CN114073700B - Iox1在自身免疫性疾病的预防和/或治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种IOX1在自身免疫性疾病的预防和/或治疗中的应用，特别是IOX1在Th17介导的体内炎症的控制中的应用。发明人筛选了用于Th1和Th17培养物中IFN‑γ和IL‑17表达的抑制剂的表观遗传化合物集中库，筛选确定出IOX1是CD4⁺ T细胞中IL‑17表达的有效抑制剂，还发现IOX1通过直接靶向TET2对Th17细胞中启动子的活性来抑制Il17a表达。发明人通过葡萄膜炎模型进一步证实IOX1通过调节Th17细胞的迁移和功能在体内发挥抗炎作用，可以有效控制Th17介导的体内炎症。

Description

IOX1在自身免疫性疾病的预防和/或治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及IOX1在自身免疫性疾病的预防和/或治疗中的应用，特别是IOX1在Th17介导的体内炎症的控制中的应用以及IOX1在眼部炎性疾病(如葡萄膜炎)的预防和/或治疗中的应用。

背景技术

CD4⁺T辅助性(Th)细胞在宿主防御病原体入侵中起到了至关重要的作用。然而，它们的异常激活却构成了许多自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、葡萄膜炎、多发性硬化症、牛皮癣、克罗恩氏疾病和I型糖尿病)的发病机理的基础。初始CD4⁺T细胞可以分化成以下功能性亚群，包括Th1、Th2、Th17、Treg、Tfh等。这一过程通过细胞外刺激触发的主转录调控因子的激活和表观基因组共同决定的染色质可接近性进行协同调控。尽管在过去的二十年中已经明确定义了用于详细说明Th的转录控制和表观遗传控制的多个关键步骤，但仍然亟需开发出可微调CD4⁺T细胞介导的炎症反应的治疗方法，以便治疗自身免疫性疾病。

炎性Th17细胞在几种自身免疫性疾病中起着关键性的免疫致病作用。因此，靶向Th17细胞同时介导这些细胞的分化和炎性功能的分子是一种用于治疗自身免疫疾病的可行疗法。靶向IL-17和IL-23的生物制剂(单克隆抗体)以及RORγt抑制剂已经在治疗某些疾病(如牛皮癣和类风湿性关节炎)方面显示出强大的功效，但对葡萄膜炎和克罗恩氏病等其他疾病是无效的。

自身免疫性葡萄膜炎(AU)是一种由自身免疫失衡等多种原因引起的常见难治性眼病,青壮年发病，在我国患者人数已逾500万，致盲率高达35％，已成为我国日益突出的重大致盲性眼病。患者表现为反复发作的眼局部炎症伴随全身组织器官炎性反应，严重影响正常生活，因此，医疗介入变得相当重要。在此阶段(或此阶段前)，常规临床治疗为激素配合免疫抑制剂，通过全身免疫机能抑制的方法治疗自身免疫性葡萄膜炎。目前常规的自身免疫性葡萄膜炎治疗药物容易在患者中产生不良副作用。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种通式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐、酯、前药、溶剂化物在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，

其中，R₁-R₅独立地选自：氢、取代或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、-COR₆、-C(O)OR₆、-C(O)NR₆R₇、-CH＝NR₆、-CN、-OR₆、-OC(O)R₆、-S(O)_t-R₆、-NR₆R₇、-NR₆C(O)R₇、-NO₂、-N＝C₁₆R₇和卤素；

t为0、1或2；

R₆和R₇独立地选自：氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基和卤素。

具体地，R_1-5独立地选自：氢、取代或未取代的烷基、卤素、-OR₆。

在本发明的一个实施例中，R₁为氢。

在本发明的一个实施例中，R₂为氢。

在本发明的一个实施例中，R₃为氢。

在本发明的一个实施例中，R₄为氢。

在本发明的一个实施例中，R₅为氢。

在本发明的一个实施例中，上述化合物为IOX1，其具有如下结构：

在本发明的一个实施方式中，上述自身免疫性疾病为Th17介导的自身免疫性疾病。

在本发明的一个实施方式中，上述自身免疫性疾病包括炎症，如体内炎症和/或体表炎症，特别是体内炎症。

在本发明的一个实施方式中，上述自身免疫性疾病为眼部炎性疾病。

在本发明的一个实施方式中，上述眼部炎性疾病为葡萄膜炎及其并发症。

具体地，上述葡萄膜炎可以为前葡萄膜炎、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎或全葡萄膜炎。

具体地，上述葡萄膜炎的并发症包括：带状角膜变性、白内障、黄斑部及视盘水肿、黄斑表面褶纹样改变、角膜水肿、青光眼、视网膜脱离等。

本发明还提供一种通式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐、酯、前药、溶剂化物在制备抗炎药物中的应用。

具体地，上述应用中，通式Ⅰ的化合物具有本发明上述相应定义。

具体地，炎症可以为非感染性炎症或感染性炎症，特别是非感染性炎症，例如自身免疫性疾病引起的炎症。

具体地，炎症可以为体内炎症和/或体表炎症，特别是体内炎症。

具体地，上述炎症为Th17介导的炎症。

在本发明的一个实施方式中，上述炎症为眼部炎症。

在本发明的一个实施方式中，上述眼部炎症包括葡萄膜炎。

本发明还提供一种通式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐、酯、前药、溶剂化物在制备预防和/或治疗眼部炎性疾病的药物中的应用。

具体地，上述应用中，通式Ⅰ的化合物具有本发明上述相应定义。

具体地，上述眼部炎性疾病可以为感染性眼部炎性疾病或非感染性眼部炎性疾病，特别是非感染性眼部炎性疾病，如自身免疫性眼部炎性疾病，特别是Th17介导的自身免疫性眼部炎性疾病。

在本发明的一个实施方式中，上述眼部炎性疾病为葡萄膜炎及其并发症。

具体地，上述葡萄膜炎为自身免疫性葡萄膜炎。

具体地，上述葡萄膜炎可以为前葡萄膜炎、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎或全葡萄膜炎。

具体地，上述葡萄膜炎的并发症包括：带状角膜变性、白内障、黄斑部及视盘水肿、黄斑表面褶纹样改变、角膜水肿、青光眼、视网膜脱离等。

在本发明上述应用中，上述通式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐、酯、前药、溶剂化物可以经全身给药，例如静脉注射、肌内注射、皮下注射、腹膜内注射等，也可以经局部施用，如眼内给药等。

