CN114085869A - 一种特异性表达人源性sirpg的转基因小鼠的构建方法及其应用 - Google Patents

一种特异性表达人源性sirpg的转基因小鼠的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性表达人源性SIRPG的转基因小鼠的构建方法，属于生物技术领域，所述方法为利用CRISPR‑Cas9基因敲入技术***外源基因hSIRPG，具体步骤为：根据小鼠***位点序列，构建基于CRISPR‑Cas9***的gRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到gRNA和Cas9 mRNA；并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的Cas9 mRNA，gRNA和供体质粒显微注射到小鼠受精卵中；取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔，获得转基因小鼠，还公开了所得转基因小鼠的应用，本发明为研究SIRPG的功能、为探索hSIRPG在人类疾病，尤其是肺癌的发生、发展及治疗尤其是靶向治疗中的作用提供了动物模型，为筛选靶向SIRPG的抑制剂提供了便利。

Description

一种特异性表达人源性SIRPG的转基因小鼠的构建方法及其 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种特异性表达人源性SIRPG的转基因小鼠的构建方法及其应用。
背景技术
据统计，非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌的85％。ⅢA期NSCLC的5年生存率约为14％，ⅢB期的5年生存率约为5％。然而，一旦NSCLC发展到Ⅳ期并转移到不同的地方，就很难治疗了。Ⅳ期NSCLC的5年生存率仅为1％。免疫治疗是晚期非小细胞肺癌患者可供选择的有效治疗方式之一，比如：抗PD1/PDL1的免疫治疗虽然能使部分肺癌患者从中获益，但仍有大部分患者不能从中获益。因此，寻找新的免疫检测点抑制剂可为患者提供更多的选择性。而为了寻找新的免疫检测点抑制剂，试验功能小鼠是研究中必不可少的。
SIRPG(也被称为SIRPgamma、SIRP-beta2和CD172g)是一种具有细胞外免疫球蛋白样结构域的跨膜糖蛋白。它属于信号调节蛋白家族，由一组在人类染色体20p13上紧密定位的基因编码，还包括SIRPA、SIRPB和可溶性SIRPD。SIRPG主要表达在T淋巴细胞和活化的NK细胞上。到目前为止，SIRPG与非小细胞肺癌(NSCLC)的相互关系未见报道。
另外，由于小鼠缺失SIRPG基因，因此研究人员也无法利用基因敲除技术研究SIRPG在小鼠模型中的作用。所以，如何构建人源性SIRPG(即hSIRPG)基因敲入的小鼠模型是本领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一，就在于提供一种特异性表达人源性SIRPG的转基因小鼠的构建方法，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种特异性表达人源性SIRPG的转基因小鼠的构建方法，所述方法为利用CRISPR-Cas9基因敲入技术***外源基因hSIRPG，具体步骤为：根据小鼠***位点序列，构建基于CRISPR-Cas9***的gRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到gRNA和Cas9mRNA；并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的Cas9 mRNA，gRNA和供体质粒显微注射到小鼠受精卵中；取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔，获得转基因小鼠；其中，所述外源基因hSIRPG的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
基于本申请发明人的前期研究发现：NSCLC患者中癌细胞高表达SIRPG(参见图2)，因此，针对NSCLC癌细胞中SIRPG的阻断剂或者抑制剂的开发，可能是治疗NSCLC的一个重要方向。但是，本领域技术人员知晓的，小鼠是缺失SIRPG基因的，因此，本申请提出了一种人源性SIRPG(即hSIRPG)基因敲入的小鼠模型的构建方法，从而为相关研究提供研究条件和便利。
CRIPR/Cas***是一种高效、快速、简便和廉价的基因编辑技术。自2013年张锋实验室率先报道成功将CRISPR-Cas***成功地应用到了哺乳动物细胞后，CRISPR-Cas***在各种动物模型中得到大量的应用。目前，被最为广泛应用的CRISPR***是II型CRISPR-Cas***，也就是CRISPR-Cas9***。本发明采用CRISPR/Cas9***，设计、构建和体外转录gRNA，同时构建同源重组载体(Donor vector)，建立了人源化基因敲入转基因小鼠模型。
作为优选的技术方案：所述gRNA的核苷酸如SEQ ID NO:7所示：5′-CTGAGCCAACAGTGGTAGTA-3′。
作为优选的技术方案：所述外源基因有CAG启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)驱动，在启动子和外源基因之间包含一段受Cre重组酶条件性控制的STOP序列。
作为进一步优选的技术方案：所述重组酶为Cre重组酶。
作为进一步优选的技术方案：所述STOP序列如SEQ ID NO:3所示。
作为进一步优选的技术方案：所述外源基因hSIRPG和荧光报告基因之间通过P2A自切割肽段链接，所述P2A自切割肽段的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示：
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGCGACGTGGAGGAGAACCCTGGTCCT。
作为更进一步优选的技术方案：所述荧光报告基因编码绿色荧光蛋白zsGreen，其序列如SEQ ID NO:5所示。本领域技术人员知晓的，也可以使用其它荧光蛋白。
作为优选的技术方案：所述hSIRPG基因的5’端带有kozak序列，所述kozak序列为5′-GCCGCCACC-3′，能够增强外源基因的翻译效率；所述小鼠为C57BL/6JGpt背景的小鼠。
本发明的目的之二，在于提供采用上述方法构建的转基因小鼠的应用，包括：将构建所得的转基因小鼠与Kras LSL_G12D/+小鼠交配，得到hSIRPGLSL_KI/-+Kras LSL_G12D/+转基因小鼠，经鼻腔注射Cre病毒，诱导转基因小鼠肺部hSIRPG的表达以及Kras突变，观察hSIRPG敲入后转基因小鼠存活时间；解剖小鼠肺组织，取出称重并进行HE染色，观察肿瘤形成情况；
在KRASG12D/++SIRPGKI/+转基因小鼠Cre病毒注射8周后，每隔一天注射中和抗体，然后解剖小鼠肺组织，取出称重并进行HE染色，观察肿瘤形成情况并作统计。
所述Cre病毒优选为Ad-Cre病毒。
所述中和抗体优选为anti-SIRPG LSB2.20抗体，购自Santa Cruz公司。
所述转基因小鼠还用于下述的至少一项：
(1)观察hSIRPG基因敲入对转基因小鼠一般生理功能，尤其是免疫功能的影响；
(2)观察hSIRPG基因敲入后对肿瘤组织微环境免疫细胞浸润的影响；
(3)探索靶向hSIRPG后肿瘤生长抑制的具体机制；
(4)用于hSIRPG单克隆抗体的研究；
(5)用于探究更多hSIRPG基因功能的研究。
