CN114041475B - 一种用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于水体改良剂技术领域，公开了一种用于降低高盐度养殖水体半管藻黏附毒力的复合提取物。本发明复合提取物，以重量百分比计，包含双降子提取物42％‑52％、白薯莨提取物25％‑37％、金针菜提取物12％‑30％。与水产常用的水质改良剂相比，本发明复合提取物在合适的使用剂量下，例如10mg/m3剂量下，对养殖水体中半管藻黏附毒力的减弱具有良好的作用。其次，本发明与复合有机酸3201联用时，对养殖水体中半管藻黏附毒力的减弱具有良好的增效作用，同时也可降低3201的有效使用剂量。最后，本发明复合提取物为对半管藻的黏附毒力有明显的降低作用。

Description

一种用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及水体改良剂技术领域，更具体地，涉及一种用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物及其制备方法和应用。
背景技术
养殖水体中的藻类种类繁多，藻类品种间也存在明显的地域差异，通常情况下，可作为对虾天然饵料摄食且对对虾无任何明显毒性副作用的藻类被视为有益藻类，而有些被对虾当饵料摄食后会引发包括肠炎在内的多种病症，或是黏附虾体后会引起黏附部位的局部病变从而引发虾体发病死亡的藻类被视为有害藻类，然而任何一个养殖水体中，都具有藻类生态的多样性，绝大数情况下都是处于有益藻和有害藻的生态平衡中，当有害藻的生长繁殖突破这种生态平衡，那么将会对养殖动物的健康养殖带来威胁，严重时甚至会导致养殖的失败。
半管藻属于中心硅藻纲盒形藻目半管藻属，主要分布于不同盐度水体中，易形成具有黏附性的藻
Figure BDA0003305924510000011
团状，在静止水体中会沉降至底部，而在开动增氧机的水文活动水体中则呈悬浮分布，且对养殖对虾的鳃部、甲壳、游泳足等具有不同程度的黏附性，造成黏附部位的局部组织损伤和局部组织坏死，进一步恶化时会因损伤部位继发感染致病原而发生死亡，以金刚虾为例，半管藻
Figure BDA0003305924510000012
团黏附对虾游泳足或鳃部会导致黏附部位变黄，进一步发展将会因组织坏死变黑色，当损伤部位黑色面积扩大时或继发感染致病原时，金刚虾发生传染性死亡的风险将大大增加，最后造成不同程度的养殖经济损失。因此，降低半管藻对对虾的养殖危害，降低半管藻的黏附毒力是关键技术点之一。
发明内容
本发明为了克服现有技术中上述缺陷，首先提供一种用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物。
本发明的第二个目的是提供上述降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物，以重量百分比计，所述复合提取物包含：双降子提取物42％-52％、白薯莨提取物25％-37％、金针菜提取物12％-30％。
优选的，上述复合植物提取物，以重量百分比计，所述复合提取物包含：双降子提取物48％-52％、白薯莨提取物28％-34％、金针菜提取物15％-26％。
更优选的，上述复合植物提取物，以重量百分比计，所述复合提取物包含：双降子提取物48％、白薯莨提取物32％、金针菜提取物20％。
优选的，所述双降子提取物为双降子发酵浓缩物，双降子为薯蓣科山药属的双降子地下块根。
更优选的，所述双降子提取物的制备方法为：
S1、将双降子块根冲洗干净去杂，按2-5mm厚度切片，按重量体积比1：(1-1.5)与含量为50％-65％乙醇溶液浸泡12-16h，期间间歇式保质上下摇动使浸泡更均匀，环境温度为25-28℃；分别收集双降子的乙醇浸出液和经乙醇预处理的双降子块根切片；
S2、双降子的乙醇浸出液进行旋转蒸馏处理，获得双降子的乙醇浸出浓缩液，浓缩后的体积为原体积的1/4至1/3即可；
S3、将双降子块根切片置于35-45℃环境烘干，接着过40-60目进行粉碎处理获得经乙醇预处理的双降子块根粉，按质量体积比，将经乙醇预处理的双降子块根粉、蒸馏水、乳酸菌培养基、乳酸菌粉按100：(1400-2000)：(3-5)：(0.1-0.5)混合，再按蒸馏水每100体积份，加入2600-3000IU纤维素酶，装入35-40℃可调温的密闭发酵容器中，其中，加入的乳酸菌含量为(3-6)╳1011cfu/g，发酵期间，间隔式搅拌和可调控式pH值调节，当培养液OD值为6.6-7.6时结束发酵，将发酵容器中的混合物离心去渣，收集上清液，并分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，接着将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的10％-30％，所获得经乙醇预处理的双降子块根粉的乳酸菌发酵浓缩液；
S4、以体积份比计，按1：(2-3)的比例，将双降子乙醇浸出浓缩液和经乙醇预处理的双降子块根粉的乳酸菌发酵浓缩液均匀混合，获得混合物即为所述双降子浓缩提取物。
其中，乙醇为市场工业级纯度，S3所述无搅拌式超滤浓缩的技术参数如下：环境温度25-30℃条件下，操作压力为0.3～0.6Mpa，超滤膜的膜通量以50～100L/m2·h为宜。
其中，所述乳酸菌液态培养基可以为市售的乳酸菌液态培养基，例如进口的Lactobacillus Medium。
其中，所述纤维素酶，为市售工业用纤维素酶，纯度为工业级。