在本发明上述应用中，上述通式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐、酯、前药、溶剂化物可被配制为以下形式的药物制剂：片剂(包括糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片、口腔片剂等等)、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊、微胶囊)、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、混悬剂、控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂、缓释制剂、缓释微囊)、气雾剂、膜剂(例如，口服崩解膜剂、口腔粘膜-粘附膜剂)、注射剂(例如，皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射)、静脉滴注剂、透皮吸收制剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂、栓剂(例如，直肠栓剂、***栓剂)、小药丸、鼻制剂、肺制剂(吸入剂)、眼睛滴剂等等，特别是注射剂。上述各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种辅料混合，然后将其制成所需的剂型。

在制备注射剂时，可以使用本领域内任何常用的载体，例如：水、乙醇、丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、聚乙氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可以加入常用的溶解剂和缓冲剂等。

具体地，上述药物制剂可以为单位剂型。在这种形式中，该制剂被再分成包含适当量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以是注射剂、眼睛滴剂或者任意剂型；另外，单位剂型也可以是包装好的制剂，诸如包装在小瓶或者安瓿中的注射剂、眼睛滴剂和粉剂等等。

在本发明的一个实施方案中，上述药物中，通式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐、酯、前药、溶剂化物为唯一活性成分。

在本发明的另一个实施方案中，上述药物中还包含第二活性组分，其用于预防和/或治疗与本发明相同疾病或其他疾病。

本发明还提供一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的通式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐、酯、前药、溶剂化物或本发明上述药物的步骤。

具体地，上述方法中，通式Ⅰ的化合物、自身免疫性疾病具有本发明上述定义。

在本发明的一个实施方案中，上述对象为哺乳动物，特别是人类。

本发明还提供一种预防和/或治疗眼部炎性疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的通式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐、酯、前药、溶剂化物或本发明上述药物的步骤。

具体地，上述方法中，通式Ⅰ的化合物、眼部炎性疾病具有本发明上述定义。

在本发明的一个实施方案中，上述对象为哺乳动物，特别是人类。

发明人通过使用体外培养***，筛选了用于Th1和Th17培养物中IFN-γ和IL-17表达的抑制剂的表观遗传化合物集中库，筛选确定出IOX1是CD4⁺T细胞中IL-17表达的有效抑制剂，此外，还发现IOX1通过直接靶向TET2对Th17细胞中启动子的活性来抑制Il17a表达。发明人使用两种葡萄膜炎模型做进一步的分析，证实IOX1通过调节Th17细胞的迁移和功能在体内发挥抗炎作用，IOX1可以作为Th17介导的体内炎症，如眼部炎性疾病(如葡萄膜炎)的有效治疗剂。

附图说明

图1所示为靶向辅助性T细胞的抗炎分子的“表观遗传化合物库”的筛选。(A)将IOX1确定为Th17细胞抑制剂的体外化合物筛选和体内确认过程的示意图。(B)左图：在低剂量或高剂量药物处理后，Th1、Th17和iTreg细胞中细胞因子(IFN-γ和IL-17)和Foxp3阳性细胞频率的倍数变化的分层聚类；右图：在低剂量或高剂量药物处理后，Th1、Th17和iTreg细胞的活力变化的分层聚类。样品号：筛选中使用的每种药物剂量的重复样品。

图2所示为通过筛选过程确定的五种化合物的抗炎作用的确认。(A)在经五种候选药物处理后，经OVA刺激的OTII Th1培养物中IFN-γ⁺细胞的频率。(B)在经五种候选药物处理后，经OVA刺激的OTII Th17培养物中IL-17⁺细胞的频率。在经低、中、高剂量的五种候选药物的处理后，人CD4+T细胞培养物中IFN-γ⁺(C)和IL-17⁺(D)细胞的频率。

图3所示为IOX1对鼠类和人CD4⁺T细胞的体外作用。(A)IOX1的结构图示。(B)在经各种剂量的IOX1处理后，在衍生自大部分外周CD4⁺T细胞的鼠类Th1和Th17培养物(由抗CD3/CD28抗体刺激)中，IFN-γ和IL-17在72小时中的代表性FACS染色。鼠类Th1(C)和Th17(D)(由抗CD3/CD28抗体刺激)培养物中IFN-γ⁺和IL-17⁺细胞频率总结(在每种情况下N＝6)。(E)在经各种剂量的IOX1处理后，由抗CD3/CD28包被的微珠刺激的外周人CD4⁺T细胞中的IFN-γ、IL-17和CFSE在第5天的代表性FACS染色。(F)在经IOX1处理后，由抗CD3/CD28包被的微珠刺激的人CD4⁺T细胞中IFN-γ⁺和IL-17⁺细胞频率总结(在每种情况下N＝6)。Mann-Whitney U检验的显著性水平用星号表示(*P<0.05，**P<0.01)。

图4所示为IOX1在48小时、72小时和96小时培养物(A)中以剂量依赖性方式抑制鼠类Th1和Th17的极化，不影响Th1(B-C)培养物和Th17(D-E)培养物中的细胞活力和增殖。

图5所示为IOX1抑制Th1和Th17的极化。(A)在经各种剂量的IOX1处理后，初始衍生的鼠类Th1和Th17培养物(由抗CD3/CD28抗体刺激)中IFN-γ和IL-17在72小时中的代表性FACS染色。(B)在鼠类Th1和Th17(由抗CD3/CD28抗体刺激)培养物中IFN-γ⁺和IL-17⁺细胞频率的总结(在各种情况下N＝5)。在经各种剂量的IOX1处理后，初始衍生Th1和Th17培养物中在第72小时的细胞活力(C)和增殖(D)(E)在经各种剂量的IOX1处理后，OTII Th1和Th17培养物(由OVA刺激)中的IFN-γ和IL-17在72小时中的代表性FACS染色。Mann-Whitney U检验的显著性水平用星号表示(**P<0.01)。

图6所示为Th17细胞中IOX1调控的基因程序。(A)在火山图中示出了在经IOX1处理后DEG至少变化了两倍，P<0.05。(B)使用IPA分析IOX1诱导的DEG中富集的途径。(C)使用IPA分析IOX1诱导的DEG的潜在上游调节因子。在第72小时收集Th17细胞。进行CETSA，分析IOX1与JMJD3、KDM3A、KEM4E(D)之间以及IOX1与TET2、TET3(E)之间的潜在缔合。红色矩形突出显示了在TET2的CETSA中确定的变化。

