CN114085878A - 基于微生物发酵的生物型发泡剂制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用生物发酵技术合成的生物型发泡剂制备方法，此发泡剂主要成份包含0.01‑0.05‰的活性物质，是将特定菌株在适宜环境下进行扩大培养、发酵合成，通过调节发酵后溶液酸碱性改变产物溶解度使其沉淀，并通过离心机高速离心、有机溶剂萃取和旋转蒸发后得到纯度较高的目的产物。本发明的生物型发泡剂具有较强的发泡能力，在经过气体作为动力混合后能够迅速产生细而密泡沫，发泡性能优异，并且其自身无毒害且可降解，生产工艺绿色环保，兼具发泡效果好、使用方便、成本低廉多种优点，可为消防泡沫灭火、矿山泡沫降尘、泡沫浮选等技术提供优质的发泡材料。
Description
技术领域
本发明属于泡沫技术领域，特别涉及一种生物型发泡剂及制备方法。
背景技术
泡沫通常是指由液体薄膜隔开的气泡聚集体，可用于消防泡沫灭火、矿山泡沫降尘、泡沫浮选和驱油技术等。一般来说，水难以直接形成泡沫，需要通过向水中加入发泡剂并借助鼓气、搅拌等方式将气相分散在液相中进而产生气泡，其中活性物质能够有效降低液体的表面张力，并且分子中的亲疏水基团，在溶于水后受疏水作用影响，亲水端伸入水中而疏水端伸入空气中，在液膜表面双电子层排列而包围空气，从而形成泡沫。因此，发泡剂成为影响泡沫技术应用效果的关键因素，然而传统的发泡剂普遍为化学发泡剂，存在发泡效能不足、生物降解性较差、具有一定毒害性等问题，导致其在应用中使用量增大、成本提升，对人员和器械设备都有一定的腐蚀性，且容易对环境污染周边环境。
发明内容
针对传统化学发泡剂的不足，本发明提供一种生物型发泡剂制备方案，它由生物活性物质和水组成，具体如下：
a.工程菌株获取：分别向枯草芽孢杆菌标准菌株中加入活化培养液并混合，使菌株分散于活化培养液中，用移液器抽取菌株-活化液混合物，分别接种至液态活化培养基和固态活化培养基中，并使用三角棒将固态培养基中菌液涂布均匀，在恒温条件下培养，若液态活化培养基中菌落呈现淡粉色、圆型、边缘不整齐、可褶皱、不透明、由湿润转向干燥的扁平状菌落形态，且固态活化培养基镜检菌落明显，则说明该菌株可作为合成生物型发泡剂的初级工程菌株。
b.高产菌株筛选：基于枯草芽孢杆菌的次级代谢产物表面活性肽具有溶血特性，向血琼脂平板中加入少量液态活化培养基中工程菌株菌液，使用三角棒将菌液均匀涂布，在恒温条件下培养，通过计算溶血圈比面积获取最大的菌株，接种至固态生长培养基和液态生长培养基中，在恒温条件下培养，其中固态培养基用于储藏，液态培养基用于富集培养。
c.菌株保藏与复壮：将需要保藏的菌株用SCP培养基充分稀释，涂布至固态生长培养基，在恒温条件下培养，在低温中可短期保存。将需要保藏的菌株用SCP培养基充分稀释，接种至液态生长培养基，在恒温条件下培养后，取菌液与甘油充分混合，制备成的溶液置于冷冻管中，速冻后冷藏于低温冰箱。可用于长期保藏。保藏的菌株在使用前需要对其进行复苏。短期保存至固态生长培养基的菌株将其置于恒温培养箱培养，并观察菌落形态。甘油管长期冷冻保藏的菌株，在复试前需要进行解冻。取菌液与液态生长培养基按照一定比例均匀混合。后接种菌液均匀涂布至固态活化培养基。将菌液与平板在恒温条件下培养，并观察形态变化。若固态活化培养基菌落特征明显，且呈现淡粉色、圆形、边缘不整齐、可褶皱、不透明、由湿润转向干燥的扁平状菌落形态，则说明该菌株复壮成功。
d.微生物发酵：取少量液态生长培养基中菌液接种至一定量液态发酵培养基，将液态培养基放于水浴摇床中，采用不同摇瓶方式在一定温度、酸碱度、摇床转速条件下培养24h以上。发酵完成后即可得到次级代谢产物。
e.活性物质提取：采用酸化分级沉淀法将发酵液中活性物质提取出来，先将装有发酵液的锥形瓶置于低温水浴锅中，保证微生物不再继续发酵，将发酵液倒入高速离心机中离心，取上清液加入盐酸调节pH值至酸性，在低温条件下静置过夜；反复离心、酸化数次后收集沉淀，即为表面活性肽粗品。将表面活性肽粗品加入无水甲醇，利用超声波使其充分溶解，使用高速离心机将溶液离心，取上清液采用旋转蒸发仪减压蒸发至干，蒸干物加超纯水并用NaOH调节pH值至碱性，用过滤膜过滤；滤液用浓盐酸调节pH至酸性后在高速离心机中离心,收集沉淀并干燥。沉淀干燥物即为表面活性肽纯品。
