作用是治疗性的，即，该作用部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利症状。为此，本文描述的方法包括施用“治疗有效量”的包含表达本文描述的核酸序列的宿主细胞或含有本文描述的核酸序列的载体的组合物。
术语“治疗有效量”、“治疗量”、“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或其语法等同物是指以必要的剂量和时间段内达到期望结果的有效量。治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及本文描述的组合物在个体中引发期望响应的能力等因素而变化。本公开内容的组合物的精确待施用量可以由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移程度和状况方面的个体差异来确定。
可选地，向患者或受试者施用本文描述的一种或更多种组合物的药理学和/或生理学作用可以是“预防性的”，即，该作用完全或部分预防疾病或其症状。
“预防有效量”是指以必要的剂量和时间段内达到期望的预防结果(例如，预防疾病发作)的有效量。
“消泡剂”在加工期间降低可以导致水性分散体的凝固、在成品膜中的泡沫或通常损害加工的发泡。示例性消泡剂包括硅乳液或失水山梨醇倍半油酸酯(sorbitansesquoleate)。
“抗氧化剂”包括，例如，丁基羟基甲苯(BHT)、抗坏血酸钠、抗坏血酸、焦亚硫酸钠以及生育酚。在某些实施方案中，在需要时，抗氧化剂增强化学稳定性。
本文描述的制剂可以得益于抗氧化剂、金属螯合剂、含硫醇化合物以及其他一般稳定剂。这样的稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油，(b)约0.1％至约1％w/v甲硫氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v单硫代甘油，(d)约1mM至约10mM EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨醇酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v聚山梨醇酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸右旋糖酐，(k)环糊精，(l)戊聚糖多硫酸酯以及其他肝素类似物，(m)二价阳离子诸如镁离子和锌离子；或(n)其组合。
“粘合剂”赋予内聚性质，并包括，例如，藻酸及其盐；纤维素衍生物诸如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如，
Figure BDA0003381014890001601
)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如，
Figure BDA0003381014890001603
)、乙基纤维素(例如，
Figure BDA0003381014890001602
)以及微晶纤维素(例如，
Figure BDA0003381014890001604
)；微晶右旋糖；直链淀粉；硅酸镁铝；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；交联聚维酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶、糊精、糖诸如蔗糖(例如，
Figure BDA0003381014890001605
)、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露醇、山梨醇、木糖醇(例如，
Figure BDA0003381014890001606
)以及乳糖；天然或合成的树胶诸如***树胶、黄蓍胶、茄替胶、芒麻胶(mucilage of isapol husks)、聚乙烯吡咯烷酮(例如，
Figure BDA0003381014890001607
CL、
Figure BDA0003381014890001608
CL、
Figure BDA0003381014890001609
XL-10)、落叶松***半乳聚糖(larch arabogalactan)、
Figure BDA00033810148900016010
聚乙二醇、蜡、藻酸钠等。
“载体”或“载体物质”包括任何制药学中常用的赋形剂，并且应当基于与本文公开的化合物(诸如，依鲁替尼和抗癌剂的化合物)的相容性以及期望剂型的释放谱特性来选择。示例性载体物质包括例如粘合剂、助悬剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。“药学上相容的载体物质”可以包括，但不限于，***树胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.,编著,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,NewYork,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版(Lippincott Williams&Wilkins 1999)，(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
“分散剂”和/或“粘度调节剂”包括通过液体介质或制粒方法或共混法控制药物的扩散和均匀性的物质。在一些实施方案中，这些剂还促进包衣基质或溶蚀基质(erodingmatrix)的效力。示例性扩散促进剂/分散剂包括，例如，亲水性聚合物，电解质、Tween
Figure BDA0003381014890001611
60或Tween
Figure BDA0003381014890001612
80、PEG、聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商业上称为
Figure BDA0003381014890001613
)以及基于碳水化合物的分散剂诸如，例如，羟丙基纤维素(例如，HPC、HPC-SL和HPC-L)、羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100、HPMC K4M、HPMC K15M和HPMC K100M)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)、非结晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚与环氧乙烷和甲醛聚合物(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，Pluronics
Figure BDA0003381014890001614
和
Figure BDA0003381014890001615
其是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)、和泊洛沙胺(例如，Tetronic
Figure BDA0003381014890001616
也称为Poloxamine
Figure BDA0003381014890001617
其是来源于环氧丙烷和环氧乙烷顺序加成至乙二胺的四官能嵌段共聚物(BASF Corporation,Parsippany,N.J.))、聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)、聚乙二醇(例如，可具有约300至约6000、或约3350至约4000、或约7000至约5400的分子量的聚乙二醇)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、树胶诸如，例如，黄蓍胶和***树胶、瓜尔胶、黄原胶类(xanthans)，包括黄原胶(xanthan gum)、糖、纤维素(诸如，例如，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠)，聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(PVA)、藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂诸如纤维素或三乙基纤维素也可以用作分散剂。脂质体分散体和自乳化分散体中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、来自卵的天然磷脂酰胆碱、来自卵的天然磷脂酰甘油、胆固醇和肉豆蔻酸异丙酯。
一种或更多种溶蚀促进剂(erosion facilitator)与一种或更多种扩散促进剂的组合也可以用于本发明组合物中。
术语“稀释剂”是指用来在递送之前稀释感兴趣的化合物的化学化合物。因为稀释剂可以提供更稳定的环境，因此稀释剂也可以用来稳定化合物。溶解于缓冲的溶液(其还可以提供pH控制或保持)的盐被用作本领域中的稀释剂，包括，但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些实施方案中，稀释剂增加组合物的体积以利于压缩，或者产生足够的体积以均匀共混用于胶囊填充。这样的化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素诸如
Figure BDA0003381014890001621
磷酸氢钙、磷酸氢钙二水合物；磷酸三钙；磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉、可压性糖，诸如
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(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、基于蔗糖的稀释剂、糖果糖；一元碱硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物、dextrates；水解的谷类固体、直链淀粉；粉末化纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇；氯化钠；肌醇、膨润土等。
“填充剂”包括化合物诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、dextrates、右旋糖酐、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。
“润滑剂”和“助流剂”是防止、降低或抑制物质的粘附或摩擦的化合物。示例性润滑剂包括例如硬脂酸、氢氧化钙、滑石、硬脂酰富马酸钠、烃类诸如矿物油、或氢化植物油诸如氢化大豆油
Figure BDA0003381014890001623
高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属(诸如铝、钙、镁、锌)盐，硬脂酸、硬脂酸钠、甘油、滑石、蜡、
Figure BDA0003381014890001624
硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、聚乙二醇(例如PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇诸如CarbowaxTM、油酸钠、苯甲酸钠、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠、胶态二氧化硅诸如SyloidTM、
Figure BDA0003381014890001625
淀粉诸如玉米淀粉、硅油、表面活性剂等。
“增塑剂”是用来软化微胶囊化物质或薄膜衣以使它们不易碎的化合物。适合的增塑剂包括，例如聚乙二醇诸如PEG300、PEG 400、PEG 600、PEG1450、PEG 3350以及PEG 800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素以及三乙酸甘油酯。在一些实施方案中，增塑剂还可以作为分散剂或润湿剂发挥作用。
“增溶剂”包括化合物诸如三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆盐、聚乙二醇200-600、四甘醇、transcutol、丙二醇以及异山梨醇二甲醚等。
稳定剂”包括化合物诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等。
“助悬剂”包括化合物诸如聚乙烯吡咯烷酮，例如，聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25、或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、聚乙二醇(例如可以具有约300至约6000、或约3350至约4000或约7000至约5400的分子量的聚乙二醇)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶，诸如，例如，黄蓍胶和***树胶，瓜尔胶，黄原胶类，包括黄原胶，糖、纤维素(诸如，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素)，聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等
“表面活性剂”包括化合物诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、Tween 60或Tween 80、三乙酸甘油酯、维生素E TPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、polaxomers、胆盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，例如，
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(BASF)等。一些其他表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如，聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如，辛苯聚醇10、辛苯聚醇40。在一些实施方案中，表面活性剂可以被包括在内以增强物理稳定性或用于其他目的。
“粘度增强剂”包括，例如，甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、***树胶、壳聚糖及其组合。
“润湿剂”包括化合物诸如油酸，单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三乙酸甘油酯、Tween 80、维生素ETPGS、铵盐等。
任选地，包含本文描述的组合物的制剂包含药学上可接受的盐，通常，例如，氯化钠，并且优选地以约生理浓度。任选地，本发明的制剂可以包含药学上可接受的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度范围为0.1％至2.0％，通常为v/v。合适的防腐剂包括制药领域已知的那些防腐剂。苯甲醇、苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯是防腐剂的实例。任选地，本发明的制剂可以包含以0.005％至0.02％浓度的药学上可接受的表面活性剂。
本文描述的组合物可以特别配制，用于以固体、液体或凝胶形式向受试者施用抗体或其抗原结合片段，包括适于以下的那些施用：(1)肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液、或悬浮液、或持续释放制剂通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；(2)表面应用，例如，作为乳膏、软膏或受控释放贴剂或喷雾剂应用于皮肤；(3)***内或直肠内，例如作为***栓剂、乳膏或泡沫剂；(4)眼施用；(5)经皮施用；(6)经粘膜施用；或(7)鼻施用。此外，本公开内容的抗体或其抗原结合片段或组合物可以植入患者中或使用药物递送***注射。参见，例如，Urquhart等人，24Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.199(1984)；Controlled Release ofPesticides&Pharmaceuticals(Lewis,编著，Plenum Press,New York,1981)；美国专利第3,773,919号、第3,270,960号。