进一步地，上述的乳酸菌优选为莱氏曼氏乳杆菌分离株，罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌等乳酸杆菌功能上不能取代本发明分离到的莱氏曼氏乳杆菌。
进一步地，S3上述培养物离心优选在5000rpm离心，例如5000rpm离心10分钟。
作为一种具体的实施方式，所述双降子提取物的制备方法为：
S1、将双降子块根冲洗干净去杂，按3mm厚度切片，按重量体积比1：1.2与含量为55％乙醇溶液浸泡15h，期间间歇式保质上下摇动使浸泡更均匀，环境温度为26℃；分别收集双降子的乙醇浸出液和经乙醇预处理的双降子块根切片；
S2、双降子的乙醇浸出液进行旋转蒸馏处理，获得双降子的乙醇浸出浓缩液，浓缩后的体积为原体积的1/3即可；
S3、将双降子块根切片置于38℃环境烘干，接着过60目进行粉碎处理获得经乙醇预处理的双降子块根粉，按质量体积比，将经乙醇预处理的双降子块根粉、蒸馏水、乳酸菌培养基、乳酸菌粉按100：1600：5：0.4混合，再按蒸馏水每100体积份，加入2600-3000IU纤维素酶，装入35℃可调温的密闭发酵容器中，其中，加入的乳酸菌含量为3╳1011cfu/g，发酵期间，间隔式搅拌和可调控式pH值调节，当培养液OD值为6.9时结束发酵，将发酵容器中的混合物离心去渣，收集上清液，并分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，接着将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的10％-30％，所获得经乙醇预处理的双降子块根粉的乳酸菌发酵浓缩液；
S4、以体积份比计，按1：2的比例，将双降子乙醇浸出浓缩液和经乙醇预处理的双降子块根粉的乳酸菌发酵浓缩液均匀混合，获得混合物即为所述双降子浓缩提取物。
优选的，所述白薯莨提取物为经过滤提和发酵超滤浓缩后混合的获得物，白薯莨为薯蓣科薯蓣属白蔓莨的地下块根。
更优选的，所述白薯莨提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将白薯莨去皮洗净，搅拌机搅碎成渣，按质量体积比，按1：(8-10)：(0.3-0.6)比例，将白薯莨渣与蒸馏水、0.5M氢氧化钠溶液充分混合成悬浊液，持续搅拌1-3h，加稀盐酸对过剩的氢氧化钠进行中和处理，后再经40-50目筛网过滤，分别收集白薯莨滤液和白薯莨滤渣；
S2、将白薯莨滤液装入平口容器静置12-16h，待水相和底层层析物完全分离，弃上层水相，收集底层层析物，置于30-35℃环境下烘干至含水量低于8％为宜，获得白薯莨层析物；按质量百分比计，将即时收集的白薯莨滤渣与浓度为1M的氨水、浓度为3M的硫酸镁按质量体积比50：(3-6)：(1-2)进行充分混合，置于25-28℃环境下3-8h，获得白薯莨滤渣处理物；接着按质量体积比，将白薯莨滤渣处理物置于55-65℃进行热处理12-24分钟，冷却后获得白薯莨滤渣热炙物；
S3、将白薯莨滤渣热炙物与蒸馏水、乳酸菌液态培养基、乳酸菌粉混合，30-36℃密闭培养至OD值为6.4-7.4得到培养物，25-28℃条件下，离心去渣，收集上清液，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，并将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的20％-25％，获得白薯莨滤渣热炙物发酵浓缩液；最后，先将白薯莨层析物过40-50目筛获得粉碎物，接着按体积质量比，按1：(2-4)的比例，将白薯莨层析物粉碎物与白薯莨滤渣热炙物发酵浓缩液充分混合，并置于35-40℃环境中烘干至含水量低于8％，所获得的混合物再经40-50目筛粉碎后即为所述的白薯莨提取物。
其中，白薯莨滤渣热炙物与蒸馏水、乳酸菌液态培养基、乳酸菌粉的重量体积比为10：(100-125)：(4-7)：(1-3)，乳酸菌的含量为(4-7)╳1010cfu/g。
其中，白薯莨滤渣热炙物、蒸馏水、乳酸菌液态培养基和乳酸菌粉的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将白薯莨滤渣热炙物和乳酸菌液态培养基混合，再加入乳酸菌粉混合，最后加入蒸馏水混合均匀。
其中，S3所述无搅拌式超滤浓缩的技术参数如下：环境温度26-28℃条件下，操作压力为0.4～0.6Mpa，超滤膜的膜通量以50～100L/m2·h为宜。
其中，所述乳酸菌液态培养基可以为市售的乳酸菌液态培养基，例如进口的Lactobacillus Medium。
其中，硫酸镁、氨水、氢氧化钠均为市售化学纯等级。
进一步的，上述的乳酸菌优选为嗜盐片球菌分离株，罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌等乳酸杆菌功能上不能取代本发明分离到的嗜盐片球菌。
进一步的，上述培养物离心优选在4800rpm离心，例如4800rpm离心8分钟。
作为一种优选的实施方式，上述白薯莨提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将白薯莨去皮洗净，搅拌机搅碎成渣，按质量体积比，按1：10：0.4比例，将白薯莨渣与蒸馏水、氢氧化钠溶液充分混合成悬浊液，持续搅拌1-3h，加稀盐酸对过剩的氢氧化钠进行中和处理，后再经50目筛网过滤，分别收集白薯莨滤液和白薯莨滤渣；