f.生物型发泡剂由下述成分组成：活性物质、水。
一种生物型发泡剂制备方法，包括以下步骤：
a.工程菌株获取：准备一支装有5ml液态活化培养基的10ml试管和两个固态活化培养基，移液枪吸取0.5ml液态活化培养基打入冻干管，充分混合，将菌液倒回固态活化培养基，混合均匀，吸取菌液，均匀涂布至固态活化培养基平板，每个平板涂布0.1-0.3ml菌液，整个过程应在无菌操作台上完成。将液态活化培养基和固态活化培养基置于30-40℃恒温培养箱中培养12-36h；若液态活化培养基中菌落呈现淡粉色、圆形、边缘不整齐、可褶皱、不透明、由湿润转向干燥的扁平状菌落形态，且固态活化培养基镜检菌落明显，则说明该菌株可作为合成生物型发泡剂的初级工程菌株。
b.高产菌株筛选：枯草芽孢杆菌的次级代谢产物表面活性肽具有溶血特性，该物质浓度越高，溶血能力越强。根据这一特性，可初步筛选表面活性肽合成能力较强的细菌。取液态活化培养基中一定量的培养液，用SCP培养基分级稀释一定倍数，稀释倍数由OD600值确定，OD值是采用分光光度计在600nm测定的吸光度。稀释后均匀涂布于血琼脂平板，在30-40℃下培养6-18h，筛选出溶血圈比面积较大的菌株，分别接种至固态生长培养基和液态生长培养基，在30-40℃条件下培养6-18h后，将固态培养基在2-5℃冰箱中保存并标记，液态培养基用于对筛选出的菌株富集培养。
c.菌株保藏与复壮：将需要保藏的菌株用SCP培养基充分稀释，涂布至固态生长培养基斜面，在30-40℃条件下培养6-18h后，在2-5℃冰箱中可短期保存，保存时间不宜超过20d；将需要保藏的菌株用SCP培养基充分稀释，接种至液态生长培养基，在30-40℃条件下培养6-18h后，取菌液与40％甘油充分混合，制备成1ml溶液于冷冻管中，速冻后冷藏于低温冰箱，可用于长期保藏，但保藏时间不宜超过400d；保藏的菌株在使用前需要对其进行复苏。短期保存至固态生长培养基的菌株将其至于30-40℃的恒温培养箱培养6-18h，并观察菌落形态。甘油管长期冷冻保藏的菌株，在复试前需要进行解冻。后取0.5ml菌液与液态生长培养基按照1:1(v/v)比例均匀混合。后接种50-200μl菌液均匀涂布至固态活化培养基。将菌液与平板置于30-40℃恒温培养箱，培养12-24h，并观察形态变化。若固态活化培养基平板菌落特征明显，且呈现淡粉色、圆形、边缘不整齐、可褶皱、不透明、由湿润转向干燥的扁平状菌落形态，则说明该菌株复壮成功。
d.在250ml三角瓶中装入液态发酵培养基50-70mL，用移液器精准取液态生长培养基中菌液注入三角瓶中，保证接种量为1.5-3％，将接种后的液态发酵培养基放入旋转式水浴摇床中，在温度为30-40℃、酸碱度为7-8、摇床转速为200-240r/min、通氧量为60-100ml/min条件下培养48h以上。发酵完成后即可得到次级代谢产物。
e.采用酸化分级沉淀法提取发酵液中活性物质，在低温下(4℃)将发酵液恒温水浴25-35min；将发酵液置于高速离心机，在相对离心力为6000-8000g的条件下离心15-25min；取上清液加入6mol/L浓盐酸调节pH至2.0，在2-5℃条件下静置过夜；在相对离心力为10000-13000g的条件下离心15-25min，弃上清液；沉淀用超净水重悬，调节pH至2.0再次酸洗；离心后，收集沉淀，即为表面活性肽粗品。将表面活性肽粗品加入20-40mL的无水甲醇，经20-60KHZ超声波萃取25-35min，使其充分溶解于甲醇试剂，在相对离心力为16000-20000g的条件下离心15-25min，上清液在50-60℃真空度为0.5-0.7的旋转蒸发仪中减压蒸发至干；蒸干物加超净水，用1mol/LNaOH调节pH至12.0，用滤膜过滤；滤液用6mol/L浓盐酸调节pH至2.0；在相对离心力为8000-11000g的条件下离心15-30min,收集沉淀并干燥。沉淀干燥物即为活性物质纯品。
f.按照重量将0.01‰-0.05‰活性物质加入水中，加热并将温度控制在37℃左右；使用磁力搅拌器搅拌40-50min,使活性物质在水中混合均匀；停止搅拌，将发泡剂溶液静置至室温，形成白色透明且均一稳定的生物型发泡剂。
本发明与传统的化学发泡剂相比，本发明具有以下优点：