本文公开的包含本文描述的抗体或抗原结合片段的组合物，还可以根据所治疗的特定适应症的需要包含多于一种活性化合物，优选地不会相互产生不利影响的具有互补活性的化合物。例如，组合物还可以包含细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和/或血管生成抑制剂，诸如VEGFR拮抗剂。这样的分子合适地以对所意图的目的有效的量组合存在。包含本文描述的抗体或其抗原结合片段的组合物的活性成分还可以被包埋在例如分别通过凝聚(coascervation)技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，被包埋在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微米颗粒、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳液(macroemulsions)中。这样的技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences(第16版，Osol，编著，1980)中。药物组合物也可以在囊泡特别是脂质体中递送(参见Langer 1990Science 249:1527-1533；Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编著),Liss,New York,第353-365页中的Treat等人(1989)；Lopez-Berestein,同上,第317-327页；参见一般同上)。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、磷脂分散体、薄片状层等，并且可以用作将M-CSF抗体靶向特定组织以及增加组合物半衰期的媒介物。多种方法可用于制备脂质体，如例如美国专利第4,837,028号和第5,019,369号中描述的，这些专利通过引用并入本文。
包含抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如描述于以下中的：Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；和美国专利第4,485,045号和第4,544,545号。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利第5,013,556号。特别有用的脂质体可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法产生。脂质体通过限定孔径的过滤器挤出，得到具有期望直径的脂质体。本发明抗体的Fab'片段可以经由二硫键交换反应与脂质体缀合，如Martin等人,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中描述的。化学治疗剂(诸如多柔比星)任选地包含在脂质体中[参见，例如，Gabizon等人，J.National CancerInst.81(19):1484(1989)]。
在一些实施方案中，可以使用持续释放制品。持续释放制品的合适实例包括包含本公开内容的抗体或抗原结合片段的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中基质呈成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(包含乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙立德的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得分子释放能够持续超过100天，但某些水凝胶在较短的时间段内释放蛋白。当包封的抗体长时间保持在体内时，它们可以因暴露在37℃的水分而变性或聚集，导致生物活性的丧失和可能的免疫原性改变。根据所涉及的机制，可以设计用于稳定化的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫醇二硫化物(thiodisulfide)交换形成分子间的S--S键，则稳定化可以通过以下来实现：修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂、并开发特定的聚合物基质组合物。在某些情况下，药物组合物可以在受控释放***中递送。在一种实施方案中，可以使用泵(参见，Langer，同上；Sefton 1987CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一种实施方案中，可以使用聚合物物质。在又另一种实施方案中，受控释放***可以置于组合物的靶附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson,1984,in Medical Applicationsof Controlled Release,同上，第2卷，第115-138页)。
本公开内容的药物组合物可以通过例如标准针和注射器皮下或静脉内递送。此外，对于皮下递送，笔递送装置容易地适用于递送本发明的药物组合物。这样的笔递送装置可以是可重复使用的或一次性使用的。可重复使用的笔递送装置通常利用包含药物组合物的可更换药筒。在药筒内的全部药物组合物已被施用并且药筒是空的后，空的药筒可以容易地被弃去并被包含药物组合物的新药筒替代。然后，笔递送装置可以重复使用。在一次性使用的笔递送装置中，不存在可更换的药筒。相反，一次性使用的笔递送装置预先填充有容纳于装置内的储器(reservoir)中的药物组合物。在储器中的药物组合物用尽后，整个装置被弃去。许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置适用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括，但当然不限于，仅举几个例子，AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOGMIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN70130TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,Ind.)、NOVOPENTMI、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)。适用于皮下递送药物组合物的一次性使用的笔递送装置的实例包括，但不限于，SOLOSTARTM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(EliLilly)。
可注射制品可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴输注等的剂型。这些可注射制品可以通过公众已知的方法制备。例如，可注射制品可以通过，例如，将以上描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水性介质或常规用于注射的油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质有，例如，生理盐水、包含葡萄糖和其他辅剂的等渗溶液等，其可以与适当的增溶剂组合使用，所述增溶剂诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质采用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂诸如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。这样制备的注射剂优选地填充在合适的安瓿中。
本公开内容的组合物可以呈以下的形式：例如，颗粒、粉末、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳液、酏剂、悬浮液或溶液。单位剂量中包含的前述抗体的量可以是每剂型约5mg至约500mg；特别是在注射形式中，优选的是前述抗体以约5mg至约100mg被包含，并且对于其他剂型以约10mg至约250mg被包含。
对于口服、含服和舌下施用，粉末、悬浮液、颗粒、片剂、丸剂、胶囊、软胶囊和囊片作为固体剂型是可接受的。这些可以通过例如将本发明的一种或更多种化合物或其药学上可接受的盐或互变异构体与至少一种添加剂诸如淀粉或其他添加剂混合来制备。合适的添加剂是蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、右旋糖酐、淀粉、琼脂、藻酸盐、壳多糖、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、***树胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成的聚合物或甘油酯。任选地，口服剂型可以包含其他有助于施用的成分，诸如非活性稀释剂，或润滑剂诸如硬脂酸镁，或防腐剂诸如对羟基苯甲酸酯或山梨酸，或抗氧化剂诸如抗坏血酸、生育酚或半胱氨酸，崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂或增香剂。片剂和丸剂可以用本领域已知的合适包衣物质进一步处理。
用于口服施用的液体剂型可以呈药学上可接受的乳液、糖浆、酏剂、悬浮液和溶液的形式，其可以包含非活性稀释剂，诸如水。在一些实施方案中，药物制剂和药物可以例如使用无菌液体，诸如，但不限于油、水、醇及它们的组合制备为液体悬浮液或水性溶液。在一些实施方案中，药物组合物可以冻干形式制备。冻干制剂可以包含本领域已知的冷冻保护剂。如本文使用的术语“冷冻保护剂(cryoprotectant)”通常包括为蛋白提供稳定性以免受冷冻诱导的应激的剂。冷冻保护剂的实例包括多元醇，诸如，例如，甘露醇，并且包括糖类，诸如，例如，蔗糖，以及包括表面活性剂，诸如，例如，聚山梨醇酯、泊洛沙姆或聚乙二醇等。冷冻保护剂也对制剂的张力有贡献。可以添加药学上合适的表面活性剂、助悬剂、乳化剂，用于口服或肠胃外施用。
如以上所述，悬浮液可以包含油。这样的油包括，但不限于，花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。悬浮液制品也可以包含脂肪酸酯，诸如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化脂肪酸甘油酯。悬浮液制剂可以包含醇，诸如，但不限于，乙醇、异丙醇、十六醇、甘油和丙二醇。醚，诸如，但不限于，聚乙二醇，石油烃，诸如矿物油和凡士林；和水也可以用于悬浮液制剂中。
对于鼻施用，药物制剂和药物可以是喷雾剂或气雾剂，所述喷雾剂或气雾剂包含合适的溶剂和任选地其他化合物，诸如，但不限于，稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物可利用度调节剂及它们的组合。用于气雾剂制剂的推进剂可以包括压缩空气、氮气、二氧化碳或基于烃的低沸点溶剂。
可注射剂型通常包括水性悬浮液或油性悬浮液，其可以使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来制备。可注射形式可以呈溶液相或悬浮液的形式，所述溶液相或悬浮液用溶剂或稀释剂来制备。可接受的溶剂或媒介物包括无菌水、林格氏溶液或等渗水性盐水溶液。可选地，无菌油可以用作溶剂或助悬剂。优选地，油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成的油、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。
对于注射，药物制剂和/或药物可以是适用于用如以上描述的适当溶液重构的粉末。这些粉末的实例包括，但不限于，冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒、沉淀物或微粒。对于注射，制剂可以任选地包含稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物可利用度调节剂及它们的组合。
对于直肠施用，药物制剂和药物可以呈栓剂、软膏、灌肠剂、片剂或乳膏的形式，用于在肠、乙状结肠和/或直肠中释放化合物。直肠栓剂通过将本发明的一种或更多种化合物或该化合物的药学上可接受的盐或互变异构体与可接受的媒介物例如可可脂或聚乙二醇混合来制备，直肠栓剂在正常储存温度以固相存在，并且在适于在体内诸如直肠中释放药物的那些温度以液相存在。油也可以用于制备软明胶型制剂和栓剂。水、盐水、水性右旋糖和相关的糖溶液以及甘油可以用于制备悬浮液制剂，该悬浮液制剂也可以包含助悬剂，诸如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基纤维素或羧甲基纤维素以及缓冲剂和防腐剂。
抗体或其抗原结合片段在这些组合物中的浓度可以变化很大，即，按重量计从少于约10％，通常至少约25％至高达75％或90％，并且根据所选择的特定施用模式将主要通过流体体积、粘度等来选择。用于制备口服、表面和肠胃外可施用组合物的实际方法对本领域技术人员来说将是已知的或明显的，并且详细描述于，例如，Remington'sPharmaceutical Science,第19版，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1995)中，将其通过引用并入本文。
在本发明的另一种实施方案中，提供了包含可用于治疗以上描述的疾病、紊乱或状况，包括用于治疗癌症的物质的制备品。该制备品包括容器和标记。适合的容器包括，例如，瓶(bottle)、小瓶(vial)、注射器和试管。容器可以由诸如玻璃或塑料的各种物质形成。容器容纳对治疗状况有效的组合物，并且可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是本发明的抗体。容器上或与之缔合的标记指示组合物用于治疗所选择的状况。制备品还可以包括第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。该制备品还可以包括从商业和用户角度期望的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和带有使用说明书的包装插页。本文描述的药物组合物和药物可用于治疗癌性疾病。
诊断和其他用途
本文提供了使用抗体来检测、诊断和监测与抗原表达(相对于正常样品增加或减少，和/或不适当表达，诸如在通常缺乏表位表达的组织和/或细胞中存在表达)相关的疾病、紊乱或状况的方法。本文提供了确定患者是否会对抗体疗法有响应的方法。
在一些实施方案中，该方法包括使用本文公开的抗体检测患者是否具有表达靶抗原的细胞。在一些实施方案中，检测方法包括使样品与本公开内容的抗体或其抗原结合片段接触，并且确定结合水平是否不同于参考或比较样品(诸如对照)的结合水平。在一些实施方案中，该方法可以用于确定本文描述的抗体或多肽对受试者是否为适当治疗。
在一些实施方案中，使细胞或细胞/组织裂解物与抗体接触，并且确定抗体与细胞之间的结合。当测试细胞与相同组织类型的参考细胞相比显示出结合活性时，这可能指示受试者将得益于用抗体的治疗。在一些实施方案中，测试细胞来自人类组织。在一些实施方案中，测试细胞来自人类血液。
可以使用本领域已知的用于检测特异性抗体-抗原结合的各种方法。可以进行的示例性免疫测定包括萦光偏振免疫测定(FPIA)、萦光免疫测定(FIA)、酶免疫测定(EIA)、比浊抑制免疫测定(nephelometric inhibition immunoassay，NIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。指示物部分或标记物基团可以附接至受试抗体，并且被选择以便满足该方法的各种用途的需要，所述用途通常由测定设备和相容的免疫测定程序的可用性决定。
合适的标记物包括，但不限于，放射性核素(例如125I、131I、35S、3H或32P)、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶或β-半乳糖苷酶)、萦光部分或蛋白(例如，萦光素、罗丹明、藻红蛋白、GFP或BFP)或发光部分(例如，由Quantum Dot Corporation,PaloAlto,Calif.提供的QdotTM纳米颗粒)。用于进行以上所述各种免疫测定的一般技术是本领域普通技术人员已知的。
对于诊断目的，抗体或其抗原结合片段可以用可检测的部分来标记，所述可检测的部分包括，但不限于，放射性同位素、萦光标记物和本领域已知的各种酶-底物标记物。将标记物与抗体缀合的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，抗体不需要被标记，并且抗体的存在可以使用与第一抗体结合的第二标记抗体来检测。本发明的抗体或其抗原结合片段可以用作癌症相关抗原的亲和纯化剂，或者用于癌症相关抗原蛋白的诊断测定，例如检测癌症相关抗原蛋白在特定细胞、组织或血清中的表达。本文公开的抗体或其抗原结合片段也可以用于体内诊断测定。通常，为了这些目的，抗体用放射性核素(诸如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32p或35S)标记，使得肿瘤可以使用免疫闪烁扫描法(immunoscintiography)来定位。
