CN114041044A - 高容量分子检测 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及用于生物样品的高容量检测的组合物和方法。本文公开的多个光学标记及其组合可包括不同比例的光学标记，可用于检测大量靶分子、细胞或组织。

Description

高容量分子检测

相关申请的交叉引用

根据35 U.S.C. § 119(e)，本申请要求于2019年7月1日提交的美国临时申请序列号62/869,502以及于2019年10月23日提交的美国临时申请序列号62/925,197的权益，其每一个的全部内容通过引用并入本发明。

背景技术

荧光原位杂交（FISH）是原位检测个体DNA位点的有力工具。它已广泛用于临床诊断，诸如细胞遗传学分析。由于它的高灵敏度（>98%）、高特异性（>98%）、大范围检测大量数值和结构变化、以及在单细胞水平上检测变化的优越能力，仍然将其视为临床中检测基因组异常的金标准。即使下一代测序成为基因组学分析的常规方式，也是如此。尽管因为可以在单细胞水平上分析基因组变化，FISH为细胞遗传分析提供了独特的益处，但是目前的FISH技术需要的杂交时间长（从几小时到过夜），缺乏多重能力，并且基因组分辨率低（大约100 kb）。特别地，其多重能力有限是由于可用于显微检查的不同荧光颜色/通道的数量有限。此外，其基因组分辨率低可能由不良的探针设计所导致。受限于此，FISH尚未成功用于全基因组水平的单细胞结构变异检测。

对于DNA分析，已经开发了多种用于多重DNA FISH的方法，诸如多重FISH（M-FISH）、COBRA-FISH、光谱核型分析（SKY）。这些方法主要用于24色人类染色体可视化。M-FISH和SKAY二者都使用组合标记策略。COBRA-FISH将组合标记与比值标记结合在一起。为染色体分析而开发的比值标记依赖于大量的双链DNA探针和荧光团（通常为10,000-100,000）用于每个DNA位点和染色体，并且得到的基因组分辨率非常低（10Mb-100Mb）。

对于RNA分析，scRNA-Seq广泛用于整个转录组水平的单细胞基因表达谱分析。然而，该方法具有明显的局限性，诸如不能提供空间信息、检测效率低、细胞捕获效率低。原位RNA检测是无缝整合序列信息和空间信息而不损失细胞的最佳方式。它保持了组织完整性，并且可用于（1）观察来自固体组织和液体样品的单细胞中的局部基因表达，（2）在正常组织结构中研究基因调节，（3）在转录组水平上理解细胞异质性，以及（4）检测稀有细胞群和病原体感染。

已经开发了许多种多重和原位RNA检测技术。它们可分为三个主要类别：（1）原位测序方法，诸如FISSEQ，（2）具有原位杂交和原位测序的杂交方法，诸如STARmap，（3）顺序FISH方法，诸如seqFISH和MERFISH。

虽然原位测序的基因组分辨率最高（单核苷酸），但是进行一次实验需要数天到数周。此外，由于其检测效率低（0.01%-5%），滚环扩增的点尺寸大，每个细胞只能检测大约500个基因，使得不能准确定量单细胞中的基因表达。STARmap整合了水凝胶-组织化学、靶向信号扩增和原位测序，实现多重RNA原位检测，但其检测效率仍不像金标准单分子RNA FISH那样高，单分子RNA FISH使用多个短DNA寡核苷酸探针每次靶向一条RNA拷贝，检测特异性和灵敏度高（>90%）。

多重和顺序FISH技术提高了检测效率，其中seqFISH和MERFISH两者表现最好。这两种方法均基于单分子RNA FISH，检测效率大于90%。然而，它们的周转时间还不够快，特别是对于小的基因包（gene panel）（<500个基因）进行检测，这需要3-5天才能完成。它们每轮的多重能力仍然受到可用荧光颜色/通道的限制。

对于原位多重蛋白质检测，也开发了几种方法，诸如Codex和DNA交换方法。然而，这些方法对于大的蛋白质包（panel）检测是耗时的。一个主要的速度限制因素也是显微镜可用的荧光通道有限数量。

