CN114041417A - 一种植物快速育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物快速育种方法。本发明提供了获得植物DH系的方法，包括：以单倍体诱导系作为父本，以杂合基因型的显性雄性不育材料或者光温敏雄性不育材料或经过化学杀雄处理的不育材料作为母本，进行杂交；从所得F1代中鉴定分离出单倍体，加倍，选择可育的加倍后植株，即得目的DH系。本发明所提供的快速DH创制的方法，可显著缩短作物纯系育成的年限，降低工作量，大大减少育种的工作量和成本，进而提高品种的选育效率，为新品种的品种更新换代提供技术支撑。

Description

一种植物快速育种方法

技术领域

本发明涉及育种领域，具体涉及一种植物快速育种方法。

背景技术

小麦、水稻等是自花授粉植物，同时也是最重要的粮食作物，在全世界范围内广泛种植。近年来，我国作物育种水平及品种表现不断提升，使我国小麦、水稻等作物单产和总产不断提高。随着人们生活条件的不断改善，消费者对食品的需求的种类不断多样化，质量进一步提高，因此，对当今小麦水稻等自交作物的新品种的选育提出了新的要求，即不仅需要高产、抗病、抗逆，还要在加工品质、食味品质、营养品质上不断提高，归根结底是对新品种快速更新换代的需求。小麦或水稻等自交作物的传统育种方法一般需要经历杂交和多代自交，周期长、人力物力耗费巨大。而小麦作为自花授粉作物，近百年来，其育种技术未有革命性的进步。因此，亟需新的革命性育种技术，以提高育种的效率，缩短育种周期。

单倍体育种技术是缩短作物育种周期的重要手段。相对于常规育种中连续自交或回交的方法，使用单倍体育种技术能够在1-2年内获得纯系，因此能够缩短育种周期，提高育种效率。近年来，玉米单倍体育种技术研究取得了重要进展。以Stock6衍生诱导系为父本的单倍体诱导***得到了广泛应用。单倍体诱导效率由最初的2％提高到10％以上。玉米单倍体诱导的遗传研究工作在近年来同样取得了重要进展。其中影响单倍体诱导效率位点qhir1中的关键诱导基因ZmPLA1已被证明是控制玉米单倍体诱导的关键基因(Liu et al.,2017；Kelliher et al.,2017；Gilles et al.,2017)。此外还发现ZmDMP的突变也能够在ZmPLA1的基础上，实现玉米单倍体诱导效率的倍增(Zhong et al.,2019)。由于玉米单倍体诱导基因在不同作物中序列上的同源性，单倍体诱导***有望在其他作物中推广应用。如玉米单倍体诱导***可以应用于小麦、水稻等作物的单倍体诱导，有效产生单倍体籽粒(Liu et al.,2019；Yao et al.,2018)。为小麦、水稻等单倍体育种技术体系构建奠定了重要基础。

小麦是严格的自交授粉作物。在小麦育种过程中，因其杂交困难，而难以开展大规模杂交工作，因此，通常小麦育种的过程是连续自交的过程。不育系的使用能够使杂交更加方便。在小麦、水稻及玉米等物种中发现了很多不育系，但95％以上的不育系均为隐性纯合不育，难以在育种过程中应用。太谷核不育是小麦中屈指可数的显性不育系，该材料是高忠丽1972年在山西太谷县发现的，其发现和应用改变了小麦杂交困难的问题，在小麦杂交育种和轮回选择的过程中起到了重要作用。随后，邓景扬等通过遗传分析发现，太谷核不育是一个由单基因控制的显性核不育材料。目前，太谷核不育材料已经被广泛应用于小麦杂交育种与轮回选择。经历数十年研究，太谷核不育基因(MS2)被证明位于第4号染色体的短臂。该基因的启动子区域被太谷反转座子***后，启动了基因的表达，从而导致了雄配子发育的异常，最终导致完全的雄性不育(Ni et al.,2017；Xia et al.,2017)。

虽然太谷核不育材料可以用于小麦育种的轮回选择，能够大大减少杂交授粉的工作量。然而其轮回选择的过程仍需较长的周期。另一方面，虽已利用基因编辑方法创制了小麦诱导系，其单倍体诱导效率能够达到10-20％，但因其需要对诱导母本进行剪颖壳和去雄等复杂的操作，限制了单倍体育种的规模化应用。

发明内容

为了有效解决上述技术问题，本发明旨在提供一种植物快速杂交诱导方法。

第一方面，本发明要求保护一种获得植物DH系的方法。

本发明所要求保护的获得植物DH系的方法，可包括如下步骤：

(A)以植物的孤雌生殖单倍体诱导系作为父本，以所述植物的杂合基因型的显性雄性不育材料或者光温敏雄性不育材料或经过化学杀雄处理的不育材料或导入携带显性雄性不育基因及诱导切除元件的材料作为母本，进行杂交，得到F1代；

(B)从(A)杂交所得F1代中鉴定分离出母本来源的单倍体；

(C)对(B)所得母本来源的单倍体进行染色体加倍，从加倍后植株中选择可育材料，即得所述植物的DH系。这种DH系不携带雄性不育基因，因此可以应用于育种。

其中，所述植物为自花授粉植物。所述植物可为满足如下条件的任何植物：1)能够实现显性不育或化学杀雄或光温敏不育；和2)能够实现单倍体诱导。所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物。

具体而言，所述植物包括但不限于小麦、水稻、高粱、大麦、燕麦、大豆、豌豆、绿豆、花生、芝麻、马铃薯、亚麻、烟草、拟南芥、番茄、油菜、向日葵、黄瓜、甘薯、白菜、萝卜、胡萝卜等。

当所述植物为单子叶植物时，所述孤雌生殖单倍体诱导系为PLA基因被沉默或抑制或敲除的植物。

当所述植物为双子叶植物时，所述孤雌生殖单倍体诱导系为DMP基因被沉默或抑制或敲除的植物。

进一步地，当所述植物为小麦时；所述孤雌生殖单倍体诱导系可为PLA基因被沉默或抑制或敲除的小麦。当所述植物为大麦时；所述孤雌生殖单倍体诱导系为PLA基因被沉默或抑制或敲除的大麦。当所述植物为水稻时；所述孤雌生殖单倍体诱导系为PLA基因被沉默或抑制或敲除的水稻。

进一步地，当所述植物为油菜时；所述孤雌生殖单倍体诱导系为DMP基因被沉默或抑制或敲除的油菜。当所述植物为拟南芥时；所述孤雌生殖单倍体诱导系为DMP基因被沉默或抑制或敲除的拟南芥。

更进一步地，当所述植物为小麦时，所述PLA基因可为小麦A基因组中的PLA-A基因和/或小麦B基因组中的PLA-B基因和/或小麦D基因组中的PLA-D基因。所述方法中，沉默或抑制或敲除小麦基因组中所述PLA基因为突变小麦基因组中所述PLA基因使小麦基因组中PLA基因的表达量降低或使小麦基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换。

更进一步地，当所述植物为大麦时，所述PLA基因可为大麦基因组中的PLA基因。所述方法中，沉默或抑制或敲除大麦基因组中PLA基因为突变大麦基因组中PLA基因使大麦基因组中PLA基因的表达量降低或使大麦基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换。

更进一步地，当所述植物为水稻时，所述PLA基因可为水稻基因组中的PLA基因。所述方法中，沉默或抑制或敲除水稻基因组中PLA基因为突变水稻基因组中PLA基因使水稻基因组中PLA基因的表达量降低或使水稻基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换。

更进一步地，当所述植物为油菜时，所述DMP基因可为油菜基因组中的DMP1A基因、DMP2A基因和/或DMP2C基因。所述方法中，沉默或抑制或敲除油菜基因组中DMP基因为突变油菜基因组中的所述DMP基因使油菜基因组中的所述DMP基因的表达量降低或使油菜基因组中的所述DMP基因发生缺失突变或***突变或碱基替换。

更进一步地，当所述植物为拟南芥时，所述DMP基因可为拟南芥基因组中的DMP8基因和/或DMP9基因。所述方法中，沉默或抑制或敲除拟南芥基因组中DMP基因为突变拟南芥基因组中的所述DMP基因使拟南芥基因组中的所述DMP基因的表达量降低或使拟南芥基因组中的所述DMP基因发生缺失突变或***突变或碱基替换。

更加具体地，所述使小麦基因组中所述PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换可通过CRISPR/Cas9技术实现。

更加具体地，所述使大麦基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换可通过CRISPR/Cas9技术实现。

更加具体地，所述使水稻基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换可通过CRISPR/Cas9技术实现。

更加具体地，所述使油菜基因组中DMP基因发生缺失突变或***突变或碱基替换可通过CRISPR/Cas9技术实现。

更加具体地，所述使拟南芥基因组中DMP基因发生缺失突变或***突变或碱基替换可通过CRISPR/Cas9技术实现。

在本发明的第一个具体实施方式中，所述植物为小麦，所述CRISPR/Cas9的靶序列为SEQ ID No.6。

其中，所述小麦A基因组中的PLA-A基因的序列如SEQ ID No.1所示；所述小麦B基因组中的PLA-B基因的序列如SEQ ID No.2所示；所述小麦D基因组中的PLA-D基因的序列如SEQ ID No.3所示。

所述大麦基因组中的PLA基因的序列如SEQ ID No.4所示。

所述水稻基因组中的PLA基因的序列如SEQ ID No.5所示。

在本发明的第二个具体实施方式中，所述植物为油菜，所述CRISPR/Cas9的靶序列为SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和/或SEQ ID No.13。

其中，所述油菜基因组中的DMP1A基因的序列如SEQ ID No.7所示(对应靶序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.13)；所述油菜基因组中的DMP2A基因的序列如SEQ ID No.8所示(对应靶序列为SEQ ID No.10和SEQ ID No.12)；所述油菜基因组中的DMP2C基因的序列如SEQ ID No.9所示(对应靶序列为SEQ ID No.10和SEQ ID No.12)。

在本发明的第三个具体实施方式中，所述植物为拟南芥，所述CRISPR/Cas9的靶序列为SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和/或SEQ ID No.21。

其中，所述拟南芥基因组中的DMP8基因的序列如SEQ ID No.16所示(对应靶序列为SEQ ID No.18和SEQ ID No.19)；所述拟南芥基因组中的DMP9基因的序列如SEQ IDNo.17所示(对应靶序列为SEQ ID No.20和SEQ ID No.21)。

步骤(A)中，作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料中携带的显性雄性不育基因可为MS2基因(太谷核不育基因)。相应的，所述杂合基因型的显性雄性不育材料的基因型为MS2ms2。

步骤(A)中，所述光温敏雄性不育材料可为光敏型、温敏型或光温互作型雄性不育材料，上述材料在特定光温环境下可表现雄性不育。如油菜pol TCMS在低于15℃部分恢复育性，高于20℃环境下彻底雄性不育。