图7所示为IOX1通过与Il17a启动子上的TET2直接缔合直接调节Il17a的表达。(A)使用重亚硫酸盐测序分析鼠类Th17细胞中Il17a近端启动子上的CpG位点来测定DNA甲基化状态。CpG位点的编号为1至12。对来自四个独立实验的共计36个克隆进行测序。发现CpG位点#7和#8的甲基化状态在经DMSO和IOX1处理的Th17细胞之间存在统计学差异(Fisher精确检验，*P<0.05)。(B)Il17a启动子上脱甲基CpG位点频率总结。(C)通过ChIP测定，在经IOX1处理后TET2与II17a启动子的CpG-5和CpG-6-8位点结合。(D)通过Chem-IP测定，在经IOX1处理后IOX1与Il17a启动子的CpG-5和CpG-6-8位点结合。(E)在IOX1(20μM)的作用下WT(CD4^Cre)和TET2缺陷型(CD4^CreTet2^f/f)Th17细胞中IL-17表达的代表性FACS分析。(F)在WT(CD4^Cre)和TET2缺陷型(CD4^CreTet2^f/f)Th17细胞中IOX1诱导的IL-17抑制的总结(N＝3)。(G)在WT(CD4^Cre)和TET2缺陷型(CD4^CreTet2^f/f)Th17细胞中由IOX1诱导的IL-17⁺细胞频率的抑制倍数(N＝3)。Mann-Whitney U检验的显著性水平用星号表示(*P<0.05，**P<0.01)。

图8所示：(A)生成用于Chem-IP分析的生物素化IOX1的示意图。(B)在WT(CD4^Cre)(N＝4)和TET2缺陷型(CD4^CreTet2^f/f)(N＝3)Th17细胞中IOX1诱导的CCL20表达抑制(在培养物上清液中，通过ELISA测得)总结。(C)在WT(CD4^Cre)(N＝4)和TET2缺陷型(CD4^CreTet2^f/f)(N＝3)Th17细胞中IOX1诱导的对CCL20表达的抑制。Mann-Whitney U检验的显著性水平用星号表示(*P<0.05)。

图9所示为IOX1对鼠类EAU的影响。(A)免疫后13天接受DMSO或IOX1(12.5mg/kg，每天两次)处理的小鼠体重(对于每只经DMSO和IOX1处理的小鼠，N＝10)。(B)示出免疫后第7、9、11和13天眼部炎症的严重程度的代表性眼底照片和OCT。(C)EAU临床评分总结(对于每只经DMSO和IOX1处理的小鼠，N＝10)。(D)视网膜细胞的代表性FACS染色。(E)视网膜CD45⁺CD4⁺细胞的数量。(F)每个视网膜组织的所有活细胞中的视网膜CD45⁺CD4⁺细胞的频率。(G)每个视网膜组织的所有活细胞中的视网膜CD45⁺CD4⁺IL-17⁺细胞的频率。(H)每个视网膜组织的所有活细胞中的视网膜CD45⁺CD4⁺IFN-γ⁺细胞的频率。(I)每个视网膜组织的所有活细胞中视网膜CD45⁺CD4⁺IL-17⁺IFN-γ⁺细胞的频率。(对于每只经DMSO和IOX1处理的小鼠，N＝10)。Mann-Whitney U检验的显著性水平用星号表示(*P<0.05，**P<0.01)。

图10所示为免疫后第14天IOX1对典型鼠类EAU模型***中CD4⁺T细胞的影响。(A)眼睛引流***的代表性FACS染色。眼睛引流***的所有活细胞中的CD45⁺CD4⁺(B)、CD45⁺CD4⁺IL-17⁺(C)、CD45⁺CD4⁺IFN-γ⁺(D)和CD45⁺CD4⁺IL-17⁺IFN-γ⁺(E)细胞的频率。(F)腹股沟***的代表性FACS染色。腹股沟***的所有活细胞中的CD45⁺CD4⁺(G)、CD45⁺CD4⁺IL-17⁺(H)、CD45⁺CD4⁺IFN-γ⁺(I)和CD45⁺CD4⁺IL-17⁺IFN-γ⁺(J)细胞的频率。(K)脾脏的代表性FACS染色。每个脾脏的所有活细胞中的CD45⁺CD4⁺(L)、CD45⁺CD4⁺IL-17⁺(M)、CD45⁺CD4⁺IFN-γ⁺(N)和CD45⁺CD4⁺IL-17⁺IFN-γ⁺(O)细胞的频率。(对于每只经DMSO和IOX1处理的小鼠，N＝7)。Mann-Whitney U检验的显著性水平用星号表示(*P<0.05)。

图11所示为IOX1对过继转移的CD4⁺T细胞诱导的眼内炎症的影响。(A)用经IOX1或DMSO处理的过继转移的CD4⁺T细胞生成EAU小鼠的示意图。(B)示出细胞转移后第5、7、9、和11天眼部炎症的严重程度的代表性眼底照片和OCT。(C)EAU临床评分总结(对于每只经DMSO和IOX1处理的小鼠，N＝10)。(D)视网膜细胞的代表性FACS染色。(E)视网膜CD45⁺CD4⁺细胞的数量。(F)每个视网膜组织的所有活细胞中的视网膜CD45⁺CD4⁺细胞的频率。(G)每个视网膜组织的所有活细胞中的视网膜CD45⁺CD4⁺IL-17⁺细胞的频率。(H)每个视网膜组织的所有活细胞中的视网膜CD45⁺CD4⁺IFN-γ⁺细胞的频率。(I)每个视网膜组织的所有活细胞中视网膜CD45⁺CD4⁺IL-17⁺IFN-γ⁺细胞的频率。(对于每只经DMSO和IOX1处理的小鼠，N＝10)。Mann-Whitney U检验的显著性水平用星号表示(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。

图12所示为胞转移后第10天IOX1对过继转移的鼠类EAU模型***中的CD4⁺T细胞的影响。(A)眼睛引流***的代表性FACS染色。眼睛引流***的所有活细胞中的CD45⁺CD4⁺(B)、CD45⁺CD4⁺IL-17⁺(C)、CD45⁺CD4⁺IFN-γ⁺(D)和CD45⁺CD4⁺IL-17⁺IFN-γ⁺(E)细胞的频率。(F)腹股沟***的代表性FACS染色。腹股沟***的所有活细胞中的CD45⁺CD4⁺(G)、CD45⁺CD4⁺IL-17⁺(H)、CD45⁺CD4⁺IFN-γ⁺(I)和CD45⁺CD4⁺IL-17⁺IFN-γ⁺(J)细胞的频率。(K)脾脏的代表性FACS染色。每个脾脏的所有活细胞中的CD45⁺CD4⁺(L)、CD45⁺CD4⁺IL-17⁺(M)、CD45⁺CD4⁺IFN-γ⁺(N)和CD45⁺CD4⁺IL-17⁺IFN-γ⁺(O)细胞的频率。(对于每只经DMSO和IOX1处理的小鼠，N＝7)。Mann-Whitney U检验的显著性水平用星号表示(*P<0.05)。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

