CN114085778B - 米根霉jyh-4-23及其在金银花绿原酸提取中的应用 - Google Patents

米根霉jyh-4-23及其在金银花绿原酸提取中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株米根霉JYH‑4‑23及其在金银花绿原酸提取中的应用，在金银花超声乙醇提取绿原酸前，用米根霉JYH‑4‑23的发酵制备的糖苷酶粗酶液预处理，粗酶液中还含有多种糖苷酶，可以水解金银花中的纤维素、半纤维素和果胶等物质，使得其结构组织疏松，在超声乙醇提取时，绿原酸更容易溶出，从而能够显著提高金银花中绿原酸的提取得率。本发明所用的米根霉JYH‑4‑23，是针对能够促进金银花中绿原酸溶出而有目的筛选和诱变选育得到。本发明提供的金银花中绿原酸提取方法，较常规超声乙醇提取法相比，金银花中绿原酸的提取得率可以提高41.5％。

Description

米根霉JYH-4-23及其在金银花绿原酸提取中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一株米根霉JYH-4-23及其在金银花绿原酸提取中的应用。
(二)背景技术
绿原酸(chlorogenic acid，CAS号327-97-9，分子式C16H18O9，分子量354.3，分子结构式见图1)，又名咖啡鞣酸，由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，是植物在有氧呼吸过程中经莽草酸途径代谢产生的苯丙素类化合物。绿原酸具有多种生物活性，表现出良好的抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、保肝胆、降血压和降血脂等药理作用。作为一种天然抗氧化剂的绿原酸，可用作食品和水果的保鲜剂；绿原酸能有效去除活性氧自由基，可以保护皮肤胶原蛋白免受损害，防止紫外线对皮肤的伤害，因此也广泛应用于皮肤美白、润肤、防晒和护发等日化用品中。可见，绿原酸在食品、药品和化妆品领域中都用广泛的应用等。
绿原酸天然存在于许多植物中，从高等双子叶植物到较低等的蕨类植物都有分布，主要存在于忍冬科(Caprifoliaceae)、杜仲科(Eucommiaceae)、菊科(Compositae)及蔷薇科(Rosaceae)等植物中。含量较高的植物包括金银花(花中可达5％)、杜仲(树皮中可达5％)、向日葵(籽实中可达3％)、咖啡(咖啡豆中可含2％)、菊花(0.2％)等。此外，普通水果蔬菜中也含微量的绿原酸成分，例如马铃薯、红白菜、胡萝卜、茄子、甘蓝、莴苣、菠菜等[陈绍华,王亚琴,罗立新.天然产物绿原酸的研究进展.食品科技,2008,33(2):195-199]。
虽然目前绿原酸可以采用化学方法合成，但或因合成工艺中使用有毒物质，或因合成产率较低，绿原酸的化学合成工艺尚未工业化使用，人们更青睐植物中提取的天然绿原酸。金银花中绿原酸含量较高，是提取绿原酸的较好原料。国内有较多关于从金银花中提取绿原酸的报道，方法主要有水提法和醇提法，在这两种方法的基础上，又有超声波、微波、超高压和酶解辅助提取法。不同的提取方法有各自的优缺点，不同研究报道的提取得率也差异较大。水提法成本低，但绿原酸得率较低；醇提法的绿原酸得率有显著提高，但需要大量乙醇。在水提或醇提法前，增加超声波、微波、超高压或酶解预处理，可以促进植物材料中的绿原酸溶出，提取得率有显著提高。几种方法相比之下，超声波或微波辅助提取法有一定的优势，不会显著增加提取成本。超高压辅助提取法需要高压设备；酶解辅助提取法往往酶的使用成本较高，以及产物得率提高幅度不大，这两种方法的工业化应用有一定的困难。
为了提高金银花中绿原酸的提取得率，本发明对金银花绿原酸超声波辅助醇提工艺进行改进，增加微生物酶预处理步骤，可以显著提高金银花绿原酸的提取得率。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株糖苷酶的微生物新菌株—米根霉(Rhizopus oryzae)JYH-4-23，及其在金银花绿原酸提取中的应用，金银花经预处理后，绿原酸的提取得率可以显著提高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株产糖苷酶的微生物新菌株—米根霉(Rhizopus oryzae)JYH-4-23，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61966，保藏日期2021年9月29日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
本发明所述米根霉JYH-4-23，是从金银花的微生物富集培养物中分离，经过筛选和诱变选育获得的优良菌株。所述米根霉JYH-4-23的菌落形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，28℃培养1d，灰白色细长绒毛状菌丝铺满培养皿，菌丝层较厚。2d后逐渐变为灰褐色，表面产生灰褐色分生孢子，孢子数量少；3d后孢子数量较多。有匍匐菌丝，假根发达；孢囊梗直立或稍弯曲，2–4株成束，较长。孢子囊呈球形、近球形或卵圆形，呈淡褐色，直径120–200μm。孢囊孢子呈椭圆形或球形，大小不一致。米根霉JYH-4-23在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图2。