步骤(A)中，所述经过化学杀雄处理的不育材料是指生长期处于雌雄蕊分化期，通过喷洒化学杀雄剂导致雄性不育的材料。

步骤(A)中，所述导入携带显性雄性不育基因及诱导切除元件的材料，在显性雄性不育基因表达的情况下导致雄性不育，而利用化学诱导后可将显性雄性不育基因切除而恢复育性。

进一步地，步骤(A)中，作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料(小麦)可按照包括如下步骤(a1)或(a2)的方法制备得到：

(a1)将基因型为“rhtrht,MS2ms2”的太谷核不育小麦(高杆雄性不育)与基因型为“rhtrht,ms2ms2”的普通小麦(高杆可育)进行杂交，得到的基因型为“rhtrht,MS2ms2”的F1代(高杆雄性不育)即为步骤(A)中作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料。

(a2)将基因型为“Rhtrht,MS2ms2”的矮败小麦(矮杆雄性不育)与基因型为“rhtrht,ms2ms2”的普通小麦(高杆可育)进行杂交，得到的基因型为“Rhtrht,MS2ms2”的F1代(矮杆雄性不育)即为步骤(A)中作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料。

注：Rht为显性矮杆基因，矮败小麦中的矮秆基因Rht与不育基因MS2紧密连锁。

更进一步地，步骤(a1)中，将所述基因型为“rhtrht,MS2ms2”的太谷核不育小麦(高杆雄性不育)与所述基因型为“rhtrht,ms2ms2”的普通小麦(高杆可育)进行杂交后，开花前根据穗形态辨别F1代中的可育株和不育株(可育株雄穗花药发育正常，可散粉；不育株不能形成饱满的花药组织，花药败育无法正常散粉，在外形上，一般表现为穗颜色浅绿)，去除可育株，剩余不育株即为所述基因型为“rhtrht,MS2ms2”的F1代(高杆雄性不育)。

更进一步地，步骤(a2)中，将所述基因型为“Rhtrht,MS2ms2”的矮败小麦(矮杆雄性不育)与所述基因型为“rhtrht,ms2ms2”的普通小麦(高杆可育)进行杂交后，去除所得F1代中的所有高杆株(包括高杆可育)，剩余的矮杆株即为所述基因型为“Rhtrht,MS2ms2”的F1代(矮杆雄性不育)。

步骤(A)中，作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料可为由双基因控制的杂合光温敏细胞核雄性不育材料Msmsrfrf(油菜)。

注：MS是核不育基因；rf是细胞质育性恢复基因。

进一步地，作为所述母本的杂合基因型的光温敏雄性不育材料可按照包括如下步骤的方法制备得到：将基因型为“MsMsrfrf”的纯合不育材料与基因型为“msmsrfrf”的可育材料进行杂交，得到的基因型为“Msmsrfrf”的F1代即为步骤(A)中作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料。

进一步地，步骤(A)中，所述母本按照包括如下步骤的方法制备得到：构建可以表达不育基因(如Ms7基因)且包含Cre/loxP重组酶与LhGR/pOp6化学诱导***的载体，将该载体转入所述植物，得到的阳性转基因植株即为所述母本(拟南芥)。

其中，所述Ms7基因序列如SEQ ID No.14所示。该基因可由p5126启动子启动表达，所述p5126启动子序列如SEQ ID No.15所示。

进一步地，步骤(A)中，作为母本的所述光温敏雄性不育材料可按照如下方法制备得到：利用隐性基因控制的光温敏感型不育材料与育性正常的材料杂交，F1表现为全部可育，F1自交后代在短日低温下产生育性分离，可育株与不育株分离比为3：1，F1后代自交中的不育株即可作为步骤(A)中的所述母本。育种群体需按照如上步骤导入光温敏雄性不育基因后，可以作为母本进行单倍体诱导。作为母本的所述光温敏雄性不育材料可以是小麦光温敏不育系337S，其在短日低温下表现不育，在长日照高温下表现可育。在本发明的具体实施方式中，作为所述母本的光温敏雄性不育材料为温敏雄性不育油菜pol TCMS。

进一步地，步骤(A)中，作为所述母本的经过化学杀雄处理的不育材料通过喷施化学杀雄剂获得。具体而言，作为母本的经过化学杀雄处理的小麦材料可通过在小麦雌雄分化期喷洒WL84811等化学杀雄剂获得。作为母本的经过化学杀雄处理的油菜材料可通过在油菜抽薹后喷施苯磺隆等化学杀雄剂获得。

步骤(A)中，所述母本和所述父本花期相遇。

进一步地，步骤(A)中，当所述植物为小麦时，所述母本于10月中上旬播种；所述父本次年2-3月分期播种，每七天播种一期，共播种七期，分布于母本材料周围，保证父母本花期相遇。当所述植物为油菜或拟南芥时，所述母本和所述父本于10月上旬播种，所述父本分布于所述母本材料周围。

步骤(A)中，所用杂交方式可采取隔离区开放授粉或单株套袋杂交的方式。

步骤(B)中，进行母本来源的单倍体鉴定的方法可为如下任一：

(b1)荧光鉴定母本来源的单倍体：若作为父本的所述孤雌生殖单倍体诱导系表达荧光蛋白，而作为母本的所述杂合基因型的显性雄性不育材料不表达荧光蛋白，则从(A)杂交所得F1代中选择无荧光特性的植株，即为母本来源的单倍体。

(b2)分子标记鉴定单倍体：利用父母本间多态性分子标记进行鉴定，从(A)杂交所得F1代中选择母本带型的植株，即为或候选为母本来源的单倍体。

(b3)流式细胞检测叶片倍性：提取小麦叶片细胞核，进行流式细胞检测，从(A)杂交所得F1代中选择细胞核信号峰位为六倍体小麦细胞核信号峰位一半的植株，即为母本来源的单倍体；或者，提取油菜叶片细胞核，进行流式细胞检测，从(A)杂交所得F1代中选择细胞核信号峰位为四倍体油菜细胞核信号峰位一半的植株，即为母本来源的单倍体；或者，提取拟南芥叶片细胞核，进行流式细胞检测，从(A)杂交所得F1代中选择细胞核信号峰位为二倍体拟南芥细胞核信号峰位一半的植株，即为母本来源的单倍体。

实际应用中，可以步骤(b2)为初步鉴定，步骤(b3)为进一步鉴定。

步骤(B)中，以杂合显性细胞核雄性不育材料为母本时，所得母本来源的单倍体有两种：一种是携带显性雄性不育基因的母本来源的单倍体(基因型为“rht，MS2”或“Rht,MS2”)；另一种是不携带显性雄性不育基因的母本来源的单倍体(基因型为“rht,ms2”)。或者，以杂合显性细胞核雄性不育材料为母本时，所得母本来源的单倍体有两种：一种是携带显性雄性不育基因的母本来源的单倍体(基因型为“Msrf”)；另一种是不携带显性雄性不育基因的母本来源的单倍体(基因型为“msrf”)。

步骤(C)中，可对所述母本来源的单倍体进行秋水仙素处理实现染色体加倍。当然也可以通过其他手段实现染色体加倍。

步骤(C)中，从加倍后植株中选择可育材料按照可包括如下步骤(c1)或(c2)的方法进行：

(c1)若步骤(A)中作为母本的所述杂合基因型的显性雄性不育材料按照前文步骤(a1)制备得到，则在步骤(C)中开花前根据穗形态辨别可育株和不育株，去除不育株，剩余即为可育的DH系。

(c2)若步骤(A)中作为母本的所述杂合基因型的显性雄性不育材料按照前文步骤(a2)制备得到，则在步骤(C)中去除矮杆株(不育)，剩余即为可育的DH系。

利用该方法获得的DH系也属于本发明的保护范围。

第二方面，本发明要求保护前文所述方法在植物育种中的应用。

第三方面，本发明要求保护一种适用于植物的育种方法。

本发明所要求保护的适用于植物的育种方法，可包括前文所述步骤(A)-(C)。

第四方面，本发明要求保护一种植物的单倍体诱导方法。

本发明要求保护的植物的单倍体诱导方法，可包括前文的步骤(A)和(B)。

利用该方法培育得到的新品种也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述植物可为自花授粉植物。所述植物可为满足如下条件的任何植物：1)能够实现显性不育或化学杀雄或光温敏不育；和2)能够实现单倍体诱导。所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物。

具体而言，所述植物包括但不限于小麦、水稻、高粱、大麦、燕麦、大豆、豌豆、绿豆、花生、芝麻、马铃薯、亚麻、烟草、拟南芥、番茄、油菜、向日葵等。

本发明首先创制小麦单倍体孤雌生殖诱导系，利用CRISPR/Cas9***敲除小麦PLAs基因，获得具备单倍体诱导能力的tapla小麦，所述TaPLA基因可位于小麦A、B、D任一染色体组，从而获得单突(tapla-A或tapla-B或tapla-D)或双突(tapla-AB或tapla-AD或tapla-BD)或三突(tapla-ABD)小麦诱导系。而后组配用于生产小麦DH的基础材料，为避免后期小麦人工杂交工作量大的问题，要求基础材料亲本至少一方携带显性不育基因，如Ms2基因，从而获得目标基础材料的不育系。而后利用含有tapla基因的小麦单倍体孤雌生殖诱导系与杂合基因型的雄性不育系杂交，所用杂交方式可采取隔离区开放授粉、或单株套袋杂交的方式进行。由于携带杂合显性雄性不育基因或光温敏雄性不育系的单株具有雄性不育的特征，因此无需对该母本进行去雄等复杂工作。收获杂交F1种子。而后对所得F1种子进行发苗，利用荧光标记、分子标记、田间表型鉴定等方法对单倍体进行鉴别，并结合流式细胞检测候选单倍体倍性，最后使用秋水仙素对单倍体进行加倍，成苗后移栽和自交，最终获得小麦DH系。本发明所提供的快速DH创制的方法，能够避免大量的杂交授粉工作，从而解决植物特别是自花授粉作物的杂交选系难这一关键技术问题，可显著缩短作物纯系育成的年限，降低工作量，大大减少育种的工作量和成本，进而提高品种的选育效率，为新品种的更新换代提供技术支撑。

附图说明

图1为小麦DH系生产流程图。

图2为细胞流式法验证小麦单倍体倍性。

图3为实施例3中的显性不育载体质粒图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、快速创制小麦DH系

一、利用CRISPR/Cas9***敲除小麦PLAs基因获得突变体，创制小麦单倍体诱导系

利用CRISPR/Cas9***敲除小麦A基因组PLA-A基因(SEQ ID No.1)、B基因组PLA-B基因(SEQ ID No.2)和D基因组PLA-D基因(SEQ ID No.3)，以期获得同时敲除A基因组PLA-A、B基因组PLA-B和D基因组PLA-D的三突小麦，下文称其为小麦单倍体诱导系。