本发明通过构建hSIRPGLSL_KI/+转基因小鼠，可经过与Cre重组酶作用，探索hSIRPG基因表达的生理功能及病理作用，尤其是对肿瘤发生、发展以及免疫治疗的影响。同时，本发明还将hSIRPGLSL_KI/+小鼠与KrasLSL_G12D/+小鼠共同繁育，构建hSIRPGLSL_KI/++KrasLSL_G12D/+转基因小鼠模型，为探索hSIRPG在肺部肿瘤生长中的作用，以及靶向hSIRPG激活免疫抑制肿瘤生长提供了动物模型。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明为研究SIRPG的功能、为探索hSIRPG在人类疾病，尤其是肺癌的发生、发展及治疗尤其是靶向治疗中的作用提供了动物模型，为筛选靶向SIRPG的抑制剂提供了便利，具有利用价值高、实用性强等优点。
附图说明
图1为本发明的构建方法的设计策略图；转基因小鼠模型采用CRISPR/Cas9技术将CAG-LSL-hSIRPG-P2A-ZsGreen基因片段定点***到小鼠的H11位点；
图2为NSCLC患者癌和癌旁组织的免疫印迹图；在12例NSCLC患者中，SIRPG在癌组织(T)中的表达明显高于癌旁组织(A)；
图3为重组后序列的打靶载体图谱；
图4为鉴定策略示意图，图中；
野生型：①②PCR反应未获得Target条带；③PCR反应可以获得单一的WT条带；
杂合子：①②PCR反应可以获得Target条带；③PCR反应可以获得单一的WT条带；
纯合子：①②PCR反应可以获得Target条带；③PCR反应未获得单一的WT条带；
图5为KRASG12D/++SIRPGKI/+转基因小鼠获取策略图；经鼻腔注射Cre病毒，诱导转基因小鼠肺部hSIRPG的表达以及Kras突变。
图6为KRASG12D/+转基因小鼠与KRASG12D/++SIRPGKI/+转基因小鼠未经治疗的肺部HE染色图片；
图7为KRASG12D/+转基因小鼠与KRASG12D/++SIRPGKI/+转基因小鼠未经治疗的生存曲线，肺部体重，直径＞100μm的肿瘤结节数量对比图；
图8为KRASG12D/++SIRPGKI/+转基因小鼠接受靶向hSIRPG中和抗体后，对照组的肺部体重，直径＞100μm的肿瘤结节数量。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1
hSIRPGLSL_KI/+转基因小鼠的构建
一种特异性表达人源性SIRPG的转基因小鼠(hSIRPGLSL_KI/+)，其构建方法为：
采用CRISPR/Cas9技术将CAG-LSL-hSIRPG-P2A-ZsGreen(其氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示)***小鼠H11位点；
其原理示意图如图1所示，sgRNA设计在***位置周围，基于sgRNA的设计原则，在靶位点区域共设计多条sgRNA，将选定的sgRNA(SEQ ID NO:7：5′-CTGAGCCAACAGTGGTAGTA-3′)连入带T7启动子的质粒载体pUC57上并进行体外转录，得到进行显微注射的gRNA；
根据靶基因序列，设计引物，将目的基因(hSIRPG-P2A-zsGreen-pA)片段连接到PMD-18T载体上，即为供体质粒，质粒图谱如图3所示；
将Cas9 mRNA、gRNA和供体质粒按等摩尔比混合，显微注射到小鼠受精卵中，注射后至出生得到F0小鼠。由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0小鼠为嵌合体。故以F0小鼠鼠趾进行鉴定得到的F0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型待F1小鼠鼠趾检测后确定；
转基因小鼠的基因型鉴定(鉴定策略如图4)：
1)采用鼠尾直接PCR试剂盒(快速基因型鉴定)进行转基因小鼠基因型鉴定：
提取小鼠组织(脚趾)的基因组：组织裂解液与蛋白酶按100：1比例配制。
2)将50ul上述裂解液加到组织中，55℃孵育30分钟；然后95℃孵育5分钟以失火蛋白酶。
3)按照正常PCR程序扩增目的片段用于鉴定小鼠基因型。
4)用于鉴定hSIRPG等位基因的引物信息件表1：
表1用于鉴定hSIRPG等位基因的引物序列
Figure BDA0003365357570000071
表1中的引物序列依次记为SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:14。
实施例2
hSIRPGLSL_KI/+转基因小鼠的应用
KrasLSL_G12D/+转基因小鼠(为B6.129S4-Krastm4Tyj/Jnju，受赠于四川大学)携带一个点突变(G12D)，其表达被loxP侧翼终止密码子的存在所阻断，其纯合子在子宫中死亡。Cre介导的重组可以切除终止密码子，使致癌Kras蛋白得以表达。经鼻腔感染编码Cre的腺病毒可导致非常高的肺部肿瘤发生率，在肺部肿瘤的研究中起重要作用。
已有文献报道SIRPG主要在T淋巴细胞和活化的NK细胞上表达。本申请发明人在肺癌患者中检测到癌细胞高表达SIRPG(如图2所示)，高表达的SIRPG参与维持肿瘤细胞的干性以及免疫逃逸的发生。但小鼠体内并无SIRPG基因，建立hSIRPG基因敲入的小鼠模型可发挥巨大价值。
因此，将实施例1构建的hSIRPGLSL_KI/+转基因小鼠与KrasLSL_G12D/+转基因小鼠交配，得到基因型为hSIRPGLSL_KI/++KrasLSL_G12D/+的子代小鼠。可通过鼻腔注射Adeno-Cre病毒，使得肺部组织特异性表达Cre重组酶，通过剪切stop序列，产生基因型为hSIRPGKI/++KrasG12D/+的子代小鼠，肺部组织特异性表达hSIRPG。繁育策略如图5。通过前述方法鉴定转基因小鼠基因型。
KrasLSL_G12D+转基因小鼠引物信息：
①GTCGACAAGCTCATGCGGG(SEQ ID NO:15)
②CGCAGACTGTAGAGCAGCG(SEQ ID NO:16)
③CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC(SEQ ID NO:17)
①&②为野生型＝～507bp；
②&③为突变＝～600bp。
记录并观察KRASG12D/+和KRASG12D/++SIRPGKI/+转基因小鼠存活时间；解剖小鼠肺组织，取出称重并进行HE染色，观察肿瘤形成情况并做统计。小鼠肺组织HE染色结果见图6，小鼠生存时间，肺组织重量及肺结节数量统计结果见图7。结果表明，hSIRPG基因的敲入明显促进肿瘤生长，导致肿瘤结节数量明显增多，小鼠肿瘤负担明显加重，小鼠生存能力明显减弱，存活时间明显缩短，证明本发明能够为hSIRPG基因对肺癌的影响提供准确可靠的转基因小鼠模型；
在KRASG12D/++SIRPGKI/+转基因小鼠Cre病毒注射8周龄后，隔天给予中和抗体(IgG50μg/次；anti-SIRPG LSB2.20/50μg/次)治疗，共计4次。解剖小鼠肺组织，取出称重并进行HE染色，观察肿瘤形成情况并作统计。小鼠肺组织重量及肺结节数量统计结果见图8。结果表明，hSIRPG基因的敲入促进肿瘤生长，但靶向hSIRPG的中和抗体明显改善基因敲入小鼠的肿瘤负担，肺结节数量明显减少；证明本发明能够为靶向hSIRPG基因的肺癌治疗研究提供准确可靠的转基因小鼠模型，利于该领域的进一步研究。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 许川
邬红
刘益强
蒋涛
<120> 一种特异性表达人源性SIRPG的转基因小鼠的构建方法及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 387
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Pro Val Pro Ala Ser Trp Pro His Pro Pro Gly Pro Phe Leu Leu
1 5 10 15
Leu Thr Leu Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Ala Gly Glu Glu Glu Leu
20 25 30
Gln Met Ile Gln Pro Glu Lys Leu Leu Leu Val Thr Val Gly Lys Thr