S2、将白薯莨滤液装入平口容器静置12h，待水相和底层层析物完全分离，弃上层水相，收集底层层析物，置于33℃环境下烘干至含水量低于8％为宜，获得白薯莨层析物；按质量百分比计，将即时收集的白薯莨滤渣与浓度为1M的氨水、浓度为3M的硫酸镁按质量体积比50：4：2进行充分混合，置于26℃环境下4h，获得白薯莨滤渣处理物；接着按质量体积比，将白薯莨滤渣处理物置于55℃进行热处理18分钟，冷却后获得白薯莨滤渣热炙物；
S3、将白薯莨滤渣热炙物与蒸馏水、乳酸菌液态培养基、乳酸菌粉混合，33℃密闭培养至OD值为7.2得到培养物，26℃条件下，离心去渣，收集上清液，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，并将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的20％，获得白薯莨滤渣热炙物发酵浓缩液；最后，先将白薯莨层析物过40-50目筛获得粉碎物，接着按体积质量比，按1：2.5的比例，将白薯莨层析物粉碎物与白薯莨滤渣热炙物发酵浓缩液充分混合，并置于36℃环境中烘干至含水量低于8％，所获得的混合物再经50目筛粉碎后即为所述的白薯莨提取物。
优选的，所述金针菜提取物为百合科萱草属金针菜全花经过预处理、发酵和超滤浓缩获得的物质。
更优选的，所述金针菜提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将含水量低于10％的金针菜经过预处理，按质量体积比计，与氯化钠按1：(1.2-1.8)混合均匀，再经90-105℃进行热处理10-15分钟，冷却后，滤掉氯化钠，筛出金针菜获得金针菜热炙处理物；
S2、再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得金针菜脱水干燥物，干燥物过40-60目筛进行粉碎，获得金针菜热炙脱水干燥粉碎物；
S3、将金针菜热炙脱水干燥粉碎物：蒸馏水：乳酸菌液态培养基和乳酸菌粉混合，35-40℃密闭培养至OD值为6.2-7.5得到培养物，26-30℃条件下，过滤收集培养物，3500-5000rpm离心15-25min，取离心上清液，弃离心沉积物，并以离心上清液密闭分装，于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，800-1200rpm离心5-10min，去渣且收集离心上清液，将收集的上清液加入无搅拌式超滤装置浓缩至原体积的15％-22％，获得浓缩液即为所述的金针菜提取物。
其中，S3所述的金针菜热炙脱水干燥粉碎物：蒸馏水：乳酸菌液态培养基按重量体积比10：(100-130)：(6-8)进行混合。
其中，所述金针菜为优选当年生百合科萱草属金针菜整花部。
其中，S1所述金针菜的预处理，其操作步骤如下，优选当年百合科萱草属金针菜整花部，浸泡于2-3倍质量体积比的2.5-3.2M氯化镁溶液，环境温度25-30℃，浸泡24-36h取出，沥干，预处理的金针菜含水量为8％-10％，即可。
所述金针菜热炙脱水干燥粉碎物、蒸馏水、乳酸菌液态培养基和乳酸菌粉的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将金针菜热炙脱水干燥粉碎物和乳酸菌液态培养基混合，再加入乳酸菌粉混合，最后加入蒸馏水混合均匀。
其中，S3所述无搅拌式超滤装置浓缩的技术参数如下：环境温度26-38℃条件下，操作压力为0.3～0.5Mpa，超滤膜的膜通量以60～90L/m2·h为宜。
进一步的，S2所述速冻优选为将预处理的金针菜置于-20～-40℃速冻10～12h。
进一步的，S2所述预膨化是将速冻后的预处理的金针菜置于真空度90～95KPa，温度70～80℃的条件下油炸膨化3～6min。
进一步的，S2所述真空脱油是将油炸后的预处理的金针菜置于转速150～250r/min的条件下脱油6～15min。
进一步的，上述的乳酸菌优选为嗜盐片球菌分离株，其加入量为每质量份金针菜粉碎物加入含量为(5-7)╳1011cfu/g菌粉12-24g，罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌等乳酸杆菌功能上不能取代本发明分离到的嗜盐片球菌。
作为一种优选的实施方式，所述金针菜提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将含水量低于10％的金针菜经过预处理，按质量体积比计，与氯化钠按1：1.6混合均匀，再经92℃进行热处理12分钟，冷却后，滤掉氯化钠，筛出金针菜获得金针菜热炙处理物；
S2、再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得金针菜脱水干燥物，干燥物过40-60目筛进行粉碎，获得金针菜热炙脱水干燥粉碎物；
S3、将金针菜热炙脱水干燥粉碎物：蒸馏水：乳酸菌液态培养基和乳酸菌粉混合，35℃密闭培养至OD值为7.2得到培养物，26℃条件下，过滤收集培养物，4500rpm离心15min，取离心上清液，弃离心沉积物，并以离心上清液密闭分装，于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，1200rpm离心5min，去渣且收集离心上清液，将收集的上清液加入无搅拌式超滤装置浓缩至原体积的15％，获得浓缩液即为所述的金针菜提取物。
其中，的嗜盐片球菌粉的加入量为含量为6╳1011cfu/g的菌粉15g。
