CN114073995A - 分析单细胞的微流控设备和单元及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于微流控设备的进样混匀单元和一种样品聚焦单元。本发明还提供了一种利用条形码粒子分析来自单个细胞或单个核酸的微流控设备，其具有上述进样混匀单元和样品聚焦单元。本发明还提供了一种利用条形码粒子分析来自单个细胞或单个核酸的方法。

Description

分析单细胞的微流控设备和单元及其方法
技术领域
本发明涉及生物学与医疗器械领域。具体的，本发明涉及一种对单个生物颗粒如细胞或核酸进行分析的微流控***、单元和方法。
背景技术
单细胞测序这一工具在胚胎，肿瘤，各类干细胞研究中都具有无法比拟的优势。随着单细胞测序技术的不断突破和测序仪器的广泛使用，使单细胞测序分析越来越多的应用到各类前沿生物医学研究中。没有两个细胞的基因组，转录组水平完全类似，因此对大量细胞的平均组学表达分析会平均掉本来在单个细胞中相当显著的表达特征。
目前的单细胞测序分析平台大多采用微流控设备进行。在微流控设备中，生物物质例如细胞和核酸等，以及部分粒子(如高聚物微球、磁珠等)在腔体中，即使是短暂时间(例如几分钟)内，也会发生沉淀和聚集现象，导致在微流道中的移动甚至是堵塞。现有技术中采用的常规方法，例如磁转子或电机带动的叶片等，都存在器件尺寸和在液体中引起气泡的问题。
本领域还需要更好的单细胞测序分析平台和技术。
发明内容
本发明提供了一种用于微流控设备的进样混匀单元，其用于对微流控设备的样品腔或流道内的样品溶液进行搅拌以保持样品中颗粒(如生物颗粒和/或条形码粒子)的分散状态。所述进样混匀单元包括设置在样品腔或流道底部的体声波谐振器。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的进样混匀单元中所述体声波谐振器输出体声波的功率为约0.1-5mW，优选为约0.5-2mW。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的进样混匀单元中所述体声波谐振器输出功率为脉冲式功率。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的进样混匀单元中所述体声波谐振器为超高频体声波谐振器，可在溶液内产生频率为约0.1-50GHz，优选为0.5-50GHz的体声波。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的进样混匀单元中的超高频体声波谐振器为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器，例如为厚度伸缩振动模式的声波谐振器。
本发明还提供了一种用于微流控设备的样品聚焦单元，例如为用于利用条形码粒子分析生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸)的微流控设备。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元包括：
流体通道，其具有溶液入口和出口；
超高频体声波谐振器，其设置于所述流体通道的底部，所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波；其中，所述超高频体声波谐振器发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生由超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界限定的涡旋通道；其中所述微流道的结构和所述超高频体声波谐振器的体声波作用区域的形状和位置，配置为使得溶液样品中的颗粒(如生物颗粒和/或条形码粒子)在经过体声波区域时进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在指定位置离开涡旋通道进入下游通道。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元中对应所述释放点的超高频体声波谐振器的体声波作用区域存在转折或曲率变化。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界线条形状使得生物颗粒和条形码粒子保持在涡旋通道中移动至释放点，例如通过减少体声波产生区域的边界线条中出现转折或曲率变化。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元中所述超高频体声波谐振器输出体声波的功率为约20-5000mW，优选为50-2000mW，更优选为100-500mW。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元中具有流速调节装置，可调节溶液流经体声波区域的速度为约0.1-100mm/s，优选为约0.5-50mm/s，更优选为约1-10mm/s。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元中具有流速调节装置，可调节溶液流经体声波区域的速度为约0.1-500μL/min，优选为约0.5-100μL/min，更优选为约1-50μL/min。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元中的流体通道的高度为约10-300μm，优选为约25-100μm，例如为约40-85μm。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元中的超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约500-200000μm2，优选为约5000-50000μm2，最优选为约10000-25000μm2。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元中的超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边长为约30-500μm，优选为约40-300μm，最优选为约50-200μm。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元的超高频体声波谐振器为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器，例如为厚度伸缩振动模式的声波谐振器。
在本发明的其中一个方面，所述样品聚焦单元的体声波谐振器为超高频体声波谐振器，可在溶液内产生频率为约0.5-50GHz的体声波。
本发明还提供了一种用于利用条形码粒子分析生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸)的微流控设备。所述设备设置为将来自样品的单个生物颗粒与条形码粒子配对和形成其内包含配对的单个生物颗粒-条形码粒子的液滴。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备包括以下单元：
生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装单元；其用于形成其内包含一个配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴；
以及以下单元中的一个或多个的组合：
如前所述的用于微流控设备的进样混匀单元；和/或
如前所述的用于微流控设备的样品聚焦单元。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备包括以下单元：
所述进样混匀单元；
所述样品聚焦单元；和
所述生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装单元。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备还包括处理和分析单元，所述处理和分析单元对包含在液滴内的单个配对的生物颗粒-条形码进行处理，例如使得生物颗粒的核酸与条形码接触并且条形码化，以及对包含在液滴内的单个生物颗粒的信息，特别是核酸信息进行分析。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备中所述生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装单元设置为将来自样品的单个生物颗粒和条形码粒子分别形成其内包含所述生物颗粒或所述条形码粒子的液滴，然后将包含所述生物颗粒或所述条形码粒子的液滴配对和合并，由此形成内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备中所述生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装单元设置为将来自样品的单个生物颗粒与条形码粒子配对，然后形成其内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴，例如将包含配对的生物颗粒-条形码粒子的第一液体(通常为水性溶液)与第二液体(通常为油)接触。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备中所述液滴封装单元的液滴产生元件具有以下结构：