35 40 45
Ala Thr Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly Pro Val
50 55 60
Leu Trp Phe Arg Gly Val Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln
65 70 75 80
Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu Thr Lys
85 90 95
Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Ser Ile Thr Pro Ala
100 105 110
Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Glu
115 120 125
Asn Val Glu Phe Lys Ser Gly Pro Gly Thr Glu Met Ala Leu Gly Ala
130 135 140
Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Leu Gly Pro Ala Ala Arg Thr Thr Pro
145 150 155 160
Glu His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro Arg
165 170 175
Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp Phe
180 185 190
Gln Thr Asn Val Asp Pro Thr Gly Gln Ser Val Ala Tyr Ser Ile Arg
195 200 205
Ser Thr Ala Arg Val Val Leu Asp Pro Trp Asp Val Arg Ser Gln Val
210 215 220
Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg Gly
225 230 235 240
Thr Ala Asn Leu Ser Glu Ala Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu Val
245 250 255
Thr Gln Gln Pro Met Arg Val Gly Asn Gln Val Asn Val Thr Cys Gln
260 265 270
Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Ser Leu Gln Leu Thr Trp Ser Glu Asn
275 280 285
Gly Asn Val Cys Gln Arg Glu Thr Ala Ser Thr Leu Thr Glu Asn Lys
290 295 300
Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Thr Ser Trp Phe Leu Val Asn Ile Ser Asp
305 310 315 320
Gln Arg Asp Asp Val Val Leu Thr Cys Gln Val Lys His Asp Gly Gln
325 330 335
Leu Ala Val Ser Lys Arg Leu Ala Leu Glu Val Thr Val His Gln Lys
340 345 350
Asp Gln Ser Ser Asp Ala Thr Pro Gly Pro Ala Ser Ser Leu Thr Ala
355 360 365
Leu Leu Leu Ile Ala Val Leu Leu Gly Pro Ile Tyr Val Pro Trp Lys
370 375 380
Gln Lys Thr
385
<210> 2
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
atgcctgtcc cagcctcctg gccccatcct cctggtcctt tcctgcttct gactctactg 60
ctgggactta cagaagtggc aggtgaggag gagctacaga tgattcagcc tgagaagctc 120
ctgttggtca cagttggaaa gacagccact ctgcactgca ctgtgacctc cctgcttccc 180
gtgggacccg tcctgtggtt cagaggagtt ggaccaggcc gggaattaat ctacaatcaa 240
aaagaaggcc acttccccag ggtaacaaca gtttcagacc tcacaaagag aaacaacatg 300
gacttttcca tccgcatcag tagcatcacc ccagcagatg tcggcacata ctactgtgtg 360
aagtttcgaa aagggagccc tgagaacgtg gagtttaagt ctggaccagg cactgagatg 420
gctttgggtg ccaaaccctc tgcccccgtg gtattgggcc ctgcggcgag gaccacacct 480
gagcatacag tgagtttcac ctgtgagtcc catggcttct ctcccagaga catcaccctg 540
aaatggttca aaaatgggaa tgagctctca gacttccaga ccaacgtgga ccccacagga 600
cagagtgtgg cctacagcat ccgcagcaca gccagggtgg tactggaccc ctgggacgtt 660
cgctctcagg tcatctgcga ggtggcccat gtcaccttgc agggggaccc tcttcgtggg 720
actgccaact tgtctgaggc catccgagtt ccacccacct tggaggttac tcaacagccc 780
atgagggtgg ggaaccaggt aaacgtcacc tgccaggtga ggaagttcta cccccagagc 840
ctacagctga cctggtcgga gaatggaaac gtgtgccaga gagaaacagc ctcgaccctt 900
acagagaaca aggatggtac ctacaactgg acaagctggt tcctggtgaa catatctgac 960
caaagggatg atgtggtcct cacctgccag gtgaagcatg atgggcagct ggcggtcagc 1020
aaacgccttg ccctagaggt cacagtccac cagaaggacc agagctcaga tgctacccct 1080
ggcccggcat catcccttac tgcgctgctc ctcatagctg tcctcctggg ccccatctac 1140
gtcccctgga agcagaagac c 1161
<210> 3
<211> 1662
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatctgtaa gtctgcagaa attgatgatc 60
tattaaacaa taaagatgtc cactaaaatg gaagtttttc ctgtcatact ttgttaagaa 120
gggtgagaac agagtaccta cattttgaat ggaaggattg gagctacggg ggtgggggtg 180
gggtgggatt agataaatgc ctgctcttta ctgaaggctc tttactattg ctttatgata 240