所述米根霉JYH-4-23的核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internaltranscribed spacer，rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述米根霉JYH-4-23在金银花绿原酸提取中的应用，所述应用的方法为：将米根霉JYH-4-23经发酵培养的发酵液过滤，获得的滤液即为糖苷酶的粗酶液；将粗酶液与金银花混合，于30–35℃条件酶解10–14h，过滤除去粗酶液，得酶解后的金银花粉滤饼；滤饼中加入乙醇水溶液浸提后，再进行超声提取，抽滤，滤液浓缩，获得金银花的醇提浓缩物，真空干燥，获得绿原酸。
进一步，所述粗酶液体积用量以金银花质量计为3–4mL/g，所述金银花在加入前需在85℃干燥并粉碎过40目筛。
进一步，所述粗酶液制备方法为：将米根霉JYH-4-23接种于产酶培养基中，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡条件下培养36–48h，发酵液过滤，滤液即为糖苷酶的粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：麸皮15–20g/L，(NH4)2SO4 3–4g/L，KH2PO4 2–5g/L，MgSO40.5–1.0g/L，CaCl2 0.2–0.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.0–6.5。
进一步，优选所述产酶培养基组成为：麸皮20g/L，(NH4)2SO4 4g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。
本发明所述米根霉JYH-4-23在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子液，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后将孢子液或种子液以体积浓度2％–5％的量接入产酶培养基进行产酶培养，所述米根霉JYH-4-23发酵培养方法为：
(1)活化培养：将米根霉JYH-4-23接种于马铃薯蔗糖琼脂(PDA)平板培养基，于28–30℃恒温培养48–60h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得米根霉JYH-4-23孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；
(2)种子扩大培养：步骤(1)活化培养后的米根霉JYH-4-23孢子液按体积浓度2％–5％的接种量接种至种子培养基中，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡条件下培养30–36h，得干菌体浓度为2.15–2.23g/L的种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蔗糖10–15g/L，酵母浸粉3–5g/L，KH2PO4 2–3g/L，MgSO4 0.3–0.5g/L，CaCl2 0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH6.0-6.5。优选所述的种子培养基组成为：蔗糖10g/L，酵母浸粉3g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO40.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。
(3)产酶培养：用步骤(1)活化培养后米根霉JYH-4-23孢子液，或步骤(2)制备的种子液按体积浓度2％–5％的接种量接入产酶培养基，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡培养36–48h，获得干菌体浓度为3.28–3.43g/L、β-葡萄糖苷酶活力为35.8–37.4U/mL的发酵液。
进一步，所述乙醇水溶液浸提是指将所述的酶解后的金银花滤饼，加入体积浓度70％–80％乙醇水溶液中，搅拌均匀后置于50–60℃水浴中浸提1–2h；所述乙醇水溶液用量以金银花粉质量计为10–15mL/g。
进一步，所述超声提取是指乙醇水溶液浸提后转入60℃的超声波清洗机中，功率100–200W超声提取30–60min。
进一步，所述金银花的醇提浓缩物的制备方法为：所述的酶解后的金银花滤饼，加入体积浓度70％–80％乙醇水溶液中，搅拌均匀后置于50–60℃水浴中浸提1–2h，再转入60℃的超声波清洗机中，功率100–200W超声提取30–60min；超声醇提结束后，趁热抽滤，将滤液45℃减压浓缩至原体积的1/20–1/15，获得浓缩物；所述乙醇水溶液用量以金银花粉质量计为10–15mL/g。