本发明的抗体可以用于任何已知的测定方法，诸如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定诸如ELISA和免疫沉淀测定。Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques,第147-158页(CRC Press,Inc.1987)。抗体也可以用于免疫组织化学，以使用本领域已知的方法标记肿瘤样品。为了方便起见，本发明的抗体可以在试剂盒(即，以预定量的试剂与进行诊断测定的说明书的包装组合)中提供。当抗体用酶标记时，试剂盒将包含酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测发色团或萦光团的底物前体)。此外，可以包括其他添加剂，诸如稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以变化很大，以提供实质优化了测定灵敏度的试剂溶液的浓度。特别地，试剂可以以干燥粉末(通常是冻干的)提供，包括赋形剂，所述赋形剂在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。
药盒
本文还提供了用于本文描述的任何方法的药盒、药物、组合物和单位剂型。本文提供了一种药盒，所述药盒包含治疗有效量的本文公开的至少一种IgA抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，药盒还包含第二治疗剂(例如，化学治疗剂)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是水性形式或冻干形式。药盒还包含稀释剂或重构溶液。
药盒可以包含一个或更多个包含抗体(或单位剂型和/或制备品)的容器。在一些实施方案中，提供了单位剂量，其中单位剂量包含预定量的包含抗体的组合物(例如，治疗有效量)，含有或不含一种或更多种另外的剂。在一些实施方案中，这样的单位剂量在单次使用的预填充注射器中提供用于注射。在一些实施方案中，包含抗体或其抗原结合片段的组合物可以包含盐水、蔗糖等；缓冲剂，诸如磷酸盐等；和/或在稳定且有效的pH范围内配制。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以以冻干粉末提供，该冻干粉末可以在添加适当的液体例如无菌水后重构。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段还包含一种或更多种抑制蛋白聚集的物质，包括，但不限于，蔗糖和精氨酸。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段还包含肝素和/或蛋白聚糖。
在一些实施方案中，药盒还包含根据本文描述的任何方法用于治疗癌症的说明书。药盒还可以包含选择适合个体或治疗的描述。药盒中提供的说明通常是标记或包装插页上的书面说明书(例如，药盒中包含的纸页)，但机器可读的说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可以接受的。在一些实施方案中，药盒还包含另一种治疗剂(例如，抗癌症抗体或化学治疗剂)
药盒处于合适包装中。合适的包装包括，但不限于，小瓶、瓶、罐、柔性包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。药盒可以任选地提供另外的组分，诸如缓冲剂和解释信息。因此，本申请还提供了制备品，所述制备品包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、罐、柔性包装等。
实施例
实施例1.工程化治疗性IgA抗体
将第一野生型IgA2抗体工程化为掺入以下氨基酸取代和缺失：N45.2G、P124R、C86S、N114T、I115L、T116S、C147的缺失和Y148的缺失，根据IMGT方案编号。
将第二野生型IgA2抗体工程化为将位置135处的天冬酰胺突变为谷氨酰胺。N135Q突变使IgA2抗体的一个N-糖基化位点缺失。N135Q突变可以与另外的突变N45.2G、P124R、C86S、N114T、I115L、T116S、C147的缺失和Y148的缺失组合，根据IMGT方案编号。
将第三野生型IgA2抗体工程化为缺失整个尾段：氨基酸131-148(PTHINVSVVMAEADGTCY)(SEQ ID NO:9)。IgA2抗体的N135 N-糖基化位点。尾段缺失可以与另外的突变N45.2G、P124R、C86S、N114T、I115L和T116S组合，根据IMGT方案编号。
表1详述了以下的同一性百分比、阳性百分比、空位和总长度的比较：野生型IgA2(IgA2_Valerius_hgnc_id＝HGNC:5479)；包含以下氨基酸取代和缺失的工程化IgA2抗体:N45.2G、P124R、C86S、N114T、I115L、T116S、C147的缺失和Y148的缺失(IgA2-2.0)(根据IMGT方案编号)；本文描述的包含N135Q突变的工程化IgA2抗体(IgA3.0糖基化突变的hgnc id＝HGNC:5470)；本文描述的包含尾段氨基酸131-148缺失的工程化IgA2抗体(IgA2-3.0_尾段_del_)；IgA2(tr|A0A0G2JMB2|A0A0G2JMB2人类)；IgA2(sp|P01877|IGHA2_人类)；和IgA2(tr|A0A286YEY5|A0A286YEY5人类)。
表1.工程化抗体氨基酸序列的比较
Figure BDA0003381014890001741
实施例2工程化IgA变体
蛋白糖基化对循环中抗体的功能和血清半衰期发挥重要作用。IgA的不完全糖基化导致通过专用受体的清除。不完全糖基化蛋白内化的主要受体是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGRP1)。这种受体识别N-糖基化蛋白上的末端半乳糖，并且是从血清中清除IgA的重要介体。IgA2(m1)抗体具有由总共4个N-连接的糖基化位点(CH1-N45.2、CH2-N15.2、CH2-N114、CH3_CHS-N135)形成的复杂的N-连接的糖基化模式。为了增强IgA2(m1)的半衰期，将关键的N-糖基化基序工程化为仅包含单个N-糖基化基序或根本不包含N-糖基化基序。单个N-连接的糖基化位点导致更完全的糖基化谱，从而增加半衰期，并且随后减少抗体清除。然而，完全非糖基化的IgA根本不会经历糖基化依赖性清除，大大增加了半衰期。此外，这种非糖基化的变体将允许在低等生物体中生产，显著增加产率并降低生产成本。因此，单个糖基化或非糖基化的抗体将简化生物制药生产，并且成为治疗目的的理想候选者。
工程化IgA变体的设计
IgA2(m1)重链的基因序列是IgA工程化的骨架，并且N-连接的糖基化基序被沉默，并且引入稳定化突变(表2；图4A-图4D)。这产生了一系列分子：IgA3.0-(min)、IgA3.0+(plus)和IgA4.0。
IgA3.0+变体
IgA3.0+分子被修饰以允许重链与轻链之间通过CH1-P124R突变共价结合。两个半胱氨酸残基被修饰或去除(CH2-C86S；CH3_CHS-C147del_Y148del)以防止与血清蛋白形成半胱氨酸桥，从而防止二聚体聚集物和/或复合物形成。此外，三个N-连接的糖基化基序通过取代这些基序中的关键氨基酸(CH1-N45.2G；CH2-N114T；CH3_CHS-N135Q)被沉默。
IgA3.0-或IgA3.0min变体
IgA3.0min分子包含与IgA3.0+中的CH1和CH2相同的突变，但与IgA3.0+相比，在IgA3.0min中，几乎整个尾段都被缺失(CH3_CHS-P131-Y148del)。
IgA4.0变体或非糖基化的变体
IgA4.0分子通过以下来产生：通过4个单独的氨基酸取代使唯一剩余的N-连接的糖基化基序(CH2-N15.2)沉默，从而产生4个完全非糖基化的IgA2分子。
表2列出了工程化IgA变体(IgA3.0+、IgA3.0min和IgA4.0)相对于野生型(WT)IgA2(m1)的突变
Figure BDA0003381014890001751
Figure BDA0003381014890001761
实施例3
方法
克隆IgA3.0/IgA4.0
为了克隆IgA3.0+和IgA3.0min分子，覆盖IgA3.0整个恒定区(CH1-CH2-CH3-CHS)的合成DNA被订购(Baseclear,Leiden NL)并且克隆到pEE14.4载体中，替代IgA2(m1)序列。在一些IgA3.0min分子的情况下，覆盖IgA3.0min可变区和恒定区两者(VH-CH1-CH2-CH3-CHS)的gBlocks(IDT)被克隆到pcDNA3.4载体中。基于IgA3.0min载体，IgA4.0分子通过用包含正确的IgA4.0突变的gBlocks(IDT)替代pcDNA3.4载体中IgA3.0min的CH1-CH2-CH3-CHS区来克隆。
产生
为了产生IgA3.0+和IgA3.0min，根据制造商的说明使用HEK293F细胞(ThermoFisher)。对于DNA复合，将单独的IgA3.0+或IgA3.0min重链(HC)的载体，连同κ轻链(LC)的载体和pAdvantage载体(pAdv；Promega)以最佳的HC:LC:pAdv比例混合，并且与293fectin复合，然后转染。
为了产生IgA3.0min和IgA4.0，根据制造商的说明使用ExpiCHO-S细胞(ThermoFisher)。对于DNA复合，将单独的IgA3.0+或IgA3.0min或IgA4.0重链的载体，连同κ轻链的载体和pAdvantage载体(Promega)以最佳的HC:LC:pAdv比例混合，并且与Expifectamine复合，然后转染。
纯化
用于纯化IgA的程序对于所有IgA变体都是相同的，并且通过以下来进行：用HiTrap KappaSelect柱(GE Healthcare)使用FPCL从澄清且过滤的细胞培养上清液中捕获κ轻链，随后使用HiPrep 26/60Sephacryl S-300HR柱通过尺寸排阻层析程序进行分离。
结合测定
为了确定工程化抗体的结合，评价了可变部分的结合和Fc部分的结合。
在FACS结合实验中，在表达CD20的Daudi细胞上测试来自HEK293F产物的IgA3.0min-奥妥珠单抗(IgA3.0min-Obi)或IgA3.0+-奥妥珠单抗(IgA3.0+-Obi)的澄清上清液。来自ExpiCHO-S产物的奥妥珠单抗-IgA4.0的澄清上清液未稀释地用于FACS结合实验。
简言之，将上清液与Daudi细胞一起在冰上孵育1小时。在洗涤之后，将细胞与PE标记的抗IgA抗体(Southern Biotech)一起孵育45分钟。在洗涤之后，将细胞用PFA固定，并且在Canto II(BD)上测量。识别CD20的对照抗体以5-10ug/mL的浓度添加。
为了确定抗体Fc区是否能够与FcαR结合，将IgA2(m1)和IgA3.0min-Obi(25μg/mL)在ELISA板中在碳酸盐缓冲液pH9.0中包被过夜。将板用1％BSA封闭，之后允许钙黄绿素标记的表达CD89的健康供体多形核中性粒细胞(PMN)在37℃结合平板45分钟。随后，在每两个洗涤步骤之后，结合通过比较剩余信号与输入信号(未洗涤)来确定。用于确定包被浓度是否相等的另外的对照通过以下来进行：将ELISA板用系列稀释的IgA2(m1)和IgA3.0min抗体染色过夜，之后IgA2(m1)和IgA3.0min抗体的存在用抗hIgA-HRP(Southern Biotech)来检测。
ADCC
将靶细胞装载51Cr(Perkin-Elmer)，洗涤两次，并且与系列稀释的IgA抗体和健康供体PMN一起孵育4小时。在上清液中测量铬释放，并且特异性裂解使用以下公式计算：((实验cpm-基础cpm)/(最大cpm-基础cpm))×100，其中最大裂解通过将标记的细胞与1.25％triton一起孵育来确定，并且最小裂解在不存在抗体和效应细胞的情况下确定。对于IgA4.0，评价ExpiCHO-S产物的未稀释上清液。
热稳定性
热稳定性使用Sypro Orange(Life Technologies)在热位移测定中分析。将在25μL PBS和3×SYPRO Orange(最终浓度)中稀释的总共12.5μg的抗体转移至白色96孔薄壁PCR板(Roche)中，并且用Optical-Quality Sealing Tape(Roche)密封。将板在ViiA7(Roche)中以1.6℃/秒的加热速率从37℃加热至99℃，并且在每个度数孵育1分钟。同时分别使用490nm和575nm作为激发和发射波长记录萦光。
为了评价不稳定的IgA分子的功能性，将PBS中的抗体在热循环仪中在不同温度(4℃、以12℃的步进增量的23℃-95℃)孵育5分钟。在孵育之后，添加完全培养基，并且抗体以10μg/mL的最终浓度直接用于ADCC。
糖基化分析
根据制造商的说明(NEB)进行PNGase F处理。简言之，将抗体首先在100℃变性10分钟，并且随后添加NP-40、Glycobuffer和PNGase F酶，并且在37℃孵育1小时。将样品加入含有20mM DTT的在Laemmli缓冲液中，并且在10％Mini Protean TGX SDS-PAGE(Bio-Rad)上运行。将凝胶用InstantBlue(Expedeon)染色10分钟，并且用水冲洗。
聚糖的鉴定和定量通过质谱术来确定。对于Her2-IgA2(m1)，如先前描述的，对连接特异性唾液酸衍生化之后释放的IgA2抗体的N-糖基化进行反射性正模式MALDI-TOF-MS分析(Meyer,Nederend等人2015)。对于IgA3.0min-Her2、IgA3.0min-Obi和IgA4.0-Obi变体，采用LC/MS2方法。
将抗体进行变性、还原、烷基化，并且用GluC(Roche(Indianapolis,IN))和胰蛋白酶(Sigma-Aldrich(Steinheim,Germany))进行蛋白水解消化。为此，将10μg抗体加入100mMTris-HCl(pH 8.5)、5mM Tris(2-羧乙基)-膦(TCEP,Sigma-Aldrich(Steinheim,Germany))、30mM氯乙酰胺(CAA,Sigma-Aldrich(Steinheim,Germany))和1％脱氧胆酸钠(sodium deoxychelate)(SDC,Sigma-Aldrich(Steinheim,Germany))、水(MQ)(由Q-POD或Q-Gard 1***(Millipore)产生，以≥18.2MΩ运行)。将该混合物与GluC以1:75w/w的酶:蛋白比例在37℃孵育4h，随后与胰蛋白酶(1:100w/w)在37℃孵育过夜。此后，通过将样品加入0.5％三氟乙酸(TFA,Sigma-Aldrich(Steinheim,Germany))并以最大速度离心10min来沉淀SDC。收集上清液用于固相提取(SPE)。
对于SPE，使用位于真空歧管上的OasisμElution HLB 96-孔板(Waters,Wexford,Ireland)。将板用0.5％TFA平衡的乙腈(ACN,BioSolve Valkenswaard,The Netherlands)来调节，加载上清液，用0.5％TFA洗涤，并且最后用50％ACN 0.5％TFA将肽洗脱。回收的洗脱液通过旋转蒸发方法干燥，并且在2％甲酸中重构，用于随后的LC-MS2分析。
对于每个消化且脱盐的样品，将100ng通过使用Agilent 1290Infinity HPLC***(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)进行分析，该***配有分流器以实现纳米流动、与Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)联用。将样品在与50cm分析柱(内径50μm，装有2.7μm Poroshell 120EC-C18；AgilentTechnologies,Amstelveen,The Netherlands)偶联的2cm的捕集柱(内径100μm，装有3μmReproSil-Pur C18-AQ；Dr.Maisch GmbH,Ammerbuch-Entringen,German)上进行分离。缓冲液A由0.1％甲酸组成，缓冲液B由80％ACN中的0.1％甲酸组成。LC梯度如下：0-5min：100％A(其余为B)，5-53min：87％A至60％A，53-58min 0％A，58-65min 100％A。