在本发明的内容中，以下术语具有如下详述的含义。

术语“烷基”指的是直链或支链的且不含不饱和键的烃链自由基，且该烃链自由基以单键与分子其它部分连接。典型的烷基基团含有1至12个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个)、1至8个、1至6个或者1至3个碳原子，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基等。如果烷基被环烷基取代，其相应为“环烷基烷基”，如环丙基甲基。如果烷基被芳基取代，那么其相应为“芳烷基”，如苄基、二苯甲基或苯乙基。如果烷基被杂环基取代，那么其相应为“杂环基烷基”。

术语“烯基”指的是至少含两个碳原子、至少一个不饱和键的直链或支链的烃链自由基，且该烃链自由基以单键与分子其它部分连接。典型的烯基基团含有2至12个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个)、2至8个、2至6个或2至4个碳原子。在具体实施方式中，烯基基团为乙烯基、1-甲基-乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基或丁烯基。

术语“环烷基”指的是脂环烃。典型的环烷基含1至4个单环和/或稠环、含3至18个碳原子，优选3至10个(例如3、4、5、6、7、8、9、10个)碳原子，如环丙基、环己基或金刚烷基。在具体实施方式中，环烷基含3至约6个碳原子。

术语“芳基”指的是单环或多环自由基，包括含单芳基基团和/或稠芳基基团的多环自由基。典型的芳基基团包含1至3个单环或稠环及6至约18个碳环原子，优选6至约14个(例如6、8、10、12、14个)碳环原子，如苯基、萘基、联苯基、茚基、菲基或蒽基。

术语“杂环基”包括含1至3个单环和/或稠环及3至18个环原子的杂芳香族基团和杂脂环基团。优选的杂芳香族基团和杂脂环基团含5至10个(例如5、6、7、8、9、10个)环原子。本发明的化合物中的合适的杂芳基含1、2或3种杂原子，所述杂原子选自N、O或S原子。杂芳基包括，例如，香豆素，包括8-香豆素、喹啉基，包括8-喹啉基、异喹啉基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、***基、四唑基、异恶唑基、恶唑基、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、恶二唑基、噻二唑基、呋吖基、哒嗪基、三嗪基，噌啉基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋吖基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并恶唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。本发明的化合物中的合适的杂脂环基团含1、2或3种杂原子，其中杂原子选自N、O或S原子，杂脂环基团包括，例如，吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃、四氢噻吩基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、氧硫杂环己烷基、哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基、吖庚因基、氧氮杂环庚基基、二吖庚因基、三吖庚因基、1,2,3,6-四氢吡啶基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基，二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂环己烷基、1,3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基、3H-吲哚基和喹嗪基。

术语“卤素”或“卤基”是指溴代、氯代、碘代或氟代。

术语“盐”应理解为根据本发明通式Ⅰ的化合物的任意形式，其中该化合物为离子形式或者为带电荷的且与带相反电荷的离子(阳离子或阴离子)耦合或在溶液中。该定义还包括季铵盐和该分子与其它分子和离子的复合物，特别是通过离子相互作用形成的复合物。

术语“酯”应理解为酸与本发明通式Ⅰ的化合物的羟基反应生成的化合物。

术语“溶剂化物”应理解为是指本发明的化合物的任意形式，其中该化合物通过非共价键与另一个分子相连(通常为极性溶剂)，特别是包括水化物和醇化物，例如甲醇化物。

术语“前药”使用其广义含义，并涵盖在体内可转化成本发明化合物的衍生物。前药的例子包括但不限于式(I)中的化合物的衍生物和代谢物，包括可生物水解的部分，如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸酯类似物。优选地，具有羧基官能团的前体药物为羧酸的低级烷基酯。所述的羧酸酯易由存在于分子中的任何羧酸部分进行酯化得到。前药通常可由已知方法来制备，如在Burger“Medicinal Chemistry and Drug Discovery第六版(Donald J.Abraham ed.，2001，Wiley)和“Design and Applications of Prodrugs”(H.Bundgaard ed.，1985，Harwood Academic Publishers)中描述的方法。

术语“自身免疫性疾病”是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。自身免疫性疾病是对自身抗原的不适当和过度反应的结果。自身免疫疾病的实例包括，但不限于，阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(1型)、营养不良性大疱性表皮松解症、***、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、***性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。

术语“炎症(inflammation)”即平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍；其可以为感染引起的感染性炎症，也可以为不是由于感染引起的非感染性炎症，例如免疫反应引起的炎症(如各种类型的超敏反应、一些自身免疫性疾病引起的炎症)。炎症病变可以发生在体表和/或体内。

术语“眼部炎性疾病(OID)”为包括其中炎症侵袭眼睛或周围组织的多种疾病和病症的通用术语。通常，基于眼部炎症的位置给出OID的诊断名称，例如，葡萄膜炎为葡萄膜的炎症，巩膜炎为巩膜的炎症，睫状体平坦部炎(pars planitis)为睫状体扁平部(parsplana)的炎症等。OID的病因可分为感染性和非感染性，其中，感染性OID是指由细菌、病毒、真菌、立克次体、寄生虫等病原体感染所致；非感染性又可分为外源性和内源性，其中外源性OID主要包括由外伤、手术等物理性损伤、酸碱及药物等化学性损伤所致，血-眼屏障破坏和血管通透性增加所致；内源性OID主要是由于自身免疫反应所致。OID经常是全身性自身免疫性疾病的一种表现形式。

术语“葡萄膜炎”又称色素膜炎，是虹膜、睫状体及脉络膜组织炎症的总称。按发病部位可分为前葡萄膜炎、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、全葡萄膜炎；其中，前葡萄膜炎包括虹膜炎、前部睫状体炎、虹膜睫状体炎；后葡萄膜炎炎症累及玻璃体膜以后的脉络膜、视网膜组织；中间葡萄膜炎炎症累及睫状体平坦部、周边部视网膜、玻璃体基部；全葡萄膜炎指前葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、后葡萄膜炎的混合型。“急性”葡萄膜炎是其中突然发生体征和症状并持续高达约六周的一种形式的葡萄膜炎。“慢性”葡萄膜炎是其渐渐起病并持续超过约六周的较长时间的一种形式。