atgtttcata gttggatatc ataatttaaa caagcaaaac caaattaagg gccagctcat 300
tcctcccact catgatctat agatctatag atctctcgtg ggatcattgt ttttctcttg 360
attcccactt tgtggttcta agtactgtgg tttccaaatg tgtcagtttc atagcctgaa 420
gaacgagatc agcagcctct gttccacata cacttcattc tcagtattgt tttgccaagt 480
tctaattcca tcagaagctt gcagatctgc gactctagag gatcgactgt gccttctagt 540
tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact 600
cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 660
tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc 720
aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gctgcgactc tagaggatca taatcagcca 780
taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacgtt taaacctccc acacctcccc 840
ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat 900
aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 960
cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatctgcgac 1020
tctagaggat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 1080
tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 1140
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 1200
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 1260
tctggatctg cgactctaga ggatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 1320
tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 1380
tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 1440
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 1500
tgtatcttat catgtctgga tccccatcaa gctgataaca tacgctctcc atcaaaacaa 1560
aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc tgtccccagt gcaagtgcag gtgccagaac 1620
atttctctat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt at 1662
<210> 4
<211> 1720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 420
cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 480
tgggggcggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg 540
ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 600
tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 660
cgctgcgcgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg 720
gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg 780
ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct 840
tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg ggggagcggc tcggggggtg cgtgcgtgtg 900
tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggctc cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg 960
gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg 1020
tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt 1080
gggggggtga gcagggggtg tgggcgcgtc ggtcgggctg caaccccccc tgcacccccc 1140
tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtacgg ggcgtggcgc 1200
ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc 1260
gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc ccccggagcg ccggcggctg 1320
tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg 1380
acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc 1440
tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct 1500
tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccctctccag cctcggggct gtccgcgggg 1560
ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc gtgtgaccgg 1620
cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac agctcctggg 1680
caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa 1720
<210> 5
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggcccagt ccaagcacgg cctgaccaag gagatgacca tgaagtaccg catggagggc 60
tgcgtggacg gccacaagtt cgtgatcacc ggcgagggca tcggctaccc cttcaagggc 120