a.用于传输第二液体的第二液体通道，以及第一液体通道与第一液体通道相交的接头，所述接头设置为使得第一液体与第二液体接触，并被第二液体分隔产生基本上单分散的液滴；
或为
b.容纳第二液体的腔体，第一液体进入第二液体，形成基本上单分散的液滴。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备中处理和分析单元选自以下装置或其任意组合：
加样装置，例如用于加入令细胞膜破裂或通透性增加的试剂，或是使得核酸条形码从粒子脱离的刺激剂，由此使得条形码粒子上的核酸片段可以与细胞的核酸接触和反应，包括识别和结合等；
光刺激装置，例如通过可释放寡核苷酸的光不稳定性键的裂解。热刺激装置，其中珠粒环境的温度升高可能会导致键联的裂解或寡核苷酸从珠粒的释放；
核酸扩增装置(其包括温度控制器等)，用于利用条形码粒子上的核酸片段对细胞的核酸进行扩增和建库；
信号识别装置；
信息分析装置，包括处理单细胞的单个分析物(例如，RNA、DNA或蛋白质)或多种分析物(例如，DNA和RNA、DNA和蛋白质、RNA和蛋白质、或RNA、DNA和蛋白质)，实现例如对细胞的蛋白质组、转录组和基因组的分析。
本发明还提供了一种采用前述微流控设备来利用条形码粒子分析生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸)的方法，其中将来自样品的单个生物颗粒与条形码粒子配对，和形成其内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴；
所述方法包括以下步骤：
进样混匀；
样品聚焦；
样品配对和液滴封装；使进入微流道的生物颗粒和条形码粒子形成其内包含一个配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴。
在本发明的其中一个方面，所述方法中进样混匀步骤对样品腔内的生物样品溶液或条形码粒子溶液进行搅拌以保持生物颗粒和/或条形码粒子的分散状态。在本发明的其中一个方面，所述方法中包括用设置在样品腔底部的体声波谐振器在所述腔体内产生频率为约0.1-50GHz的体声波。在本发明的其中一个方面，所述方法中所述体声波谐振器脉冲式输出体声波。
在本发明的其中一个方面，所述方法中样品聚焦步骤对流道中的生物颗粒或条形码粒子的运动进行调整，消除或减少在流道宽度方向的随机分布；优选的，样品聚焦后进行样品配对。
在本发明的其中一个方面，所述方法中样品聚焦步骤通过将生物颗粒或条形码粒子通过在底部超高频体声波谐振器的微流道，所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波。其中，所述超高频体声波谐振器发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生由超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界限定的涡旋通道。其中所述微流道的结构和所述超高频体声波谐振器的体声波作用区域的形状和位置，配置为使得用于配对的生物颗粒或条形码粒子在经过体声波区域时进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在指定位置离开涡旋通道进入下游通道。在本发明的其中一个方面，所述释放点的超高频体声波谐振器的体声波作用区域存在转折或曲率变化。在本发明的其中一个方面，其中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界线条形状使得生物颗粒和条形码粒子保持在涡旋通道中移动至释放点，例如通过减少体声波产生区域的边界线条中出现转折或曲率变化。
在本发明的其中一个方面，所述聚焦步骤中所述超高频体声波谐振器输出体声波的功率为约20-5000mW，优选为50-2000mW，更优选为100-500mW。
在本发明的其中一个方面，所述聚焦步骤中调节微流道中的溶液流经体声波区域的速度为约0.1-100mm/s，优选为约0.5-50mm/s，更优选为约1-10mm/s。
在本发明的其中一个方面，所述聚焦步骤中调节溶液流经体声波区域的速度为约0.1-500μL/min，优选为约0.5-100μL/min，更优选为约1-50μL/min。
在本发明的其中一个方面，所述方法还包括处理和分析单元步骤，对包含在液滴内的单个配对的生物颗粒-条形码进行处理，例如使得生物颗粒的核酸与条形码接触并且条形码化，以及对包含在液滴内的单个生物颗粒的信息，特别是核酸信息进行分析。
在本发明的其中一个方面，所述方法中将来自样品的单个生物颗粒和条形码粒子分别形成其内包含所述生物颗粒或所述条形码粒子的液滴，然后将包含所述生物颗粒或所述条形码粒子的液滴配对和合并，由此形成内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴。
在本发明的其中一个方面，所述方法中将来自样品的单个生物颗粒与条形码粒子配对，然后形成其内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴，例如将包含配对的生物颗粒-条形码粒子的第一液体(通常为水性溶液)与第二液体(通常为油)接触。
在本发明的其中一个方面，所述方法中液滴封装通过以下方式进行：
a.将运输第一液体的第一液体通道与运输第二液体的第二液体通道在接头处接触，使得第一液体被第二液体分隔产生基本上单分散的液滴；
或为
b.将第一液体通入容纳第二液体的腔体，在第二液体内形成基本上单分散的液滴。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的在微流控设备中利用条形码粒子来分析生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸等)的方法涉及的步骤的示意图。
图2为本发明提供的方法和微流控设备中的超高频体声波谐振器的设置结构示意图和作用方式示意图。
图3为本发明提供的方法和微流控设备中的超高频体声波谐振器在微流道中通过体声波引起涡旋隧道以及溶液中的颗粒在所述涡旋隧道中的移动的原理和现象示意图。
图4为本发明提供的微流控设备的示例性的进样搅匀单元的结构和设置的示意图，以及所述进样搅匀单元对样品进行搅匀的工作结果图。
图5为本发明提供的微流控设备的示例性的样品聚焦单元的结构和设置的示意图，以及所述样品聚焦单元对微流道中生物颗粒或粒子进行聚焦和“排队”的工作结果图。
图6为本发明的微流控设备的又一个示例性的样品配对单元的结构和设置。
图7为本发明提供的微流控设备的示例性的液滴封装单元的结构和设置的示意图，以及所述液滴封装单元形成包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴的工作示意图和实验结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的区间。
实施例1实验方法和材料
微流体通道制备：
通过软光刻制备由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的微流体通道。
超高频体声波谐振器制备：
体声波谐振器装置通过在硅基的晶圆上进行化学气相沉积、金属溅射、光刻等方法制备。具体的方法如下：
1.使用浓硫酸与双氧水体积比为3:1的食人鱼溶液对硅片的表面进行彻底的清洗，该方法可以有效地去除硅片上的有机物和无机物。
2.在清洗过的硅片上，通过表面溅射的方法形成一层氮化铝薄膜，再使用离子增强型化学气相沉积的方法，沉积一层二氧化硅薄膜。接着使用同样的方法，交替沉积氮化铝薄膜和二氧化硅薄膜，形成氮化铝和二氧化硅交替重叠的布拉格声反射层结构。
3.在布拉格反射层结构上，溅射出一层600nm的钼薄膜作为底电极。接着采用标准光刻技术，包括涂胶、曝光、显影等，对钼电极薄膜进行光刻，之后进行刻蚀，形成有目标图案的底电极。
4.在钼电极上再溅射一层氮化铝薄膜作为压电层。使用干法刻蚀对氮化铝薄膜定义图案。
5.使用负光刻胶对掩模版上的图案进行转移，再溅射出一层50nm厚的钛钨合金，它作为粘附层可以增加金电极的粘附性。之后使用蒸镀的方法长出一层300nm厚的金薄膜的上电极。最后使用丙酮去除掉目标图案周围的金薄膜，形成有目标图案的金电极。