葡萄膜炎的临床表现主要包括：眼睛发红、眼痛、畏光、流泪、视物模糊、视力减退、眼前黑影飘动、视物变形等，甚至出现视力完全丧失。葡萄膜炎可引起多种并发症，常见并发症有带状角膜变性、白内障、黄斑部及视盘水肿、黄斑表面褶纹样改变、角膜水肿、青光眼、视网膜脱离等。

术语“药学上可接受的”，表示考虑到待治疗的疾病以及相应的施用途径，所指出的材料不具有引起合理谨慎的医师避免将该材料施用于患者的性质。例如，通常要求这种材料基本上是无菌的。

术语“治疗”是指在疾病发作之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病的一种或多种临床症状。

术语“预防”指在疾病发作之前，通过治疗以避免、最小化或令疾病难于发作或发展。

术语“患者”或“对象”等等在本文中可交换使用，是指根据本文所述的方法治疗的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。具体地，前述动物包括哺乳动物，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴子或人类，特别是人类。

术语“有效量”是指提供治疗性或预防性益处的量，其包括以下的化合物的量：当被施用时，其足以预防治疗的疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的疾病的迹象或症状中的一个或多个。“有效量”将根据化合物、疾病及其严重性、和待治疗的对象的年龄、体重等因素而变化。

本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中所用材料和方法如下：

材料

含有128种化合物的表观遗传化合物库(分类号L1900)购自美国Selleck。所有化合物最初均置于DMSO溶液中(储备浓度为10mM)，并根据每个实验中的说明进一步稀释为工作溶液。用于细胞培养的鼠类抗CD3、抗CD28、抗IL-4和抗IFN-γ抗体购自美国eBioscience。用于FACS分析或分选的鼠类抗IL-17、抗IFN-γ、抗CD3、抗CD4、抗CD44和抗CD62L抗体购自美国Biolegend。用于FACS的人抗IL-17、抗IFN-γ抗体购自美国Biolegend。重组鼠类mIL-2购自美国PeproTech。重组鼠类mIL-6、mIL-12和重组人hTGF-β1购自美国R&D Systems。抗TET2(分类号45010)、抗TET3(ab139311)、抗JMJD3(分类号3457)、抗KDM3A(分类号12835-1-AP)和抗KDM4E(分类号TA337374)抗体购自美国中部Merck、英国Abcam、美国Proteintech、美国OriGene。

小鼠

雌性C57BL6/J、B10.RIII或OT-II(8-10周)小鼠购自英国Charles River或广东省医学实验动物中心(中国)。CD4^CreTet2^f/f小鼠是来自上海交通大学陈国强教授的礼物。所有动物均被安置在布里斯托尔大学、中山眼科中心或中山大学癌症中心的SPF设施中。所有动物实验均已获得布里斯托尔大学、中山眼科中心或中山大学癌症中心的机构动物护理和使用委员会的批准。所有动物相关工作均按照《ARVO关于眼科和视力研究中动物使用声明》进行。

鼠类CD4⁺T细胞培养

解剖鼠类***和脾脏并将其处理成单细胞悬浮液。根据制造商的说明，使用CD4(L3T4)微珠(Miltenyi Biotec，德国)分离出总CD4⁺T细胞。或者，使用BD Aria分选仪对CD62L⁺CD44^-初始CD4⁺T细胞进行FACS分选。获得的CD4⁺T细胞的纯度大于95％。将分离的CD4⁺T细胞接种到预先涂有5μg/ml抗CD3和2μg/ml抗CD28的96孔板(10万个细胞/孔)中。在以下条件下对辅助性T细胞进行极化处理：Th1(20ng/ml mIL-12和100ng/ml抗IL-4)，Th17(20ng/ml mIL-6、1ng/ml hTGF-β1、100ng/ml抗IL-4和100ng/ml抗IFN-γ)和iTreg(50ng/mlmIL-2和10ng/ml hTGF-β1)所有细胞在37℃含有5％CO₂的加湿培养箱中，用含有10％FCS、Pen/Strep和2-巯基乙醇的RPMI-1640进行培养。在筛选实验中，在细胞极化开始时，将128种表观遗传化合物添加到培养物中，其中浓度由公布的数据或初步实验确定。在OTII实验中，收集来自57BL6/J小鼠的脾细胞并辐照成APC；分离来自57BL6 OT-II Tg小鼠的CD4⁺T细胞，并在极化培养条件(Th1：4ng/ml mIL-12和4μg/ml抗IL-4mAb；Th17：4μg/ml抗IL-4mAb、1.2ng/ml hTGF-β、4ng/ml mIL-6，2ng/ml mIL-1α、4μg/ml抗IL-12mAb和8μg/ml抗IFN-γmAb)和OVA肽(2μg/ml)下，用APC(1CD4：10APC)进行接种。

人外周血CD4⁺T细胞的分离与处理

在根据国家卫生服务研究伦理委员会批准的方案获得知情同意后，在英国布里斯托尔大学医院信托基金会(04/Q2002/84)从健康对照(HC)(N＝6；5名女性和1名男性；平均年龄为32.83岁)的外周血中进行阴性选择，获得CD4⁺T细胞。从所有研究参与者获得书面知情同意书。根据制造商的说明，将最多80ml的未凝结的外周血与RosetteSep人CD4⁺T细胞富集混合物(STEMCELL Technologies，加拿大)和Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，美国)一起温育，获得CD4⁺T细胞。通过密度梯度去除富集的CD4⁺T细胞，并在补充有10％胎牛血清(Gibco，美国)的RPMI-1640(Thermofisher，美国)中洗涤。人CD4⁺T细胞的纯度大于95％。

用免疫磁珠人T激活剂CD3/CD28(Gibco，美国)刺激CD4⁺T细胞，并接种在含或不含DMSO的96孔微孔板(10万个细胞/孔)中，或在完整的RPMI1640培养基中指示IOX1浓度。在第5天获取之前，用PMA和离子霉素刺激细胞4小时，进行增殖和细胞内细胞因子染色分析。

流式细胞术

使用LIVE/DEAD可固定死细胞燃料试剂盒(Thermofisher Scientific，美国)排除死细胞。在FACS分析中，使用FcγRII/III(24G2；上清液)阻断非特异性抗体结合。将细胞与抗细胞表面标志物的一抗一起温育，然后使用如前所述的方案进行细胞内细胞因子染色(Zou,Y.et al.The DNA Methylation Inhibitor Zebularine Controls CD4(+)T CellMediated Intraocular Inflammation.Frontiers in immunology 10,1950,doi:10.3389/fimmu.2019.01950(2019))。所有样品都使用BD LSR II或BD LSR Fortessa X-20(BD Bioscience，美国)流式细胞仪进行分析，并使用FlowJo v10(Tree Star Inc.，美国)对FCS数据进行分析。