aagcaggcca tcaacctgtg cgtggtggag ggcggcccct tgcccttcgc cgaggacatc 180
ttgtccgccg ccttcatgta cggcaaccgc gtgttcaccg agtaccccca ggacatcgtc 240
gactacttca agaactcctg ccccgccggc tacacctggg accgctcctt cctgttcgag 300
gacggcgccg tgtgcatctg caacgccgac atcaccgtga gcgtggagga gaactgcatg 360
taccacgagt ccaagttcta cggcgtgaac ttccccgccg acggccccgt gatgaagaag 420
atgaccgaca actgggagcc ctcctgcgag aagatcatcc ccgtgcccaa gcagggcatc 480
ttgaagggcg acgtgagcat gtacctgctg ctgaaggacg gtggccgctt gcgctgccag 540
ttcgacaccg tgtacaaggc caagtccgtg ccccgcaaga tgcccgactg gcacttcatc 600
cagcacaagc tgacccgcga ggaccgcagc gacgccaaga accagaagtg gcacctgacc 660
gagcacgcca tcgcctccgg ctccgccttg ccc 693
<210> 6
<211> 9060
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atttccagga gcaatagtta tcactgcccc tttgtttctt aggtgtcact agaaaaacag 60
gtgaagtgaa ctgacctgtg cagtctcagg gattattact actgcaagga cagtcggagc 120
cagccatgct ctagctctgt ttttcacttc ttataagcct gagaattttt gctgagatgt 180
gaacatgtca gccttggtgg gctttcttac gttgcatttt cttacgttgc attttgcact 240
ttaggaagcc tttggttaaa tcctctggta gacttcccat cccccaaagt aacaaaccat 300
tcaagcaaag taggtcagaa aatattgtca atactgagaa caggacttgg gagtgagtat 360
ccaagggtgg tcttagtaga cttgtggggt tctgtgggtg aggtgtagag tagagctact 420
ttgctgcact gacactcttc tctccatagt tctgcatcct ccaggctcta gttcccaggc 480
agcagctatc agcgttcaga ctcctcagaa tgtacccagc cggtcgggca tgccccacat 540
gcactcccag ctggagcatc gtaccagcca aaggagcagc tcccctgtgg gccttgccaa 600
atggtttggc tcagatgtgc tacagcagcc tctgccctcc atgcccacca aagtcatcag 660
tgtagatgaa ctggaatata gacagtgaag agggcaggct ggctcaccca tacctggacc 720
tgtggtgaca ccctggtcat gactctcatt ccctctttgt aatgggcttt tacattggag 780
cacactatgt gaagatgttt aggggatcca catacctacc atgatctaca ttatgacaga 840
aggctgttaa atcgaatgaa cctacatggt tcaaatacaa gggatacaag attgtcagtc 900
ctggaagtct ttcttttata aaatatgtga atgaagtgtt ggtgtcttct agaggtgaca 960
cctaagggtt ctgaaaaaat aaaatgtata gacccttatg tacagacctg tgtataaact 1020
tttgtacata caaatagggt agcttttttt gaacttatac atacagctgt acataaagta 1080
actatcagtt aggcttgtgt caactgtttg gatttttttc acttgaatat ttgggacttt 1140
ttcttttggt ttattaaaag ttacatatgc cacgtgtgtg aacgatatgg ctggtactgt 1200
gtttatttct tccatgaact aagacagtct aaatgagttc ctttcacgtt ttaattttac 1260
cttaggactt ctggaatttc ttctgcacat aaagttctga tagcattagt ttaagctgga 1320
ctaaccctga aagtagcttg tggcaagtat caaggaatca atattatact ctacaaaatc 1380
aaagtttaca gagaagtcat atagtaattt ttctgaaatt tactggcaca atgttaatcc 1440
agcctgactc caactaatta atggtcacat taatttaagt ctttcccttg cctctgctgc 1500
attagtttct ctcaaaattg ttaacttaca acttgaagtc tggtattata aattgaatgt 1560
aaagcattct gaaagatact atactgattg caggtttttc agtcaggttc aagctaattt 1620
gaccagtcat tggattaatt atggatctgg ggccataaat gctattttaa ttccactata 1680
gagattaaaa taagccattc tccatttcat aatattctat tggactttga ctgcaggggc 1740
ctccaagtct tgacagtaga ttataatcct tcagctgccc actctactgg aggaggacaa 1800
actggtcact tttcagcaaa acctggctgt ggatcagggc agtctggtac ttccaagctc 1860
attagatgcc atcatgctct cactgcctcc tcagcttcaa gaggaatctg gaaaaagcag 1920
tcccactggt caggaaagga acactagtgc acttatcctg ggtgtctgct gagctcgaga 1980
gtcgacctta attaagtcga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg 2040
ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc 2100
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca 2160
tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 2220
cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg 2280
acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt 2340
ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct 2400
gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta tttatttttt 2460
aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg 2520
gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc 2580
gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag 2640
cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc 2700
ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga gcgggcggga 2760
cggcccttct cctccgggct gtaattagcg cttggtttaa tgacggcttg tttcttttct 2820
gtggctgcgt gaaagccttg aggggctccg ggagggccct ttgtgcgggg ggagcggctc 2880
ggggggtgcg tgcgtgtgtg tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggctccg cgctgcccgg 2940
cggctgtgag cgctgcgggc gcggcgcggg gctttgtgcg ctccgcagtg tgcgcgaggg 3000
gagcgcggcc gggggcggtg ccccgcggtg cggggggggc tgcgagggga acaaaggctg 3060
cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc agggggtgtg ggcgcgtcgg tcgggctgca 3120
accccccctg cacccccctc cccgagttgc tgagcacggc ccggcttcgg gtgcggggct 3180
ccgtacgggg cgtggcgcgg ggctcgccgt gccgggcggg gggtggcggc aggtgggggt 3240
gccgggcggg gcggggccgc ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc gcggcggccc 3300
ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc 3360
gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc ccaaatctgt gcggagccga aatctgggag 3420
gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga 3480
aatgggcggg gagggccttc gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc ctctccagcc 3540
tcggggctgt ccgcgggggg acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg 3600
cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt 3660
tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaat 3720
aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atctgtaagt ctgcagaaat tgatgatcta 3780
ttaaacaata aagatgtcca ctaaaatgga agtttttcct gtcatacttt gttaagaagg 3840
gtgagaacag agtacctaca ttttgaatgg aaggattgga gctacggggg tgggggtggg 3900
gtgggattag ataaatgcct gctctttact gaaggctctt tactattgct ttatgataat 3960
gtttcatagt tggatatcat aatttaaaca agcaaaacca aattaagggc cagctcattc 4020
ctcccactca tgatctatag atctatagat ctctcgtggg atcattgttt ttctcttgat 4080
tcccactttg tggttctaag tactgtggtt tccaaatgtg tcagtttcat agcctgaaga 4140
acgagatcag cagcctctgt tccacataca cttcattctc agtattgttt tgccaagttc 4200
taattccatc agaagcttgc agatctgcga ctctagagga tcgactgtgc cttctagttg 4260
ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 4320
cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 4380
tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 4440
gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc tgcgactcta gaggatcata atcagccata 4500
ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacgttta aacctcccac acctccccct 4560
gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa 4620
tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 4680
ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tctgcgactc 4740
tagaggatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc 4800
ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt 4860
attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 4920
tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc 4980
tggatctgcg actctagagg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg 5040
ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg 5100
ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 5160
tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg 5220
tatcttatca tgtctggatc cccatcaagc tgataacata cgctctccat caaaacaaaa 5280