质谱术在正离子模式下进行，以2kV喷雾电压从包被的熔凝石英(fused silica)发射器进行电喷雾电离。每个样品以一式三份进行测量，使用相同的MS1获取方法，但使用不同的MS2方法。对于MS1扫描，质量范围设置为m/z 350至2000，分辨率为60,000，AGC靶为400,000，最大注射时间为50毫秒。三种MS2方法中的每一种均在最高电荷状态、3s周期时间内的最低m/z信号启动HCD片段化(30％归一化碰撞能量；NCE)，使用30s的排除时间。HCD的MS2以30,000的分辨率、120至4000的m/z、50,000的AGC靶和50毫秒的最大注射时间来记录。对于MS2方法1，仅进行HCD片段化。对于MS2方法2，在HCD谱内至少3种氧鎓离子(oxoniumion)(Hex：127.0390、145.0495、163.0601；HexNAc：138.0550、168.0655、186.0761、204.0867；PhosphoHex:243.0264；NeuAc:274.0921、292.1027；复合物(Complex)：366.1395、405.0793、407.1660、512.1974、657.2349)的检测触发对同一前体信号的步进HCD(将HCD片段与10％、25％和40％的NCE组合)。步进HCD以30,000的分辨率、120至4000的m/z、200,000的AGC靶和250毫秒的最大注射时间来记录。对于MS2方法3，氧鎓离子的检测触发EThcD(30％补充激活)，该EThcD(30％补充激活)以30,000的分辨率、120至4000的m/z、200,000的AGC靶和250毫秒的最大注射时间来记录。
自下而上的数据通过Byonic v3.3.11(Protein Metrics Inc.)解释。原始数据用Arg和Lys(胰蛋白酶)以及Glu和Asp(GluC)处的C末端裂解位点来检索。使用10ppm的前体质量允差和20ppm的片段质量允差，允许3次缺失的裂解。Cys脲甲基化(carbamidomethylation)被包括在内作为固定修饰，并且Met氧化作为可变修饰。对于N-糖基化，按照N-聚糖生物合成途径，279种组合物被包括在内。
使用Skyline(v3.7.0.11317)进行相对定量。为此，整合了通过Byonic发现糖基化的每种肽，包括全部主要的错误裂解(miscleavage)和氧化变体。对于这些中的每一个，从每次LC-MS2运行中整合前述279种聚糖组合物。随后，对如此获得的整合进行精选(curated)以符合以下标准：1)与理论质量的误差≤5ppm，2)具有≥0.85的理论同位素模式的idotp，3)在该肽的平均保留时间的±2min内洗脱，4)没有明显重叠的同位素模式。所得的糖肽列表与Byonic注释一致，并且进一步用于相对定量。对于每个精选的肽糖型(glycoform)，MS1区被整合，并且在同一N-糖基化位点上提供信息的肽被组合。作为替代定量方法，计数在特定糖基化位点上提供信息的每个糖肽组合的肽谱匹配(PSM)数。
对于聚糖种类的可视化，遵循功能糖组学联合会(Consortium for FunctionalGlycomics)的建议。聚糖卡通图使用GlycoWorkbench(v2.1 build146)构建。对于非变性MS分析，使用Vivaspin 500 30kDa分子量截留(cut-off)过滤器(Sartorius StedimBiotech,Germany)，通过以15,000×g离心10×15min，将抗体缓冲液交换至150mM乙酸铵pH7.5。缓冲液交换后，用150mM乙酸铵pH 7.5将抗体调节至约3μM的浓度。
非变性MS在具有扩展的质量范围(EMR)的改良的Exactive Plus Orbitrap仪器(Thermo Fisher Scientific,Bremen)上进行，使用25mg/mL CsI溶液进行校准。手动优化传输多极和离子透镜的电压设置，以在所需的m/z范围提供良好的传输。电喷雾电离采用1.2kV的毛细管电压由镀金玻璃毛细管实现，而MS以80V的源片段化、250℃的源温度、80V的碰撞能量和在m/z 200的35000的分辨率运行。分子的去溶剂化通过向HCD池中添加氮气以达到约3.7×10-10巴的气压来进一步实现。通过将电荷针对质量拟合到最低标准差，从电荷状态分布计算质量(通常导致质量误差低于1Da)。
药代动力学/药效学研究
对于IgA的药代动力学/药效学研究，将BALB/cByJ小鼠(Jackson Laboratory)i.v.注射100μg(1mg/mL)的抗体。在指定的时间点收集血液，离心以分离和收集血清。对稀释的血清进行ELISA。
生物分布
在进行放射性标记之前，将抗体与螯合剂缀合。将抗体通过30kDa离心过滤器以12,000g旋转8min。随后，将500μL的0.1M碳酸氢钠(pH8.2)添加至离心过滤器，并再次以12,000g旋转8min。将离心过滤器倒置于新管中，并以1,000g离心2min，得到约40μL，向其中添加60uL碳酸氢钠缓冲液，得到100μL。添加20倍摩尔过量的p-SCN-Bn-DTPA(2mg/mL于无水DMSO中(在500ul中使用1mg))，并且涡旋30sec，并且在37℃孵育1小时。接下来，将BnDTPA-IgG1-dinutximab或BnDTPA-IgA3.0min-dinutximab缀合物运行通过G50柱，用0.5M MES缓冲液(pH 5.4)以100μL级分洗脱为12个级分。将5个最浓缩的级分合并(pool)，并且通过30kDa离心过滤器以12,000g旋转8min。将500μL体积的0.5M MES缓冲液(pH 5.4)添加至离心过滤器中，并且以12,300g离心另外8min。将离心过滤器倒置于新的微量离心管中，并以1,000g离心2min。蛋白浓度通过Nanodrop测量。
为了放射性标记抗体，将150uL铟溶液(55.5MBq)添加至微量离心管中的MES缓冲液中的150ug抗体，并且在室温孵育45min。将反应混合物运行通过G50柱，并且用PBS(pH7.4)洗脱。将样品以100μL级分(3滴)在微量离心管中收集16个级分，检查活性并且将最高的级分合并。
为了通过iTLC条检查放射性标记抗体的纯度，将总共2μL的反应混合物移液到iTLC上并干燥2分钟。将一定体积的0.1M柠檬酸盐缓冲液添加至测量量筒中，覆盖底部。将iTLC条置于测量量筒中，并且允许向上吸取柠檬酸盐缓冲液，直至距离顶部约1cm。将条取出，并且使用放射性TLC扫描。
体内i.p.模型
小鼠在University of Utrecht的动物机构维持。使用在CB17/lcr-Prkdcscid/lcrlcocrl(Charles river)背景下回交的雌性hCD89 Tg或hCD89NTg小鼠进行实验。将小鼠以5只的组安置于12:12的光暗循环，其中食物和水随意可用。全部实验都根据国际准则进行，并且得到了国家动物科学程序中央管理局(the national Central Authority forScientific Procedures on Animals，CCD)和当地实验动物福利机构的批准。
在第0天i.p.注射1x10e5个细胞的量的A431-Luc2-Her2细胞，随后在第6天s.c.注射20ug pegG-CSF(Amgen)。在i.p.注射在PBS中的2.5mg萤光素(Promega)10分钟之后，在U-OI***(MiLabs)上测量生物发光(BLI)信号。在第6天，将小鼠随机分成不同的处理组。处理从第7天开始，每天i.p.注射10μg IgA3.0min-Her2，持续10天。在指示的时间点测量BLI信号。
实施例4
结果
将编码针对各种靶的IgA2、IgA3.0min、IgA3.0+和IgA4.0分子的质粒转染到HEK293F和/或ExpiCHO-S细胞中。如图5A-图5B中示出的，IgA3.0min-C47A8-CQ抗体表达的水平与野生型IgA2(m1)-Her2相似或更佳，其中在HEK293F细胞中测试了不同的HC:LC:pAdv比例。这对于IgA3.0+也是如此。
作为生产细胞系之间的比较，在HEK293F细胞和ExpiCHO-S细胞两者中产生了IgA3.0-分子(例如，IgA3.0min-Obi、IgA3.0min-Her2、IgA3.0min-mCTLA4，分别靶向三种不同的抗原CD20、Her2和mCTLA4)，图6A-图6C。通过对上清液进行夹心ELISA确定，IgA3.0min分子在ExpiCHO-S细胞中的表达水平较高，其中表达水平几乎达到1g/L。此外，在ExpiCHO-S细胞中成功产生了不同的IgA3.0min分子(IgA3.0min-ch14.18、IgA3.0min-TA99、IgA3.0min-Her2、IgA3.0min-Obi，分别靶向各种抗原GD2、gp75、Her2、CD20)(图7A-图7D)。这些数据表明，工程化IgA3.0min和IgA3.0+变体被正确表达，而不依赖于生产***选择。
此外，在ExpiCHO-S细胞中表达的所有四种非糖基化IgA4.0变体都显示出与IgA3.0min抗体相似的表达水平(图8A-图8D)。这表明引入的突变均未阻止工程化IgA4.0变体的表达，并且完全非糖基化的IgA抗体被正确表达。
随后IgA3.0min变体IgA3.0min-Obi(图9A-图9B))和IgA3.0min-Her2(图10A-图10B)的κ轻链依赖性纯化，随后它们各自的SEC分离(对于IgA3.0min-Obi为图9C-图9D，并且图10C-图10D展示了IgA3.0min-Her2)揭示，不存在通常可见于野生型IgA2(m1)的由尾段中的半胱氨酸引起的聚集物。通过去除这个半胱氨酸(IgA3.0+)或整个尾段(IgA3.0min)，没有发生聚集。同样，在与IgA3.0min变体一样也缺少尾段的IgA4.0变体IgA4.0-Obi(图11A-图11B)的SEC分离中没有观察到聚集物形成。
接下来，IgA3.0+-Obi和IgA3.0min-Obi分子的结合能力在Daudi细胞上通过流式细胞术来确定。如预期的，IgA3.0+-Obi以及IgA3.0min-Obi抗体两者都能够与Daudi细胞上的CD20结合，表明它们的Fab片段正确折叠(图12A-图12E)。接下来，为了评价完全非糖基化的IgA4.0变体是否也仍然能够结合靶抗原，使用CD20互补的SKBR3细胞进行了流式细胞术测定(图15)。这些FACS结合数据表明工程化IgA4.0变体(IgA4.0_NT-Obi、IgA4.0_NQ-Obi、IgA4.0_NG-Obi、IgA4.0_NG-Obi和IgA4.0_NLT-TIS-Obi)与工程化IgA3.0min分子一样好地结合CD20，证实了Fab区的折叠不受工程化的影响。
为了评价Fc部分是否仍然保留结合FcαR的能力，进行了IgA-FcαR结合测定，其中允许中性粒细胞结合IgA包被的板，随后进行一系列洗涤。在许多次洗涤之后，中性粒细胞仍然能够结合IgA分子，其中IgA3.0min-Obi显示出与IgA2(m1)相似或更佳的结合谱(图13)。为了确保呈递给中性粒细胞的IgA分子的量相等，进行了IgA检测步骤，表明IgA2(m1)和IgA3.0mi的抗体浓度相等(图14)。
为了展示工程化IgA分子具有功能性并且能够诱导PMN介导的ADCC，进行了铬释放测定。针对SKBR3-CD20细胞，IgA3.0min-Her2抗体能够诱导与IgA2(m1)-Her2一样好或更好的ADCC(图16A)。此外，在ExpiCHO-S细胞中产生的IgA3.0min-Obi抗体与HEK293F产生的抗体一样有效地在Daudi和Ramos两种细胞中诱导ADCC(图16B-图16C)。此外，完全非糖基化的IgA4.0变体以与IgA3.0min-Obi相似的水平诱导ADCC(图16D)，显示出关于杀伤的全部功能性。这与功能性严重受损或消除的非糖基化的IgG1(Jefferis 2009)形成鲜明对比。这些数据表明，尽管对工程化IgA变体引入了修饰，但IgA3.0min以及IgA4.0两者仍然保留了其诱导ADCC的功能。
为了观察工程化IgA3.0min和IgA4.0变体是否更加热稳定，进行了SYPRO热位移。在SYPRO Orange存在的情况下，在缓慢升高其温度的热循环仪中孵育抗体。当蛋白解折叠时，SYPRO Orange能够结合疏水性口袋，并且可以检测到萦光信号。图17A示出了两种野生型IgA2(m1)抗体与两种工程化IgA3.0min分子和四种工程化IgA4.0抗体的热稳定性谱。曲线的位移表明在较高温度IgA3.0min变体和IgA4.0变体比野生型IgA2(m1)更稳定。对于所评价的不同IgA分子，通过非线性回归分析计算的Tm值被平均化(图17B)。与野生型IgA2(m1)相比，两种类型的工程化IgA变体(IgA3.0min和IgA4.0)在较高温度显示出改进的稳定性。
为了将观察到的稳定性转为功能性，将抗CD20 IgA抗体(野生型IgA2和IgA3.0min-Obi)加热至一定温度，并且使用Raji细胞在铬释放ADCC中进行测试(图17C)。将信号针对对照归一化，该对照是在4℃孵育的抗体。野生型IgA2(m1)与工程化IgA3.0min/IgA4.0分子之间热暴露抗体的杀伤效率不同。前者在暴露于47℃或更高温度时显示出递减的谱，而后者在暴露于71℃之后仍显示出超过50％的活性。在高于83℃的温度，所测试的三种抗体的全部活性均丧失。这表明抗体的稳定性在功能性方面是重要的，并且相对于野生型，工程化IgA变体的改进的热稳定性是有利的。
由于与野生型IgA2(m1)相比，工程化的IgA3.0min和IgA4.0分子具有更少N-连接的糖基化位点或没有N-连接的糖基化位点，因此进行了PNGase F测定以使剩余的N-糖基化可视化(图18)。为此，将IgA分子用PNGase F处理，所述PNGase F处理通过在最内部的GlcNac与天冬酰胺之间进行裂解而去除全部的N-连接的糖基化。随后，样品在还原性SDS-PAGE凝胶上运行。如预期的，野生型IgA2(m1)(HEK293F-产生的)由于存在四个N-连接的聚糖而显示出分子量的大的迁移，而IgA3.0min-Obi(HEK293F-产生的)的迁移由于仅仅作为单个糖基化事件而较小。然而，非糖基化的IgA4.0变体(ExpiCHO-S-产生的)没有显示任何迁移，表明这种抗体未被糖基化。
为了更详细地评价糖基化谱，将抗体通过质谱术进行分析。分析了野生型IgA2(m1)-Her2和IgA3.0min-Her2的糖基化谱(图19A-图19B)。通过MALDI-TOF-MS分析在IgA2(m1)-Her2中检测到数个N-聚糖种类，反映了四个N-连接的糖基化基序上的总体糖基化。而由LC/MS2分析获得的IgA3.0min-Her2谱的峰仅来自剩下的单个N-连接的糖基化基序，因此也反映了总体糖基化谱，因为没有其他位点被修饰。当通过LC/MS2比较来自HEK293F和ExpiCHO-S抗体生产***的抗体时，观察到糖基化谱的重大差异(图19C)。在ExpiCHO-S中，大多数(>50％)的糖基化抗体终止于双触角型((bi-antennary)GlcNac，而HEK293F显示出更多样排列(diverse array)的杂合或复合类型的糖基化种类。与ExpiCHO-S产生的抗体相比，HEK293F产生的抗体中存在明显更多的不利的游离半乳糖。这些结果表明，ExpiCHO-S产生的抗体显示出较少的异质性糖基化，并且对于ASGPR诱导的清除将具有更佳的半衰期特征。为了确定IgA4.0分子中是否发生糖基化事件，采用了非变性MS方法，分析完整的未消化的抗体。所有四种IgA4.0变体均展示出非常接近理论肽骨架的质量(图19D-图19G)。在所有四种变体中均存在一致的36Da的减少，这不能归因于N-聚糖种类，因为这些N-聚糖种类通常是1500-2500Da/聚糖。所观察到的质量差异可能是形成了计36Da的两个焦谷氨酸盐(pyroglutamate)。因此，该分析显示IgA4.0抗体变体在其骨架上缺少N-聚糖，表明非糖基化的IgA抗体在体外测定具有完全功能性。
为了确定工程化的IgA3.0变体和IgA4.0变体中糖基化位点的丧失是否导致更佳的血清半衰期，建立了药代动力学研究。将BALB/c小鼠i.v.注射100μg抗体，并且在指示的时间点通过ELISA来分析血清样品。评价了两种不同形式的抗体，dinutuximab和奥妥珠单抗。检测到的血清野生型IgG1-Dinutuximab水平高于快速清除的野生型IgA2-Dinutuximab水平(图20A)。在24小时时IgA2与IgA3.0min之间的血清水平差异可以归因于注射之后最初几小时内通过ASGPR的清除。这表明，由于通过ASGPR的N-糖基化依赖性清除较少，IgA3.0min的分布相较不明显。数据显示，与野生型IgA2-Dinutuximab相比，对IgA3.0min-Dinutuximab抗体观察到增加的血清半衰期。当评价Ig4.0-奥妥珠单抗的血清半衰期时，与其IgA3.0min对应物IgA3.0min-奥妥珠单抗相比，观察到血清半衰期明显增加(图20B)。这表明工程化的IgA变体相对于其野生型对应IgA具有延长的血清半衰期，并且因此可以使用较少的抗体对肿瘤发挥相似的作用。