RNA测序分析

根据制造商的说明，用MasterPure Complete DNA和RNA纯化试剂盒(Epicentre，英国)从经IOX1或DMSO处理的Th17细胞(N＝2)中提取总RNA。使用Bioruptor PLUS(Diagenode，比利时)，将共计100ng RNA超声处理成具有300-400个碱基对的片段。根据制造商的方案，使用用于Illumina的VAHTS mRNA-seq V3文库制备试剂盒(Vazyme，中国南京)制备mRNA库，并使用HiSeq SR簇试剂盒V4和HiSeq SBS试剂盒V4 50周期试剂盒，在Illumina HiSeq2500测序仪上进行测序(Illumina)。初始处理通过CASAVA(v1.8.2)进行。然后通过FastQC(v0.11.5)，完成对测序读数的质量控制，并通过Cutadapt(v1.9.1)进行修整。然后，使用DEseq2对质量控制的读数进行差异表达基因(DEG)分析，并使用IngenuityPathway Analysis(IPA)进行路径分析。

酶联免疫吸附测定法(ELISA)

在72小时中，从经DMSO或IOX1(20μM)处理的Th17细胞培养物中收集上清液，并根据制造商的说明用CCL20 ELISA试剂盒(分类号ab100728，Abcam，美国)进行分析。

重亚硫酸盐测序

使用Epicenter MasterPure纯化试剂盒(EpiCenter，美国)，从培养的Th17细胞中提取DNA；然后根据制造商的说明，用EpiTect重亚硫酸试剂盒(Qiagen，德国)进行转化。转化后，将DNA纯化并洗脱到20μl洗脱缓冲液中。对Il17a启动子序列进行PCR扩增、TA克隆，并对30多个克隆进行测序。使用以下引物对：重亚硫酸盐-F：TAAATATTAATAGGTTTTTTGATAATATGT；重亚硫酸盐-R：AATAAAA-CTCTCCCTAAACTCATATTTA。

染色体免疫沉淀法(ChIP)

使用ChIP-IT试剂盒(Active Motif，美国)进行ChIP分析。简言之，在室温下，将经IOX1或DMSO处理的Th17细胞用含有1％甲醛的固定缓冲液固定15分钟。然后，使用Bioruptor PLUS(Diagenode，比利时)提取核DNA-蛋白复合物并对其进行超声处理。将样品与抗TET2抗体一起在4℃下温育过夜。然后，通过蛋白G琼脂糖微珠捕获抗体-DNA复合物。然后，通过实时PCR对免疫沉淀的DNA进行纯化和定量。使用以下引物对：CpG-6-8-F：TCTGCCCTTCCCATCTAC；CpG-6-8-R：TCCCTGGACT-CATGTTTG；CpG-5-F：TGCTCTCTAGCCAGGGAA；CpG-5-R：ATGGGAAGGGC-AGAAGTT。

细胞热转移分析(CETSA)

CETSA按照前述方式进行(Jafari,R.et al.The cellular thermal shift assayfor evaluating drug target interactions in cells.Nature protocols 9,2100-2122,doi:10.1038/nprot.2014.138(2014))。简言之，分离出总CD4⁺T细胞并在Th17条件下极化3天。在获取前4小时，将IOX1(20μM)添加到培养物中。收获后，在室温下将细胞在PBS中洗涤两次，并在200μl PCR管中将其重悬于含有蛋白酶抑制剂的PBS中。然后，将细胞加热至不同温度后置于液氮中速冻。然后，将从经处理的细胞中提取的蛋白质加载到Bio-RadMini-PROTEAN Tetra***中的7.5％15孔微型凝胶上，并使用针对JMJD3、KDM3A、KDM4E、TET2和TET3的抗体进行分析。

Chem-IP-PCR分析

该方法是基于Anders等人之前的研究(Anders,L.et al.Genome-widelocalization of small molecules.Nature biotechnology 32,92-96,doi:10.1038/nbt.2776(2014))。简言之，由Dangang Peptides Inc.(中国)合成生物素化的IOX1。使用液相色谱-质谱仪和核磁共振对产物进行验证。分离出总CD4⁺T细胞并在Th17条件下极化3天。在收获细胞前3小时，将20μM IOX1-生物素或20μM生物素添加到Th17细胞中。然后，在室温下，将细胞用含有1％甲醛的固定缓冲液固定15分钟，并通过添加5分钟终止缓冲液来终止固定。使用Bioruptor PLUS(Diagenode，比利时)进行超声处理，然后将所有样品与链霉亲和素微珠(MyOne链霉亲和素T1，Invitrogen)一起在4℃下温育过夜，用含有0.1％BSA的PBS洗涤，并用上述ChIP试剂盒中的洗脱缓冲液在70℃下洗脱。然后，通过实时PCR对免疫沉淀的DNA进行纯化和定量。

实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)

在第0天，用100μL重组人光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)肽(161-180)(1mg/mL)，沿大腿对B10.RIII小鼠皮下免疫，所述重组人光感受器间类视黄醇结合蛋白肽以1：1(v：v)的比率在含有2.5mg结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)完整H37Ra(BDBiosciences)的完全弗氏佐剂中乳化。免疫后，每只小鼠腹膜内注射1μg百日咳博代氏杆菌毒素(Tocris Bioscience)。从第0天到第13天，每天两次腹膜内给予IOX1(12.5mg/kg)或DMSO溶液。在第14天，处死所有小鼠进行分析。为了评估EAU的临床评分，我们用Micron III鼠类底照相机(Phoenix Research Labs，美国)并同时进行光谱-光学相干断层摄影(OCT)扫描进行局部内窥镜眼底成像(TEFI)。临床评分是由两名富有经验的独立观察员根据之前描述的EAU评分标准以盲评的方式给出的(Copland,D.A.et al.The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopicfundal imaging with histologic and cellular infiltratecorrelation.Investigative ophthalmology&visual science 49,5458-5465,doi:10.1167/iovs.08-2348(2008)；Chu,C.J.et al.Assessment and in vivo scoring ofmurine experimental autoimmune uveoretinitis using optical coherencetomography.PloS one 8,e63002,doi:10.1371/journal.pone.0063002(2013))。