第一，绿色环保性好。本发明的生物型发泡剂主要成份为微生物代谢产生的活性物质，采用微生物发酵法获取微生物次级代谢产物，该过程中无毒害物质产生，其中微生物需用的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均为理想生防微生物，在土壤中广泛存在，对人无危害性。
第二，制备工艺简单。本发明的生物型发泡剂发泡性能优异且稳定性好，其制备工艺操作简单，仅需将活性物质按照重量加入至水中，并充分搅拌混合均匀，即可得到不同浓度的发泡剂。
第三，表面活性高，发泡能力强。本发明的生物型发泡剂中活性物质为微生物次级代谢产物，该生物型发泡剂的临界胶束浓度为0.03‰左右，使用量最多是传统化学发泡剂的三十分之一；且具有优异的发泡性能，活性物质中含有的亲疏水基团，能够在气液界面和液相内部有序排布，其中的环状/长链状活性分子可很好的降低水的表面张力，增加泡沫形成速率。
第四，泡沫均匀而细密。采用鼓气法能够产生均匀且密集的泡沫，气泡尺寸均匀、分布细密，气泡之间压差小，气体扩散速率降低，可使泡沫维持一定时间，能够减少由扩散导致气泡失稳，改善气泡的稳定性。
具体实施方式
实施案例1：用于矿山抑尘泡沫技术发泡基础材料
首先，准备一支装有5ml液态活化培养基的10ml试管和两个固态活化培养基，移液枪吸取0.5ml液态活化培养基打入冻干管，充分混合，将菌液倒回固态活化培养基，混合均匀，吸取菌液，均匀涂布至固态活化培养基平板，每个平板涂布0.2ml菌液，将整个过程应在无菌操作台上完成。将液态活化培养基和固态活化培养基正置于37℃恒温培养箱中培养24h；若液态活化培养基中菌落呈现淡粉色、圆形、边缘不整齐、可褶皱、不透明、由湿润转向干燥的扁平状菌落形态，且固态活化培养基镜检菌落明显，则说明该菌株可作为合成生物型发泡剂的初级工程菌株。
其次，取液态活化培养基中一定量的培养液，用SCP培养基分级稀释一定倍数，稀释倍数由OD600值确定，OD值是采用分光光度计在600nm时测定的吸光度。稀释后均匀涂布于血琼脂平板，在37℃下培养12h，筛选出溶血圈比面积较大的菌株，分别接种液态生长培养基，在37℃条件下培养12h。
然后，在250ml三角瓶中装入液态发酵培养基59.89mL，用移液器精准吸取液态生长培养基中的菌液注入三角瓶中，保证接种量为2.17％，将接种后的液态发酵培养基放入旋转式水浴摇床中，在温度为37.56℃、酸碱度为7.99、摇床转速为220r/min、通氧量为80ml/min条件下培养48h以上。发酵完成后即可得到次级代谢产物。
再者，采用酸化分级沉淀法提取发酵液中活性物质，在低温下(4℃)将发酵液恒温水浴45min；将发酵液置于高速离心机，在相对离心力为7500g的条件下离心25min；取上清液加入6mol/L浓盐酸调节pH至2.0，在4℃条件下静置过夜；在相对离心力为12000g的条件下离心30min，弃上清液；沉淀用超净水重悬，调节pH至2.0再次酸洗；离心后，收集沉淀，即为表面活性肽粗品。将表面活性肽粗品加入40mL的无水甲醇，经40KHZ超声波萃取30min,在相对离心力为18000g的条件下离心20min，上清液在55℃真空为0.6的旋转蒸发仪中减压蒸发至干；蒸干物加超净水，用1mol/LNaOH调节pH至12.0，用滤膜过滤；滤液用6mol/L浓盐酸调节pH至2.0；在相对离心力为10000g的条件下离心20min,收集沉淀并干燥。沉淀干燥物即为活性物质纯品。
最后，将按照重量将0.003kg活性物质加入99.997kg水中，加热并将温度控制在37℃左右；使用磁力搅拌器搅拌40-50min,使活性物质在水中混合均匀；停止搅拌，将发泡剂溶液静置至室温，形成白色透明且均一稳定的生物型发泡剂。
实施案例2：用于矿井火灾泡沫技术发泡基础材料
首先，准备一支装有5ml液态活化培养基的10ml试管和两个固态活化培养基，移液枪吸取0.5ml液态活化培养基打入冻干管，充分混合，将菌液倒回固态活化培养基，混合均匀，吸取菌液，均匀涂布至固态活化培养基平板，每个平板涂布0.3ml菌液，整个过程应在无菌操作台上完成。将液态活化培养基和固态活化培养基正置于37℃恒温培养箱中培养36h；若液态活化培养基中菌落呈现淡粉色、圆形、边缘不整齐、可褶皱、不透明、由湿润转向干燥的扁平状菌落形态，且固态活化培养基镜检菌落明显，则说明该菌株可作为合成生物型发泡剂的初级工程菌株。