cgaaacaaaa caaactagca aaataggctg tccccagtgc aagtgcaggt gccagaacat 5340
ttctctataa cttcgtatag catacattat acgaagttat tctgaggcgg aaagaaccag 5400
gccgccacca tgcctgtccc agcctcctgg ccccatcctc ctggtccttt cctgcttctg 5460
actctactgc tgggacttac agaagtggca ggtgaggagg agctacagat gattcagcct 5520
gagaagctcc tgttggtcac agttggaaag acagccactc tgcactgcac tgtgacctcc 5580
ctgcttcccg tgggacccgt cctgtggttc agaggagttg gaccaggccg ggaattaatc 5640
tacaatcaaa aagaaggcca cttccccagg gtaacaacag tttcagacct cacaaagaga 5700
aacaacatgg acttttccat ccgcatcagt agcatcaccc cagcagatgt cggcacatac 5760
tactgtgtga agtttcgaaa agggagccct gagaacgtgg agtttaagtc tggaccaggc 5820
actgagatgg ctttgggtgc caaaccctct gcccccgtgg tattgggccc tgcggcgagg 5880
accacacctg agcatacagt gagtttcacc tgtgagtccc atggcttctc tcccagagac 5940
atcaccctga aatggttcaa aaatgggaat gagctctcag acttccagac caacgtggac 6000
cccacaggac agagtgtggc ctacagcatc cgcagcacag ccagggtggt actggacccc 6060
tgggacgttc gctctcaggt catctgcgag gtggcccatg tcaccttgca gggggaccct 6120
cttcgtggga ctgccaactt gtctgaggcc atccgagttc cacccacctt ggaggttact 6180
caacagccca tgagggtggg gaaccaggta aacgtcacct gccaggtgag gaagttctac 6240
ccccagagcc tacagctgac ctggtcggag aatggaaacg tgtgccagag agaaacagcc 6300
tcgaccctta cagagaacaa ggatggtacc tacaactgga caagctggtt cctggtgaac 6360
atatctgacc aaagggatga tgtggtcctc acctgccagg tgaagcatga tgggcagctg 6420
gcggtcagca aacgccttgc cctagaggtc acagtccacc agaaggacca gagctcagat 6480
gctacccctg gcccggcatc atcccttact gcgctgctcc tcatagctgt cctcctgggc 6540
cccatctacg tcccctggaa gcagaagacc ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg 6600
aagcaggctg gcgacgtgga ggagaaccct ggtcctatgg cccagtccaa gcacggcctg 6660
accaaggaga tgaccatgaa gtaccgcatg gagggctgcg tggacggcca caagttcgtg 6720
atcaccggcg agggcatcgg ctaccccttc aagggcaagc aggccatcaa cctgtgcgtg 6780
gtggagggcg gccccttgcc cttcgccgag gacatcttgt ccgccgcctt catgtacggc 6840
aaccgcgtgt tcaccgagta cccccaggac atcgtcgact acttcaagaa ctcctgcccc 6900
gccggctaca cctgggaccg ctccttcctg ttcgaggacg gcgccgtgtg catctgcaac 6960
gccgacatca ccgtgagcgt ggaggagaac tgcatgtacc acgagtccaa gttctacggc 7020
gtgaacttcc ccgccgacgg ccccgtgatg aagaagatga ccgacaactg ggagccctcc 7080
tgcgagaaga tcatccccgt gcccaagcag ggcatcttga agggcgacgt gagcatgtac 7140
ctgctgctga aggacggtgg ccgcttgcgc tgccagttcg acaccgtgta caaggccaag 7200
tccgtgcccc gcaagatgcc cgactggcac ttcatccagc acaagctgac ccgcgaggac 7260
cgcagcgacg ccaagaacca gaagtggcac ctgaccgagc acgccatcgc ctccggctcc 7320
gccttgccct aactagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 7380
ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 7440
tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 7500
ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 7560
gggagtaagg gcaggatgtg tcaaactgcc aatagagaac tacttactct tcaggctgaa 7620
gctgatggaa caggtaacaa aggcaaacac taatcatgat cagcaagatg aagcagaaag 7680
ggaacaaggg gatattaaat gtgtatagac acgctagaga gatggctcag cagttaagag 7740
aactagctgg tctttcagag gtcctgagat caattttaga cacccacatg gtggctcatg 7800
accatctatc tataaatgga tctgattttc atgtctggca gtgtacagaa gctaactgaa 7860
gaaaggtgga agacccacaa gagttcaaga taagccctat atagtgaagt tcaaggcaag 7920
ctttttctac ctgaaactta gtctcaaaaa aaaatgaata cgtaaacagt cttccagggg 7980
ataagaacct tacagaaaaa gcagaaatgc ctggggcact ggattaccga tgtaatcaaa 8040
ttcagtcctt gaattgaaca caggattgcc tagagcaagg ccagccagag attcatctca 8100
gagggagaaa ggtgtctttg gagcaatttt gtggtaatct agtatgtatc acataagttt 8160
agacgcattt gggactggaa agatgtgaac aaagcaccct atggctcaca tctgtcatta 8220