进一步，所述真空干燥条件为：50℃、–0.1MPa条件下真空干燥至恒重。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在金银花超声乙醇提取绿原酸前，用米根霉JYH-4-23发酵制备的糖苷酶粗酶液预处理，粗酶液中还含有多种糖苷酶，可以水解金银花中的纤维素、半纤维素和果胶等物质，使得其结构组织疏松，在超声乙醇提取时，绿原酸更容易溶出，从而能够显著提高金银花中绿原酸的提取得率。本发明所用的米根霉JYH-4-23，是针对能够促进金银花中绿原酸溶出而有目的筛选和诱变选育得到。本发明提供的金银花中绿原酸提取方法，较常规超声乙醇提取法相比，金银花中绿原酸的提取得率可以提高41.5％。
(四)附图说明
图1为绿原酸分子结构式。
图2为米根霉JYH-4-23的菌落照片。
图3为绿原酸浓度—A328的标准曲线。
图4为对硝基苯酚浓度—A400标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述的金银花为忍冬科(Caprifoliaceae)植物金银花(Lonicerajaponica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花，夏初花开放前采收，干燥。金银花粉是85℃干燥的金银花经粉碎后过40目筛的细粉。
实施例1：产酶菌株的分离和筛选
用于产酶预处理金银花的野生菌株，按如下步骤分离和筛选：
(1)250-mL三角瓶中加入10g的金银花粉，再加入8mL无菌生理盐水润湿，于28℃恒温培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，于28℃恒温培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，置于28℃恒温培养72h，得纯培养菌株11株，各菌株的编号见表1。
(2)11个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。
(3)取步骤(2)制备各菌株的孢子液1.0mL(接种量为2％的体积百分数)，接入50mL产酶培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡条件下产酶培养48h后，全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为糖苷酶粗酶液。
(4)15g金银花细粉于250-mL三角瓶中，再加入步骤(3)制备的粗酶液45mL，搅拌均匀后于30℃酶解10h，布氏漏斗抽滤除去粗酶液，得金银花粉滤饼。
(5)步骤(4)经各个菌株粗酶液预处理的全部金银花粉滤饼分别于250-mL三角烧瓶中，分别加入150mL的体积浓度为70％乙醇水溶液，摇匀后置于50℃水浴中浸提2h，然后转入60℃的超声波清洗机中，100W超声提取60min后，趁热用布氏漏斗抽滤，分光光度法测定328nm下的吸光值，计算滤液中绿原酸的浓度。
同样条件下，用45mL的未接种微生物的产酶培养基代替粗酶液做阴性对照；用45mL含质量浓度1％纤维素酶(活力100000U/g)的磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)代替粗酶液做纤维素酶预处理对照。
表1不同菌株发酵制备的粗酶液预处理金银花后绿原酸的提取得率
由表1数据可以看出，金银花粉经菌株JYH-4发酵制备的粗酶液预处理后，较阴性对照相比，绿原酸的提取得率提高的幅度最高，达到了25.7％；较纤维素酶预处理对照相比，绿原酸的提取得率提高了11.8％，说明利用菌株JYH-4发酵制备的粗酶液预处理金银花，能够显著提高绿原酸的提取得率，且优于纤维素酶预处理。本发明选定该菌株作为提高金银花中绿原酸提取得率的发酵产酶的菌种。
所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，加入20g葡萄糖和20g琼脂，pH自然(实测6.5左右)，加热至琼脂溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15–20mL。
所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：麸皮20g/L，(NH4)2SO4 4g/L，KH2PO42g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述的绿原酸含量采用分光光度法测定，具体方法为：1.0mL绿原酸提取液样品(视样品中绿原酸浓度高低适当调整取样量，控制测定A328＝0.2–1.0之间，固体绿原酸粗提物用70％的乙醇水溶液溶解)，于10-mL容量瓶中定容，用紫外-可见分光光度计测定328nm处吸光度(A328)，由绿原酸标浓度—A328标准曲线计算得样品中绿原酸浓度，再由此浓度乘以测定样品的体积和稀释倍数得绿原酸质量。
绿原酸标浓度—A328标准曲线的绘制：称取5mg绿原酸标准品于100mL容量瓶中，用70％乙醇水溶液定容成浓度为50mg/L标准溶液。分别吸取1、2、3、4、5mL该标准品溶液于10mL容量瓶中，用70％乙醇水溶液定容成浓度分别为5、10、15、20、25mg/L的绿原酸溶液。以70％的乙醇水溶液为参比，于紫外-可见分光光度计测定A328，以绿原酸浓度为横坐标，A328为纵坐标绘制标准曲线(图3)。
所述的绿原酸提取得率按公式(1)计算：
实施例2：产酶菌株JYH-4的诱变选育