其次，取液态活化培养基中一定量的培养液，用SCP培养基分级稀释一定倍数，稀释倍数由OD600值确定，OD值是采用分光光度计在600nm时测定的吸光度。稀释后均匀涂布于血琼脂平板，在37℃下培养24h，筛选出溶血圈比面积较大的菌株，分别接种液态生长培养基，37℃下培养24h后。
然后，在250ml三角瓶中装入液态发酵培养基55mL，用移液器精准吸取液态生长培养基中的菌液注入三角瓶中，保证接种量为2.5％，将接种后的液态发酵培养基放入旋转式水浴摇床中，在温度为37.6℃、酸碱度为8、摇床转速为220r/min、通氧量为90ml/min条件下培养72h以上。发酵完成后即可得到次级代谢产物。
再者，采用酸化分级沉淀法提取发酵液中活性物质，在低温下(2℃)将发酵液恒温水浴30min；将发酵液置于高速离心机，在相对离心力为8000g的条件下离心20min；取上清液加入6mol/L浓盐酸调节pH至2.0，在2℃条件下静置过夜；在相对离心力为12000g的条件下离心30min，弃上清液；沉淀用超净水重悬，调节pH至2.0再次酸洗；离心后，收集沉淀，即为表面活性肽粗品。将表面活性肽粗品加入50mL的无水甲醇，经50KHZ超声波萃取25min,在相对离心力为18000g的条件下离心20min，上清液在60℃，真空度为0.6的旋转蒸发仪中减压蒸发至干；蒸干物加超净水，用1mol/LNaOH调节pH至12.0，用滤膜过滤；滤液用6mol/L浓盐酸调节pH至2.0；在相对离心力为12000g的条件下离心15min,收集沉淀并干燥。沉淀干燥物即为活性物质纯品。
最后，按照重量将0.005kg活性物质加入99.995kg水中，加热并将温度控制在30-40℃；使用磁力搅拌器搅拌40-50min,使活性物质在水中混合均匀；停止搅拌，将发泡剂溶液静置至室温，形成白色透明且均一稳定的生物型发泡剂。
图1本发明与传统化学发泡剂的发泡能力
发泡能力FC是泡沫体积与通入气体量的比值，如图1所示，生物型发泡剂质量浓度为0.03％时，其发泡能力与质量浓度1‰的传统化学发泡剂相同，说明达到相同的发泡效果，该生物性发泡剂最多仅需传统化学发泡剂的三十分之一。而继续增加生物型发泡剂的浓度，其发泡能力无明显提升，说明0.03‰为生物型发泡剂的最佳使用浓度。
图2本发明与传统化学发泡剂的泡沫尺寸
图2表示三种浓度发泡剂在发泡结束的1min、5min、10min、15min后起泡的分布情况，通过图中可看出在初始时刻，生物型发泡剂的气泡呈现“小而密”的状态，并随着时间的增加，生物型发泡剂的气泡总体更加均匀，能够发现更为明显的Plateau边界，这说明气泡之间紧密排列，能够提升气泡的稳定性。
Claims (7)
1.一种生物型发泡剂，其特征在于，它由生物活性物质和水组成，制备步骤如下：
a.工程菌株获取：分别向枯草芽孢杆菌标准菌株中加入活化培养液并混合，使菌株分散于活化培养液中，用移液器抽取菌株-活化液混合物分别接种至液态活化培养基和固态活化培养基中，并使用三角棒将固态培养基中菌液涂布均匀，在恒温条件下培养，当固态活化培养基中长出淡粉色、若活化培养液中菌落呈现淡粉色、圆型、边缘不整齐、可褶皱、不透明、由湿润转向干燥的扁平状菌落形态，且固态活化培养基镜检菌落明显，则说明该菌株可作为合成生物型发泡剂的初级工程菌株。
b.高产菌株筛选：基于枯草芽孢杆菌的次级代谢产物表面活性肽具有溶血特性，向血琼脂平板中加入少量液态活化培养基中的工程菌株菌液，使用三角棒将菌液均匀涂布，在恒温条件下培养，通过计算溶血圈比面积获取最大的菌株，接种至固态生长培养基和液态生长培养基中，在恒温条件下培养，其中固态培养基用于储藏，液态培养基用于富集培养。
c.菌株保藏与复壮：将需要保藏的菌株用SCP培养基充分稀释，涂布至固态生长培养基，在恒温条件下培养，在低温中可短期保存。将需要保藏的菌株用SCP培养基充分稀释，接种至液体生长培养基，在恒温条件下培养后，取菌液与甘油充分混合，制备成的溶液置于冷冻管中，速冻后冷藏于低温冰箱。可用于长期保藏。保藏的菌株在使用前需要对其进行复苏。短期保存至固态生长培养基的菌株将其置于恒温培养箱培养，并观察菌落形态。甘油管长期冷冻保藏的菌株，在复试前需要进行解冻。取菌液与液态生长培养基按照一定比例均匀混合。后接种菌液均匀涂布至固态活化培养基。将菌液与平板在恒温条件下培养，并观察形态变化。若固态活化培养基菌落特征明显，且呈现淡粉色、圆型、边缘不整齐、可褶皱、不透明、由湿润转向干燥的扁平状菌落形态，则说明该菌株复壮成功。