actctagttc cagtgcacct gacaccgtct tctggcctct gcagtgacca agcacatggg 8280
tagtatgtag acatatacat aagcaaaaca cacatcatta aaaagtgaca tttcccaaag 8340
gaagctgaag aaccagttct tgagaagata gtagaaatca gaaggggaaa tagtagacat 8400
acagagggac tgaccaggtt gtgtcacctt tataggctag gctaatggat gatcgacact 8460
agcgctcttt gtgaaggaca cacaaatgag acatagttta taggactaaa cacacttcta 8520
agcaatttaa tgagacttaa gaccctgtct ctagcaaata ctctggatga tattcagctc 8580
aaggctcttg tcagacatgt ttccattttc aaggtgagct aactggccaa aactgccaac 8640
aacctgtagt gaatagagaa gatgagaaaa tctggattct caaatgacct aatgaaagcc 8700
actggagcgc catatggttt ctgtgaaaat gccttttcaa tcattaacct cttaaatgag 8760
tgttagcatc ctaactaatg agtggtgcag aatagtgggt ctgcttagct taactaaggc 8820
caagaaaaca aaacaggaaa ttcattccat gtcatgagac tcatactacg aggttccctt 8880
agacctcagg agaaaaagtc tttggctgta agaacacacc tcagtggatg tggtagacta 8940
tgcctttact cttttttttt tttttttttt tttttgggtt ttttcgagac agggtttctc 9000
tgtgtagcct tggctgtcct ggaactcact ttgttgacca ggctggcctc gaactcagag 9060
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgagccaac agtggtagta 20
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gcgacgtgga ggagaaccct 60
ggtcct 66
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcagcgttca gactcctcag aatgt 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcaatggaaa gtccctattg gcgt 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atcagcctcg actgtgcctt cta 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcacagaaac catatggcgc tcc 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtctttccc ttgcctctgc t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gggtcttcca cctttcttca g 21
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtcgacaagc tcatgcggg 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgcagactgt agagcagcg 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccatggcttg agtaagtctg c 21

Claims (10)

1.一种特异性表达人源性SIRPG的转基因小鼠的构建方法，其特征在于，所述方法为利用CRISPR-Cas9基因敲入技术***外源基因hSIRPG，具体步骤为：根据小鼠***位点序列，构建基于CRISPR-Cas9***的gRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到gRNA和Cas9 mRNA；并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的Cas9 mRNA，gRNA和供体质粒显微注射到小鼠受精卵中；取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔，获得转基因小鼠；其中，所述外源基因hSIRPG的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述gRNA的DNA序列为5′-CTGAGCCAACAGTGGTAGTA-3′。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源基因由CAG启动子驱动，在启动子和外源基因之间包含一段受Cre重组酶条件性控制的STOP序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重组酶为Cre重组酶。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述STOP序列如SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述外源基因hSIRPG和荧光报告基因之间通过P2A自切割肽段链接，所述P2A自切割肽段的核苷酸序列为：GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGCGACGTGGAGGAGAACCCTGGTCCT。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述荧光报告基因编码绿色荧光蛋白zsGreen，其序列如SEQ ID NO:5所示。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述hSIRPG基因的5’端带有kozak序列，所述kozak序列为5′-GCCGCCACC-3′；所述小鼠为C57BL/6JGpt 背景的小鼠。
9.权利要求1-8任意一项的方法构建的转基因小鼠的应用，其特征在于：将构建所得的转基因小鼠与Kras LSL_G12D/+小鼠交配，得到hSIRPGLSL_KI/-+Kras LSL_G12D/+转基因小鼠，经鼻腔注射Cre病毒，诱导转基因小鼠肺部hSIRPG的表达以及Kras突变，观察hSIRPG敲入后转基因小鼠存活时间；解剖小鼠肺组织，取出称重并进行HE染色，观察肿瘤形成情况；
在KRASG12D/++SIRPGKI/+转基因小鼠Cre病毒注射8周后，每隔一天注射中和抗体，然后解剖小鼠肺组织，取出称重并进行HE染色，观察肿瘤形成情况并作统计。
10.权利要求1-8任意一项的方法构建的转基因小鼠的应用，其特征在于：所述转基因小鼠用于下述的至少一项：
(1)观察hSIRPG基因敲入对转基因小鼠一般生理功能，尤其是免疫功能的影响；
(2)观察hSIRPG基因敲入后对肿瘤组织微环境免疫细胞浸润的影响；
(3)探索靶向hSIRPG后肿瘤生长抑制的具体机制；
(4)用于hSIRPG单克隆抗体的研究；
(5)用于探究更多hSIRPG基因功能的研究。
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