对于高容量和高通量的细胞条形码，已经结合多色和多强度水平来检测不同的细胞群体。荧光细胞条形码（FCB）已经发展成通过流式细胞术用两种荧光团来区分多达36个细胞群，并且能够用三种荧光团检测多达216个细胞群。然而，FCB的探针标记方案不能扩展到原位分子检测和空间成像。

发明内容

在各种实施方案中，本发明提供了用于高容量检测多个靶分子、颗粒和细胞的组合物和方法，所述多个靶分子、颗粒和细胞在原位、体外、离体或体内条件下被空间上隔开。分子可以包括DNA、RNA、肽、蛋白质等，但不限于此。为了克服不同颜色的染料数量的限制，本技术采用不同比值和强度的染料的组合，或者更一般地采用光学标记，这些染料数量较多，并且在光学上仍然是彼此可区分的。本技术还提供了用于设计标记编码方案以及信号检测和校正的方法。

根据本发明的一个实施方案，本发明提供了一种被制备用于检测的样品，包括：第一多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第一靶分子；以及第二多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第二靶分子，其中每个靶与至少两种光学标记相关联，使得（a）第一多个探针附接有至少第一种光学标记，第二多个探针附接有至少第二种光学标记，并且（b）第一靶分子和第二靶分子在激发时与来自两个或两个以上颜色通道的不同信号强度比值相关联。

在一个实施方案中，还提供了一种用于杂交的试剂盒、包装，或探针的混合物，包括：第一多个探针，每个探针可结合第一靶分子，或者第一多个探针和一个或多个中间探针，所述中间探针允许第一多个探针间接结合第一靶分子；以及第二多个探针，每个探针可结合第二靶分子，或者第二多个探针和一个或多个中间探针，所述中间探针允许第二多个探针间接结合第二靶分子，其中每个靶与至少两种光学标记相关联，使得（a）第一多个探针附接有至少第一种光学标记，第二多个探针附接有至少第二种光学标记，并且（b）第一靶分子和第二靶分子在激发时与来自两个或两个以上颜色通道的不同信号强度比值相关联。

在又一个实施方案中，提供了一种检测样品中两个或更多个靶分子的方法，包括在允许探针与靶结合的条件下将探针与包括第一靶和第二靶的样品混合，其中与靶相关联的不同颜色或颜色强度允许检测靶。

另一个实施方案提供了一种被制备用于检测的样品，包括：第一多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第一靶分子；以及第二多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第二靶分子，其中每个探针都附接有一个或多个光学标记，使得：（a）至少第一光学标记与第一靶和第二靶两者相关联，但是第一靶和第二靶与不同数量的第一光学标记相关联，并且（b）第一靶和第二靶在激发时与从光学标记发出的不同颜色、颜色的不同强度，或其组合相关联。

在一个实施方案中，还提供了一种用于杂交的试剂盒、包装，或探针的混合物，包括：第一多个探针，每个探针可结合第一靶分子，或者第一多个探针和一个或多个中间探针，所述中间探针允许第一多个探针间接结合第一靶分子；以及第二多个探针，每个探针可结合第二靶分子，或者第二多个探针和一个或多个中间探针，所述中间探针允许第二多个探针间接结合第二靶分子，其中每个探针都附接有一个或多个光学标记，使得一旦结合靶向生物分子：（a）至少第一光学标记将与第一靶和第二靶两者相关联，但是第一靶和第二靶将与不同数量的第一光学标记相关联，并且（b）第一靶和第二靶在激发时与从光学标记发出的不同颜色、颜色的不同强度，或其组合相关联。

另一个实施方案提供了一种光学探针检测的样品，包括：第一多个探针，其直接或间接结合第一靶向生物分子；以及第二多个探针，其直接或间接结合第二靶向生物分子，其中每个探针附接有一个或多个光学标记，使得：（a）第一靶和第二靶与两个不同的光学标记相关联，并且（b）第一靶和第二靶与同一颜色的两个不同强度相关联。

而在另一个实施方案中，本发明提供了一种探针组，包括第一探针和第二探针，其中第一探针和第二探针分别附接有两个光学标记，这两个光学标记具有相同或重叠的色谱但强度不同，其中第一探针和第二探针各自还附接有第二光学标记，并且其中第一探针和第二探针光学上可区分。在一些实施方案中，探针具有不同的结合特异性。在一些实施方案中，第一探针和第二探针直接或间接结合生物样品中的两个靶分子。