d.微生物发酵：取少量液态生长培养基中菌液接种至一定量液态发酵培养基，将液态培养基放于水浴摇床中，采用不同摇瓶方式在一定温度、酸碱度、摇床转速条件下培养24h以上。发酵完成后即可得到次级代谢产物。
e.活性物质提取：采用酸化分级沉淀法将发酵液中活性物质提取出来，先将装有发酵液的锥形瓶置于低温水浴锅中，保证微生物不再继续发酵，将发酵液倒入高速离心机中离心，取上清液加入盐酸调节pH值至酸性，在低温条件下静置过夜；反复离心、酸化数次后收集沉淀，即可得到表面活性肽粗品。将表面活性肽粗品加入无水甲醇，利用超声波使其充分溶解，使用高速离心机将溶液离心，取上清液采用旋转蒸发仪减压蒸发至干，蒸干物加超纯水并用NaOH调节pH值至碱性，用过滤膜过滤；滤液用浓盐酸调节pH至酸性后在高速离心机中离心,收集沉淀并干燥。沉淀干燥物即为表面活性肽纯品。
f.生物型发泡剂由下述成分组成：活性物质、水。
2.根据权利要求1所述的一种生物型发泡剂，其特征在于，工程菌株获取具体步骤如下：
准备一支装有5ml液态活化培养基的10ml试管和两个固态活化培养基，移液枪吸取0.5ml液态活化培养基打入冻干管，充分混合，将菌液倒回固态活化培养基，混合均匀，吸取菌液，均匀涂布至固态活化培养基平板，每个平板涂布0.1-0.3ml菌液，整个过程应在无菌操作台上完成。将液态活化培养基和固态活化培养基置于30-40℃恒温培养箱中培养12-36h；若液态活化培养基中菌落呈现淡粉色、圆形、边缘不整齐、可褶皱、不透明、由湿润转向干燥的扁平状菌落形态，且固态活化培养基镜检菌落明显，则说明该菌株可作为合成生物型发泡剂的初级工程菌株。
3.根据权利要求1所述的一种生物型发泡剂，其特征在于，高产菌株筛选具体步骤如下：
枯草芽孢杆菌的次级代谢产物表面活性肽具有溶血特性，该物质浓度越高，溶血能力越强。根据这一特性，可初步筛选表面活性肽合成能力较强的细菌。取液态活化培养基中一定量的培养液，用SCP培养基分级稀释一定倍数，稀释倍数由OD600值确定，OD值是采用分光光度计在600nm时测定的吸光度。稀释后均匀涂布于血琼脂平板，在30-40℃下培养6-18h，筛选出溶血圈比面积较大的菌株，分别接种至固态生长培养基和液态生长培养基，在30-40℃条件下培养6-18h后，将固态培养基在2-5℃冰箱中保存并标记，液态培养基用于对筛选出菌株的富集培养。
4.根据权利要求1所述的一种生物型发泡剂，其特征在于，菌株保藏与复壮具体步骤如下：
将需要保藏的菌株用SCP培养基充分稀释，涂布至固态生长培养基斜面，在30-40℃条件下培养6-18h后，在2-5℃冰箱中可短期保存，保存时间不宜超过20d；将需要保藏的菌株用SCP培养基充分稀释，接种至液态生长培养基，在30-40℃条件下培养6-18h后，取菌液与40％甘油充分混合，制备成1ml溶液于冷冻管中，速冻后冷藏于低温冰箱，可用于长期保藏，但保藏时间不宜超过400d；保藏的菌株在使用前需要对其进行复苏。短期保存至固态生长培养基的菌株将其至于30-40℃的恒温培养箱培养6-18h，并观察菌落形态。甘油管长期冷冻保藏的菌株，在复试前需要进行解冻。后取0.5ml菌液与液态生长培养基按照1:1(v/v)比例均匀混合。后接种50-200μl菌液均匀涂布至固态活化培养基。将菌液与平板置于30-40℃恒温培养箱，培养12-24h，并观察形态变化。若固态活化培养基平板菌落特征明显，且呈现淡粉色、圆形、边缘不整齐、可褶皱、不透明、由湿润转向干燥的扁平状菌落形态，则说明该菌株复壮成功。
5.根据权利要求1所述的一种生物型发泡剂，其特征在于，微生物发酵具体步骤如下：
在250ml三角瓶中装入液态发酵培养基50-70mL，用移液器精准吸取液态生长培养基中的菌液注入三角瓶中，保证接种量为1.5-3％，将接种后的液态发酵培养基放入旋转式水浴摇床中，在温度为30-40℃、酸碱度为7-8、摇床转速为200-240r/min、通氧量为60-100ml/min条件下培养48h以上。发酵完成后即可得到次级代谢产物。
6.根据权利要求1所述的一种生物型发泡剂，其特征在于，活性物质提取具体步骤如下：