最后，体声波谐振器装置与PDMS微通道芯片粘合集成。体声波谐振器装置设置在通道的中间位置。
将体声波谐振器装置用标准SMA接头与网络分析仪连接，通过测试频谱找到谐振峰，可测得体声波谐振器装置在微流道中发出的体声波的频率。在本申请的实施例中制备和使用的体声波谐振器频率为约1.5GHz-2.0GHz。
仪器和材料
高频信号发生器：(MXG Analog Signal Generator,Agilent,N5181A 100kHz-3GHz
功率放大器：Mini-Circuits,with 35dBm enhancement of the original RFsource power
注射泵：New Era Pump Systems,Inc.,NE-1000
细胞：
Hela细胞株：广州吉妮欧生物科技有限公司，ATCC#CCL2
细胞培养：
在补充有10％FBS(Thermo)，100U/ml青霉素(Thermo)和100ug/ml链霉素(Thermo)的DMEM培养基(Thermo)中培养293T细胞。培养的细胞密度在1x105/mL～2x106/mL。在进行微流道实验时，可稀释为1x105/mL进行实验。PBS缓冲液(Gibco)。
染色剂：
Calcein-AM(北京索莱宝科技有限公司，中国)
4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen,USA)
实施例2
在本实施例的具体实施过程中，提供了一种在微流控设备中利用条形码粒子来分析生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸等)，特别是分析所述生物颗粒的核酸的方法和微流控设备。本发明提供的方法和微流控设备可将来自生物样品的单个生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸等)与条形码粒子配对，然后将包含配对的单个生物颗粒-条形码粒子的第一液体(通常为水性溶液)与第二液体(其为与第一液体不相溶的液体，通常为油性液体)接触形成其内包含一个配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴(例如为油包水型液滴)。所述方法还包括对包裹在液滴里的单个生物颗粒的核酸做进一步的处理和分析，例如进行核酸扩增和建库等。
本发明提供的方法和微流控设备适合处理的生物颗粒通常具有约0.01-30um的直径，优选为0.2-25um的直径，更优选为0.5-20um。
在本发明的其中一个方面，所述生物颗粒为细胞或细胞释放到细胞外环境中的囊泡。细胞包括天然的或培养的高等植物或动物(例如包括人在内的哺乳动物)的细胞，以及细菌，真菌等单细胞生物或简单多细胞生物。囊泡为各种动物细胞释放到细胞外环境中的微囊泡。这些细胞相关的微囊泡是从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体。细胞释放的微囊泡包括外泌体、微囊泡、囊泡、膜小泡、水泡、气泡、***小体、微颗粒、管腔内囊泡、核内体样囊泡或胞吐囊泡等。细胞释放的微囊泡具有大约30-1000nm、大约30-800nm、大约30-150nm或者大约30-100nm的直径。
在本发明的其中一个方面，所述生物颗粒为病毒，包括拟病毒、类病毒和病毒粒子。所述病毒可以为DNA/RNA病毒，以及蛋白病毒。尽管病毒没有完整的细胞结构，在本文中，细胞也包括病毒。
在本发明的其中一个方面，所述方法中的所述生物颗粒是核酸、蛋白质或多糖分子，特别是核酸分子。本文所用的“核酸”(以及等价术语“多核苷酸”)是指在核苷酸亚单位之间包含磷酸二酯键的核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物。核酸包括，但不限于，基因DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、微RNA、片段核酸、从亚细胞器如线粒体获得的核酸，以及从可能出现在样品上或样品中的微生物或病毒获得的核酸。核酸包括天然或合成的，例如以人工或天然DNA或RNA为模板的扩增反应产物。核酸可以是双链或者单链、环状或线性的。本发明方法尤其适用于分离长度≥200bp，优选≥1kbp、更优选≥10kbp、例如为≥50kbp的核酸(例如任何形式的DNA和RNA，包括天然或合成核酸，例如以DNA或RNA为模板的扩增反应产物)。
可以用于检测生物颗粒的样品包括：来自细胞培养物、真核微生物或诊断样品如体液、体液沉淀物、洗胃样本、细针抽取物、活组织检查样品、组织样品、癌细胞、来自病人的细胞、来自组织的细胞或来自待测试和/或治疗疾病或感染的个体的体外培养的细胞、或法医样品。体液样品的非限制性实例包括全血、骨髓、脑脊液、腹膜液、胸膜液、淋巴液、血清、血浆、尿、乳糜、粪便、***、痰、***吸液、唾液、棉签样本、冲洗或灌洗液和/或擦拭样本。
在本发明的方法中使用的条形码粒子为具有核酸条形码的粒子，所述粒子具有结合其上的核酸片段。所述核酸片段包括条形码。“条形码”或“条形码序列”是指可以与至少一个核苷酸序列偶联用于例如稍后鉴定所述至少一个核苷酸序列的任何独特的序列标记。所述核酸片段还可包括分子标识符(UMI)序列。UMI序列含有随机化的核苷酸并独立于条形码序列并入所述核酸片段中。当将含有相同条形码序列但不同UMI序列的核酸片段添加到与一个样品相关的RNA中时，每个RNA序列可以在条形编码期间与不同的UMI序列连接。所述核酸片段还可包括识别和结合待分析生物颗粒的核酸的结合序列，例如可与样品细胞相关的RNA结合和扩增。所述粒子可为珠粒、色谱树脂、多孔板、微量离心管等，例如为珠粒、微珠、微粒、微球、纳米粒子、纳米珠粒或水凝胶。在本发明的其中一个方面，所述粒子为珠粒，例如由金属和/或聚合物材料制成的球形珠粒。在本发明的其中一个方面，所述粒子为水凝胶粒子。本发明的方法和微流控中采用的条形码粒子的直径在约0.1μm至100μm范围内。所述含有条形码的核酸可以使用任何希望的机制如化学键或生物素-抗生物素蛋白、生物素-链霉亲和素、金-硫醇等相互作用结合到所述粒子上。
图1为本发明的在微流控设备中利用条形码粒子分析生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸)的方法涉及的步骤的示意图。如图1所示，本发明的方法可包括以下步骤：
1.进样混匀。在样品腔内加入含有待测生物颗粒(如细胞)的样品，以及在另一样品腔内加入条形码粒子，对位于样品腔的生物样品溶液或粒子溶液进行搅拌以保持生物颗粒(如细胞)和/或粒子的分散状态，避免出现沉淀和/聚集；
2.样品聚焦。对流道中的生物颗粒(如细胞)或条形码粒子的运动进行调整，使得生物颗粒和条形码粒子汇聚，消除或减少在流道宽度方向的随机分布；
3.样品-条形码粒子配对和液滴封装。使进入微流道的生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸)和条形码粒子产生单个生物颗粒与单个条形码粒子的配对，和形成其内包含单个配对的生物颗粒-条形码的液滴；
4.处理和分析。对包含在液滴内的单个配对的生物颗粒-条形码进行处理，使得生物颗粒的核酸与条形码接触并且条形码化，以及对包含在液滴内的单个生物颗粒的信息，特别是核酸信息进行分析。
上述步骤可独立或以各种组合的方式用于本发明的方法。其中，组合方式包括如图1所示意的各种组合和执行方式(箭头表示各程序的执行顺序)。
在本发明的其中一个方面，本发明的方法可包括全部前述4个步骤，例如对目的生物样品进行进样混匀、样品聚焦，另外对条形码粒子进行进样混匀和样品聚焦，然后将聚焦后的生物样品与带有条形码的粒子进行样品配对和液滴封装、处理和分析。
在本发明的其中另一个方面，本发明的方法可包括全部前述7个步骤中的部分步骤。例如，在本发明的方法中，可直接将目的生物样品和条形码粒子进行样品配对、液滴封装、处理和分析；又例如，在前述方法中，可在生物样品与带有条形码的粒子进行样品配对的步骤之前对生物样品与带有条形码的粒子分别进行样品聚焦。
本发明还提供了利用条形码粒子来处理和分析生物颗粒的设备。在本发明中，所述设备为微流控设备。微流控***和设备用于容纳和运输液体等流体材料，其流道尺寸在微米甚至纳米级别。典型的微流控***和设备通常包括毫米级或更小尺寸的结构和功能单位。
图2为本发明提供的微流控设备中的超高频体声波谐振器的设置结构示意图和作用方式示意图。图2(a)为设置在微流控设备中的超高频体声波谐振器的示意图(俯视)。如图2(a)所示，本发明提供的用于处理和分析生物颗粒的微流控设备10可包括以下单元：
-进样混匀单元100；
-样品聚焦单元200；
-配对和液滴封装单元300；
-处理和分析单元700(未示出)。