CD4⁺T细胞过继转移诱发的葡萄膜炎

以上述方式在供体小鼠中诱导EAU。在第11天，从供体小鼠中获取脾脏和***，并将其制成单细胞悬浮液。在补充有20ng/ml鼠类IL-23和10μg/ml hIRBP161-180肽的25ml完整RPMI1640培养基中培养约7.5x 10⁶个细胞/烧瓶。24小时后，向培养物中添加10ml含有鼠类IL-2的新鲜培养基(终浓度为10ng/ml)。72小时后，使用CD4(L3T4)微珠(MiltenyiBiotec，德国)分离出破裂的CD4⁺T细胞。共计将200万CD4⁺T细胞(在200μl PBS中)腹膜内过继转移到每只初始受体小鼠内。以上述方式评估EAU的临床评分。

统计

使用Prism Graphpad 7.0(GraphPad Software，美国)进行统计分析。相应地使用Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验或双向ANOVA检验。

实施例1：体外CD4⁺T细胞中IFN-γ和IL-17A抑制剂的表观遗传化合物库的筛选

发明人在以往的研究中发现，表观遗传调控在CD4⁺T细胞分化中起到了关键性的作用。为了对表观遗传机制的哪些分子成分可进行直接操控进行***性评估从而实现对辅助性T细胞中炎症细胞因子表达的最佳控制，发明人筛选出市售的“表观遗传化合物库”(2015年购自Selleck)并对其在Th1、Th17和Treg细胞的增殖和分化中的潜在作用进行研究。该化合物库收集了128种表观遗传酶和信号分子抑制剂，包括组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)、JAK、组蛋白脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶(HATs)、DNA和甲基转移酶(Dnmts)(如图1A所示)。首先使用鼠类Th1、Th17和诱导型Treg(iTreg)培养***筛选这128种化合物对Th细胞分化和活力的影响(如图1A所示)。基于相关文献中的先前应用或发明人在鼠类Th细胞培养中获得的初步结果，为每种化合物选择两种剂量(即低剂量和高剂量)(如表1所示)。进行了4000多次培养，针对Th1、Th17和iTreg细胞对所有这128种化合物的反应进行表征。分别使用通过FACS染色检测到的标志性细胞因子IFN-γ和IL-17及转录因子Foxp3，作为Th1、Th17和iTreg的分化标记。如图1B所示，11种化合物(即选择性极光激酶A抑制剂Alisertib)在高剂量下被发现在Th1培养物中将IFN-γ⁺细胞的频率提高至少2倍，而52种化合物(即JAK2抑制剂CEP-33779)被发现在Th1培养物中将IFN-γ⁺细胞的频率降低至少2倍。另一方面，10种化合物(即PARP抑制剂AZD2461)在高剂量下被发现在Th17培养物中将IL-17⁺细胞的频率提高至少2倍，而42种化合物(即含溴区结构域的蛋白抑制剂Molibresib)被发现在Th17培养物中将IL-17⁺细胞的频率降低至少2倍。所测试的所有化合物均无法促进iTreg细胞中Foxp3表达。重要的是，在Th1(52)和Th17(42)分化的那些抑制剂中，发明人发现约62％的抑制剂导致明显的细胞死亡(至少使细胞活力降低20％)。因此，结果表明，在表观遗传药物的作用下，对Th1和Th17细胞中关键炎性细胞因子表达的抑制作用通常伴随着细胞活力的降低。

接下来，发明人选择五种抑制Th1细胞中IFN-γ表达和Th17细胞中IL-17表达但不会影响T细胞活力的化合物，包括INO-1001、AZD1208、IOX1、OTX015和Tubastatin A。使用采用抗原特异性OVA刺激的OTII***的Th1和Th17培养物以及健康志愿者的外周血总CD4⁺T细胞，用于检查这5种候选化合物是否仍然能够控制IFN-γ和IL-17的体外表达。如图2A-B所示，这五种化合物均未抑制Th1细胞中的IFN-γ表达，而IOX1和OTX015抑制了Th17细胞中的IL-17表达。而且，在高剂量的AZD1208、IOX1和OTX015的刺激作用下，在Th1和Th17细胞中观察到对IFN-γ和IL-17的抑制作用(如图2C-D所示)。这些数据表明，IOX1和OTX015可以作为Th1和Th17分化的候选抑制剂。

表1表观遗传化合物库的化合物及其高、低剂量

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实施例2：IOX1抑制CD4⁺T细胞中的IL-17体外表达

由于OTX015的体内抗炎作用有限(数据未示出)，发明人将进一步的研究集中在IOX1上，IOX1是2OG加氧酶的强效广谱抑制剂，包含JmjC脱甲基酶和DNA脱甲基酶。除了筛选试验外，发明人还进一步检查了在经过48小时、72小时和96小时培养后，两种不同剂量的IOX1对Th1和Th17细胞中IFN-γ和IL-17表达的抑制作用(如图3B-D和图4A-E所示)。结果表明，IOX1优先控制Th17分化，不会改变体外CD4⁺T细胞总培养物中T细胞的活力和增殖。使用初始T细胞衍生的Th1和Th17培养物进一步证实了这些结果(如图5A-D所示)。此外，使用OVA刺激的OT-II细胞***时，发明人发现IOX1仅抑制抗原特异性Th17分化，不会影响Th1分化(如图5E所示)。有趣的是，在人CD4⁺T细胞培养物中，IOX1对细胞因子表达和细胞增殖均显示出显著的抑制作用(图3E-F)。研究结论是：IOX1对辅助性T细胞(优选对体外Th17细胞)具有抗炎作用。

实施例3：IOX1通过靶向TET2蛋白来抑制Il17a表达

为了探索IOX1对Th17细胞的总体影响，发明人进行了RNA序列分析以剖析IOX1在Th17细胞中诱导的全基因组表达变化。如火山图(如图6A所示)所示，在Th17细胞中，IOX1显著下调了36个基因的表达(P<0.05，倍数变化>2)，而仅上调了7个基因的表达(如表2所示)。Th17标志性细胞因子Il17a和Ccl20的表达均明显受到IOX1的抑制(如图6A所示)。然而，在IOX1的作用下，并未发现促进Th17分化的转录因子(如Rorc、Rora、Stat3或Irf4)出现任何变化。使用Ingenuity Pathway Analysis程序进行进一步的基因本体分析，结果表明，43个IOX1反应基因明显富集了IL-17A信号传导和炎症小体等途径(如图6B所示)，而各种上游调节因子可以负责IOX1反应基因的调控(如图6C所示)。因此，转录组学分析表明，IOX1可以仅对Th17细胞中的关键细胞因子表达抑制作用。