以发酵液中的β-葡萄糖苷酶活力为指标，对菌株JYH-4进行诱变育种，筛选产糖苷酶性能优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株JYH-4经PDA平板培养基28℃活化培养48h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45mL无菌生理盐水的三角瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡20min。孢子悬液经过滤除去菌丝(三角漏斗垫2层擦镜纸)，在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量在1×108个/mL。
(2)诱变：在红光照明下，分别取2.0mL上述孢子悬液和一枚无菌回形针于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5min。0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养36h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得48个菌株。各个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。吸取各菌株的孢子液1mL，接入50mL产酶培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡条件下产酶培养48h后，全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液。测定各菌株发酵滤液的β-葡萄糖苷酶活力，选择酶活力较出发菌株提高的菌株。初筛获得酶活提高20％以上的菌株13株，再按上述方法，每个菌株做3个重复发酵的β-葡萄糖苷酶活力复筛，复筛菌株的β-葡萄糖苷酶活力见表2。
表2突变菌株产β-葡萄糖苷酶活力复筛结果
从表2数据可以看出，JYH-4-23菌株发酵液中β-葡萄糖苷酶活力最高，达到36.4U/mL，较野生菌株JYH-4提高了53.6％。
按实施例1所述的方法，用JYH-4-23菌株发酵制备的粗酶液预处理金银花粉后，绿原酸的提取得率为6.67％，较出发菌株JYH-4的5.96％提高了11.9％，较未经预处理阴性对照的4.74％提高了40.7％。JYH-4-23菌株经过转接传代5次，每代发酵制备的粗酶液预处理金银花后，β-葡萄糖苷酶活力波动范围小于10％，说明该菌株产糖苷酶的遗传稳定性良好。
所述的β-葡萄糖苷酶活力测定方法为：试管中依次加入粗酶液0.6mL、pH 5.5的柠檬酸缓冲液0.2mL和10mmol/L的对硝基酚-β-葡萄糖苷(pNPG)0.2mL，于30℃下反应15min后，加入5mL的1mol/L Na2CO3溶液摇匀以终止反应。以煮沸灭活的粗酶液相同处理为参比，于400nm波长下测定吸光度(A400)。由对硝基苯酚(pNP)浓度—A400标准曲线计算出反应体系中pNP浓度。
β-葡萄糖苷酶活力单位(U)的定义：30℃下、pH 5.5缓冲体系中，lmin内水解pNPG生成1μmol的pNP的酶量为1个酶活单位。
酶活按以下公式(2)计算。
式(2)中，V1：反应体系总体积；V2：粗酶液体积；C1：pNP浓度；T：反应时间。
对硝基苯酚浓度—A400标准曲线的制作：用蒸馏水配制浓度为1mmol/L的pNP标准溶液。分别吸取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL至l0mL容量瓶中，用lmol/L Na2CO3溶液定容后混匀，使各样品中对硝基苯酚的浓度为10、20、30、40、50μmol/L。以蒸馏水为空白，测定在400nm波长处的吸光值，以对硝基苯酚浓度为横坐标，A400为纵坐标，绘制对硝基苯酚浓度—A400标准曲线。
实施例3：菌株JYH-4-23的分类鉴定
菌株JYH-4-23接种在PDA平板培养基上，，28℃培养1d，灰白色细长绒毛状菌丝铺满培养皿，菌丝层较厚。2d后逐渐变为灰褐色，表面产生灰褐色分生孢子，孢子数量少；3d后孢子数量较多。有匍匐菌丝，假根发达；孢囊梗直立或稍弯曲，2–4株成束，较长。孢子囊呈球形、近球形或卵圆形，呈淡褐色，直径120–200μm。孢囊孢子呈椭圆形或球形，大小不一致。米根霉JYH-4-23在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图2。
测得菌株JYH-4-23的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与6株已知的米根霉(Rhizopus oryzae)有大于99％的同源性。根据菌株JYH-4-23菌落特征和rDNA-ITS核苷酸序列比对结果，可以确定菌株JYH-4-23的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，毛霉门(Mucoromycota)，毛霉亚门(Mucoromycotina)，毛霉纲(Mucoromycetes)，毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，根霉属(Rhizopus)，米根霉(Rhizopus oryzae)。
ITS区rDNA序列为：
TCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCTTCTGCCCTCTGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCATTGAACGCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCAATTAGCTAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCTTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGACAACAATCAATCTTTTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT。
综上，从金银花粉的微生物富集物中分离的菌株JYH-4，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株JYH-4-23，即米根霉(Rhizopus oryzae)JYH-4-23，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61966，保藏日期2021年9月29日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4：米根霉JYH-4-23应用于金银花中绿原酸的提取
米根霉JYH-4-23应用于金银花中绿原酸的提取，可以按以下步骤操作：
(1)冷冻干燥保藏的米根霉JYH-4-23菌粉，接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养60h，加10mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，得米根霉JYH-4-23的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)取步骤(1)制备的孢子液1.5mL(接种量为2％的体积百分数)，接入75mL产酶培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡条件下产酶培养48h，得干菌体浓度为3.28g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为37.4U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，250-mL三角瓶装75mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)20g金银花细粉于250-mL三角瓶中，再加入步骤(2)制备的粗酶液60mL，搅拌均匀后于30℃酶解10h，布氏漏斗抽滤除去粗酶液过滤，得金银花粉滤饼。
(4)步骤(3)经粗酶液预处理的全部金银花粉滤饼于250-mL三角烧瓶中，加入300mL的体积浓度为70％乙醇水溶液，摇匀后置于50℃水浴中浸提2h，然后转入60℃的超声波清洗机中，功率100W超声提取60min。超声醇提结束后，趁热用布氏漏斗抽滤，将滤液45℃减压浓缩至20mL，获得绿原酸浓缩物。
(5)步骤(4)的全部浓缩物于50℃、–0.1MPa条件下真空干燥至恒重，研磨成细粉，得金银花绿原酸粗提物。
按上述步骤，得金银花绿原酸粗提物4.68g，绿原酸质量含量为28.7％，即得到绿原酸1.34g，提取得率为6.72％，产品为灰绿色粉状物。
实施例5：米根霉JYH-4-23应用于金银花中绿原酸的提取
米根霉JYH-4-23应用于金银花中绿原酸的提取，可以按以下步骤操作：
(1)4℃冰箱保藏的米根霉JYH-4-23平板培养物，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃恒温培养54h，加10mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，得米根霉JYH-4-23的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)取步骤(1)制备的孢子液1mL(接种量为2％的体积百分数)，接入50mL种子培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡条件下产酶培养30h，得干菌体浓度为2.15g/L的种子液，所述的种子培养基终浓度组成和配制方法为：蔗糖10g/L，酵母浸粉3g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL的三角瓶装50mL种子培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)用步骤(2)制备的种子液7.5mL(接种量为5％的体积百分数)接入150mL产酶培养基，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养42h，得干菌体浓度为3.43g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为36.6U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，500-mL的三角瓶装150mL产酶培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)30g金银花细粉于250-mL三角瓶中，再加入步骤(3)制备的粗酶液100mL，搅拌均匀后于35℃酶解12h，布氏漏斗抽滤除去粗酶液过滤，得金银花粉滤饼。