本发明提供的微流控设备的流体通道，或称为微流道，除了供流体进入和流出的开口以外，一般是封闭的。流体通道的截面通常具有0.1-500μm的尺寸，其可以为各种形状，包括椭圆、矩形、方形、三角形、圆形等。可以用各种已知的微制备技术来制备流体通道，其材料包括但不限于硅石、硅、石英、玻璃或聚合材料(例如聚二甲基硅氧烷即PDMS、塑料等)。可以用涂层涂覆所述通道。涂层可改变通道的特性，并且可以图案化。例如，涂层可以是亲水的，疏水的，磁性的，传导的，或生物性功能化的。
在本发明提供的微流控设备中，采用了超高频体声波谐振器。如图2所示，本实施方式的微流控设备具有多个设置在腔体或流道的底部的超高频体声波谐振器(深色图形所示)。通过超高频体声波谐振器在溶液中产生的体声波对生物颗粒或条形码粒子的移动进行控制。在本发明中，超高频体声波谐振器是指可产生频率为约0.5-50GHz(例如为约1-50Ghz)的体声波的谐振器。可使用于本发明的超高频体声波谐振器可以为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器，例如为厚度伸缩振动模式的声波谐振器。
本发明采用的所述超高频体声波谐振器可与构成微流控设备的壁的材料很好地适合，方便地设置在微流控设备的壁内，例如设置在容纳液体的腔体或是微流体通道的底部。所述超高频体声波谐振器可在溶液内产生传向对侧的体声波。
图2(b)为剖面图，显示微流控设备的流体通道(A-A截面)以及设置在微流控设备的流道底部的超高频体声波谐振器(B-B截面)或设置在微流控设备的腔体的底部的超高频体声波谐振器(C-C截面)的结构示意图。图2(c)和(d)为超高频体声波谐振器的工作方式和在溶液中产生的效果的示意图。如图2(b)所示，超高频体声波谐振器可设置在微流控设备的微流道11或腔体12的壁(通常是底部13)内。超高频体声波谐振器的顶部配置在微流控设备的壁的表面(如腔体或微流道底部表面)，向对侧(如向流道顶部14或腔体12的上方)产生传播方向与所述壁垂直的体声波。超高频体声波谐振器的顶部表面构成的区域为体声波产生区域，在本文中也称为体声波区域。如图2(b)所示，所述超高频体声波谐振器包括由下往上依次设置的声波反射层15、底电极层16、压电层18及顶电极层17。所述底电极层、压电层、顶电极层及声波反射层相重叠区域构成体声波产生区域。
本申请的发明人发现，如图2(c)和(d)所示，在本发明的设备中，超高频体声波谐振器可有两种工作方式。如图2(d)所示，在腔体(高度大于1000μm，例如大于5000μm)中，超高频体声波谐振器发射传向顶部的体声波，在溶液中产生声流体，在溶液中产生扰动，使得溶液中的颗粒保持分散。这种工作方式中，通常对超高频体声波谐振器施加脉冲式功率，以获得更好的分散溶液中的颗粒的效果。
另外，如图2(c)所示，超高频体声波谐振器在微流道(高度不大于500μm，例如不大于300μm)中，可发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生沿超高频体声波谐振器的体声波产生区域分布的涡旋，连续的涡旋构成由超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界限定的涡旋通道。在涡旋中的颗粒受到的力包括涡旋产生的流体拖拽力(Stokes drag force)，层流产生的惯性拖拽力(inertial lift force)和声波衰减引起的声辐射力(acoustic radiation force)。由于流体拖拽力的大小与颗粒如颗粒直径成正向关系，而声辐射力的大小与颗粒尺寸的平方成正向关系。随着颗粒的增大，受到的力会从以流体拖拽为主导转变到以声辐射力为主导，声辐射力将颗粒推向涡旋中心。较大的颗粒受到更大的声辐射力从而移动到涡旋中心；而较小的颗粒则在涡旋拖拽力的作用下在***旋转，更小的颗粒甚至离开涡旋。另外，颗粒在层流产生的侧向拖拽力作用下向体声波作用区域的下游移动。保留在涡旋中的颗粒受到的力达到一定的平衡时，颗粒停止在涡旋通道相关位置，不产生相对流道的运动。
本申请的发明人出乎意料地发现，在前述图2(c)所示的微流道内超高频体声波谐振器的体声波的作用方式中，颗粒在通过设置在微流道的超高频体声波谐振器的体声波作用区域时，在一定的参数条件下，会出现以下描述的三种移动方式(已提交的专利申请PCT/CN2020/096131和PCT/CN2020/096178也对相关发现进行了描述和公开。该些专利申请全文引入本申请)。图3为在该工作方式中颗粒在通过设置在微流道的超高频体声波谐振器的体声波作用区域的移动方式示意图。如图3所示，超高频体声波谐振器21在微流道11中发射传向所述流体通道的对侧的壁(即流道顶部，未示出)的体声波在溶液中产生沿超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界23分布的涡旋22，连续的多个涡旋构成由超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界23限定的涡旋通道24。样品溶液25中的颗粒在经过体声波作用区域时，在不同的参数条件(流道高度、流速、超高频体声波谐振器产生的体声波功率、颗粒尺寸、形状和性质、以及溶液的自身性质及其与颗粒相对性质等)下，可(a)基本不受影响地通过体声波作用区域(不进入涡旋通道)；(b)进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动后从涡旋通道中的某个位置离开涡旋通道，此位置可称为释放点；或(c)进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并停留在涡旋通道中的某个位置，此位置可称为捕获点。在一定的装置和流体条件条件(即固定的流道高度、体声波功率、流速、溶液性质等)下，较大颗粒251更倾向于被“捕获”，即进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并停留在涡旋通道中的捕获点，较小颗粒252则更倾向于进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动后从涡旋通道中的释放点离开涡旋通道，更小的颗粒253则倾向于不进入涡旋通道。释放点和捕捉点通常是同一个位置。可以在一定范围内，通过调整不同的参数条件(如改变流道高度、流速、超高频体声波谐振器产生的体声波功率等)，使得相同的颗粒分别产生上述三种移动方式，即不进入涡旋通道，或进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动后停留在涡旋通道的某个位置，或是进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动后在某个位置离开涡旋通道。也可以通过调整相关参数使得相同的颗粒在上述三种移动方式中转化，例如从不进入涡旋通道转变为进入涡旋通道，或是从停留在涡旋通道某个位置转变为离开涡旋通道。另外，可以通过设定某些参数条件，使得进入涡旋通道的不同颗粒分别产生上述三种移动方式。由此，通过设置在微流道的超高频体声波谐振器以及调节各个相关参数(流道高度、流速、超高频体声波谐振器产生的体声波功率、颗粒尺寸、形状和性质、以及溶液的自身性质及其与颗粒相对性质等)，可以达到对溶液样品中的颗粒或多种颗粒进行区分、捕获、分离、富集某个或多个种类的颗粒，以及对微流道中的颗粒的移动进行控制。
在本发明的其中一个方面，在本发明的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法和微流控设备中，可以通过设置在微流道的超高频体声波谐振器来控制溶液中的生物颗粒(如细胞或核酸)或条形码粒子进入超高频体声波在溶液中引起的涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置停留或离开涡旋通道。在本发明的其中又一个方面，可通过调节超高频体声波谐振器的体声波作用区域的形状和位置，使得溶液中的被控制移动的生物颗粒(如细胞或核酸)或条形码粒子进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道。由此所述生物颗粒(如细胞或核酸)或条形码粒子以指定位置和方向离开体声波作用区域，进入希望的流出通道。该设定的离开涡旋通道的位置称为释放点，也即所述生物颗粒(如细胞或核酸)或条形码粒子离开体声波作用区域的位置。除去所述被控制移动的生物颗粒的溶液则保持流入方向移动。