其中，所述乳酸菌液态培养基可以为市售的乳酸菌液态培养基，例如进口的Lactobacillus Medium。
进一步的，所述速冻优选为将金针菜置于-30℃速冻12h。
进一步的，所述预膨化是将速冻后的金针菜置于真空度90KPa，温度80℃的条件下油炸膨化5min。
进一步的，所述真空脱油是将油炸后的金针菜置于转速200r/min的条件下脱油6min。
本发明还供上述用于降低水体半管藻黏附毒力的复合提取物的制备方法，包括以下步骤：在25-40℃环境下，将各组分混合，置于35-45℃环境下烘干至含水量低于8％，再经40-50目过筛，所获得的粉碎物为所述复合提取物。
更优选的，上述制备方法包括以下步骤：在26℃环境下，将各组分混合，置于38℃环境下烘干至含水量为8％，再经50目过筛，所获得的粉碎物为所述复合提取物。
本发明还提供上述用于降低水体半管藻黏附毒力的复合提取物的应用，尤其是与复合有机酸3201联用时，对养殖水体中半管藻黏附毒力的减弱具有良好的增效作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
首先，本发明复合提取物在合适的使用剂量下，例如10mg/m3剂量下，本发明复合提取物对养殖水体中半管藻黏附毒力的减弱具有良好的作用。
其次，本发明与复合有机酸3201联用时，对养殖水体中半管藻黏附毒力的减弱具有良好的增效作用，同时也可降低3201的有效使用剂量。
最后，本发明复合提取物由双降子提取物、白薯莨提取物和金针菜提取物组成，三种成分具有显著的配伍增效作用，具体为对半管藻的黏附毒力有明显的降低作用。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
制备一种用于降低水体半管藻黏附毒力的复合提取物的制备与应用，以重量百分比计，所述复合提取物包含：双降子提取物48％、白薯莨提取物32％、金针菜提取物20％，在26℃环境下，将各组分混合，置于38℃环境下烘干至含水量为8％，再经50目过筛，所获得的粉碎物为所述复合提取物。
其中，所述双降子提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：将双降子块根冲洗干净去杂，按3mm厚度切片，按重量体积比1：1.2与含量为55％乙醇溶液浸泡15h，期间间歇式保质上下摇动使浸泡更均匀，环境温度为26℃；分别收集双降子的乙醇浸出液和经乙醇预处理的又降子块根切片；首先，双降子的乙醇浸出液进行旋转蒸馏处理，获得双降子的乙醇浸出浓缩液，浓缩后的体积为原体积的1/3即可；其次，将双降子块根切片置于38℃环境烘干，接着过60目进行粉碎处理获得经乙醇预处理的双降子块根粉；按质量体积比，将经乙醇预处理的双降子块根粉、蒸馏水、乳酸菌培养基、乳酸菌粉按100：1600：5：0.4，再按蒸馏水每100体积份，加入2600-3000IU纤维素酶，装入35℃可调温的密闭发酵容器中，其中，加入的乳酸菌含量为3╳1011cfu/g，发酵期间，间隔式搅拌和可调控式pH值调节，当培养液OD值为6.9时结束发酵，将发酵容器中的混合物离心去渣，收集上清液，并分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，接着将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的20％，所获得经乙醇预处理的双降子块根粉的乳酸菌发酵浓缩液；最后，以体积份比计，按1：2的比例，将双降子乙醇浸出浓缩液和经乙醇预处理的双降子块根粉的乳酸菌发酵浓缩液均匀混合，获得混合物即为所述双降子浓缩提取物。
其中，所述白薯莨提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：将白薯莨去皮洗净，搅拌机搅碎成渣，按质量体积比，按1：10：0.4比例，将白薯莨渣与蒸馏水、氢氧化钠溶液充分混合成悬浊液，持续搅拌1.5h，加稀盐酸对过剩的氢氧化钠进行中和处理，后再经50目筛网过滤，分别收集白薯莨滤液和白薯莨滤渣；将滤液装入平口容器静置12h，待水相和底层层析物完全分离，弃上层水相，收集底层层析物，置于33℃环境下烘干至含水量为8％，获得白薯莨层析物；按质量百分比计，将即时收集的白薯莨滤渣与浓度为1Mol/L的氨水、浓度为3Mol/L的硫酸镁按50：4：2进行充分混合，置于26℃环境下4h，获得白薯莨滤渣处理物；接着按质量体积比，将白薯莨滤渣处理物置于55℃进行热处理18分钟，冷却后获得白薯莨滤渣热炙物；将白薯莨滤渣热炙物与蒸馏水、乳酸菌液态培养基、乳酸菌粉混合，33℃密闭培养至OD值为7.2得到培养物，26℃条件下，离心去渣，收集上清液，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，并将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的20％，获得白薯莨滤渣热炙物发酵浓缩液；最后，先将白薯莨层析物过50目筛获得粉碎物，接着按体积质量比，按1：2.5的比例，将白薯莨层析物粉碎物与白薯莨滤渣热炙物发酵浓缩液充分混合，并置于36℃环境中烘干至含水量为8％，所获得的混合物再经50目筛粉碎后即为所述的白薯莨提取物。