小麦单倍体诱导系的具体制备方法如下：

1、选取靶点

敲除载体设计为单靶点，靶点序列如下：

5’-GACGGTGCTGACCATCGACG-3’(SEQ ID No.6)。

针对靶位点序列设计的sgRNA序列和sgRNA编码DNA序列为如下：

靶位点的sgRNA序列：5’-guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc-3’；

sgRNA的编码DNA序列：5’-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3’。

2、CRISPR/Cas9载体的构建

CRISPR/Cas9载体为将连接靶点的sgRNA的编码DNA序列***pBUN411骨架(pBUN411记载在如下文献中：Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.A CRISPR/Cas9 toolkitfor multiplex genome editing in plants[J].BMC plant biology,2014,14(1):1.)的BsaI酶切位点之间后得到的载体。

3、转基因小麦的获得

CRISPR/Cas9载体通过热激转化转至农杆菌感受态细胞EHA105(华越洋生物科技有限公司产品，公众可通过购买获得)，得到重组菌EHA105/CRISPR/Cas9。再将重组菌EHA105/CRISPR/Cas9采用农杆菌侵染法(重组农杆菌进行28℃扩繁，使用扩繁后的菌液对小麦进行侵染)转化小麦受体材料Fielder(记载于“郭丹丹,李保云.小麦‘Fielder’ω-醇溶蛋白基因及启动子的克隆与序列分析[J].中国农业大学学报,2020,25(07):1-9.”一文)幼胚，经过筛选、分化和生根后获得T0代转基因小麦植株。

4、突变体鉴定

提取T0代转基因小麦植株叶片DNA并利用如下鉴定引物进行PCR扩增，扩增产物进行Sanger测序，并将测序结果与野生型小麦PLAs基因(SEQ ID No.1至SEQ ID No.3)进行比对，PLA突变序列检测引物如下：

用于检测PLA-A基因的引物对：

4AF：5’-GTCAAGATCTCCAGCCGAGAC-3’；

4AR：5’-GGTACTTGCCGCTGTACCT-3’。

用于检测PLA-B基因的引物对：

4BF：5’-AACTCAACATGGGGCGTCCTC-3’；

4BR：5’-ACGTCGTATGTGGAGAAGATGATG-3’。

用于检测PLA-D基因的引物对：

4DF：5’-TTCGGGTCCGGATTCTATTGTG-3’；

4DR：5’-GCAGGTACTTGCCGTTGTACC-3’。

结果获得如下1种转基因事件，小麦A基因组PLA-A、B基因组PLA-B和D基因组PLA-D均发生突变，三个具体突变序列如表1所示。

表1、小麦基因组中三个具体突变序列

经过多代选择后形成稳定突变，并将其称为小麦单倍体诱导系。

二、利用小麦单倍体诱导系与太谷核不育小麦杂交生产DH系

小麦DH系生产流程图可如图1所示。

本实施案例中，采用的母本材料为矮败小麦(Rhtrht,MS2ms2)与济麦22(rhtrht,ms2ms2)杂交形成的F1。采用的父本为上述步骤一所创制的小麦单倍体诱导系，具体操作流程如下：

1、母本材料的种植

母本材料于10月中上旬播种，播种前进行选种拌种，保证发芽率；精细整地施足底肥；播种要深浅一致，并保证留足父本诱导系种植空间；出苗后要及时查苗和补苗。

2、父本诱导系种植

由于父本诱导系材料为春性小麦，为保证父母本花期相遇，父本诱导系于次年2-3月分期播种，每七天播种一期，共播种七期，分布于母本材料周围，保证开花期父母本花期相遇。

3、母本材料的去除

由于母本材料会出现育性分离，需去除可育株保留不育株，常规雄性不育系材料不能形成成熟花药，因此通过对花药大小检查，能够鉴定是否为不育株，保留不育株，去除可育株。在矮败小麦形成的F1中，由于矮秆基因Rht与不育基因MS2连锁，表现为矮秆不育，高秆可育，需去除高秆株保留矮秆株；在太谷核不育小麦形成的F1中，开花前根据穗形态辨别可育株与不育株(可育株雄穗花药发育正常，可散粉；不育株不能形成饱满的花药组织，花药败育无法正常散粉，在外形上，一般表现为穗颜色浅绿)，去除可育株。在开花期，利用竹竿赶粉，保证父母本充分杂交。

4、单倍体鉴定

由于小麦单倍体诱导系具备单倍体诱导能力，在杂交后代可产生大约10-20％的单倍体，其余为杂合六倍体，需对单倍体进行鉴定，鉴定方法如下：

对分子标记鉴定的拟单倍体进行流式细胞检测，具体步骤如下：提取拟单倍体和六倍体小麦幼嫩叶片的细胞核，并以六倍体作为对照，将其细胞核信号峰位设为400(由于单倍体核酸含量为六倍体的一半，因此，单倍体细胞核信号峰位在200附近出现)，若拟单倍体信号峰出现在400附近，则认为其为六倍体；若待测植株细胞核信号峰出现在200附近，则认为其为真单倍体。

流式细胞结果如图2和表2所示。

表2、流式细胞检测叶片倍性

母本类型	拟单倍体数	真单倍体数	准确率
				败育/普通	63	62	98.41％
矮败/普通	70	70	100.00％

5、染色体加倍

以上确认为单倍体的植株可利用秋水仙素等加倍试剂进行加倍，收获当代种子并从中选择可育材料即可获得纯合的DH系(DH系指单倍体加倍成功，自交结实的株数)。具体操作为：苗期分蘖节处理加倍，分蘖期的幼苗放入含秋水仙素0.02％-0.1％(％表示质量百分比)的水溶液中，对分蘖节进行浸泡，在通气泵介导的供氧条件下处理5-10h，然后取出幼苗，流水冲洗3-4h，最后移栽在花盆中，自交收获。

小麦单倍体加倍表现如表3所示。

表3、小麦单倍体加倍表现

母本类型	单倍体苗数	死苗数	成苗数	获得DH数	加倍效率
						败育/普通	30	1	29	24	82.76％
矮败/普通	41	2	39	30	76.92％

实施例2、快速诱导油菜单倍体

一、利用CRISPR/Cas9***敲除油菜DMP基因获得突变体，创制油菜单倍体诱导系

利用CRISPR/Cas9***敲除油菜DMP同源基因BnDMP1A(SEQ ID No.7)、BnDMP2A(SEQ ID No.8)、BnDMP2C(SEQ ID No.9)，构建三突材料，下文称其为油菜单倍体诱导系。

油菜单倍体诱导系的具体制备方法如下：

1、选取靶点

利用CRISPOR网站(http://crispor.tefor.net/)设计靶位点。首先选择油菜为参考基因组，PAM的序列类型为NGG，根据“Doench 2016”评分排序，选择编辑效率高同时脱靶概率低的靶位点。三个基因共设计4个敲除靶点，靶点序列如下：

(1)：5’-CACGAAAATGGAGAAAACAG-3’(SEQ ID No.10)

(2)：5’-GAGAAAACAGAGGAAAGTGT-3’(SEQ ID No.11)

(3)：5’-TGGGATCAGAGTTTACACGA-3’(SEQ ID No.12)

(4)：5’-GAACTCCTTGAGCGACCATG-3’(SEQ ID No.13)

其中，BnDMP1A敲除靶点为(2)和(4)，BnDMP2A敲除靶点为(1)和(3)，BnDMP2C敲除靶点为(1)和(3)。

2、CRISPR/Cas9载体的构建

1)引物设计，携带靶点序列的引物结构如下：

T1-F：tgtggtctcaATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagaaatagcaag

分别将19-nt靶点序列替换引物中的19-nt N即可得到靶位点扩增的正向引物BnDMPs-T1～T4：

BnDMP-T1：tgtggtctcaATTGCACGAAAATGGAGAAAACAGgttttagagctagaaatagcaag

BnDMP-T2：tgtggtctcaATTGAGAAAACAGAGGAAAGTGTgttttagagctagaaatagcaag

BnDMP-T3：tgtggtctcaATTGTGGGATCAGAGTTTACACGAgttttagagctagaaatagcaag

BnDMP-T4：tgtggtctcaATTGAACTCCTTGAGCGACCATGgttttagagctagaaatagcaag

2)PCR扩增，以质粒pBUE411(公众可以由Addgene网站申请获得，https://www.addgene.org/62200/；A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing inplants.Xing HL,Dong L,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ.BMC PlantBiol.2014 Nov 29；14(1):327.10.1186/s12870-014-0327-y PubMed 25432517)为模板，靶点引物BnDMPs-T1～T4分别与方向引物sgRNA-R(tgtggtctcaAGCGTAATGCCAACTTTGTAC)配对进行PCR扩增。

3)将4个PCR产物进行纯化后，分别与U6-26启动子(记载于“Zhong Y,Chen B,LiM,et al.A DMP-triggered in vivo maternal haploid induction system in thedicotyledonous Arabidopsis[J].Nature Plants,2020,6(5):466-472.”一文)连接至MoClo Toolkit试剂盒中的level 1载体(pICH47751，pICH47761，pICH47772和pICH47781)骨架上。其中，靶点1的扩增产物克隆到pICH47751骨架，并由U6-26启动子启动表达，所得重组载体经测序验证正确后命名为pL1-F3。靶点2的扩增产物克隆到pICH47761骨架，并由U6-26启动子启动表达，所得重组载体经测序验证正确后命名为pL1-F4。靶点3的扩增产物克隆到pICH47772骨架，并由U6-26启动子启动表达，所得重组载体经测序验证正确后命名为pL1-F5。靶点4的扩增产物克隆到pICH47781骨架，并由U6-26启动子启动表达，所得重组载体经测序验证正确后命名为pL1-F6。

4)将标签元件pL1-F1-FastR(记载于“Zhong Y,Chen B,Li M,et al.A DMP-triggered in vivo maternal haploid induction system in the dicotyledonousArabidopsis[J].Nature Plants,2020,6(5):466-472.”一文)，35s启动子驱动的基因编辑元件pL1-F2-p35s::hCas9(记载于“Zhong Y,Chen B,Li M,et al.A DMP-triggered invivo maternal haploid induction system in the dicotyledonous Arabidopsis[J].Nature Plants,2020,6(5):466-472.”一文)和上述pL1-F3、pL1-F4、pL1-F5、pL1-F6进一步克隆至level2载体pICSL4723中，获得最终载体。

其中，上述pICH47751，pICH47761，pICH47772和pICH47781和pICSL4723记载于文献“Engler C,Youles M,Gruetzner R,Ehnert T,Werner S,Jones J D G,Patron N J,Marillonnet S.A Golden Gate Modular Cloning Toolbox for Plants[J].ACSSynthetic Biology,2014,3(11):839-843”。