由于生物颗粒(如细胞或核酸)或条形码粒子等脱离涡旋通道的其中一个重要因素是沿流体通道方向的层流的影响，释放点通常位于涡旋通道的下游区域。在本发明的另一个方面，释放点通常处于涡旋通道出现转折或曲率变化的地方，即对应体声波作用区域边界出现转折或曲率变化的位置的上方，也即，对应所述释放点的体声波作用区域的边界存在转折或曲率变化。在不受有关理论约束的情况下，发明人认为，这个现象的原因在于，在涡流通道的转折或转角处，涡旋方向和声辐射力方向突然变化，进入涡旋通道的生物颗粒(如细胞或核酸)或条形码粒子中，符合合适的条件(如合适的尺寸)的颗粒由于已经聚焦到涡旋中心，在声辐射力的作用下能够随着涡旋通道改变运动方向并且快速重新聚焦到转折后的涡旋通道的中心；而不符合条件(如具有较小尺寸)的生物颗粒(如细胞或核酸)或条形码粒子则会因为层流拖拽方向的跳变而受到更大的影响，从而离开涡旋通道。
在本发明的其中一个方面，本发明提供的上述方法适于处理含有大量生物颗粒(如细胞或核酸)或条形码粒子的液体样品；所述大量生物颗粒或条形码粒子可以连续移动的方式进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道，由此达到快速和大通量处理的目的。
在本发明的其中一个方面，上述方法中还包括通过调节微流道的高度、产生体声波的功率和/或通过调节所述溶液流经体声波区域的速度，来调节进入涡旋通道的生物颗粒或条形码粒子。未进入涡旋通道的生物颗粒或条形码粒子则穿过体声波区域，沿样品进入流体通道的方向流出。
在本发明的其中一个方面，上述方法中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界线条(即对应的涡旋通道的形状)设置为适于生物颗粒或条形码粒子在涡旋通道中顺着涡旋通道移动至释放点。由此可避免生物颗粒或条形码粒子脱离涡旋通道而不按设定从释放点离开涡旋通道。
在本发明的其中又一个方面，其中通过调节所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界形状使得目标生物颗粒或条形码粒子保持在涡旋通道中移动至释放点。如前所述，体声波产生区域的边界线条中存在转折或曲率变化，可能会增加颗粒脱离涡旋通道的几率。因此，可以通过减少体声波产生区域的边界线条中出现转折或曲率变化来使得颗粒保持在涡旋通道中移动，即减少脱离涡旋通道的生物颗粒或条形码粒子。
在本发明的其中一个方面，在本发明的方法或微流控设备中，可以通过设置在微流道的超高频体声波谐振器可控地停留或释放在超高频体声波谐振器的体声波产生区域的生物颗粒(如细胞或核酸)或条形码粒子。在本发明的其中又一个方面，所述方法或微流控设备可以控制超高频体声波谐振器的体声波产生区域停留或释放的生物颗粒或条形码粒子的种类，例如在使不同大小的生物颗粒或条形码粒子在超高频体声波谐振器的体声波产生区域停留后，释放不同大小的生物颗粒或条形码粒子，特别是按尺寸从小到大的顺序释放不同大小的生物颗粒或条形码粒子。在本发明的其中又一个方面，可通过调节体声波的功率，控制“捕获的”颗粒或粒子按尺寸从小到大顺序释放。
本发明中的超高频体声波谐振器是指能够产生频率超过0.5GHz，例如频率为0.5-50GHz(优选为不低于1GHz)的声波的谐振器。所述超高频体声波谐振器可以为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器。
在本发明中，所述超高频体声波谐振器的体声波作用区域(通常为所述超高频体声波谐振器的顶部)的形状至少包括但不限于以下其一：圆形，椭圆形、半圆、抛物线、顶点为锐角或者钝角的多边形、顶点用圆弧替代的多边形、顶点为锐角、半圆或抛物线任一组合的多边形，或者同样形状的重复排列的方阵式或圆环式阵列。本申请提供上述形状的声波作用区域，但其他任意形状的声波作用区域也在本申请的保护范围之内。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中或在本发明提供的微流控设备中，超高频体声波谐振器的体声波产生区域的微流体通道(本文中可简称为微流道或流道)高度(超高频体声波谐振器的顶部与其对侧的壁的距离，通常为流道底部至顶部的距离)为约10-300μm。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中或在本发明提供的微流控设备中，所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约500-200000μm2，优选为约5000-50000μm2，最优选为约10000-25000μm2。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中或在本发明提供的微流控设备中，所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域的长度(微流道内流体方向)或宽度(与微流道内流体方向水平垂直的方向)为约20-500μm，优选为约40-400μm。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中或在本发明提供的微流控设备中，所述超高频体声波谐振器产生体声波的功率为约0.5-5000mW，优选为约10-2000mW。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中或在本发明提供的微流控设备中，溶液流经所述超高频体声波谐振器的体声波区域的速度为约0.1-100mm/s，优选为约0.5-5mm/s。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中或在本发明提供的微流控设备中，溶液流经所述超高频体声波谐振器的体声波区域的速度为约0.1-500μL/min，优选为约0.5-30μL/min。
在本发明的微流控设备中，可以通过外部压力源、内部压力源、电子动力学或磁场动力学方式来控制注入液体的流速。外部压力源和内部压力源可以是泵，例如蠕动泵、注射泵或气动泵等。本实施例中采用由电脑微调的注射泵来控制液体注入的流速。
本发明的微流控设备还包括功率调节装置，其调节所述超高频体声波谐振器产生的体声波的功率。在本实施例中，所述功率调节装置为具有功率调节功能的功率放大器。由于薄膜体声波谐振器能量转换效率高，基本没有损耗，所述功率调节装置的输出功率可基本上视为薄膜体声波谐振器在流体中产生体声波的输出功率。本发明的微流控设备中，所述功率调节装置可与高频信号发生器连接。所述功率放大器的输出电路分别与所述超高频体声波谐振器的底电极、压电层、顶电极连接。
实施例3进样混匀步骤和进样混匀单元
在本发明提供的在微流控设备中利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法可包括进样搅匀的步骤，以及本发明提供的微流控设备中可包括进样搅匀单元。本发明提供的方法在微流控设备的样品腔内加入含有待测生物颗粒(如细胞)的样品，以及在另一样品腔内加入条形码粒子。在本发明的其中一个方面，所述方法包括分别对位于不同样品腔的生物样品溶液或粒子溶液进行搅拌，以保持生物颗粒(如细胞)和/或条形码粒子(如磁珠)的分散状态，避免出现沉淀和/聚集。
在本发明的其中一个方面，通过设置在微流控设备的样品腔底部的超高频体声波谐振器产生的体声波对所述生物样品溶液或粒子溶液进行搅拌。
如图2所示，本发明提供的示例性的微流控设备包括进样混匀单元100。图4为本发明提供的微流控设备的示例性进样搅匀单元的结构和设置，以及所述进样搅匀单元对样品进行搅匀的工作结果图。
如图4(a)所示，所述进样搅匀单元100包括加样口或加样孔101和样品腔102，生物颗粒(如细胞)和/或条形码粒子的溶液从加样口101加入到样品腔102内，然后通过出样口103和样品通道104进入到下游处理单元。
所述样品腔102为横截面为圆形的柱体，容积为约0.2-2.0ml，高度约为0.5-2.0cm。加样口可具有或不具有顶盖。
所述进样搅匀单元还包括设置在所述样品腔底部的超高频体声波谐振器105，其可在样品腔的溶液内产生频率为约0.5-50GHz的体声波。如图4(b)和(c)所示，在腔体(高度通常大于0.2cm，例如大于0.5cm)内，体声波的作用方式为如实施例2中描述的如图2(d)所示的工作方式，即体声波在溶液中产生旋流，使得样品腔内的溶液产生旋流和扰动，使得溶液中的细胞或所述条形码粒子保持悬浮和分散状态。由于腔体不设置顶部覆盖物，或者其顶部覆盖物与底部的距离较大(大于0.2cm)，因此在腔体底部设置的体声波谐振器产生的体声波引起的涡旋基本不引起溶液中颗粒物在谐振器表面的聚集。在用于产生涡流和使得溶液保持流动状态的应用中，对超高频体声波谐振器施加脉冲式功率，可获得更好的分散溶液中的颗粒的效果。在本发明的其中一个方面，在所述进样搅匀单元中，所述体声波谐振器的作用功率为约0.1-5mW，优选为约0.5-2mW。当溶液中含有细胞时，采用的作用功率可低于0.5mW，避免产生过量的热量，对细胞产生不利影响。