为了确定IgA3.0min抗体是否分布至肿瘤，进行了生物分布实验，其中抗体用111铟进行放射性标记，以在体内监测它们。为此，将表达GD2的IMR-32成神经细胞瘤细胞皮下注射到NSG小鼠中。在生长42天之后，将小鼠静脉内注射放射性标记的野生型IgG1-dinutuximab和IgA3.0min-dinutuximab。注射之后24小时和48小时对小鼠进行筛查(图21A-图21B)。在肝和肿瘤两者中都观察到放射性信号，表明抗体浸润肿瘤。肝信号表示积累的来自血液的正在分解代谢的抗体。通过确定肿瘤/肝比率，肿瘤特异性信号将被针对背景校正。最初，在24小时之后观察到的信号是相似的，但是在48小时时，IgA3.0min-Dinutuximab信号比其IgG1对应物是更具肿瘤特异性(图22)。
接下来确定了IgA3.0min在体内的功效。为此，使用了具有hCD89转基因和非转基因的SCID的已建立的肿瘤模型(Brandsma,Ten Broeke等人2015)。将小鼠i.p.注射A431-luc2-Her2细胞。在肿瘤建立后，将小鼠通过i.v.施用PBS或IgA3.0min-Her2来处理(图23)。在指示的时间点通过BLI监测肿瘤生长。在PBS组中肿瘤显示出指数生长。然而，用IgA3.0min-Her2处理的小鼠未显示出肿瘤生长，并且在58天之后控制了癌症，展示了工程化IgA变体的功效。
结果表明，与野生型IgA2(m1)相比，所有工程化IgA变体(IgA3.0+、IgA3.0min和IgA4.0)均显示出改进的生物制药特性，同时仍保留了其功能性。工程化IgA变体以高水平表达，并且可以被纯化而没有聚集物，从而产生纯的且更稳定的IgA抗体，该IgA抗体仍然显示出与靶抗原的稳健结合和在体外以及体内对靶细胞的有效杀伤。
表3列出了工程化IgA变体的重链恒定区的示例性氨基酸序列和核酸序列
Figure BDA0003381014890001871
Figure BDA0003381014890001881
Figure BDA0003381014890001891
Figure BDA0003381014890001901
Figure BDA0003381014890001911
Figure BDA0003381014890001921
Figure BDA0003381014890001931
表4列出了工程化IgA变体的κ轻链恒定结构域的示例性氨基酸序列和核酸序列。
Figure BDA0003381014890001932
表5列出了工程化IgA变体的可变重链的互补决定区的氨基酸序列
Figure BDA0003381014890001941
表6列出了工程化IgA变体的可变轻链的互补决定区的氨基酸序列的示例性列表
Figure BDA0003381014890001951
表7列出了工程化IgA变体的可变重链的示例性氨基酸序列和核酸序列。CDR区以粗体描绘
Figure BDA0003381014890001961
Figure BDA0003381014890001971
Figure BDA0003381014890001981
表8列出了工程化IgA变体的可变轻链的示例性氨基酸序列和核酸序列。CDR区以粗体描绘
Figure BDA0003381014890001982
Figure BDA0003381014890001991
Figure BDA0003381014890002001
表9列出了能够结合不同抗原的示例性IgA变体抗体。该表示出了IgA变体抗体的可变轻链、可变重链、IgA重链恒定区和κ轻链恒定区的序列的示例性配对。
Figure BDA0003381014890002002
Figure BDA0003381014890002011
Figure BDA0003381014890002021
Figure BDA0003381014890002031
Figure BDA0003381014890002041
表10列出了WT IgA重链恒定区的CH1、CH2和CH3结构域的示例性序列
Figure BDA0003381014890002042
表11
Figure BDA0003381014890002051
Figure BDA0003381014890002061
虽然本文已经示出和描述了本公开内容的优选实施方案，但是对于本领域技术人员明显的是，这样的实施方案仅以实例的方式提供。在不偏离本公开内容的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本公开内容时，可以采用本文描述的实施方案的各种替代方案，或者本文描述的这些实施方案或方面中的一个或更多个的组合。所附权利要求意图限定本公开内容的范围，并且从而涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (198)

1.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：
a.抗原结合结构域；和
b.恒定结构域，其中所述恒定结构域包含免疫球蛋白A(IgA)重链恒定区，
其中所述IgA重链恒定区包含IgA CH2区和IgA CH3区；
其中所述IgA重链恒定区与对应的WT IgA重链恒定区相比包含至少两个天然存在的糖基化位点的修饰，并且
其中所述至少两个天然存在的糖基化位点中的每一个位于所述IgA CH2区或所述IgACH3区。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少两个天然存在的糖基化位点是两个天然存在的N-连接的糖基化位点。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少两个天然存在的糖基化位点与对应的野生型IgA相比包含天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰包括所述至少两个天然存在的糖基化位点中的一个或两个的氨基酸取代或氨基酸缺失。
5.根据权利要求4所述的抗体或其功能性片段，其中所述氨基酸取代是非保守氨基酸取代。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含以下处的氨基酸取代：
i.N114和N135，
ii.N114和N15.2，或
iii.N135和N15.2，
根据IMGT方案编号。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含：
i.N114T氨基酸取代和N135Q氨基酸取代，
ii.N114T氨基酸取代和选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，或
iii.N135Q氨基酸取代和来自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，
根据IMGT方案编号。
8.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少三个天然存在的糖基化位点处的修饰。
9.根据权利要求8所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少三个天然存在的糖基化位点是三个天然存在的N-连接的糖基化位点。
10.根据权利要求8或9所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少三个天然存在的糖基化位点与对应的野生型IgA相比包含天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰是氨基酸取代或氨基酸缺失。
12.根据权利要求11所述的抗体或其功能性片段，其中所述氨基酸取代是非保守取代。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含以下处的氨基酸取代：
N114、N135和N15.2，根据IMGT方案编号。
14.根据权利要求8-13中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含：
i.N114T氨基酸取代，
ii.N135Q氨基酸取代，和
iii.选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区还包含IgA CH1区。
16.根据权利要求15所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含所述IgA CH2区中至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的修饰、所述IgA CH3区中至少一个天然存在的糖基化位点的修饰和所述IgA CH1区内至少一个天然存在的糖基化位点的修饰。
17.根据权利要求15或16所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含以下处的氨基酸取代：
i.N45.2、N114和N135，或
ii.N45.2、N15.2和N135，
根据IMGT方案编号。
18.根据权利要求17所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含：
i.N45.2G氨基酸取代、N114T氨基酸取代和N135Q氨基酸取代；或
ii.N45.2G氨基酸取代、N135Q氨基酸取代和选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，
根据IMGT方案编号。
19.根据权利要求17所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含所述IgA CH2区中至少两个天然存在的N-连接的糖基化位点的修饰和所述IgA CH1区内至少一个天然存在的糖基化位点的修饰。
20.根据权利要求19所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区包含以下处的氨基酸取代：
i.N45.2、N114和N15.2G。
21.根据权利要求20所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含：
i.N45.2G氨基酸取代，
ii.N114T氨基酸取代，和
iii.选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，
根据IMGT方案编号。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出更长的循环半衰期。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的聚集。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与包含IgG重链恒定区的对应的抗体相比诱导增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出增加的热稳定性。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的糖基化。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的WT IgA抗体相比表现出以增加的亲和力与免疫效应细胞上表达的FcαR结合。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少四个天然存在的糖基化位点的修饰。
30.根据权利要求29所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少四个天然存在的糖基化位点是四个天然存在的N-连接的糖基化位点。
31.根据权利要求29或30所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少四个天然存在的糖基化位点包含天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含所述IgA CH2区内至少两个天然存在的N-连接的糖基化位点的修饰、所述IgA CH3区内至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的修饰和所述IgA CH1区内至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的修饰。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含以下氨基酸残基处的氨基酸取代：
N45.2、N114、N135和N15.2，根据IMGT方案编号。
34.根据权利要求29-33中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区包含以下氨基酸残基处的非保守氨基酸取代：N45.2、N114、N135和N15.2，根据IMGT方案编号。
35.根据权利要求29-34中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含：
i.N45.2G氨基酸取代，
ii.N114T氨基酸取代，
iii.N135Q氨基酸取代，和
iv.选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，
根据IMGT方案编号。
36.根据权利要求29-35中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与包含至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的对应的IgA抗体相比表现出更长的循环半衰期。
37.根据权利要求29-36中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与包含IgG CH2结构域和IgG CH3结构域的对应的抗体相比诱导增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
38.根据权利要求29-37中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与包含至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的对应的IgA抗体相比表现出增加的热稳定性。
39.根据权利要求29-38中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与包含至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的对应的IgA抗体相比表现出减少的糖基化。
40.根据权利要求29-39中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与包含至少一个天然存在的N-连接的糖基化位点的对应的IgA抗体相比表现出以增加的亲和力与免疫效应细胞上表达的FcαR结合。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的修饰。
42.根据权利要求41所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰是所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的氨基酸取代或氨基酸缺失。
43.根据权利要求42所述的抗体或其功能性片段，其中所述氨基酸取代是所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的非保守氨基酸取代。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少一个天然存在的半胱氨酸氨基酸残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的C147或C86，根据IMGT方案编号。
45.根据权利要求44所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C86S氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
46.根据权利要求44-45中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C147的缺失，根据IMGT方案编号。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体或其功能性片段相比表现出减少的聚集。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA构建体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少两个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的修饰。