3、转基因油菜的获得

CRISPR/Cas9载体通过热激转化转至农杆菌感受态细胞GV3101感受态细胞(目录号：AC1001，上海唯地生物技术有限公司产品)，得到重组菌GV3101/CRISPR/Cas9。再将重组菌GV3101/CRISPR/Cas9采用农杆菌侵染法(重组农杆菌进行28℃扩繁，使用扩繁后的菌液对油菜进行侵染下胚轴)转化油菜受体材料Westar(记载于文献“Silva N F,Stone S L,Christie L N,et al.Expression of the S receptor kinase in self-compatibleBrassica napus cv.Westar leads to the allele-specific rejection of self-incompatible Brassica napus pollen[J].Molecular genetics and genomics:MGG,2001,265(3):552-559.”中)，经过筛选、分化和生根后获得T0代转基因油菜植株。

4、突变体鉴定

提取T0代转基因油菜植株叶片DNA并利用如下鉴定引物进行PCR扩增，扩增产物进行Sanger测序，并将测序结果与Westar油菜基因DMP序列(SEQ ID No.7至SEQ ID No.8)进行比对，DMP突变序列检测引物如下：

用于检测BnDMP1A基因的引物对：

BnDMP1A-F：5’-TGGACTACGGTTTACACGGC-3’

BnDMP1A-R：5’-GGTTTCATGAACACGGCGAG-3’

用于检测BnDMP2A基因的引物对：

BnDMP2A-F：5’-CCACCACTGGTTAAGCGATACT-3’

BnDMP2A-R：5’-CATGCGACGTTTTCGACCTC-3’

用于检测BnDMP2C基因的引物对：

BnDMP2C-F：5’-CCCTTAGGACTAACGAACTCGC-3’

BnDMP2C-R：5’-CACTTACCGGAATCTCTGCCTC-3’

结果获得1种转基因事件T0-7，其BnDMP1A、BnDMP2A、BnDMP2C均发生突变，三个具体突变序列如表4所示，将其称为油菜单倍体诱导系。

表4、油菜基因组中三个具体突变序列

注：带底纹的为***碱基。

二、利用温敏不育油菜与油菜单倍体诱导系杂交生产单倍体

本实施案例中，采用的母本材料为温敏雄性不育油菜pol TCMS(记载于“杨立勇,刘平武,杨光圣.小孢子培养技术纯化与选育Pol TCMS不育两用系[J].中国油料作物学报,2006(02):115-118+124”一文)，采用的父本为上述步骤一所创制的油菜单倍体诱导系，具体操作流程如下：

1、材料的种植

材料于10月中上旬播种于小盆中，待苗生长至4-5片叶时移至大盆中，每盆可移栽2-3株。

2、父母本杂交

由于材料种植于温室中，缺少虫媒以及风媒传粉，取油菜单倍体诱导系的雄蕊，在母本雌蕊柱头上蘸一下，完成杂交。

3、单倍体鉴别

3.1荧光鉴定

由于油菜单倍体诱导系携带荧光标记，母本材料无荧光标记，将杂交收获的种子进行发芽，根据胚芽是否携带荧光分为有荧光种子和无荧光种子。将无荧光种子播种至穴盘中，出苗后进行下一步鉴定。

3.2分子标记鉴定单倍体

由于单倍体不含有父本染色体片段，因此，利用父母本间多态性分子标记可实现单倍体的初步鉴别，表现为母本带型的为单倍体。具体流程如下：首先提取油菜单倍体诱导系(父本)和pol TCMS油菜(母本)叶片DNA，利用PCR扩增的方法筛选获得多态性分子标记，分子标记信息如下：

A07-1 F：5’-CGGGGCCATAAAAACAGTGAAG-3’

A07-1 R：5’-GCCTTCAGCGACTTGAACATC-3’

对荧光鉴定中区分得到的无荧光种子发苗后，提取叶片DNA，利用上述分子标记进行PCR扩增，产物进行电泳鉴定，表现为与母本带型一致的样本为拟单倍体样本，分子标记鉴定结果如表5所示。

表5、分子标记鉴别单倍体

有荧光数	无荧光数	拟单倍体数
			254	11	8

3.3流式细胞检测叶片倍性

对分子标记鉴定的拟单倍体进行流式细胞检测，具体步骤如下：提取拟单倍体和四倍体油菜幼嫩叶片的细胞核，并以四倍体油菜作为对照，将其细胞核信号峰位设为100(由于单倍体核酸含量为六倍体的一半，因此，单倍体细胞核信号峰位在50附近出现)，若拟单倍体信号峰出现在100附近，则认为其为四倍体；若待测植株细胞核信号峰出现在50附近，则认为其为真单倍体。

流式细胞结果如表6所示。

表6、流式细胞检测叶片倍性

拟单倍体数	真单倍体数	准确率
			8	8	100％

实施例3、快速诱导拟南芥单倍体

一、构建表达不育基因Ms7、并结合Cre/loxP重组酶与LhGR/pOp6化学诱导***的载体，创制拟南芥母本显性不育系

1、不育载体的构建

具体构建方法如下：

(1)花药高表达启动子选择

根据筛选，选取在玉米花药中高表达的启动子p5126来驱动Ms7基因，基因序列如SEQ ID No.14所示、p5126启动子序列如SEQ ID No.15所示。

(2)基于Golden Gate方法的载体构建

利用MoClo Toolkit试剂盒(Kit#1000000044)构建显性不育载体。以玉米B73的DNA为模板，利用引物对p5126F/R扩增获得启动子p5126序列(SEQ ID No.15)，并克隆至Level 0载体pICH41295(记载于A modular cloning system for standardized assemblyof multigene constructs.Weber E,Engler C,Gruetzner R,Werner S,MarillonnetS.PLoS One.2011 Feb 18；6(2):e16765.doi:10.1371/journal.pone.0016765.10.1371/journal.pone.0016765 PubMed 21364738)中获得level0-p5126。以玉米B73的DNA为模板，利用引物对ZmMs7-CDS1F1/R1、ZmMs7-CDS1F2/R2和ZmMs7-CDS1F3/R3分三段扩增获得Ms7基因序列，再通过无缝克隆形成完整的Ms7序列(SEQ ID No.14)，并克隆至Level 0载体pICH41308(记载于文献“Engler C,Youles M,Gruetzner R,Ehnert T,Werner S,Jones JD G,Patron N J,Marillonnet S.A Golden Gate Modular Cloning Toolbox for Plants[J].ACS Synthetic Biology,2014,3(11):839-843”)中获得level0-ZmMs7-CDS1。level0-p5126和level0-ZmMs7-CDS1通过BsaI酶切连接至pICH47751(记载于A modular cloningsystem for standardized assembly of multigene constructs.Weber E,Engler C,Gruetzner R,Werner S,Marillonnet S.PLoS One.2011 Feb 18；6(2):e16765.doi:10.1371/journal.pone.0016765.10.1371/journal.pone.0016765PubMed 21364738一文)中，获得显性雄性不育基因表达元件：p5126:Ms7。各引物序列如表7所示。

表7、引物序列

Cre基因和LhGR/pOp6元件交由金斯瑞公司进行合成。分别获得p2x35s:eGFP-P2A-LhGR-Ter35S(SEQ ID No.22)和pOp6::TaCre-int-TerE9(SEQ ID No.23)表达元件。这些元件与显性雄性不育基因表达元件p5126:Ms7和拟南芥种子荧光表达元件：pAtOlesin::eGFP-TerOlesin(SEQ ID No.24)一起，通过golden gate方法克隆至level 2载体pICSL4723(记载于文献“Engler C,Youles M,Gruetzner R,Ehnert T,Werner S,Jones JD G,Patron N J,Marillonnet S.A Golden Gate Modular Cloning Toolbox for Plants[J].ACS Synthetic Biology,2014,3(11):839-843)中，经测序验证正确后获得最终载体，其示意图如图3所示。

2、转基因拟南芥显性雄性不育系的获得

步骤1构建的不育载体通过热激转化转至农杆菌感受态细胞GV3101感受态细胞(目录号：AC1001，上海唯地生物技术有限公司产品)，得到重组菌GV3101/MS2。再将重组菌GV3101/MS2采用农杆菌蘸花侵染法(重组农杆菌进行28℃扩繁，使用扩繁后的菌液对拟南芥进行蘸花侵染)转化拟南芥受体材料Col-0，经过GFP荧光筛选获得的转基因拟南芥植株，即为显性雄性不育系。

二、利用母本显性不育拟南芥与拟南芥单倍体诱导系杂交生产单倍体

1、材料的种植

将拟南芥种子消毒后种入1/2MS培养基上，于恒温光照培养箱培养，培养条件：22℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度60～70％。待长出四片真叶时将其移入装满土的育苗钵中，一个钵移植4株，于温室中继续培养。

2、父母本杂交

由于材料种植于温室中，缺少虫媒以及风媒传粉，取拟南芥单倍体dmp8dmp9诱导系(即AtDMP8和AtDMP9双基因突变体，记载于文献“Zhong Y,Chen B,Li M,Wang D,Jiao Y,Qi X,Wang M,Liu Z,Chen C,Wang Y,Chen M,Li J,Xiao Z,Cheng D,Liu W,Boutilier K,Liu C,Chen S.A DMP-triggered in vivo maternal haploid induction system in thedicotyledonous Arabidopsis[J].Nature Plants,2020,6(5):466-472.”，AtDMP8基因如SEQ ID No.16所示，AtDMP9基因如SEQ ID No.17所示)刚开放的小花，在步骤一得到的拟南芥显性雄性不育系雌蕊柱头上蘸两至三下，完成杂交。

3、单倍体鉴别

3.1荧光鉴定

由于拟南芥单倍体诱导系携带RFP荧光标记，母本材料无RFP荧光标记，用荧光探照灯进行观察筛选，杂交收获的二倍体种子呈强荧光，拟单倍体种子为弱荧光，将弱荧光种子播种至1/2MS培养基中，出苗后进行下一步鉴定。

3.2分子标记鉴定单倍体

由于单倍体不含有父本染色体片段，因此，利用父母本间多态性分子标记可实现单倍体的初步鉴别，表现为母本带型的为单倍体。具体流程如下：首先提取拟南芥单倍体诱导系(父本)和拟南芥母本显性不育系(母本)叶片DNA，利用PCR扩增的方法筛选获得多态性分子标记，分子标记信息如下：

DMP8F1：5’-TGCGAAATGAGATTGGTTTTGGG-3’

DMP8R1：5’-AAACACCCTGTGACTCTCCG-3’

DMP9F1：5’-ATAACCGTCAATAACCGCCG-3’

DMP9R2：5’-CCAGTCATGCAACCAACACC-3’

对荧光鉴定中区分得到的弱荧光种子发苗后，提取叶片DNA，利用上述分子标记进行PCR扩增，产物进行电泳鉴定，表现为与母本带型一致的样本为拟单倍体样本，分子标记鉴定结果如表8所示。