采用酸化分级沉淀法提取发酵液中活性物质，在低温下(4℃)将发酵液恒温水浴25-35min；将发酵液置于高速离心机，在相对离心力为6000-8000g的条件下离心15-25min；取上清液加入6mol/L浓盐酸调节pH至2.0，在2-5℃条件下静置过夜；在相对离心力为10000-13000g的条件下离心15-25min，弃上清液；沉淀用超净水重悬，调节pH至2.0再次酸洗；离心后，收集沉淀，即为表面活性肽粗品。将表面活性肽粗品加入20-40mL的无水甲醇，经20-60KHZ超声波萃取25-35min,使其充分溶解于甲醇试剂,使用滤膜过滤，剩余活性大分子结构，将过滤后的剩余物质加入超纯水，在相对离心力为16000-20000g的条件下离心15-25min，上清液在50-60℃真空为0.5-0.7的旋转蒸发仪中减压蒸发至干；蒸干物加超净水，用1mol/LNaOH调节pH至12.0，用滤膜过滤；滤液用6mol/L浓盐酸调节pH至2.0；在相对离心力为8000-11000g的条件下离心15-30min,收集沉淀并干燥。沉淀干燥物即为活性物质纯品。
7.根据权利要求1所述的一种生物型发泡剂，其特征在于，生物型发泡剂配制具体步骤如下：
按照重量将0.01‰-0.05‰活性物质加入水中，加热并将温度控制在30-40℃左右；使用磁力搅拌器搅拌40-50min,使活性物质在水中混合均匀；停止搅拌，将发泡剂溶液静置至室温，形成白色透明且均一稳定的生物型发泡剂。
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|---|---|
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5227294A (en) * | 1990-06-22 | 1993-07-13 | Eniricerche S.P.A. | Method of producing surfactin with the use of mutant of bacillus subtilis |
| CN101148650A (zh) * | 2007-09-03 | 2008-03-26 | 河北省农林科学院植物保护研究所 | 一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用 |
| WO2009050222A1 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-23 | Unilever Plc | Method for producing a foaming agent |
| CN102061280A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-05-18 | 西南大学 | 产薯蓣皂甙元的枯草芽孢杆菌swb8 |
| CN102443551A (zh) * | 2011-08-19 | 2012-05-09 | 甘肃省商业科技研究所 | 一种枯草芽孢杆菌及其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法 |
| CN109306329A (zh) * | 2018-03-16 | 2019-02-05 | 广州大峰收技术服务有限公司 | 枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN109574533A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-05 | 贵州安凯达实业股份有限公司 | 一种环境友好型发泡剂及其制备方法 |
| CN110331179A (zh) * | 2019-07-25 | 2019-10-15 | 中国矿业大学 | 一种生物抑尘剂的绿色合成方法 |
| WO2020149733A1 (en) * | 2019-01-16 | 2020-07-23 | Petroliam Nasional Berhad (Petronas) | Composition with foaming properties |
-
2021