50.根据权利要求49所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰包括所述至少两个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基中的一个或两个的氨基酸取代。
51.根据权利要求49所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰包括所述至少两个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基中的一个或两个的缺失。
52.根据权利要求49所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区包含所述至少两个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基中的一个的氨基酸取代，以及所述至少两个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基中的一个的缺失。
53.根据权利要求49-52中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少两个天然存在的半胱氨酸氨基酸残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的C147和C86，根据IMGT方案编号。
54.根据权利要求53所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C147的缺失，根据IMGT方案编号。
55.根据权利要求53所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C86S的氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
56.根据权利要求53所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含天然存在的C86氨基酸残基的氨基酸取代以及天然存在的C147氨基酸残基的缺失，根据IMGT方案编号。
57.根据权利要求56所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C86S氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
58.根据权利要求49-57中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的聚集。
59.根据权利要求49-58中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基的修饰。
61.根据权利要求60所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰是所述至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基的氨基酸取代或缺失。
62.根据权利要求60所述的抗体或其功能性片段，其中所述氨基酸取代是与WT IgA抗体相比所述至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基的非保守氨基酸突变。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少一个酪氨酸残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的Y148，根据IMGT方案编号。
64.根据权利要求63所述的抗体或其功能性片段，其中氨基酸Y148相对于包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的WTIgA重链恒定区被缺失，根据IMGT方案编号。
65.根据权利要求60-64中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的聚集。
66.根据权利要求60-65中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA抗体相比包含至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的修饰。
68.根据权利要求67所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰包括与对应的野生型IgA抗体相比所述至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的氨基酸取代或氨基酸缺失。
69.根据权利要求68所述的抗体或其功能性片段，其中所述氨基酸取代是所述至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的非保守氨基酸取代。
70.根据权利要求67-69中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少一个天然存在的苏氨酸氨基酸残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的T116或T16，根据IMGT方案编号。
71.根据权利要求67-70中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的聚集。
72.根据权利要求67-71中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出减少的与血清蛋白的聚集。
73.根据权利要求1-72中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少两个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的修饰。
74.根据权利要求73所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰包括所述至少两个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基中的一个或两个的氨基酸取代或缺失。
75.根据权利要求74所述的抗体或其功能性片段，其中所述氨基酸取代是所述至少两个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基中的一个或两个的非保守氨基酸取代。
76.根据权利要求73-75中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少两个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的T116或T16，根据IMGT方案编号。
77.根据权利要求76所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含T116S氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
78.根据权利要求76所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含T16S氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
79.根据权利要求1-78中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的修饰。
80.根据权利要求79所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰包括所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的氨基酸取代或缺失。
81.根据权利要求80所述的抗体或其功能性片段，其中所述氨基酸取代包括所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的非保守氨基酸取代。
82.根据权利要求79-81中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的I115，根据IMGT方案编号。
83.根据权利要求82所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含I115L氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少一个天然存在的亮氨酸(L)氨基酸残基的修饰。
85.根据权利要求84所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰包括所述至少一个天然存在的亮氨酸(L)氨基酸残基的氨基酸取代或缺失。
86.根据权利要求85所述的抗体或其功能性片段，其中所述氨基酸取代是所述至少一个天然存在的亮氨酸(L)氨基酸残基的非保守氨基酸取代。
87.根据权利要求84-86中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少一个天然存在的亮氨酸(L)残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的L15.3，根据IMGT方案编号。
88.根据权利要求87所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含L15.3I氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
89.根据权利要求1-88中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的修饰。
90.根据权利要求89所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区包含所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的氨基酸取代或缺失。
91.根据权利要求89所述的抗体或其功能性片段，其中所述氨基酸取代是所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的非保守氨基酸取代。
92.根据权利要求89-91中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)残基是相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的P124，根据IMGT方案编号。
93.根据权利要求92所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含P124R氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
94.根据权利要求89-93中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出更大的稳定性。
95.根据权利要求89-94中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出重链与轻链之间更大的稳定性。
96.根据权利要求89-95中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段具有所述重链与所述轻链之间的共价连接。
97.根据权利要求89-96中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段包含所述重链的半胱氨酸(C)氨基酸残基与所述轻链的半胱氨酸(C)氨基酸残基之间的二硫键。
98.根据权利要求1-97中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列。
99.根据权利要求1-98中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体是同种异型IgA2m(1)抗体或IgA2m(2)。
100.根据权利要求1-99中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体是同种异型高加索人IgA2m(1)抗体。
101.根据权利要求1-100中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的野生型IgA相比包含C末端IgA尾段的修饰。
102.根据权利要求1-101中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰包括C末端25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、12个、10个、8个、6个、4个或2个氨基酸的缺失。
103.根据权利要求1-102中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰包括C末端18个氨基酸的缺失。
104.根据权利要求1-103中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述修饰包括相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的C末端氨基酸残基131-148的缺失，根据IMGT方案编号。
105.根据权利要求1-104中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含C末端氨基酸残基P131-Y148的缺失，根据IMGT方案编号。
106.根据权利要求1-105中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区包含IgA1恒定区，所述IgA1恒定区包含IgA1 CH2区和IgA1 CH3区。
107.根据权利要求106所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA1恒定区还包含IgA1CH1区。
108.根据权利要求1-106中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区包含IgA2恒定区，所述IgA2恒定区包含IgA2 CH2区和IgA2 CH3区。
109.根据权利要求108所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA2恒定区还包含IgA2CH1区。
110.根据权利要求1-109中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段表现出在包含所述抗原结合结构域和包含IgG CH2区和IgG CH3区的IgA重链恒定区的对应的抗体的循环半衰期的1％、5％、10％、20％或30％内的循环半衰期。
111.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：
a.抗原结合结构域；和
b.恒定结构域，其中所述恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区；其中所述IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含N135Q氨基酸取代，根据IMGT方案编号。
112.根据权利要求111所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区还包含：
i.N45.2G氨基酸取代，
ii.N114T氨基酸取代，
iii.I115L氨基酸取代，
iv.T116S氨基酸取代，和
v.选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，
根据IMGT方案编号。
113.根据权利要求111或权利要求112所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区还包含：
i.C86S氨基酸取代，
ii.P124R氨基酸取代，
iii.C147的缺失，
iv.Y148的缺失，
v.L15.3I氨基酸取代，
vi.T16S氨基酸取代，或
vii.其组合，
根据IMGT方案编号。