表8、分子标记鉴别单倍体

有荧光数	弱荧光数	拟单倍体数
			479	16	14

3.3流式细胞检测叶片倍性

对分子标记鉴定的拟单倍体进行流式细胞检测，具体步骤如下：提取拟单倍体和二倍体拟南芥幼嫩叶片的细胞核，并以二倍体作为对照，将其细胞核信号峰位设为100(由于单倍体核酸含量为二倍体的一半，因此，单倍体细胞核信号峰位在50附近出现)，若拟单倍体信号峰出现在100附近，则认为其为二倍体；若待测植株细胞核信号峰出现在50附近，则认为其为真单倍体。

流式细胞结果如表9所示。

表9、流式细胞检测叶片倍性

拟单倍体数	真单倍体数	准确率
			14	11	78.5％

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业大学

<120> 一种植物快速育种方法

<130> GNCLN212912

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2733

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

aaagaaaaac acaaaaaaga gaagaaagac gaaatccgat gaaaaccgga ccagtccaag 60

caacaggcag aaacaagaaa aagattccct caaaaaaaca agaaaaagaa ccaacgaaac 120

tctacagcga gctagctagc gaacgaacca aaaaaaaacc cggtcaagat ctccagccga 180

gacttcactt acgcttcgtc atgagcgata catagaatag tttgcagtga actcagcttg 240

ggccgtcttc agtttggtca gagtgaacgc gctctcgcac tgtgtgcgcc acgacataag 300

accgaccggt tccttcttct tccactgcat gtctgcatgt cttcagttaa ccacacccgc 360

aaactgttta ctgtttactg tgccctctct cactccaaaa atagaccagc gcgcgctacg 420

gcatgaacca tggcagccac tcgctcgccg ctagcaaacc caccaattac cgccatcggt 480

ctgcctaccc tctcgtgcgg cgatcgatcc cgtcttcttc ctcctgattc tcgaccgagg 540

tgtcgtacgt cggtttgcaa cgtcggctga tcgatcggac gcgtggccgc cgggtcgatg 600

atggcaagct actggtgccg gcggccctgc gagtcgtgca gcacgcgggc gatggcgggc 660

agcgtggtcg gccagccggt ggcgccgggg cagcgggtga cggtgctgac catcgacggg 720

ggcggcatcc gcggcatcat cccgggcacc atcctcgact tcctcgaggc caagctgcag 780

gagctggacg gcccgggcgc gcgcctggcc gactacttcg actgcatcgc cggcaccagc 840

accggcggcc tcatcaccgc catgatcacc gcgcccggca aggacggccg cccgctcttc 900

gccgccaggg acgtcaaccg cttctacctc gacaacgggc cctacatctt ccctcaaagg 960

cgagagcacg aacgatctca tctcatggac atggatcatg cgagctgaac tggtggttga 1020

tgtgtggatt gtgttgagct gtgccaggag gtgcgcgctc gccgcggtga ccgcatcgct 1080

gaggcggccg aggtacagcg gcaagtacct gcacggcaag atcaggagca tgctcggcga 1140

gacgaggctg tgcgacgcgc tcaccgacgt cgtcatcccc accttcgacg tcaagcttct 1200

ccagcccatc atcttctcca catacgacgt atatatgcta attttatact tggatcatgg 1260

atcagacaga catggggcta aaaacgtgat ggatcatgtg tgcgtgcgtg caggccaaga 1320

gcatgcccct gaagaacgcg cggctcgccg acatctgcat cggcacctcc gccgccccga 1380

cctacctccc cgcgcaccac ttccacaccc acgacggcaa cggcaaggag cgcgagtaca 1440

acctcatcga cggcggcgtc gccgccaaca atccggtaac caatcaagcg tctgtccgtc 1500

tgtcagatgt tcagacacgc ttgcccgacc cgatcacact gatgaactga gctgtgacaa 1560

acgcagacga tggtggcgat gacgcagatc accaagaaga tgatgggcaa ggacagggag 1620

gagctgtacc cggtgaagcc gtcggactgc ggcaagttcc tggtgatgtc cgtcggcacc 1680

ggctcgacgt ccgaccaggg gctgtacacg gcgaagcagt gctcccagtg gggcatcatc 1740

agctggctcc gcaacaaggg catggcgccc atcatcgaca tcttcatggc agccagctcc 1800

gacctcgtcg acatccacgc cgccgtgctc ttccagtcgc tgcacagcga cggcgactac 1860

ctccgcatcc aggacaactc gctccacggc ccggcggcca cggtggacgc tgccacgccc 1920

gagaacatgg cggagctcct caggatcggc gagcggatgc tggcgcagag ggtgtccagg 1980

gtgaacgtcg agaccgggag gtacgaggag gtaaaggggg ccgggagcaa cgccgacgcg 2040

ctcgccgggt tcgccaggca gctctccgac gagaggagga caaggctcga gcgccggcgt 2100

ggtggcgccg gccgtctgaa atccagacgc tgaccttgta gcttagcgtg gcttagtttc 2160

atttattttc tatataaatt tttggcgggg atagatagag aaagcttttc acatggataa 2220

tgaaaggaaa tgatgagctc aagaaaaata acaacacttt tttttgcgta gtcaagaaaa 2280

aataacaaga cttgatgaaa ccaaaatgcc tctcaattgg tcaccatggc aattgtatat 2340

ccctttcgac atcatcatca tgaataaatc aacagtgaac aagagagcaa acgaccaaca 2400

aaaatttaca caaagcctcc tacctatttc ggcaagcttc aaaataaatg aatggattgc 2460

agcatagaaa gaaaagaaaa acctgaccta tacaacagaa cactgggaac atcggttaga 2520

cgatcatcgg gactctgcct gcttgccggc ttcagtccgc ggatcatcgc aaacagtaac 2580

ttgcacaggc aaggctgcaa atgtgctcac cttacagtga ctgtatcctt gcttccactg 2640

cacaggcttg aattggccag gcactcgtgg gggttagcgt agaaataatc ctcctctttc 2700

ggcttgtttt cgagttttcg ccgacaggac ggt 2733

<210> 2

<211> 2768

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ttccaccatg caaaccaatg caacctctta tgtggcatca tcaccctaca aaaaacgaga 60

taccgcatct gtaattcctt ttgcaaactt ttttaagtat aacttgagca atggacttaa 120

ttagaacctc tatctccgga agacatgcat ttctccttcc aaccagtaag tttaagaatt 180

aagatctgcc tcctaccaca gtcgatatgg gatttaagca actattcggg aaccatttgc 240

agtgaactca acatggggcg tcctcagttt ggtgagagag tggaccgcgc tctcgcactg 300

tctacgccaa gaccgaccgg ttccttcttc cactgcatgt cttcagttaa ccacacccgc 360

atctgtttac tgtaccctct ctcagtccaa aaatagacga gcgcgcgcta cggcacaagc 420

cattgcagcc actcgctcgc cgctagcaaa tccaccaatt actaccatcg atctgggtac 480

cctcttgtgc ggcgaccgat ctcgtcttct tcttcctctt gattgtcaac cgaggtgccg 540

tcagtttgca acggcggctg atcgatcaga cgcgcgcgcg cgtgcgtggc cgccgggtcg 600

atgatggcaa gctactggtg ccggcgcccc tgcgagtcgt gcagcacgag ggcgatggcg 660

ggcagcgtgg tgggccagcc ggtggctccg gggcagcggg tgacggtgct gaccatcgac 720

gggggcggca tccgcggcct catcccgggc accatcctcg ccttcctcga ggccaagctg 780

caggagctgg acgggccggg cgcgcgcctg gccgactact tcgactgcat cgccggcacc 840

agcaccggcg gcctcatcac cgccatgatc accgcgcccg gcaaggacgg ccgcccgctc 900

ttcgccgcca aggacgtcaa ccgcttctac ctcgacaacg ggccctacat cttcccgcaa 960

aggtgagagc acgaacgatc tcatctcatg gacatggatc atgcgcgctg aactggtgat 1020

tgatgtatga attgcattga gttgtgccag gaggtgcgcg ctcgccgcgg tgaccgcgtc 1080

gctgaggcgg ccgaggtaca acggcaagta cctgcacggc aagatcagga gcatgctcgg 1140

cgagacgagg ctgtgcgacg cgctcaccga cgtcgtcatc cccaccttcg acgtcaagct 1200

tctccagccc atcatcttct ccacatacga cgtatgctaa ttttatacga ggactaatgt 1260

gatgatcaga tcgatccatc cttggatcat ggatcagaca gacatggggc taaaaacgtg 1320

atggatcatg cgtgcgtcgt ccgtgcaggc caggtgcatg cccctgaaga acgcgcggct 1380

cgccgacgtc tgcatcggca cctcggccgc tccgacctgc ctccccgcgc accacttcca 1440

cacccacgac ggcaacggca aggagcgtga gtacaacctc atcgacggtg gcgtcgccgc 1500

caacaatccg gtaaccaatc aagcgtctgc ccgtcggtca gatgttcaga cacgcttgcc 1560

cgacccgagc acactgacca actgagctgt gagaaatgca gacgatggtg gcgatgacgc 1620

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acacggcgaa gcagtgctcc cagtggggca tcatcagctg gctgcgcaac aagggcatgg 1800

cgcccatcat cgacatcttc atggcggcca gctccgacct cgtcgacatc cacgccgccg 1860

tgctcttcca gtcgctgcac agcgacgcca actacctccg catccaggac aactcgctcc 1920

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<210> 3

<211> 2768

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

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tattagtcgt ttgcagaata aagttagtca cgagctcacc gcgtacggcc gcggcacatc 120

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<211> 2731

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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<210> 5

<211> 3010

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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gaaataacat gttacggaga gatttttgaa agttacatac aagttacact atagttacag 120

tgtaattaca tgcaagttat agtgtaatta tactataatt gtactgtaat tacatctgtc 180

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<212> DNA

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<213> Artificial sequence

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ctcttgatgt tcgaaatggt tcttccttca atctaccgcg acggagactg taacggaatc 300