(5)步骤(4)经粗酶液预处理的全部金银花粉滤饼于500-mL三角烧瓶中，加入400mL的体积浓度为75％乙醇水溶液，摇匀后置于65℃水浴中浸提1h，然后转入60℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取45min。超声醇提结束后，趁热用布氏漏斗抽滤，将滤液45℃减压浓缩至20mL，获得绿原酸浓缩物。
(6)步骤(5)的全部浓缩物于50℃、–0.1MPa条件下真空干燥10h至恒重，研磨成细粉，得金银花绿原酸粗提物。
按上述步骤，得金银花绿原酸粗提物6.24g，绿原酸质量含量为31.8％，即得到金银花绿原酸1.98g，提取得率为6.61％，产品为灰绿色粉状物。
实施例6：米根霉JYH-4-23应用于金银花中绿原酸的提取
米根霉JYH-4-23应用于金银花中绿原酸的提取，可以按以下步骤操作：
(1)4℃冰箱保藏的米根霉JYH-4-23平板培养物，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃恒温培养48h，加10mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，得米根霉JYH-4-23的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)取步骤(1)制备的孢子液1mL(接种量为2％的体积百分数)，接入50mL种子培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下产酶培养36h，得干菌体浓度为2.32g/L的种子液，所述的种子培养基终浓度组成和配制方法同实施例5。
(3)用步骤(2)制备的种子液7.5mL(接种量为5％的体积百分数)150mL产酶培养基，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养36h，得干菌体浓度为3.35g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为35.8U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例5。
(4)50g金银花细粉于500-mL三角瓶中，再加入取步骤(3)制备的粗酶液200mL，搅拌均匀后于35℃酶解14h，布氏漏斗抽滤除去粗酶液，得金银花粉滤饼。
(5)步骤(4)经粗酶液预处理的全部金银花粉滤饼于1-L三角烧瓶中，加入500mL的体积浓度为80％乙醇水溶液，摇匀后置于60℃水浴中浸提1h，然后转入60℃的超声波清洗机中，功率200W超声提取30min。超声醇提结束后，趁热用布氏漏斗抽滤，将滤液45℃减压浓缩至25mL，获得绿原酸浓缩物。
(6)步骤(5)的全部浓缩物于50℃、–0.1MPa条件下真空干燥10h至恒重，研磨成细粉，得金银花绿原酸粗提物。
按上述步骤，得金银花绿原酸粗提物9.75g，绿原酸质量含量为33.6％，即得到金银花绿原酸3.28g，提取得率为6.55％，产品为灰绿色粉状物。
如金银花粉不经本实施例步骤(1)至步骤(4)的酶解预处理，其他步骤按本实施例方法，50g的金银花粉可提取获得金银花绿原酸粗提物7.16g，绿原酸质量含量为32.3％，即得到金银花绿原酸2.31g，提取得率为4.63％，产品为灰绿色粉状物。可见，在金银花绿原酸超声乙醇提取前，增加了米根霉JYH-4-23粗酶液的预处理，较不采用酶解预处理的常规方法相比，金银花中绿原酸的提取得率可以提高41.5％。
序列表
<110> 浙江工业大学 舟山市食品药品检验检测研究院
<120> 米根霉JYH-4-23及其在金银花绿原酸提取中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 505
<212> DNA
<213> 米根霉(Rhizopus oryzae)
<400> 1
tcccacccgt gtttatcgta ccttgttgct tcggcgggcc cgcctcacgg ccgccggggg 60
gcttctgccc tctggcccgc gcccgccgaa gacaccattg aacgctgtct gaagattgca 120
gtctgagcaa ttagctaaat aagttaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttccggcat 180
cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgatacgt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc 240
gagtctttga acgcacattg cgccccttgg tattccgggg ggcatgcctg tccgagcgtc 300
attgctgccc tcaagcacgg cttgtgtgtt gggccccgtc ctccttcccg ggggacgggc 360