114.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：
a.抗原结合结构域；和
b.恒定结构域，其中所述恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH2区和IgA2 CH3区，并且其中所述IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含：
i.C86S氨基酸取代，
ii.N114T氨基酸取代，
iii.I115L氨基酸取代，
iv.T116S氨基酸取代，和
v.N135Q氨基酸取代，
根据IMGT方案编号。
115.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：
a.抗原结合结构域；和
b.恒定结构域，其中所述恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA CH3区，并且其中所述IgA2重链恒定区相对于包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含：
i.N45.2G氨基酸取代，
ii.C86S氨基酸取代，
iii.N114T氨基酸取代，
iv.I115L氨基酸取代，
v.T116S氨基酸取代，
vi.N135Q氨基酸取代，
vii.C147的缺失，和
viii.Y148的缺失，
根据IMGT方案编号。
116.根据权利要求115所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA2重链恒定区包含与SEQ ID NO:16至少95％相同的氨基酸序列。
117.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：
a.抗原结合结构域；和
b.恒定结构域，其中所述恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区，并且其中所述IgA2重链恒定区相对于包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含：
i.N45.2G氨基酸取代，
ii.C86S氨基酸取代，
iii.N114T氨基酸取代，
iv.I115L氨基酸取代，
v.T116S氨基酸取代，和
vi.C末端尾段的缺失，
根据IMGT方案编号。
118.根据权利要求117所述的抗体或其功能性片段，其中所述C末端尾段的缺失包括相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区的C末端氨基酸残基P131-Y148的缺失，根据IMGT方案编号。
119.根据权利要求117或权利要求118所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA2重链恒定区包含与SEQ ID NO:17至少95％相同的氨基酸序列。
120.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：
a.抗原结合结构域；和
b.恒定结构域，其中所述恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区；其中所述IgA2重链恒定区相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含：
i.N45.2G氨基酸取代，
ii.N114T氨基酸取代，
iii.I115L氨基酸取代，
iv.T116S氨基酸取代，
v.N135Q氨基酸取代，
vi.选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，
vii.L15.3I氨基酸取代，和
viii.T16S氨基酸取代，
根据IMGT方案编号。
121.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：
a.抗原结合结构域；和
b.恒定结构域，其中所述恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区，并且其中所述IgA2重链恒定区相对于包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含：
i.N45.2G氨基酸取代，
ii.N114T氨基酸取代，
iii.I115L氨基酸取代，
iv.T116S氨基酸取代，
v.选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，
vi.L15.3I氨基酸取代，
vii.T16S氨基酸取代，和
viii.C末端氨基酸P131-Y148的缺失，
根据IMGT方案编号。
122.根据权利要求121所述的抗体构建体，所述抗体构建体相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WTIgA2重链恒定区还包含：
i.C86S氨基酸取代，
ii.P124R氨基酸取代，
iii.C147的缺失，
iv.Y148的缺失，或
v.其组合，
根据IMGT方案编号。
123.根据权利要求121或权利要求122所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA2重链恒定区包含与选自SEQ ID NO:18-21中的任一个的序列至少95％相同的氨基酸序列。
124.根据权利要求121-123中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段是非糖基化的。
125.根据权利要求121-124中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的IgA相比具有增加的循环半衰期，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2、L15.3、T16或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。
126.根据权利要求121-125中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与包含IgG重链恒定结构域的对应的抗体相比诱导增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
127.根据权利要求121-126中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的IgA相比表现出增加的热稳定性，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2、L15.3、T16或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。
128.根据权利要求121-127中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的IgA相比表现出减少的糖基化，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2、L15.3、T16或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。
129.根据权利要求121-128中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区与对应的IgA相比表现出以增加的亲和力与免疫效应细胞上表达的FcαR结合，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2、L15.3、T16或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。
130.根据权利要求1-129中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区还包含铰链区。
131.根据权利要求130所述的抗体或其功能性片段，其中所述铰链区包含IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。
132.根据权利要求131所述的抗体或其功能性片段，其中所述铰链区包含人类IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。
133.根据权利要求130或131所述的抗体或其功能性片段，其中所述铰链是IgA1铰链或IgA2铰链或其变体或片段。
134.根据权利要求1-133中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述恒定结构域还包含轻链恒定区。
135.根据权利要求134所述的抗体或其功能性片段，其中所述轻链恒定区是κ轻链恒定区，其中所述κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:31的序列。
136.根据权利要求1-135中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA重链恒定区还包含一个或更多个白蛋白结合区。
137.根据权利要求136所述的抗体或其功能性片段，其中所述一个或更多个白蛋白结合结构域被融合至所述CH3区的C末端。
138.根据权利要求136所述的抗体或其功能性片段，其中所述恒定区包含所述轻链恒定区，并且所述一个或更多个白蛋白结合结构域被融合至所述轻链恒定区。
139.根据权利要求136-138中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与不包含所述一个或更多个白蛋白结合结构域的对应的IgA抗体相比具有更长的循环半衰期。
140.根据权利要求1-139中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中当在合适的体外补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中测量时，所述抗体或其功能性片段与包含IgG重链恒定结构域的对应的抗体相比表现出减少的CDC。
141.根据权利要求1-140中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中当在合适的体外抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定中测量时，所述抗体或其功能性片段与对应的WT IgA抗体相比表现出增加的ADCC。
142.根据权利要求1-141中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。
143.根据权利要求142所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链可变区包含以下互补决定区(CDR)中的至少一个：
包含选自SEQ ID NO:33-40中的任一个的氨基酸序列的HC-CDR1；
包含选自SEQ ID NO:41-48中的任一个的氨基酸序列的HC-CDR2；和
包含选自SEQ ID NO:49-56中的任一个的氨基酸序列的HC-CDR3。
144.根据权利要求142或权利要求143所述的抗体或其功能性片段，其中所述轻链可变区包含以下互补决定区(CDR)中的至少一个：
包含选自SEQ ID NO:57-64中的任一个的氨基酸序列的LC-CDR1；
包含选自SEQ ID NO:65-72中的任一个的氨基酸序列的LC-CDR2；和
包含选自SEQ ID NO:73-80中的任一个的氨基酸序列的LC-CDR3。
145.根据权利要求142-144中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:81-86中的任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列。
146.根据权利要求142-145中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:95-100中的任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列。
147.根据权利要求143-146中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链CDR和轻链CDR中的每一个均来源于IgG抗体。
148.根据权利要求142-147中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链可变区还包含以下四个框架区(FW)：HC-FW1、HC-FW2、HC-FW3和HC-FW4。
149.根据权利要求142-148中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述轻链可变区还包含以下四个框架区(FW)：LC-FW1、LC-FW2、LC-FW3和LC-FW4。
150.根据权利要求148-149中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链FW区和轻链FW区中的每一个均来源于IgG抗体。
151.根据权利要求148-149中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链FW区和轻链FW区中的每一个均来源于IgA抗体。
152.根据权利要求1-150中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段是。
153.所述抗体是嵌合抗体、重链抗体、单链抗体、人源化抗体、人类抗体、单克隆抗体、去免疫化抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、多价抗体或其组合。
154.根据权利要求1-152中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗原结合片段包括Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体、线性抗体、单结构域抗体(sdAb)、骆驼科动物(camelid)VHH结构域或由抗体片段形成的多特异性抗体。
155.根据权利要求1-153中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变结构域与GD2、CD20、CD47、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1或CD25特异性地结合。
156.根据权利要求1-154中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段还包括酶、底物、辅因子、荧光标志物、化学发光标志物、肽标签、磁性颗粒、药物、毒素、放射性核素、第二抗体的结合位点、金属结合结构域或其组合。
157.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-155中任一项所述的抗体或其功能性片段以及药学上可接受的载体。
158.一种治疗有相应需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗剂量的权利要求1-155中任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求156所述的药物组合物。
159.根据权利要求156或权利要求157所述的方法，其中所述抗体或其功能性片段或所述药物组合物对靶细胞是细胞裂解性的。
160.根据权利要求158所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
161.根据权利要求157-159中任一项所述的方法，其中所述抗体或其功能性片段或所述药物组合物抑制肿瘤生长。
162.根据权利要求157-160中任一项所述的方法，其中所述抗体或其功能性片段或所述药物组合物通过皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内施用。
163.根据权利要求157-161中任一项所述的方法，其中所述抗体或其功能性片段或所述药物组合物与第二治疗剂组合施用至所述受试者。
164.根据权利要求162所述的方法，其中所述第二治疗剂包括抗癌剂、化学治疗剂、放射疗法、细胞毒性剂、NSAID、皮质类固醇、膳食补充剂诸如抗氧化剂或其组合。
165.根据权利要求162-163中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂在施用所述抗体或其功能性片段或所述药物组合物之前、同时或之后施用。