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atggagaaaa cagaggaaag cgttgggatc agagtttaca cgacggcgac tccgccgcaa 60

aaaccatcac caccactgac tcactcacca aaacccgtct caatctcgtc acttcctaca 120

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<210> 10

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

gagaaaacag aggaaagtgt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

tgggatcaga gtttacacga 20

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<211> 20

<212> DNA

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gaactccttg agcgaccatg 20

<210> 14

<211> 2016

<212> DNA

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atggctgcca ataataagac gacgatggtg gtcagcctgg ggagctcgcg gcggcggaag 60

cgcggcgaga tgctgttccg gttcgagtcc ttctgccagc ccggctaccc cgctccgctc 120

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ggcaaccaca tcgtcggcaa ctacgtcgtg cggcgcgcga tgaacccggt gaccaaggtg 1200

ctcgagtact gcctggagga cgtgtccagc gtgctcccgg cggtgggcgg cgtgccgagc 1260

aacggcggcg gcaagatgag ggtccggttc cagctcacgc gggcgcagct catgagggac 1320

ctgatgcacc tgtaccgcca cgtgctgaag gagccgagcc aggcgctcac caccggcgcc 1380

ttcggcgcga tccccgtggc ggcgcggatg gtcttggaca ccaagcactt cgtcaaagat 1440

taccacgaag gtttcgctcc gatcaacagt gttggagttg ggcacgtcca catgaacctg 1500

tgttgcacgc tgcttctgaa gaacgggggt ccggagctgg tggcgccgta cgagacggtc 1560

accctgccgg cgcatgcaac ggtgggcgag ctcaaatggg aggcgcagag gctgttcagt 1620

gagatgtacc tcggcctaag gaccttcacg gccgagtccg tcgccggggt cggcgtcagc 1680

caggacgctt gcccggtgct cgggctcatc gacgtgggaa gcgtcgtggt gatcgaagga 1740

tcagtcgtcg agcagcagca gctggcggat gaaagcgtac gtacagggag cgaggccgcg 1800

tctgtgagcg agggaggcgg cgacagcgag agggtcgtgg actgcgcgtg cggagcggat 1860

gacgacgacg gggagcgcat ggcgtgctgc gacatctgcg aggcgtggca gcacacccgg 1920

tgcgcgggga tcaaggacac cgacgacgcc ccgcacgttt tcgtctgcaa ccgctgcgac 1980

aacgacgttc tgtcattccc tcccttgagc tgttag 2016

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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tatgatttag aataatatac aaatatatta cataaaaaat atattaattg aattagtgtt 60

gtctaattta taattattag aatgtaattc aattccaacg aaacaacggg gccttaggtt 120

taatatcttc cttacactgc gaaaatgttg ttacacttgc caaaaaaaat caatcgcata 180

tttaccttac aaggacatat tttagcaaaa tgctatagac atgaatccaa cgtaatcaat 240

agagtgagat ttactggtaa actaccaatt gctcatctgc tcggtaccaa ccagcctttc 300

ctattaccat gcacatgttg cctctcaact gcagcatctt tcaagccgtg agcagacatg 360

ttgcagatcg aagtaaggta tatatgtgca tagtctccta attcttcatc ttcaacctct 420

agctgattga tctctggtat ttaccactct ttccttcctt ccttccttca attctaaata 480

ccacaaatca aagttgcttt gcg 503

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<211> 940

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

tgaagcagta gcagttctgg aaacaacaaa aatttgataa accgtcgtac taaagatagt 60

tcgaacaaaa atccaaaaca catttctcat ttcacaaaac aaacgaaaac tattgagtca 120

caaaacacag agagaatgga gaaaacagag gaaagcgtcg gaatcagagt ttacacgacg 180

acaacgacgc aaaatccgtc accaacatcg tctcggtcgc ccaaacctgt ccctctctct 240

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tgtaacggaa tcaacacact catgattcat cttctcttgc ttctttgcgc aatgtcttgt 480

ttcttcttcc atttcaccga cagtttcaaa gcctccgatg ggaaaattta ctacggtttt 540

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gatgtgattg cagagaagga gattccggtg acggatgaga ggtataagtt gagggttaat 660

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tacggtgtcg gatgcatgtc tacataataa ctaatttcac ttttctgttg ttttgtgatt 900

ttttaagtat cttttttttg tagtatttgc cttgtaattt 940

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<212> DNA

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caaaagaaaa aaacagagag aaacacacga aaatggagaa aacagaggaa agcgtcggaa 60

tcagagttta cacggcgact ccgccgcaaa aaccatcacc atcaccacct tctcgttcac 120

caaaacccgt cttaatctct tcattgcctt ccctcccgtc aggagccgcc gctggaggag 180

gaagaggtcg aaaacgtcgc atggtggcgc aaggagttca aaaaacggtt tcgaagacat 240

caatgctcgt caacttcctt ccgacaggaa cactcttgat gttcgaaatg gttcttccat 300

caatataccg tgacggagac tgtaacggaa tcaacacact catgattcat ctcctcttgc 360

ttctttgcgc aatgtcttgt ttcttcttcc attttaccga cagtttcaaa gcatccgatg 420

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ggtataagtt gacggttaat gactttgttc atgcagtgat gagcgttttg gtgtttatgg 600

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tggatcaagt tatggagagt tttccaataa tggttggaat tgtttgtagt gctttgtttc 720

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ttctgttttt tggtttgttt tagtatctat ttcgtatttt ccttgtaatt tagattatct 840

gatttaaact ccaatgttct actattttta tctattgtat tgttaaa 887

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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gagaaaacag aggaaagcgt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

aagaggtcga aaacgtcgca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

tcaagagtgt tcctgtcgga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

atgaacaccg cgagtccacg 20

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<211> 8433

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 60

aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 120

ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 180

ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 240

tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 300

cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 360

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gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 480

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ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 600

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tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 780

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gaactatgac gaccaagaag cgaaaaaccg ccggcgagga cctggcaaaa caggtcagcg 1440

aggccaagca ggccgcgttg ctgaaacaca cgaagcagca gatcaaggaa atgcagcttt 1500

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tgtacaggcg gcctccactg ctatggcatc ttggtcatca agcgggtagt tgattatgag 3660

tcctgatacc ctctgcgcca acaaattgtg cacggcggcc ttacaagctt cgactcctga 3720

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gcttactgtt tggtgggaca cgccggcgta ctctgcaaca tcatagagtg taactggctt 4020

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tatggtcttg ttggggttct cgcttgtatc ctgcgaaaca cctgcagtgg cctgctggat 4860

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gtccatgccg agagtgatcc cggcggcggt cacgaactcc agcaggacca tgtgatcgcg 5040

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gtgctccacc atgttatcac atcaatccac ttgctttgta gacgtggttg gaacctcttc 6240

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ttctactgtc ctttcgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc 6420

cgaaattatc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttga tcttctgaga ctgtatcttt 6480

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cttgcttgtc ttcacagagt ggggcccact gcatccaccc cagtacatta aaaacgtccg 6600

caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata tcctgccacc 6660

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cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 7560

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gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 8160

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gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 8400

gagataggtg cctcactgat taagcattgg taa 8433

<210> 23

<211> 6604

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

cctgatctgg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 60

ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc 120

gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt taaaccactt cgtgcagaag acaatctggg 180

agaattgtga gcgctcacaa ttgaaagact agaaagaaga aagggaagag aaagaattgt 240

gagcgctcac aattgaaaga ctagaaagaa gaaagggaag agaaagaatt gtgagcgctc 300

acaattgaaa gactagaaag aagaaaggga agagaaagaa ttgtgagcgc tcacaattga 360

aagactagaa agaagaaagg gaagagaaag aattgtgagc gctcacaatt gaaagactag 420

aaagaagaaa gggaagagaa agaattgtga gcgctcacaa ttgaaagact agtggatcga 480

tcttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgaatg 540

tcaaatttgt taacagttca tcaaaatctc ccggcgctgc cggtggatgc aacttctgat 600

gaagttagga agaacttgat ggacatgttc cgcgacaggc aagcattttc tgagcacact 660

tggaagatgc tgctatctgt ctgtcgctcg tgggcggcgt ggtgcaagct aaacaacaga 720

aaatggttcc ctgcagaacc agaagatgtg agagactacc tgctgtatct gcaagctcgg 780

ggacttgccg tcaagaccat ccagcagcac cttggacagc tcaacatgct ccaccgccgc 840

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taatggataa gatccaaaaa tgacactttt aaccaagatt gtacgaagat ctttttaaac 1080

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gcatcgccta taacactctc ctcaggattg ctgaaatagc acggatacga gtcaaggaca 1260

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tcagcgtatc gggagtcgcc gacgacccca acaattatct cttctgccgt gtccggaaaa 1440

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ttgaggccac ccatcggctt atttacggcg ccaaggatga ttccgggcag aggtaccttg 1560

catggagcgg ccacagcgcg cgggttggtg ctgcgagaga tatggcgcgt gctggtgtat 1620

ccatcccgga gatcatgcag gccggcggct ggaccaacgt gaacatcgtg atgaactaca 1680

tcaggaattt ggatagtgag acaggagcca tggtaagact gctcgaggac ggcgactgag 1740

cttagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca atgcatcagt 1800

ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gtttgagtat tatggcattg ggaaaactgt 1860

ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg ttttcgctat 1920

cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc cttttgttca 1980

ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat ttgaaattat 2040

aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc ctctaatgac 2100

cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat tcactaggca 2160

acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag tatgtcctct 2220

tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct tgtcagattc 2280

taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta tgaaaatatt 2340

ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacga attcgtaatc atggtcatag 2400

ctgtttcctg cgctccatgg gaattcgtaa ttgtcttcac agagtggggc ccactgcatc 2460

caccccagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 2520

ttacaccaca atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca 2580

caaaatcacc actcgataca ggcagcccat cagtcagatc aggatctcct ttgcgacgct 2640

caccgggctg gttgccctcg ccgctgggct ggcggccgtc tatggccctg caaacgcgcc 2700

agaaacgccg tcgaagccgt gtgcgagaca ccgcggccgc cggcgttgtg gatacctcgc 2760

ggaaaacttg gccctcactg acagatgagg ggcggacgtt gacacttgag gggccgactc 2820

acccggcgcg gcgttgacag atgaggggca ggctcgattt cggccggcga cgtggagctg 2880

gccagcctcg caaatcggcg aaaacgcctg attttacgcg agtttcccac agatgatgtg 2940

gacaagcctg gggataagtg ccctgcggta ttgacacttg aggggcgcga ctactgacag 3000

atgaggggcg cgatccttga cacttgaggg gcagagtgct gacagatgag gggcgcacct 3060

attgacattt gaggggctgt ccacaggcag aaaatccagc atttgcaagg gtttccgccc 3120

gtttttcggc caccgctaac ctgtctttta acctgctttt aaaccaatat ttataaacct 3180

tgtttttaac cagggctgcg ccctgtgcgc gtgaccgcgc acgccgaagg ggggtgcccc 3240

cccttctcga accctcccgg cccgctaacg cgggcctccc atccccccag gggctgcgcc 3300

cctcggccgc gaacggcctc accccaaaaa tggcagcgct ggccaattcg tgcgcggaac 3360

ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 3420

ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 3480

cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 3540

ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 3600

tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 3660

cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 3720

actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 3780

aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 3840

tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 3900

ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 3960

tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 4020

gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 4080

gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 4140

tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tggttctcgc ggtatcattg cagcactggg 4200

gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat 4260

ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact 4320

gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 4380

aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 4440

ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 4500

ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 4560

tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 4620

gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 4680

agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 4740

taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 4800

gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 4860

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 4920

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 4980

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 5040

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 5100

acggttcctg gcagatccta gatgtggcgc aacgatgccg gcgacaagca ggagcgcacc 5160

gacttcttcc gcatcaagtg ttttggctct caggccgagg cccacggcaa gtatttgggc 5220

aaggggtcgc tggtattcgt gcagggcaag attcggaata ccaagtacga gaaggacggc 5280

cagacggtct acgggaccga cttcattgcc gataaggtgg attatctgga caccaaggca 5340

ccaggcgggt caaatcagga ataagggcac attgccccgg cgtgagtcgg ggcaatcccg 5400

caaggagggt gaatgaatcg gacgtttgac cggaaggcat acaggcaaga actgatcgac 5460

gcggggtttt ccgccgagga tgccgaaacc atcgcaagcc gcaccgtcat gcgtgcgccc 5520

cgcgaaacct tccagtccgt cggctcgatg gtccagcaag ctacggccaa gatcgagcgc 5580

gacagcgtgc aactggctcc ccctgccctg cccgcgccat cggccgccgt ggagcgttcg 5640

cgtcgtcttg aacaggaggc ggcaggtttg gcgaagtcga tgaccatcga cacgcgagga 5700

actatgacga ccaagaagcg aaaaaccgcc ggcgaggacc tggcaaaaca ggtcagcgag 5760

gccaagcagg ccgcgttgct gaaacacacg aagcagcaga tcaaggaaat gcagctttcc 5820

ttgttcgata ttgcgccgtg gccggacacg atgcgagcga tgccaaacga cacggcccgc 5880

tctgccctgt tcaccacgcg caacaagaaa atcccgcgcg aggcgctgca aaacaaggtc 5940

attttccacg tcaacaagga cgtgaagatc acctacaccg gcgtcgagct gcgggccgac 6000

gatgacgaac tggtgtggca gcaggtgttg gagtacgcga agcgcacccc tatcggcgag 6060

ccgatcacct tcacgttcta cgagctttgc caggacctgg gctggtcgat caatggccgg 6120

tattacacga aggccgagga atgcctgtcg cgcctacagg cgacggcgat gggcttcacg 6180

tccgaccgcg ttgggcacct ggaatcggtg tcgctgctgc accgcttccg cgtcctggac 6240

cgtggcaaga aaacgtcccg ttgccaggtc ctgatcgacg aggaaatcgt cgtgctgttt 6300

gctggcgacc actacacgaa attcatatgg gagaagtacc gcaagctgtc gccgacggcc 6360

cgacggatgt tcgactattt cagctcgcac cgggagccgt acccgctcaa gctggaaacc 6420

ttccgcctca tgtgcggatc ggattccacc cgcgtgaaga agtggcgcga gcaggtcggc 6480

gaagcctgcg aagagttgcg aggcagcggc ctggtggaac acgcctgggt caatgatgac 6540

ctggtgcatt gcaaacgcta gggccttgtg gggtcagttc cggctggggg ttcagcagcc 6600

agcg 6604

<210> 24

<211> 5985

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 60

aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 120

ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 180

ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 240

tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 300

cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 360

gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 420

gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 480

tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 540

ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 600

gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 660

ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 720

tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 780

ttacggttcc tggcagatcc tagatgtggc gcaacgatgc cggcgacaag caggagcgca 840

ccgacttctt ccgcatcaag tgttttggct ctcaggccga ggcccacggc aagtatttgg 900

gcaaggggtc gctggtattc gtgcagggca agattcggaa taccaagtac gagaaggacg 960

gccagacggt ctacgggacc gacttcattg ccgataaggt ggattatctg gacaccaagg 1020

caccaggcgg gtcaaatcag gaataagggc acattgcccc ggcgtgagtc ggggcaatcc 1080

cgcaaggagg gtgaatgaat cggacgtttg accggaaggc atacaggcaa gaactgatcg 1140

acgcggggtt ttccgccgag gatgccgaaa ccatcgcaag ccgcaccgtc atgcgtgcgc 1200

cccgcgaaac cttccagtcc gtcggctcga tggtccagca agctacggcc aagatcgagc 1260

gcgacagcgt gcaactggct ccccctgccc tgcccgcgcc atcggccgcc gtggagcgtt 1320

cgcgtcgtct tgaacaggag gcggcaggtt tggcgaagtc gatgaccatc gacacgcgag 1380

gaactatgac gaccaagaag cgaaaaaccg ccggcgagga cctggcaaaa caggtcagcg 1440

aggccaagca ggccgcgttg ctgaaacaca cgaagcagca gatcaaggaa atgcagcttt 1500

ccttgttcga tattgcgccg tggccggaca cgatgcgagc gatgccaaac gacacggccc 1560

gctctgccct gttcaccacg cgcaacaaga aaatcccgcg cgaggcgctg caaaacaagg 1620

tcattttcca cgtcaacaag gacgtgaaga tcacctacac cggcgtcgag ctgcgggccg 1680

acgatgacga actggtgtgg cagcaggtgt tggagtacgc gaagcgcacc cctatcggcg 1740

agccgatcac cttcacgttc tacgagcttt gccaggacct gggctggtcg atcaatggcc 1800

ggtattacac gaaggccgag gaatgcctgt cgcgcctaca ggcgacggcg atgggcttca 1860

cgtccgaccg cgttgggcac ctggaatcgg tgtcgctgct gcaccgcttc cgcgtcctgg 1920

accgtggcaa gaaaacgtcc cgttgccagg tcctgatcga cgaggaaatc gtcgtgctgt 1980

ttgctggcga ccactacacg aaattcatat gggagaagta ccgcaagctg tcgccgacgg 2040

cccgacggat gttcgactat ttcagctcgc accgggagcc gtacccgctc aagctggaaa 2100

ccttccgcct catgtgcgga tcggattcca cccgcgtgaa gaagtggcgc gagcaggtcg 2160

gcgaagcctg cgaagagttg cgaggcagcg gcctggtgga acacgcctgg gtcaatgatg 2220

acctggtgca ttgcaaacgc tagggccttg tggggtcagt tccggctggg ggttcagcag 2280

ccagcgcctg atctggggaa ccctgtggtt ggcatgcaca tacaaatgga cgaacggata 2340

aaccttttca cgccctttta aatatccgat tattctaata aacgctcttt tctcttaggt 2400

ttacccgcca atatatcctg tcaaacactg atagtttaaa ccacttcgtg cagaagacaa 2460

ttgcagcgac taaatggagc aacctactgt ttttgaagtt tgggttgcca tgtaatcact 2520

tgcaataaat atatgtacta atgactgcat cggcttgcgt gtctaaattt gtagcttatt 2580

gaaaactttt tgtggttaaa gacgaatcca gttaactaac ataagtttaa caaaacaaga 2640

ccttttccat atatagacca ccgttaccaa cttacaaaga agccaaataa agtacaacac 2700

aacacttgca agttacaaaa agagaggaaa aaaaacatgg taccatttga caacatatag 2760

aaacacacat aaacattact tataacaaaa agattcaaac tcggctttta ttatctcccc 2820

ctgatcaaat tctaaacact ttattcctca taaactaact ccccgacatt ggagttattg 2880

gactatgacg atgacatcag tggggtaagc ttacttgtac agctcgtcca tgccgagagt 2940

gatcccggcg gcggtcacga actccagcag gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc 3000

tttgctcagg gcggactggg tgctcaggta gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc 3060

gccgatgggg gtgttctgct ggtagtggtc ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt 3120

gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac 3180

gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa 3240

gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc 3300

gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc 3360

gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca 3420

ctgcacgccg taggtcaggg tggtcacgag ggtgggccag ggcacgggca gcttgccggt 3480

ggtgcagatg aacttcaggg tcagcttgcc gtaggtggca tcgccctcgc cctcgccgga 3540

cacgctgaac ttgtggccgt ttacgtcgcc gtccagctcg accaggatgg gcaccacccc 3600

ggtgaacagc tcctcgccct tgctcaccat tttttttgtt cttgtttact agagagaatg 3660

agattttgaa tgagagattg atcaaaaaga tgtgtatata ttttggaaga ggtaggagtg 3720

tttgttagat atattaagaa aggagacgag aagtcacgtg tcaatggaga catcatgcaa 3780

ttgtaggcca cgtgttaatg gcgtcaccat gcagccgctg catgtgttaa cgagaggagt 3840

ctattcaaag acacgtttgt tttttgccta gctcagaatg tggcgttggc atcgaaccga 3900

aacataaaac gcaaaacgaa cctttgggct cgtcagtatg ggtttgggcc ttcaatagat 3960

tccttctata cggcccacat atccactatt ggcaacaaaa ttagaaaaat ttaggattta 4020

gttttaaaat ttgttccgcg acattctccg gatcataact tcgtataatg tatgctatac 4080

gaagttataa ttcggcattg tcttcacaga gtggggccca ctgcatccac cccagtacat 4140

taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta caccacaata 4200

tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc cgaccggcag ctcggcacaa aatcaccact 4260

cgatacaggc agcccatcag tcagatcagg atctcctttg cgacgctcac cgggctggtt 4320

gccctcgccg ctgggctggc ggccgtctat ggccctgcaa acgcgccaga aacgccgtcg 4380

aagccgtgtg cgagacaccg cggccgccgg cgttgtggat acctcgcgga aaacttggcc 4440

ctcactgaca gatgaggggc ggacgttgac acttgagggg ccgactcacc cggcgcggcg 4500

ttgacagatg aggggcaggc tcgatttcgg ccggcgacgt ggagctggcc agcctcgcaa 4560

atcggcgaaa acgcctgatt ttacgcgagt ttcccacaga tgatgtggac aagcctgggg 4620

ataagtgccc tgcggtattg acacttgagg ggcgcgacta ctgacagatg aggggcgcga 4680

tccttgacac ttgaggggca gagtgctgac agatgagggg cgcacctatt gacatttgag 4740

gggctgtcca caggcagaaa atccagcatt tgcaagggtt tccgcccgtt tttcggccac 4800

cgctaacctg tcttttaacc tgcttttaaa ccaatattta taaaccttgt ttttaaccag 4860

ggctgcgccc tgtgcgcgtg accgcgcacg ccgaaggggg gtgccccccc ttctcgaacc 4920

ctcccggccc gctaacgcgg gcctcccatc cccccagggg ctgcgcccct cggccgcgaa 4980

cggcctcacc ccaaaaatgg cagcgctggc caattcgtgc gcggaacccc tatttgttta 5040

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 5100

caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 5160

ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 5220

gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 5280

aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 5340

ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 5400

atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 5460

gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 5520

gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 5580

atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 5640

aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta 5700

actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 5760

aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 5820

tctggagccg gtgagcgtgg ttctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 5880

ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 5940

agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaa 5985

Claims (10)

1.一种获得植物DH系的方法，包括如下步骤：

(A)以植物的孤雌生殖单倍体诱导系作为父本，以所述植物的杂合基因型的显性雄性不育材料或者光温敏雄性不育材料或经过化学杀雄处理的不育材料或导入携带显性雄性不育基因及诱导切除元件的材料作为母本，进行杂交，得到F1代；