其中，所述金针菜提取物，由包含以下步骤的方法制备得到：将含水量低于10％的金针菜经过预处理的，按质量百分比计，与氯化铵按1：1.6混合均匀，再经92℃进行热处理12分钟，冷却后，滤掉氯化钠，筛出金针菜获得金针菜热炙处理物，再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得金针菜脱水干燥物，干燥物过40-60目筛进行粉碎，获得金针菜热炙脱水干燥粉碎物，将金针菜热炙脱水干燥粉碎物：蒸馏水：乳酸菌液态培养基和乳酸菌粉混合，35℃密闭培养至OD值为7.2得到培养物，26℃条件下，过滤收集培养物，4500rpm离心15min，取离心上清液，弃离心沉积物，并以离心上清液密闭分装，于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，1200rpm离心5min，去渣且收集离心上清液，将收集的上清液加入无搅拌式超滤装置浓缩至原体积的15％，获得浓缩液即为所述的金针菜提取物。
试验例1本发复合提取物对水体半管藻黏附毒力的影响评估
1、试验材料
1.1试验藻种与动物
半管藻：由本课题组从高盐度金刚虾养殖水体中分离和鉴定获得。
金刚虾：规格200±6支/斤，活力正常，体表无异常明显病变，按3％样本量随机抽检做常见病毒和细菌检测结果均为阴性的，用于本试验。
1.2试验耗材
普通光学显微镜、剪刀、镊子和75％乙醇等耗材若干。
复合有机酸：为清远海贝海联科3201商品，批次日期是2021年2月4日。
1.3复合提取物
本实验所用的本发明所述复合提取物，其制备方法同实施例1。
2、试验方法
2.1试验虾的分组与管理
选择面积为2x2x2m3水泥池12个作为试验场地，并引入同一金刚虾养殖塘的水源作为水泥池的养殖水体，依次编号为A组、B组、C组，每个组下设3个平行组，分别为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3，每个水泥池设为一个平行组，每个平行组放养的金刚虾数量为300支。
试验暂养期为10天，正式试验周期为30天，期间正常投喂，每15天左右换水1/3，每2天排底污一次，结合使用必要的水质改良剂将养殖水体中氨氮、亚盐和溶氧等指标保持在正常值范围内。
2.2试剂配制与使用组别
利用灭菌蒸馏水将本发明复合提取物稀释至试验浓度，本试验复合提取物单用时使用终浓度为10mg/m3，与复合有机酸(3201商品)联用时则按5mg/m3使用。
复合有机酸(3201商品)按推荐使用说明书稀释使用，本试验复合有机酸(3201商品)单用时使用终浓度为0.5mL/m3，与本发明复合提取物联用时则按使用终浓度为0.25mL/m3使用。
表1试验分组与对应组别使用试剂概况
Figure BDA0003305924510000091
2.3半管藻的黏附毒力评估
正式试验第1天、15天、30天，分别从每个水泥池中随机捞取40支金刚虾，用于观察虾体鳃部、游泳足是否出现半管藻黏附及其黏附导致的组织损伤。其中，当虾体鳃部鳃丝出半管藻黏附且未出现组织损伤的，记为正常；当虾体鳃部鳃丝出现半管藻黏附且出现组织损伤的，以一根鳃丝出现损伤记为一个“+”，两根鳃丝出现损伤记为二个“++”,以此类推；同理，当虾体游泳足出现半管藻黏附且未出现组织损伤的，记为正常；当虾体游泳足出现半管藻黏附且出现组织损伤的，以一根鳃丝出现损伤记为一个“-”，两根鳃丝出现损伤记为二个“--”,以此类推。
黏附毒力危害性评估公式＝受检金刚虾鳃丝组织损伤总记数+受检金刚虾游泳足损伤总记数
黏附毒力危害指数评估公式＝(受检金刚虾鳃丝组织损伤总记数+受检金刚虾游泳足损伤总记数)x100％/40
注：
(1)黏附毒力危害性评估公式用于评估金刚虾因半管藻黏附毒力造成的组织损伤的病灶的总数，总数越高，说明半管藻毒力危害性越大；
(2)黏附毒力危害指数评估公式用于评估金刚虾因半管藻黏附毒力造成组织损伤且组织损伤导致虾体濒临死亡或发生死亡的现象，黏附毒力危害指数越高，说明因半管藻黏附毒力造成损伤继发致死的危害就越大，其中认定是否因半管藻黏附毒力造成损伤致死的必要条件之一则为濒死或发生死亡的虾体有特征性半管藻黏附损伤病灶。
(3)特征性半管藻黏附损伤病灶的认定，以虾体鳃丝和游泳足发黄或发黑局部组织中可以检测到半管藻黏附。
3、试验结果
试验结果表明(表2)，与空白对照组(D组)相比，使用本发明复合提取物可以明显的降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害性，同时也能降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害指数；与使用复合有机酸3201的试验组相比，使用本发明复合提取物可以明显的降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害性，同时也能降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害指数；然而，与空白对照组(D组)和用本发明复合提取物的试验组相比，使用本发明复合提取物+复合有机酸3201的试验组，其在降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害性和降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害指数两个方面都具有明显的优势。由此可见，在降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害性和降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害指数两个方面的效果比较，本发明复合提取物+复合有机酸3201组>本发明复合提取物组>复合有机酸3201组>空白对照组。