图4(d)显示采用本发明提供的微流控设备中搅匀单元的作用效果。在腔体(内直径为4mm，高度10mm)内加入100μl含有聚苯丙烯(PS)微球(粒径10um，1000-3000个/ul)的PBS溶液。结果显示，当显微镜聚焦到腔体内的液体表面，在体声波谐振器开启状态(功率630mW；250ms间歇振动(250ms非振动))和关闭状态下，记录0min，2min，4min，6min在同一表面拍摄到的粒子悬浮情况。结果显示，在静止状态下，照片显示粒子产生虚焦，表示产生沉降，在体声波谐振器工作下粒子悬浮良好，直至15min后粒子仍然呈现均匀悬浮状态。实验中发现，当采用连续输出功率方式时，产生沉降的现象较采用脉冲式功率的方式较早。
在本发明的其中一个方面，如前所述，在所述进样搅匀单元中采用超高频体声波谐振器，其产生频率为约0.5-50GHz的体声波。在本发明的其它方面，也可采用较低频率的体声波谐振器，例如频率为约0.1-0.5GHz。
在微流控设备中，生物物质例如细胞和核酸等，以及部分粒子(如高聚物微球、磁珠等)在腔体中，即使是短暂时间(例如几分钟)内，也会发生沉淀和聚集现象，导致在微流道中的移动甚至是堵塞。现有技术中采用的常规方法，例如磁转子或电机带动的叶片等，都存在器件尺寸和在液体中引起气泡的问题。本发明提供的方法和装置能够有效地解决这些问题。
实施例4样品聚焦步骤和样品聚焦单元
在本发明提供的在微流控设备中利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法可包括样品聚焦的步骤，以及本发明提供的微流控设备中可包括样品聚焦单元。其中，调节微流道内的生物颗粒或条形码粒子的移动方式使其汇聚，消除或减少在流道宽度方向的随机分布，以使生物颗粒或条形码粒子以更为一致的方向、位置和速度进入下游的样品配对单元。由此，在生物颗粒或条形码粒子进入配对单元的声流体涡旋中时，生物颗粒或条形码粒子有同样的初始相对位置和状态，有利于提高生物颗粒或条形码粒子的配对效率和生物颗粒的捕获效率。
在本发明的其中一个方面，通过设置在微流控设备的流道底部的超高频体声波谐振器在溶液中产生体声波并形成由超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界限定的涡旋通道，使得微流道内的生物颗粒(如细胞或核酸)或条形码粒子在经过体声波作用区域时进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在离开涡旋通道的释放点时，溶液里的生物颗粒或条形码粒子基本以相同或相似的速度和运动方向向前移动，消除或减少在流道宽度方向的随机分布情况。由此，生物颗粒或条形码粒子以较为一致的方向、位置和速度进入下游的样品配对单元，使得进入配对单元的声流体涡旋中时，生物颗粒或条形码粒子有同样的初始相对位置和状态，有利于提高生物颗粒或条形码粒子的配对效率和生物颗粒的捕获效率。
如图2所示，本发明提供的示例性的微流控设备包括样品聚焦单元400。图5显示本发明提供的微流控设备的示例性样品聚焦单元的结构和设置，以及所述样品聚焦单元对微流道中生物颗粒或粒子进行聚焦和“排队”的工作结果图。图5(a)显示所述示例性样品聚焦单元中超高频体声波谐振器的设置示意图和作用原理示意图，图5(b)和(c)为所述样品聚焦单元对样品中生物颗粒或条形码粒子的工作示意图和实验结果图。
如图5(a)所示，微流道包括进样口和位于超高频体声波谐振器设置位置下游的多个出口，其中一个出口为需要的生物颗粒或条形码粒子的出口，其它为已去除需要的生物颗粒或粒子的溶液的出口。图5(a)下图为示例性的筛分单元的结构图。所述筛分单元具有样品入口和缓冲液入口，设置在微流道底部的超高频体声波谐振器(图中五角星形深色图形所示)，以及下游的两个出口。如图5(a)所示，使含有生物颗粒或条形码粒子的溶液流经超高频体声波谐振器作用区域，在超高频体声波谐振器未产生体声波和引起涡流隧道时，所有生物颗粒或条形码粒子沿整个流道的宽度分散分布，沿液流方向移动进入下游(图5(a)上图)。在超高频体声波谐振器产生体声波和引起涡流隧道时，通过调节参数条件(例如通过调节流道高度、流速、超高频体声波谐振器产生的体声波功率或其组合)，生物颗粒或条形码粒子进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动后从涡旋通道中的某个位置(释放点)离开涡旋通道，并且以相同或相似的速度和运动方向向前移动进入下游流道，消除或减少在流道宽度方向的随机分布情况。
图5(b)和(c)显示本发明示例性微流控设备的样品筛选单元中超高频体声波谐振器的设置方式，以及对应的实验和结果。
图5(b)的上图显示将超高频体声波谐振器为叶子形，其下游尖端偏向流道的上方，由此可以使得需要的生物颗粒或条形码粒子在经过高频体声波谐振器的体声波作用区域后改变移动方向，沿着高频体声波谐振器的边缘走向从叶子形器件下游尖端位置离开后随水平液流进入设置在下游流道上端的开口，并且形成“队列”，消除或减少生物颗粒或条形码粒子在流道宽度方向的随机分布情况。图5(c)的上图显示对应的实验和结果。含Hela细胞(荧光染色)的PBS溶液进入流道后(流道高度50μm，流速约为1ul/min，超高频体声波谐振器施加体声波的功率25mW)，沿着高频体声波谐振器的边缘走向从叶子形器件下游尖端位置离开后随水平液流进入设置在下游流道上端的开口，在下游流道中，Hela细胞形成和保持为细的细胞流。
图5(b)的下图显示将超高频体声波谐振器为叶子形，其下游尖端对着流道的中间，由此可以使得需要的生物颗粒或条形码粒子在经过高频体声波谐振器的体声波作用区域后沿着高频体声波谐振器的边缘走向从叶子形器件下游尖端位置离开后，并随水平液流进入设置在下游流道中间的开口，并且形成“队列”，消除或减少生物颗粒或条形码粒子在流道宽度方向的随机分布情况。图5(c)的下图显示对应的实验和结果。含聚苯丙烯(PS)微球(粒径10um，1000个/ul)的PBS溶液进入流道后(流道高度28μm，流速约为1ul/min，超高频体声波谐振器施加体声波的功率200mW)，PS微球沿着高频体声波谐振器的边缘走向从叶子形器件下游尖端位置离开后随水平液流进入设置在下游流道上端的开口，在下游流道中，PS微球形成和保持为细的细胞流。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中的样品聚焦步骤以及在本发明提供的微流控设备的样品聚焦单元中，超高频体声波谐振器的体声波产生区域的微流体通道高度为约5-200μm，优选为约25-100μm，例如为约30-90μm。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中的样品聚焦步骤或在本发明提供的微流控设备的样品聚焦单元中，超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约500-200000μm2，优选为约5000-50000μm2，最优选为约10000-25000μm2。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中的样品聚焦步骤或在本发明提供的微流控设备的样品聚焦单元中，所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边长为约30-500μm，优选为约40-300μm，最优选为约50-200μm。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中的样品解聚步骤或在本发明提供的微流控设备的样品聚焦单元中，超高频体声波谐振器产生体声波的功率为约20-5000mW，优选为50-2000mW，更优选为100-1500mW。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中的样品解聚步骤或在本发明提供的微流控设备的样品聚焦单元中，溶液流经体声波区域的速度为约0.1-100mm/s，优选为约0.3-20mm/s，更优选为约0.5-5mm/s。
在本发明的其中一个方面，在本发明提供的利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法中的样品解聚步骤或在本发明提供的微流控设备的样品聚焦单元中，溶液流经体声波区域的速度为约0.1-200μL/min，优选为约0.1-50μL/min，更优选为约0.5-30μL/min。
实施例5生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装步骤和单元
在本发明提供的在微流控设备中利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法包括生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装的步骤，以及本发明提供的微流控设备中包括生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装单元单元。