表2 IOX1在Th17细胞中诱导的全基因组表达变化

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为了进一步弄清IOX1抑制Il17a表达的分子机制，发明人接下来研究了IOX1在Th17细胞中的潜在靶标。作为2OG加氧酶的抑制剂，IOX1的潜在靶标包括组蛋白和DNA脱甲基酶。这些脱甲基酶在介导甲基化的DNA和组蛋白标记(包括H3K4me3、H3K9me3和H3K27me3)的脱甲基过程中起着关键性的作用，共同协调Th17分化的表观遗传调控。由于H3K27me3脱甲基酶JMJD3和DNA脱甲基酶TET2/TET3被证明是IL-17表达的激活物，并且H3K9me3可以调控IL-17的表达，因此发明人检查了IOX1是否靶向组蛋白脱甲基酶JMJD3、KDM3A、KDM4E以及DNA脱甲基酶TET2/TET3来抑制Th17细胞中的Il17a表达。进行细胞热转变分析，检查IOX1是否与其靶向蛋白直接相互作用。如图6D-E所示，IOX1与TET2相互作用，但不与JMJD3、KDM3A、KDM4E或TET3相互作用。数据表明，IOX1可以通过与Th17细胞中的DNA脱甲基酶TET2相互作用而发挥作用。

如果在Th17细胞中TET2是IOX1的靶标，则可在IOX1的作用下改变Il17a启动子的DNA脱甲基状态。因此，发明人接下来进行了重亚硫酸盐测序分析，以检测Il17a启动子上存在的所有12个CpG位点上DNA脱甲基的频率(转录起始位点的-600-+200bp)(如图7A所示)。数据表明，IOX1显著降低了CpG位点7和位点8上DNA脱甲基的频率(如图7B所示)。而且，ChIP分析证明，TET2直接与Il17a启动子的CpG-6-8位点结合，而Chem-IP分析(图8A示出了生物素化的IOX1的化学结构)表明IOX1也与Il17a启动子的CpG-6-8位点结合。总之，这些结果表明IOX1与Il17a启动子上的TET2直接相互作用，这可以抵消TET2的DNA脱甲基功能。

为了验证IOX1是否通过靶向TET2发挥作用，发明人进一步研究了IOX1在TET2缺陷型Th17细胞中的IL-17抑制作用。如图7C-E所示，在TET2缺陷型CD4⁺T细胞中，Th17细胞的极化受到显著影响。然而，在IOX1的作用下，IL-17⁺细胞的平均减少倍数从野生型的7.5倍改变为TET2缺陷型Th17细胞的2.5倍(如图7D-E所示)。除了Il17a外，RNA测序数据还显示，IOX1还显著降低了Ccl20在Th17细胞中的表达(如图6A所示)。如图8B-C所示，在IOX1的作用下，Th17培养物上清液中CCL20蛋白的平均减少倍数从野生型的4.0倍改变为TET2缺陷型Th17细胞的1.7倍。研究结论是：在IOX1对IL-17表达的抑制作用中，TET2确实起到了介导的作用。

实施例4：IOX1控制体内眼内炎症

为了研究IOX1在体内的抗炎作用，发明人首先使用经典的鼠类EAU模型(参见“方法”部分)，检查腹膜内给予IOX1是否可以控制葡萄膜视网膜炎。在IOX1处理过程中，接受药物处理的小鼠未发现出现体重减轻的情况(如图9A所示)。每天进行局部内窥镜眼底成像(TEFI)和OCT扫描，评估EAU小鼠眼内炎症的严重程度。如图9B-C所示，视网膜炎症在第7天开始，并在免疫后第13天达到峰值。评估结果说明IOX1治疗显著降低了眼内炎症的严重程度，这一点也可以通过眼底临床评分的降低得到证明。接下来，发明人在免疫后第14天使用经DMSO或IOX1处理的EAU小鼠的眼睛、眼睛引流***、腹股沟***和脾脏制备单细胞悬浮液，并分析了产生IFN-γ和IL-17的CD4⁺T细胞群体。在眼睛中，观察到IOX1处理显著降低了眼内总CD4⁺、CD4⁺IFN-γ⁺、CD4⁺IL-17⁺和CD4⁺IFN-γ⁺IL-17⁺T细胞的数量和频率(如图9D-I所示)。相反，在眼睛以外，观察到由IOX1处理诱导的唯一变化是腹股沟***中的CD4⁺IL-17⁺T细胞减少(如图10A-O所示)。因此，这些数据证实，全身给予IOX1可以控制眼内炎症，不会显著改变全身CD4⁺T细胞群体。

全身给予IOX1可以通过调控多种类型的细胞来控制眼内炎症。因此，接下来使用由过继转移的致病性CD4⁺T细胞诱导的EAU模型(AT-EAU)，检测IOX1是否可以仅通过修饰CD4⁺T细胞来发挥作用。用DMSO或IOX1将来自EAU小鼠的总脾细胞体外培养两天。然后，将从这些培养物中分离出的CD4⁺T细胞转移到受体小鼠中，在5天内诱发葡萄膜视网膜炎(如图11A所示)。使用TEFI，发明人发现与经DMSO处理的细胞转移相比，经IOX1处理的CD4⁺致病性T细胞诱发的眼内炎症显著减少(如图11B所示)。在转移经IOX1处理的细胞的情况下，小鼠临床疾病严重程度的降低伴随着眼内炎性CD4⁺T细胞(尤其是Th17细胞)(如图11D-I所示)的大幅下降，以及眼睛引流***的Th17细胞的减少(如图12A-O所示)。研究结论是：IOX1确实可以控制Th17介导的体内炎症。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。

本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。

Claims (13)

1.一种化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，所述自身免疫性疾病为葡萄膜炎，所述化合物具有如下结构：

。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葡萄膜炎为前葡萄膜炎、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎或全葡萄膜炎。

3.一种化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用，所述化合物具有如下结构：

。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物针对的炎症为Th17介导的炎症；

所述炎症为体内炎症和/或体表炎症。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述炎症为体内炎症。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物针对的炎症为眼部炎症。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述眼部炎症包括葡萄膜炎。

8.一种化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗眼部炎性疾病的药物中的应用，所述化合物具有如下结构：

。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述眼部炎性疾病为感染性眼部炎性疾病或非感染性眼部炎性疾病。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述眼部炎性疾病为Th17介导的自身免疫性眼部炎性疾病。

11.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述眼部炎性疾病为葡萄膜炎。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述葡萄膜炎为自身免疫性葡萄膜炎。

13.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述葡萄膜炎为前葡萄膜炎、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎或全葡萄膜炎。