表2
Figure BDA0003305924510000101
Figure BDA0003305924510000111
4、试验小结
(1)在降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害性和降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害指数两个方面的效果比较，本发明复合提取物+复合有机酸3201组>本发明复合提取物组>复合有机酸3201组>空白对照组。
(2)本发明复合提取物与复合有机酸联用，对降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害性和降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害指数两个方面具有联用增效的作用，同时复合有机酸和本发明复合提取物的使用剂量也较之推荐剂量低。
试验例2本发明复合提取物组方配伍对半管藻黏附毒力的减弱作用评估
1、试验材料
1.1试验藻种与动物
半管藻：由本课题组从高盐度金刚虾养殖水体中分离和鉴定获得。
金刚虾：规格200±6支/斤，活力正常，体表无异常明显病变，按3％样本量随机抽检做常见病毒和细菌检测结果均为阴性的，用于本试验。
1.2试验耗材
普通光学显微镜、剪刀、镊子和75％乙醇等耗材若干。
复合有机酸：为清远海贝海联科3201商品，批次日期是2021年2月4日。
1.3复合提取物
本实验所用的本发明所述复合提取物，其制备方法同实施例1。
2、试验方法
2.1试验虾的分组与管理
选择面积为2x2x2m3水泥池12个作为试验场地，并引入同一金刚虾养殖塘的水源作为水泥池的养殖水体，依次编号为A组、B组、C组，每个组下设3个平行组，分别为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3，每个水泥池设为一个平行组，每个平行组放养的金刚虾数量为300支。
试验暂养期为10天，正式试验周期为30天，期间正常投喂，每15天左右换水1/3，每2天排底污一次，结合使用必要的水质改良剂将养殖水体中氨氮、亚盐和溶氧等指标保持在正常值范围内。
2.2试剂配制与使用组别
利用灭菌蒸馏水将本发明复合提取物稀释至试验浓度，本试验复合提取物单用时使用终浓度为10mg/m3，与复合有机酸(3201商品)联用时则按5mg/m3使用。
复合有机酸(3201商品)按推荐使用说明书稀释使用，本试验复合有机酸(3201商品)单用时使用终浓度为0.5mL/m3，与本发明复合提取物联用时则按使用终浓度为0.25mL/m3使用。
本发明复合提取物单一组分缺失或双组分缺失，缺失的组分对应的剂量用等体积份的中性PBS替代，具体如下表3。
表3试验分组与对应组别使用试剂概况(1)
Figure BDA0003305924510000121
Figure BDA0003305924510000131
为了对比本发明复合提取物全组分或单一组分的效果差异，采用双降子水提物、白薯莨水提物和金针菜的水提取直接用于评估其与本发明提取方式的效果差异，具体的制备方法以原药组分通过水煮的方式，获得最终水提物体积份与原药重量份为1：1即可，例如1ml水提物等效1g原药。
本发明复合提取物对应组分水提物单一组分缺失或双组分缺失，缺失的组分对应的剂量用等体积份的中性PBS替代，本发明复合提取物组分的全组分水提物均以本发明复合物组分比例混合而成，具体如下表4。
表4试验分组与对应组别使用试剂概况(2)
Figure BDA0003305924510000132
2.3半管藻的黏附毒力评估
正式试验第1天、15天、30天，分别从每个水泥池中随机捞取40支金刚虾，用于观察虾体鳃部、游泳足是否出现半管藻黏附及其黏附导致的组织损伤。其中，当虾体鳃部鳃丝出半管藻黏附且未出现组织损伤的，记为正常；当虾体鳃部鳃丝出现半管藻黏附且出现组织损伤的，以一根鳃丝出现损伤记为一个“+”，两根鳃丝出现损伤记为二个“++”,以此类推；同理，当虾体游泳足出现半管藻黏附且未出现组织损伤的，记为正常；当虾体游泳足出现半管藻黏附且出现组织损伤的，以一根鳃丝出现损伤记为一个“-”，两根鳃丝出现损伤记为二个“--”,以此类推。
黏附毒力危害性评估公式＝受检金刚虾鳃丝组织损伤总记数+受检金刚虾游泳足损伤总记数
黏附毒力危害指数评估公式＝(受检金刚虾鳃丝组织损伤总记数+受检金刚虾游泳足损伤总记数)x100％/40
注：
(1)黏附毒力危害性评估公式用于评估金刚虾因半管藻黏附毒力造成的组织损伤的病灶的总数，总数越高，说明半管藻毒力危害性越大；
(2)黏附毒力危害指数评估公式用于评估金刚虾因半管藻黏附毒力造成组织损伤且组织损伤导致虾体濒临死亡或发生死亡的现象，黏附毒力危害指数越高，说明因半管藻黏附毒力造成损伤继发致死的危害就越大，其中认定是否因半管藻黏附毒力造成损伤致死的必要条件之一则为濒死或发生死亡的虾体有特征性半管藻黏附损伤病灶。
(3)特征性半管藻黏附损伤病灶的认定，以虾体鳃丝和游泳足发黄或发黑局部组织中可以检测到半管藻黏附。
3、试验结果
试验结果(表5)表明，试验组A、B、C、D四组试验数据表明，在降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害性和降低半管藻对金刚虾的黏附毒力危害指数两个方面的效果比较，本发明复合提取物+复合有机酸3201组>本发明复合提取物组>复合有机酸3201组>空白对照组。