在本发明的其中一种实施方式中，使进入微流道的生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸)和条形码粒子产生单个生物颗粒与单个条形码粒子的配对，然后使得配对的生物颗粒-条形码粒子悬浮在第一液体(通常为水性溶液)中，进入下游的液滴封装单元和液滴封装步骤，以与第二液体(其为与第一液体不相溶的液体，通常为油性液体)接触，形成其内包含单个配对的生物颗粒-条形码的液滴。
在本发明的另一种实施方式中，所述生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装单元设置为将来自样品的单个生物颗粒和条形码粒子分别形成其内包含所述生物颗粒或所述条形码粒子的液滴，然后将包含所述生物颗粒或所述条形码粒子的液滴配对和合并，由此形成内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴。
如图2所示，本发明提供的示例性的微流控设备包括生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装单元300。
在本发明的一个实施方式中，本发明提供的方法可在样品配对步骤加入用于后续工作单元或步骤的溶液(例如用于在后续液滴封装步骤中的第一液体)或试剂。在本发明的一个实施方式中，本发明提供的微流控设备的样品配对单元可包括加入用于后续工作单元的溶液或试剂的流道和入口。在本发明中，可用于后续工作单元或步骤的所述试剂包括有助于细胞裂解、核酸扩增或条形码粒子解离等的试剂，例如为细胞裂解剂、细胞裂解酶、核酸连接酶、核酸聚合酶、转录酶等。
图6显示本发明的微流控设备的示例性样品配对单元的结构和设置。如图6(a)所示，样品配对单元可具有三个进样流道和入口，其中两侧分别为生物颗粒入口501和条形码粒子入口502，中间为第一液体入口507，可输入用于重悬配对的生物颗粒-条形码粒子的第一液体。通过在第一溶液入口输入第一液体，配对的生物颗粒和条形码粒子随第一液体流动方向进入下游的液滴封装单元，与第二液体形成其内包含一个配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴。
图6(b)为本发明的微流控设备的另一示例性样品配对单元的结构和设置。如图6(b)所示，样品配对单元的涡旋通道的释放点的下游可设置一个或多个试剂流道和入口509，在含有配对的生物颗粒-条形码粒子的液流中加入下游单元需要的试剂，如有助于细胞裂解、核酸扩增或条形码粒子解离的试剂等。
在本发明提供的在微流控设备中利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法包括液滴封装的步骤，以及本发明提供的微流控设备中包括液滴封装单元。其中，将含单个生物颗粒或单个条形码粒子或配对的生物颗粒-条形码粒子的第一液体与第二液体接触，以形成其内包含一个配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴。
术语“液滴”和“微滴”在本文中有时可互换使用，指小的、通常为球形的结构，其至少含有第一流体相，例如水相(例如，水)，周围是不可与第一流体相混溶的第二流体相(例如，油)。在一些实施方案中，第二流体相将是不混溶相载液。
可以采用各种已知的方法将生物颗粒或单个条形码粒子可控地包封到液滴中。
在微滴被包含在乳液中时，载液可以构成连续相，微滴构成分散相。乳液可进一步包含表面活性剂和任选的助表面活性剂。表面活性剂和/或助表面活性剂可以位于分散相和连续相的界面处。各种合适的表面活性剂是可用的，并且本领域技术人员根据所选择的筛选参数能够选择合适的表面活性剂和/或助表面活性剂。表面活性剂优选生物相容性的。例如，表面活性剂可以选择对筛选中使用的细胞或酶都是无毒的。所选择的表面活性剂也可以对气体有良好的溶解性，这有利于被封装的细胞的生长和/或活力。
范围广泛的不同的乳化方法是本领域技术人员所熟知的，其中的任何一个方法都可以用来产生本发明的微滴。很多乳化技术包括大批量地混合两种液体，通常使用湍流以增强水滴破碎。这样的方法包括涡旋、超声处理、均质化或它们的组合。例如，在微流体装置中，可以通过在T形连接处使油流和水流碰撞来形成乳液：产生的微滴大小取决于每个液流的流速而不同。制备根据本发明使用的微滴的优选的方法包括流动聚焦：连续相流体(聚焦或鞘流体)在分散相旁边或围绕分散相(被聚焦或核心流体)，在两个流体都被挤出的孔附近产生液滴破裂。流动聚焦装置由使用连续聚焦液体供给进行加压的压力室组成。在内部，一个或多个聚焦流体通过毛细管进料管注入，其末端在连接压力室和外部环境的小孔前面打开。聚焦流体流将流体弯月面模压成尖头，通过孔产生流出腔室的稳定的微米或纳米射流；射流尺寸远小于出口孔。毛细不稳定性将稳定的射流打破为均匀的液滴或气泡。进料管可以由两个或更多个同心针和注入的不同的导致复合液滴的不混溶液体或气体组成。流动聚焦确保了在射流破裂时极快地且可控地每秒产生数百万液滴。
液滴的尺寸遵循概率分布，例如高斯分布。还将进一步理解的是，可以对用于制备微流体液滴的参数进行选择，以获得具有特定体积的多个微流体液滴。优选的，本发明中的液滴是单分散的，具有基本上相同的形状和/或尺寸。液滴的体积或尺寸指多个液滴的平均体积或尺寸。本领域的普通技术人员将能够确定液滴群的平均直径，例如使用激光散射或其他已知技术。液滴可以是球形的，或者在某些情况下是非球形的。可以将与非球形液滴具有相同体积的完美数学球形的直径作为液滴(特别是非球形液滴)的直径。
可采用本领域已知的各种方法使第一液滴和第二液滴形成一一配对的组合。例如，可通过将第一液滴和第二液滴通过两条相交的微流道分别加入，通过控制微流道尺寸和流速，从而引起液滴的有序的周期性间隔，然后通入第一液滴的液流的周期可以与通入第二液滴的液流的周期相匹配，使得第一液滴和第二液滴在通道接口处形成“ABAB”形式的一一配对的组合。
本发明的其中一个方面，所述微流控设备的液滴封装单元具有：
第一液体通道，用于输入包含单个生物颗粒或单个条形码粒子或配对的生物颗粒-条形码粒子的第一液体；
液滴产生元件，其用于互不相溶的第一液体和第二液体接触和形成其内包含一个配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴；
液滴出口，形成的液滴可通过连续第二液体相(例如为油相)被运送到出口，离开出口通道的液滴可被分配到孔中以供进一步处理，例如加热。
其中，液滴产生元件可以为以下结构：
a.用于传输所述第二液体(通常为油性液体)的第二液体通道，以及第一液体通道与第一液体通道相交的接头，所述接头设置为使得第一液体与第二液体接触，并被第二液体分隔产生基本上单分散的液滴；
或为
b.容纳第二液体的腔体，含有配对细胞-粒子的第一液体进入第二液体，形成基本上单分散的液滴。
在本发明的方法中，形成的液滴中含有配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴比例高是有利的。在本发明的其中一个方面，通过调节第一液体通道和/或第二液体通道的流道截面积或者进样流速来调节液滴的生成。在本发明的其中一个方面，第一液体通道和/或第二液体通道的进样流速为约0.1-200mm/s。
图7显示了本发明提供的微流控设备的示例性的液滴封装单元的结构和设置，以及所述液滴封装单元形成包含单个生物颗粒或单个条形码粒子或配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴的工作示意图和实验结果图。
图7(a)和(b)为本发明提供的微流控设备的一种示例性的液滴封装单元的结构和设置，以及其用于液滴封装的实验和结果。
如图7(a)所示，所述微流控设备的液滴封装单元具有第一液体通道701，输入来自上游样品配对单元的含有粒子的第一液体。在本发明的其中一个方面，第一液体为水性溶液。所述微流控设备的液滴封装单元还具有第二液体通道702以及与第一液体通道相交和相通的接头703。第二液体为与第一液体不溶的液体。在本发明的其中一个方面，第二液体为油。第一液体与第二液体接触，并被第二液体分隔产生基本上单分散的液滴并进入下游的液滴出口704。图7(b)显示图7(a)所示微流控设备的液滴封装单元的实验和结果。将含细胞和微珠的溶液从左侧液体通道输入(进样流速为约5mm/s)，将油(QX200 DropletGeneration Oil#1864005,Bio-Rad)从上下两端的液体通道输入(进样流速为约8mm/min)，油与含细胞微珠的溶液在交叉处形成液滴，液滴中包含配对的单个细胞-微珠。还观察到液滴中包括含有单个微珠的液滴，以及“空包”的液滴。
在图7(a)的结构中，第二液体通道702为从上下两端与第一液体通道701垂直相交，与下游通道704形成十字交叉的结构。图7(c)为本发明提供的微流控设备的另一种示例性的液滴封装单元的结构和设置，其中第二液体通道702与第一液体通道701垂直相交，与下游通道704形成T字的结构。