(B)从(A)杂交所得F1代中鉴定分离出母本来源的单倍体；

(C)对(B)所得母本来源的单倍体进行染色体加倍，从加倍后植株中选择可育材料，即得所述植物的DH系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物为自花授粉植物；和/或

所述植物满足如下条件：1)能够实现显性不育或化学杀雄或光温敏不育；和2)能够实现单倍体诱导；和/或

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

进一步地，所述植物为小麦、水稻、高粱、大麦、燕麦、大豆、豌豆、绿豆、花生、芝麻、马铃薯、亚麻、烟草、拟南芥、油菜、番茄、向日葵、黄瓜、甘薯、白菜、萝卜、胡萝卜。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：当所述植物为单子叶植物时，所述孤雌生殖单倍体诱导系为PLA基因被沉默或抑制或敲除的植物；当所述植物为双子叶植物时，所述孤雌生殖单倍体诱导系为DMP基因被沉默或抑制或敲除的植物；

进一步地，当所述植物为小麦时；所述孤雌生殖单倍体诱导系为PLA基因被沉默或抑制或敲除的小麦；

进一步地，当所述植物为大麦时；所述孤雌生殖单倍体诱导系为PLA基因被沉默或抑制或敲除的大麦；

进一步地，当所述植物为水稻时；所述孤雌生殖单倍体诱导系为PLA基因被沉默或抑制或敲除的水稻；

进一步地，当所述植物为油菜时；所述孤雌生殖单倍体诱导系为DMP基因被沉默或抑制或敲除的油菜；

进一步地，当所述植物为拟南芥时；所述孤雌生殖单倍体诱导系为DMP基因被沉默或抑制或敲除的拟南芥；

更进一步地，当所述植物为小麦时，所述PLA基因为小麦A基因组中的PLA-A基因和/或小麦B基因组中的PLA-B基因和/或小麦D基因组中的PLA-D基因；

更进一步地，当所述植物为大麦时，所述PLA基因为大麦基因组中的PLA基因；

更进一步地，当所述植物为水稻时，所述PLA基因为水稻基因组中的PLA基因；

更进一步地，当所述植物为油菜时，所述DMP基因为油菜基因组中的DMP1A 基因、DMP2A基因和/或DMP2C基因；

更进一步地，当所述植物为拟南芥时，所述DMP基因为拟南芥基因组中的DMP8基因和/或DMP9基因；

更加具体地，所述小麦A基因组中的PLA-A基因的序列如SEQ ID No.1所示；所述小麦B基因组中的PLA-B基因的序列如SEQ ID No.2所示；所述小麦D基因组中的PLA-D基因的序列如SEQ ID No.3所示；

更加具体地，所述大麦基因组中的PLA基因的序列如SEQ ID No.4所示；

更加具体地，所述水稻基因组中的PLA基因的序列如SEQ ID No.5所示；

更加具体地，所述油菜基因组中的DMP1A基因的序列如SEQ ID No.7所示；所述油菜基因组中的DMP2A基因的序列如SEQ ID No.8所示；所述油菜基因组中的DMP2C基因的序列如SEQ ID No.9所示；

更加具体地，所述拟南芥基因组中的DMP8基因的序列如SEQ ID No.16所示；所述拟南芥基因组中的DMP9基因的序列如SEQ ID No.17所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法中，当所述植物为小麦时，沉默或抑制或敲除小麦基因组中PLA基因为突变小麦基因组中PLA基因使小麦基因组中PLA基因的表达量降低或使小麦基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换；

所述方法中，当所述植物为大麦时，沉默或抑制或敲除大麦基因组中PLA基因为突变大麦基因组中PLA基因使大麦基因组中PLA基因的表达量降低或使大麦基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换；

所述方法中，当所述植物为水稻时，沉默或抑制或敲除水稻基因组中PLA基因为突变水稻基因组中PLA基因使水稻基因组中PLA基因的表达量降低或使水稻基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换；

所述方法中，当所述植物为油菜时，沉默或抑制或敲除油菜基因组中DMP基因为突变油菜基因组中DMP基因使油菜基因组中DMP基因的表达量降低或使油菜基因组中DMP基因发生缺失突变或***突变或碱基替换；

所述方法中，当所述植物为拟南芥时，沉默或抑制或敲除拟南芥基因组中DMP基因为突变拟南芥基因组中DMP基因使拟南芥基因组中DMP基因的表达量降低或使拟南芥基因组中DMP基因发生缺失突变或***突变或碱基替换；

进一步地，所述使小麦基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换是通过CRISPR/Cas9技术实现的；

进一步地，所述使大麦基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换可通过CRISPR/Cas9技术实现；

进一步地，所述使水稻基因组中PLA基因发生缺失突变或***突变或碱基替换可通过CRISPR/Cas9技术实现；

进一步地，所述使油菜基因组中DMP基因发生缺失突变或***突变或碱基替换可通过CRISPR/Cas9技术实现；

进一步地，所述使拟南芥基因组中DMP基因发生缺失突变或***突变或碱基替换可通过CRISPR/Cas9技术实现；

更进一步地，当所述植物为小麦时，所述CRISPR/Cas9的靶序列为SEQ ID No.6；

更进一步地，当所述植物为油菜时，所述CRISPR/Cas9的靶序列为SEQ ID No.10、SEQID No.11、SEQ ID No.12和/或SEQ ID No.13；

更进一步地，当所述植物为拟南芥时，所述CRISPR/Cas9的靶序列为SEQ ID No.18、SEQID No.19、SEQ ID No.20和/或SEQ ID No.21。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料中携带的显性雄性不育基因为MS2基因；所述杂合基因型的显性雄性不育材料的基因型为MS2ms2；

步骤(A)中，所述光温敏雄性不育材料为光敏型、温敏型或光温互作型雄性不育材料，在特定光温环境下表现雄性不育；

步骤(A)中，所述经过化学杀雄处理的不育材料是指生长期处于雌雄蕊分化期，通过叶面喷洒化学杀雄剂导致雄性不育的材料；

步骤(A)中，所述导入携带显性雄性不育基因及诱导切除元件的材料，在显性雄性不育基因表达的情况下导致雄性不育，而利用化学诱导后能将显性雄性不育基因切除而恢复育性。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料按照包括如下步骤(a1)或(a2)的方法制备得到：

(a1)将基因型为“rhtrht,MS2ms2”的太谷核不育小麦与基因型为“rhtrht,ms2ms2”的普通小麦进行杂交，得到的基因型为“rhtrht,MS2ms2”的F1代即为步骤(A)中作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料；

(a2)将基因型为“Rhtrht,MS2ms2”的矮败小麦与基因型为“rhtrht,ms2ms2”的普通小麦进行杂交，得到的基因型为“Rhtrht,MS2ms2”的F1代即为步骤(A)中作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料；

或

步骤(A)中，作为所述母本的杂合基因型的显性雄性不育材料为由双基因控制的杂合光温敏细胞核雄性不育材料Msmsrfrf；

或

步骤(A)中，所述母本按照包括如下步骤的方法制备得到：构建可以表达不育基因且包含Cre/loxP重组酶与LhGR/pOp6化学诱导***的载体，将该载体转入所述植物，得到的阳性转基因植株即为所述母本；

或

步骤(A)中，作为所述母本的光温敏雄性不育材料按照如下方法制备得到：利用隐性基因控制的光温敏感型不育材料与育性正常的材料杂交，F1表现为全部可育，F1自交后代在短日低温下产生育性分离，可育株与不育株分离比为3：1，F1后代自交中的不育株即为所述母本；

或

步骤(A)中，作为所述母本的经过化学杀雄处理的不育材料通过喷施化学杀雄剂获得。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，将所述基因型为“rhtrht,MS2ms2”的太谷核不育小麦与所述基因型为“rhtrht,ms2ms2”的普通小麦进行杂交后，开花前根据穗形态辨别F1代中的可育株和不育株，去除可育株，剩余不育株即为所述基因型为“rhtrht,MS2ms2”的F1代；和/或

步骤(a2)中，将所述基因型为“Rhtrht,MS2ms2”的矮败小麦与所述基因型为“rhtrht,ms2ms2”的普通小麦进行杂交后，去除所得F1代中的所有高杆株，剩余的矮杆株即为所述基因型为“Rhtrht,MS2ms2”的F1代；

或

作为所述母本的光温敏雄性不育材料为温敏雄性不育油菜polTCMS。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述母本和所述父本花期相遇；

和/或

步骤(A)中，进行所述杂交的方式为采取隔离区开放授粉或单株套袋杂交的方式；

和/或

步骤(B)中，进行母本来源的单倍体鉴定的方法为如下任一：

(b1)荧光鉴定母本来源的单倍体：若作为父本的所述孤雌生殖单倍体诱导系表达荧光蛋白，而作为母本的所述杂合基因型的显性雄性不育材料不表达荧光蛋白，则从(A)杂交所得F1代中选择无荧光特性的植株，即为母本来源的单倍体；

(b2)分子标记鉴定单倍体：利用父母本间多态性分子标记进行鉴定，从(A)杂交所得F1代中选择母本带型的植株，即为或候选为母本来源的单倍体；

(b3)流式细胞检测叶片倍性：提取小麦叶片细胞核，进行流式细胞检测，从(A) 杂交所得F1代中选择细胞核信号峰位为六倍体小麦细胞核信号峰位一半的植株，即为母本来源的单倍体；或者，提取油菜叶片细胞核，进行流式细胞检测，从(A)杂交所得F1代中选择细胞核信号峰位为四倍体油菜细胞核信号峰位一半的植株，即为母本来源的单倍体；或者，提取拟南芥叶片细胞核，进行流式细胞检测，从(A)杂交所得F1代中选择细胞核信号峰位为二倍体拟南芥细胞核信号峰位一半的植株，即为母本来源的单倍体。

和/或

步骤(C)中，对所述母本来源的单倍体进行秋水仙素处理实现染色体加倍；

进一步地，步骤(C)中，从加倍后植株中选择可育材料按照包括如下步骤(c1)或(c2)的方法进行：

(c1)若步骤(A)中作为母本的所述杂合基因型的显性雄性不育材料按照权利要求6或7中的步骤(a1)制备得到，则在步骤(C)中开花前根据穗形态辨别可育株和不育株，去除不育株；

(c2)若步骤(A)中作为母本的所述杂合基因型的显性雄性不育材料按照权利要求6或7中步骤(a2)制备得到，则在步骤(C)中去除矮杆株。

9.权利要求1-8中任一所述方法在植物育种中的应用。

10.如下任一方法：

方法I：一种适用于植物的育种方法，包括权利要求1-9任一中的步骤(A)-(C)；

方法II：一种植物的单倍体诱导方法，包括权利要求1-9任一中的步骤(A)和(B)。

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