166.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码权利要求1-155中任一项所述的抗体或其功能性片段。
167.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码重链多肽，所述分离的核酸分子包含编码IgA重链恒定区的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列选自SEQ ID NO:25-32中的任一个。
168.根据权利要求166所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子还包含编码重链可变区的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列选自SEQ ID NO:87-84中的任一个。
169.一种载体，所述载体包含权利要求165-167中任一项所述的分离的核酸分子。
170.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求165-167中任一项所述的分离的核酸分子。
171.根据权利要求169所述的宿主细胞，所述宿主细胞还包含编码轻链多肽的分离的核酸分子，其中编码所述轻链多肽的所述分离的核酸分子包含编码轻链可变区的核酸序列，其中所述核酸序列选自SEQ ID NO:101-108中的任一个。
172.根据权利要求170所述的宿主细胞，其中编码所述轻链多肽的所述分离的核酸分子还包含编码κ轻链恒定区的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:32的序列。
173.一种宿主细胞，所述宿主细胞表达权利要求1-155中任一项所述的抗体或其功能性片段。
174.根据权利要求169-172中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞。
175.根据权利要求173所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞或HEK293细胞。
176.一种产生抗体或其功能性片段的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求169-174中任一项所述的宿主细胞在允许表达由所述分离的核酸分子编码的多肽和组装所述抗体或其功能性片段的条件下在培养基中培养；并且
(b)从所培养的宿主细胞或所述宿主细胞的培养基中纯化所述抗体或其功能性片段。
177.根据权利要求175所述的方法，其中所述纯化通过尺寸排阻层析进行。
178.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与CD20多肽或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：
(a)IgA重链恒定区，其中所述IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列；和
(b)重链可变区，其中所述重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:33的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:41的HC-CDR2和SEQ ID NO:49的HC-CDR3；
(c)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:57的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:65的LC-CDR2和SEQ ID NO:73的LC-CDR3；或
(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。
179.根据权利要求177所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变重链包含与SEQ IDNO:81的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且所述可变轻链包含与SEQID NO:95的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
180.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与GD2蛋白或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：
(a)IgA重链恒定区，其中所述IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21中的任一个的氨基酸序列；和
(b)重链可变区，其中所述重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:34的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:42的HC-CDR2和SEQ ID NO:50的HC-CDR3；
(c)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:58的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:66的LC-CDR2和SEQ ID NO:74的LC-CDR3；或
(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。
181.根据权利要求180所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变重链包含与SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且所述可变轻链包含与SEQ IDNO:5的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
182.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与Her2蛋白或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：
(a)IgA重链恒定区，其中所述IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21的氨基酸序列；和
(b)重链可变区，其中所述重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:35的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:43的HC-CDR2和SEQ ID NO:51的HC-CDR3；
(c)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:59的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:67的LC-CDR2和SEQ ID NO:75的LC-CDR3；或
(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。
183.根据权利要求182所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变重链包含与SEQ IDNO:82的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且所述可变轻链包含与SEQID NO:96的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
184.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与gp75蛋白或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：
(a)IgA重链恒定区，其中所述IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21的氨基酸序列；和
(b)重链可变区，其中所述重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:36的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:44的HC-CDR2和SEQ ID NO:52的HC-CDR3；
(c)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:60的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:68的LC-CDR2和SEQ ID NO:76的LC-CDR3；或
(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。
185.根据权利要求184所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变重链包含与SEQ IDNO:83的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且所述可变轻链包含与SEQID NO:97的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
186.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与CTLA4蛋白或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：
(a)IgA重链恒定区，其中所述IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21的氨基酸序列；和
(b)重链可变区，其中所述重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:37的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:45的HC-CDR2和SEQ ID NO:53的HC-CDR3；
(c)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:61的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:69的LC-CDR2和SEQ ID NO:77的LC-CDR3；或
(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。
187.根据权利要求186所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变重链包含与SEQ IDNO:84的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且所述可变轻链包含与SEQID NO:98的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
188.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与CD47蛋白或其变体选择性地结合，所述抗体或其功能性片段包含：
(a)IgA重链恒定区，其中所述IgA重链恒定区包含选自SEQ ID NO:16-21的氨基酸序列；和
(b)重链可变区，其中所述重链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:38的重链互补决定区1(HC-CDR1)、SEQ ID NO:46的HC-CDR2和SEQ ID NO:54的HC-CDR3；
(c)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含以下中的至少一个：SEQ ID NO:62的轻链互补决定区1(LC-CDR1)、SEQ ID NO:70的LC-CDR2和SEQ ID NO:78的LC-CDR3；或
(d)(b)的可变重链和(c)的可变轻链。
189.根据权利要求188所述的抗体或其功能性片段，其中所述可变重链包含与SEQ IDNO:85的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列，并且所述可变轻链包含与SEQID NO:99的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽序列。
190.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：
a.抗原结合结构域；和
b.恒定结构域，其中所述恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区，并且其中所述IgA2重链恒定区相对于包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的WT IgA2重链恒定区包含：
i.N45.2G氨基酸取代，
ii.N135Q氨基酸取代，
iii.C147的缺失，和
iv.Y148的缺失，
根据IMGT方案编号。
191.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含：
a.抗原结合结构域；和
b.恒定结构域，其中所述恒定结构域包含IgA2重链恒定区，所述IgA2重链恒定区包含IgA2 CH1区、IgA2 CH2区和IgA2 CH3区，并且其中所述IgA2重链恒定区相对于包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区包含：
i.N45.2G氨基酸取代，
ii.N114T氨基酸取代，
iii.I115L氨基酸取代，
iv.T116S氨基酸取代，
v.选自由N15.2G、N15.2Q和N15.2T组成的组的氨基酸取代，和
vi.C末端氨基酸P131-Y148的缺失，
根据IMGT方案编号。
192.根据权利要求191所述的抗体构建体，所述抗体构建体相对于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的WT IgA重链恒定区还包含：
i.C86S氨基酸取代，
ii.P124R氨基酸取代，
iii.C147的缺失，
iv.Y148的缺失，
v.L15.3I氨基酸取代，
vi.T16S氨基酸取代，或
vii.其组合，
根据IMGT方案编号。
193.根据权利要求191或权利要求192所述的抗体或其功能性片段，其中所述IgA2重链恒定区包含与选自SEQ ID NO:18-21中的任一个的序列至少95％相同的氨基酸序列。
194.根据权利要求191-194中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段是非糖基化的。
195.根据权利要求191-194中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的IgA相比具有增加的循环半衰期，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。
196.根据权利要求121-125中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与包含IgG重链恒定结构域的对应的抗体相比诱导增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
197.根据权利要求121-126中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的IgA相比表现出增加的热稳定性，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。
198.根据权利要求121-127中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段与对应的IgA相比表现出减少的糖基化，所述对应的IgA包含野生型氨基酸残基N45.2、N114、I115、T116、N15.2或C末端氨基酸残基P131-Y148中的一个或更多个，根据IMGT方案编号。
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