试验组E、F、G、H、K、L的试验数据表明，当本发明复合提取中双降子提取物、白薯茛提取物和金针菜提取物分别单一缺失或同时双组分缺失时，缺失组分的本发明复合提物对半管藻黏附毒力没有明显的降低作用，由此可见，本发明复合提取物各组分单一缺失或双组分同时缺失，都将明显的弱化本发明复合提取物对半管黏附毒力的降低作用。由此可见，本发明复合提取物中双降子提取物、白薯茛提取物和金针菜提取物具有联用增效作用。
表5
Figure BDA0003305924510000141
Figure BDA0003305924510000151
Figure BDA0003305924510000161
试验组P、Q、M、N的试验数据(表6)表明，当本发明复合提取中所有组分被对应组分的水提物取替后，具体为双降子水提取取替双降子提取物、白薯茛水提物取替白薯茛提取物和金针菜水提物取替金针菜提取物，本发明复合提取物对应组分的水提物对半管藻黏附毒力降低效果大大减弱，即使本发明复合提取物三种组分原药的水提物按本发明复合物组分的剂量复配时，也达不到本发明复合提取物的效果。由此可见，本发明复合提取物中双降子提取物、白薯茛提取物和金针菜提取物被单一或全部取替为对应组分的水提物时，单一组分或全部组分的水提物对半管藻黏附毒力的致弱效果大大减弱。
表6
Figure BDA0003305924510000171
4、试验小结
(1)本发明复合提取物中双降子提取物、白薯茛提取物和金针菜提取物单一组分或双组分缺失时的试验效果数据表明，本发明复合提取物中双降子提取物、白薯茛提取物和金针菜提取物具有降低半管藻黏附毒力的联用增效作用。
(2)本发明复合提取物中双降子提取物、白薯茛提取物和金针菜提取物被单一或全部取替为对应组分的水提物时，单一组分或全部组分的水提物对半管藻黏附毒力的致弱效果大大减弱。
试验例3本发明复合植物提取物对三种对虾的安全性评估
1、试验材料与方法
1.1复合提取物的制备
本实验所用的本发明所述复合提取物，其制备方法同实施例1。
1.2试验动物
南美白对虾(简称白虾)、金刚虾和草虾：苗种市场直接购买。
1.3试验对虾的暂养与分组
选择健康白虾600支，分成6个组，每个组100支，每个组下设两个平行组，每个平行组50支，分别随机命名为A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E1、E2、F1、F2。
选择健康金刚虾600支，分成6个组，每个组100支，每个组下设两个平行组，每个平行组50支，分别随机命名为H1、H2、J1、J2、K1、K2、L1、L2、M1、M2、N1、N2。
选择健康草虾600支，分成6个组，每个组100支，每个组下设两个平行组，每个平行组50支，分别随机命名为P1、P2、Q1、Q2、R1、R2、S1、S2、T1、T2、V1、V2。
1.4复合提取物梯度浓度的配制与安全性评估
取本发明复合提取物，按0、0.625ml/L、1.25ml/L、2.5ml/L、5ml/L、10ml/L的终浓度要求，分别评估其48h内对对虾的浸泡安全性，其对应的试验组分配如下表7。
表7
Figure BDA0003305924510000181
Figure BDA0003305924510000191
在0、24h、48h三个时间维度下，分别评估终浓度为0、0.625ppm、1.25ppm、2.5ppm、5ppm、10ppm的试验水体中，各个试验组试验对虾的存活情况，并通过以下公式评估复合提取物对不同试验对虾的安全性。
Figure BDA0003305924510000192
1.5其他耗材
蒸馏水若干，量杯适量。
2、试验结果
如下表8，不同时间点的安全性评估结果表明，本发明复合提取物使用浓度≤10mg/L时，48h的持续浸泡，本发明复合提取物对白虾、金刚虾和草虾具有极高的安全性。
表8
Figure BDA0003305924510000193
3、试验小结
(1)本发明复合提取物对金刚虾、白虾和草虾的安全浓度为≤10mg/L。
(2)本发明复合提取物使用终浓度为10mg/L时，其对金刚虾、白虾和草虾都具有极高的安全性。
综合试验例1-3试验结果可知，本发明复合提取物在合适的使用剂量下，对高盐度养殖水体中半管藻黏附毒力的减弱具有良好的抑制作用，且对金刚虾、白虾和草虾具有良好的使用安全性。

Claims (6)

1.一种用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物，其特征在于，以重量百分比计，所述复合植物提取物包含：双降子提取物42％-52％、白薯莨提取物25％-37％、金针菜提取物12％-30％；所述双降子提取物为双降子发酵浓缩物，所述白薯莨提取物为经过滤提和发酵超滤浓缩后混合的获得物，所述金针菜提取物为百合科萱草属金针菜全花经过预处理、发酵和超滤浓缩获得的物质；
所述双降子提取物通过以下制备方法得到：
S1、将双降子块根冲洗干净去杂，按2-5mm厚度切片，按重量体积比1：(1-1.5)与含量为50％-65％乙醇溶液浸泡12-16h，期间间歇式保质上下摇动使浸泡更均匀，环境温度为25-28℃；分别收集双降子的乙醇浸出液和经乙醇预处理的双降子块根切片；
S2、双降子的乙醇浸出液进行旋转蒸馏处理，获得双降子的乙醇浸出浓缩液，浓缩后的体积为原体积的1/4至1/3即可；