图7(d)为本发明提供的微流控设备的另一种示例性的液滴封装单元的结构和设置，其中第一液体通道701与含有第二液体的腔体705连通，含有配对细胞-粒子的第一液体通过第一液体通道进入第二液体，在腔体内形成基本上单分散的液滴。
实施例6处理和分析步骤和处理和分析步骤和单元
在本发明提供的在微流控设备中利用条形码粒子来分析生物颗粒的方法还可包括处理和分析单元的步骤，以及本发明提供的微流控设备中包括处理和分析单元。其中，对包含在液滴内的单个配对的生物颗粒-条形码进行处理，使得生物颗粒的核酸与条形码接触并且条形码化，以及对包含在液滴内的单个生物颗粒的信息，特别是核酸信息进行分析。
本发明的方法中，包含在每个液滴中的单个生物粒子的核酸可以与包含在同一个液滴中的条形码粒子发生编码反应,当混合来自多个生物粒子的核酸时，来源于这些生物粒子的核酸(并且含有条形码序列)可以追溯到一个细胞。当所述生物粒子是细胞时，包含在每个液滴中的单个细胞被裂解，其核酸被释放并且与条形码粒子发生编码反应。来自细胞的RNA可以在液滴内条形编码，并且当混合来自多个细胞的核酸时，来源于这些RNA(并且含有条形码序列)的核酸可以追溯到一个细胞。
对包含在滴液中的细胞可做细胞破裂和核酸释放等处理。对条形码粒子可做分解和条形码释放等处理。还可使滴液内的单个细胞摄取后续反应相关的试剂。在一些情况下，可以对条形码粒子提供光刺激，引起释放寡核苷酸的光不稳定性键的裂解。在一些情况下，可以对条形码粒子提供热刺激，温度升高可能会导致键联的裂解或寡核苷酸从粒子的释放。在一些情况下，可以对条形码粒子提供化学刺激，从而裂解寡核苷酸与粒子的键联。或以其他方式可使得寡核苷酸从珠粒释放。在光或热刺激的情况下，热源或光源通过微流体通道中的开口引入至含有滴液的体腔。
对细胞的核酸或条形码序列可做各种识别、结合和扩增的反应。
对生成的核酸(如扩增产物)可做信号标记和检测相关信号。
如图2所示，本发明提供的示例性的微流控设备包括处理和分析单元200。所述处理和分析单元可选自以下装置或其任意组合：
加样装置，例如用于加入令细胞膜破裂或通透性增加的试剂，或是使得核酸条形码从粒子脱离的刺激剂，由此使得条形码粒子上的核酸片段可以与细胞的核酸接触和反应，包括识别和结合等；
光刺激装置，例如通过可释放寡核苷酸的光不稳定性键的裂解。热刺激装置，其中珠粒环境的温度升高可能会导致键联的裂解或寡核苷酸从珠粒的释放；
核酸扩增装置(其包括温度控制器等)，用于利用条形码粒子上的核酸片段对细胞的核酸进行扩增和建库；
信号识别装置；
信息分析装置等，包括处理单细胞的单个分析物(例如，RNA、DNA或蛋白质)或多种分析物(例如，DNA和RNA、DNA和蛋白质、RNA和蛋白质、或RNA、DNA和蛋白质)，实现例如对细胞的蛋白质组、转录组和基因组的分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于微流控设备的进样混匀单元，其用于对微流控设备的样品腔或流道内的样品溶液进行搅拌以保持样品中颗粒(如生物颗粒和/或条形码粒子)的分散状态，所述进样混匀单元包括设置在样品腔或流道底部的体声波谐振器。
2.如权利要求1所述的微流控设备的进样混匀单元，其中所述体声波谐振器输出体声波的功率为约0.1-5mW，优选为约0.5-2mW。
3.如权利要求1所述的微流控设备的进样混匀单元，其中所述进样混匀单元中所述体声波谐振器输出功率为脉冲式功率。
4.如权利要求1所述的微流控设备的进样混匀单元，其中所述体声波谐振器为超高频体声波谐振器，可在溶液内产生频率为约0.5-50GHz，优选为0.1-50GHz的体声波。
5.一种用于微流控设备的样品聚焦单元，例如为用于利用条形码粒子分析生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸)的微流控设备，所述样品聚焦单元包括：
流体通道，其具有溶液入口和出口；
超高频体声波谐振器，其设置于所述流体通道的底部，所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波；其中，所述超高频体声波谐振器发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生由超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边界限定的涡旋通道；其中所述微流道的结构和所述超高频体声波谐振器的体声波作用区域的形状和位置，配置为使得溶液样品中的颗粒(如生物颗粒和/或条形码粒子)在经过体声波区域时进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在指定位置离开涡旋通道进入下游通道，
优选的，其中所述体声波谐振器为超高频体声波谐振器，可在溶液内产生频率为约0.5-50GHz的体声波。
6.如权利要求5所述的样品聚焦单元，其中所述样品聚焦单元中所述超高频体声波谐振器输出体声波的功率为约20-5000mW，优选为50-2000mW，更优选为100-500mW。
7.一种用于利用条形码粒子分析生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸)的微流控设备，所述设备设置为将来自样品的单个生物颗粒与条形码粒子配对和形成其内包含配对的单个生物颗粒-条形码粒子的液滴；
其中，所述微流控设备包括以下单元：
生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装单元；其用于形成其内包含一个配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴；
以及以下单元中的一个或多个的组合：
如权利要求1-5中任一项定义的用于微流控设备的进样混匀单元；和/或
如权利要求6-16定义的用于微流控设备的样品聚焦单元，
优选的，
其中所述生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装单元设置为将来自样品的单个生物颗粒和条形码粒子分别形成其内包含所述生物颗粒或所述条形码粒子的液滴，然后将包含所述生物颗粒或所述条形码粒子的液滴配对和合并，由此形成内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴。
或者，
其中所述生物颗粒-条形码粒子配对和液滴封装单元设置为将来自样品的单个生物颗粒与条形码粒子配对，然后形成其内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴，例如将包含配对的生物颗粒-条形码粒子的第一液体(通常为水性溶液)与第二液体(通常为油)接触。
8.权利要求7的微流控设备，其中还包括处理和分析单元，所述处理和分析单元对包含在液滴内的单个配对的生物颗粒-条形码进行处理，例如使得生物颗粒的核酸与条形码接触并且条形码化，以及对包含在液滴内的单个生物颗粒的信息，特别是核酸信息进行分析。
9.一种采用如权利要求7或8所述微流控设备来利用条形码粒子分析生物颗粒(如细胞、微囊泡、生物大分子如核酸)的方法，其中将来自样品的单个生物颗粒与条形码粒子配对，和形成其内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴；
所述方法包括以下步骤：
进样混匀；例如，其中进样混匀步骤对样品腔内的生物样品溶液或条形码粒子溶液进行搅拌以保持生物颗粒和/或条形码粒子的分散状态。
样品聚焦；例如，其中样品聚焦步骤对流道中的生物颗粒或条形码粒子的运动进行调整，消除或减少在流道宽度方向的随机分布；
样品配对和液滴封装；使进入微流道的生物颗粒和条形码粒子形成其内包含一个配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴，例如，其中将来自样品的单个生物颗粒和条形码粒子分别形成其内包含所述生物颗粒或所述条形码粒子的液滴，然后将包含所述生物颗粒或所述条形码粒子的液滴配对和合并，由此形成内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴，或将来自样品的单个生物颗粒与条形码粒子配对，然后形成其内包含配对的生物颗粒-条形码粒子的液滴，例如将包含配对的生物颗粒-条形码粒子的第一液体(通常为水性溶液)与第二液体(通常为油)接触。
10.如权利要求9所述的方法，其中还包括处理和分析单元步骤，对包含在液滴内的单个配对的生物颗粒-条形码进行处理，例如使得生物颗粒的核酸与条形码接触并且条形码化，以及对包含在液滴内的单个生物颗粒的信息，特别是核酸信息进行分析。
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