ccgaaaggca gcggcggcac cgcgtccggt cctcgagcgt atggggcttc gtcttccgct 420
cttgtaggcc cggccggcgc ttgccgacaa caatcaatct tttttcaggt tgacctcgga 480
tcaggtaggg atacccgctg aactt 505

Claims (10)

1.米根霉(Rhizopus oryzae)JYH-4-23，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61966，保藏日期2021年9月29日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
2.一种权利要求1所述米根霉JYH-4-23在金银花绿原酸提取中的应用，其特征在于所述应用的方法为：将米根霉JYH-4-23经发酵培养的发酵液过滤，获得的滤液即为粗酶液；再将粗酶液与金银花混合，于30–35℃条件酶解10–14h，过滤，得酶解后的金银花粉滤饼；滤饼中加入乙醇水溶液浸提后，再进行超声提取，抽滤，滤液浓缩，获得金银花的醇提浓缩物，真空干燥，获得绿原酸。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述粗酶液体积用量以金银花质量计为3–4mL/g，所述金银花在加入前需在85℃干燥并粉碎过40目筛。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述粗酶液制备方法为：将米根霉JYH-4-23接种于产酶培养基中，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡条件下培养36–48h，发酵液过滤，收集滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：麸皮15–20g/L，(NH4)2SO43–4g/L，KH2PO42–5g/L，MgSO4 0.5–1.0g/L，CaCl2 0.2–0.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.0–6.5。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述产酶培养基组成为：麸皮20g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述米根霉JYH-4-23在发酵前，先经平板培养基活化培养制备孢子液，或经种子培养基扩大培养制备种子液，然后将孢子液或种子液以体积浓度2％–5％的量接入产酶培养基进行产酶培养，所述方法为：
(1)活化培养：将米根霉JYH-4-23接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养48–60h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得米根霉JYH-4-23孢子液；所述PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然；
(2)种子扩大培养：步骤(1)活化培养后的米根霉JYH-4-23孢子液按体积浓度2％–5％的接种量接种至种子培养基中，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡条件下培养30–36h，得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蔗糖10–15g/L，酵母浸粉3–5g/L，KH2PO4 2–3g/L，MgSO4 0.3–0.5g/L，CaCl2 0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0-6.5。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述乙醇水溶液浸提是指将所述的酶解后的金银花粉滤饼，加入体积浓度70％–80％乙醇水溶液中，搅拌均匀后置于50–60℃水浴中浸提1–2h；所述乙醇水溶液用量以金银花粉质量计为10–15mL/g。
8.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述超声提取是指乙醇水溶液浸提后转入60℃的超声波清洗机中，功率100–200W超声提取30–60min。
9.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述金银花的醇提浓缩物的制备方法为：将所述的酶解后的金银花粉滤饼，加入体积浓度70％–80％乙醇水溶液中，搅拌均匀后置于50–60℃水浴中浸提1–2h，再转入60℃的超声波清洗机中，功率100–200W超声提取30–60min；超声醇提结束后，趁热抽滤，将滤液45℃减压浓缩至原体积的1/20–1/15，获得浓缩物；所述乙醇水溶液用量以金银花粉质量计为10–15mL/g。
10.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述真空干燥条件为：50℃、–0.1MPa条件下真空干燥至恒重。
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