S3、将双降子块根切片置于35-45℃环境烘干，接着过40-60目进行粉碎处理获得经乙醇预处理的双降子块根粉，按质量体积比，将经乙醇预处理的双降子块根粉、蒸馏水、乳酸菌培养基、乳酸菌粉按100：(1400-2000)：(3-5)：(0.1-0.5)混合，再按蒸馏水每100体积份，加入2600-3000IU纤维素酶，装入35-40℃可调温的密闭发酵容器中，其中，加入的乳酸菌含量为(3-6)×1011cfu/g，发酵期间，间隔式搅拌和可调控式pH值调节，当培养液OD值为6.6-7.6时结束发酵，将发酵容器中的混合物离心去渣，收集上清液，并分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，接着将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的10％-30％，所获得经乙醇预处理的双降子块根粉的乳酸菌发酵浓缩液；
S4、以体积份比计，按1：(2-3)的比例，将双降子乙醇浸出浓缩液和经乙醇预处理的双降子块根粉的乳酸菌发酵浓缩液均匀混合，获得混合物即为所述双降子浓缩提取物；
所述白薯莨提取物由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将白薯莨去皮洗净，搅拌机搅碎成渣，按质量体积比，按1：(8-10)：(0.3-0.6)比例，将白薯莨渣与蒸馏水、氢氧化钠溶液充分混合成悬浊液，持续搅拌1-3h，加稀盐酸对过剩的氢氧化钠进行中和处理，后再经40-50目筛网过滤，分别收集白薯莨滤液和白薯莨滤渣；
S2、将白薯莨滤液装入平口容器静置12-16h，待水相和底层层析物完全分离，弃上层水相，收集底层层析物，置于30-35℃环境下烘干至含水量低于8％为宜，获得白薯莨层析物；按质量百分比计，将即时收集的白薯莨滤渣与浓度为1M的氨水、浓度为3M的硫酸镁按质量体积比50：(3-6)：(1-2)进行充分混合，置于25-28℃环境下3-8h，获得白薯莨滤渣处理物；接着按质量体积比，将白薯莨滤渣处理物置于55-65℃进行热处理12-24分钟，冷却后获得白薯莨滤渣热炙物；
S3、将白薯莨滤渣热炙物与蒸馏水、乳酸菌液态培养基、乳酸菌粉混合，30-36℃密闭培养至OD值为6.4-7.4得到培养物，25-28℃条件下，离心去渣，收集上清液，分装密闭于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，并将经高温灭菌的上清液利用无搅拌式超滤浓缩至原体积的20％-25％，获得白薯莨滤渣热炙物发酵浓缩液；最后，先将白薯莨层析物过40-50目筛获得粉碎物，接着按体积质量比，按1：(2-4)的比例，将白薯莨层析物粉碎物与白薯莨滤渣热炙物发酵浓缩液充分混合，并置于35-40℃环境中烘干至含水量低于8％，所获得的混合物再经40-50目筛粉碎后即为所述的白薯莨提取物；
所述金针菜提取物由包含以下步骤的方法制备得到：
S1、将含水量低于10％的金针菜经过预处理，按质量体积比计，与氯化钠按1：(1.2-1.8)混合均匀，再经90-105℃进行热处理10-15分钟，冷却后，滤掉氯化钠，筛出金针菜获得金针菜热炙处理物；
S2、再经速冻、预膨化、真空脱油处理，获得金针菜脱水干燥物，干燥物过40-60目筛进行粉碎，获得金针菜热炙脱水干燥粉碎物；
S3、将金针菜热炙脱水干燥粉碎物：蒸馏水：乳酸菌液态培养基和乳酸菌粉混合，35-40℃密闭培养至OD值为6.2-7.5得到培养物，26-30℃条件下，过滤收集培养物，3500-5000rpm离心15-25min，取离心上清液，弃离心沉积物，并以离心上清液密闭分装，于121℃下高压灭菌15min，冷却后取出，800-1200rpm离心5-10min，去渣且收集离心上清液，将收集的上清液加入无搅拌式超滤装置浓缩至原体积的15％-22％，获得浓缩液即为所述的金针菜提取物；
其中，双降子提取物、白薯莨提取物和金针菜提取物的制备步骤中所述乳酸菌均为嗜盐片球菌。
2.根据权利要求1所述的用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物，其特征在于，以重量百分比计，所述复合提取物包含：双降子提取物48％-52％、白薯莨提取物25％-34％、金针菜提取物15％-26％。
3.根据权利要求1所述的用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物，其特征在于，所述白薯莨提取物制备步骤S3中白薯莨滤渣热炙物与蒸馏水、乳酸菌液态培养基、乳酸菌粉的重量体积比为10：(100-125)：(4-7)：(1-3)，乳酸菌的含量为(4-7)×1010cfu/g。
4.根据权利要求1所述的用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物，其特征在于，所述金针菜提取物制备步骤S3所述的金针菜热炙脱水干燥粉碎物：蒸馏水：乳酸菌液态培养基按重量体积比10：(100-130)：(6-8)进行混合。
5.权利要求1至4任一项所述用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物的制备方法，其特征在于，在25-40℃环境下，将各组分混合，置于35-45℃环境下烘干至含水量低于8％，再经40-50目过筛，所获得的粉碎物为所述复合提取物。
6.权利要求1至4任一项所述用于降低水体半管藻黏附毒力的复合植物提取物的应用。
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