- 2021-10-15 CN CN202111206086.XA patent/CN114085878A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5227294A (en) * | 1990-06-22 | 1993-07-13 | Eniricerche S.P.A. | Method of producing surfactin with the use of mutant of bacillus subtilis |
| CN101148650A (zh) * | 2007-09-03 | 2008-03-26 | 河北省农林科学院植物保护研究所 | 一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用 |
| WO2009050222A1 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-23 | Unilever Plc | Method for producing a foaming agent |
| CN101827932A (zh) * | 2007-10-18 | 2010-09-08 | 荷兰联合利华有限公司 | 制备发泡剂的方法 |
| CN102061280A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-05-18 | 西南大学 | 产薯蓣皂甙元的枯草芽孢杆菌swb8 |
| CN102443551A (zh) * | 2011-08-19 | 2012-05-09 | 甘肃省商业科技研究所 | 一种枯草芽孢杆菌及其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法 |
| CN109306329A (zh) * | 2018-03-16 | 2019-02-05 | 广州大峰收技术服务有限公司 | 枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN109574533A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-05 | 贵州安凯达实业股份有限公司 | 一种环境友好型发泡剂及其制备方法 |
| WO2020149733A1 (en) * | 2019-01-16 | 2020-07-23 | Petroliam Nasional Berhad (Petronas) | Composition with foaming properties |
| CN110331179A (zh) * | 2019-07-25 | 2019-10-15 | 中国矿业大学 | 一种生物抑尘剂的绿色合成方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BEATA KOIM-PUCHOWSKA等: "Evaluation of various methods of selection of B. subtilis strains capable of secreting surface-active compounds", PLOS ONE, vol. 14, no. 11, 12 November 2019 (2019-11-12), pages 2 - 3 * |
| HARY RAZAFINDRALAMBO等: "Foaming Properties of Surfactin, a Lipopeptide Biosurfactant from Bacillus subtilis", JOURNAL OF THE AMERICAN OIL CHEMISTS’SOCIETY, vol. 74, pages 149 * |
| 大辞海编辑委员会: "《大辞海 化工轻工纺织卷》", 31 August 2009, 上海辞书出版社, pages: 145 - 146 * |
| 李光月等: "表面活性素的国内外研究进展", 中国酿造, vol. 40, no. 2, 25 February 2021 (2021-02-25), pages 20 * |
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