还提供了检测样品中两种不同探针的方法，其中第一探针和第二探针分别附接有两个光学标记，这两个光学标记具有相同或重叠的色谱但强度不同，第一探针和第二探针各自还附接有第二光学标记，该方法包括通过两个共同颜色通道来光学地检测并区分第一探针和第二探针。

而在另一个实施方案中，本发明提供了一种探针组，包括第一探针和第二探针，其中第一探针和第二探针分别附接有第一光学标记和第二光学标记，第一光学标记和第二光学标记具有相同或重叠的色谱，但在两个或两个以上的共同颜色通道中具有不同的强度，并且其中第一探针和第二探针光学上可区分。在一些实施方案中，探针具有不同的结合特异性。在一些实施方案中，第一探针和第二探针直接或间接结合生物样品中的两个靶分子。

还提供了检测样品中两种不同探针的方法，其中第一探针和第二探针分别附接有两个光学标记，这两个光学标记具有相同或重叠的色谱，但在两个或两个以上的共同颜色通道中具有不同的强度，该方法包括通过两个或两个以上的共同颜色通道来光学地检测并区分第一探针和第二探针。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种被制备用于检测的生物样品，包括：第一靶分子，其直接或间接结合第一光学标记；以及第二靶分子，其直接或间接结合第二光学标记，其中通过（a）如果第一光学标记与第二光学标记相同，则每个靶分子结合不同数量的光学标记，或（b）第一光学标记与第二光学标记之间的相似颜色的不同强度，从而在一个或多个颜色通道中使第一靶分子和第二靶分子光学上可区分。

在一个实施方案中，还提供了一种被制备用于检测的生物样品，包括多个不同的靶分子，每个靶分子都结合一个或多个光学标记，其中靶分子在一个或多个颜色通道中彼此光学上可区分，并且靶分子中的至少两个靶分子结合相同的光学标记，但是由于结合靶分子的不同光学标记的比值不同而光学上可区分。

在一个实施方案中，还提供了一种被制备用于检测的生物样品，包括多个不同的靶分子，每个靶分子都结合一个或多个光学标记，其中靶分子在一个或多个颜色通道中彼此光学上可区分，并且至少两个靶分子结合一个共同的第一光学标记，并且分别结合具有相似颜色的第二光学标记和第三光学标记，但是由于第二光学标记和第三光学标记具有不同的强度而光学上可区分。

还提供了用于杂交的试剂盒、包装或探针混合物，其包括探针，用适于制备本发明样品的光学标记来标记所述探针。还提供了一种检测样品中两个或更多个靶分子的方法，包括在允许探针结合靶分子的条件下，将本发明的探针混合到包括靶分子的样品中，其中不同种类的靶分子与不同的光学标记组合相关联，每个靶分子由至少两个颜色通道检测。

附图说明

图1示出了8强度代码矩阵的HC-smFISH的示意图，其中8强度代码矩阵由2种颜色和2个强度水平组成。（a）强度比值编码的探针标记方案的示意图，通过一组单染料标记的探针，或者每个探针具有多个染料的探针。（b）用于强度编码的颜色通道方案。不同的染料用不同的颜色通道（例如Cy3和Cy5染料）成像。可替代地，具有重叠发射光谱的染料（例如Cy5、Cy5.5）用相同的颜色通道成像。至少两个颜色通道用于强度编码。每个矩形条表示一个颜色通道。（c）8代码矩阵（N=2且M=2）的强度坐标图。在每个颜色通道中使用2个强度水平（不包括0）。每个点代表来自寡核苷酸FISH斑点的测量强度比值。（d）由FISH斑点的二维（2D）强度分布生成的参考强度代码图。通过分析斑点的密度分布产生三个具有边界的簇，在此代表三个强度代码。每个强度代码具有不规则的边界。

图2示出了标记方案-1。（a）直接标记。（b）间接标记。（c）通过分支DNA扩增的间接标记。此处使用两个颜色通道：Cy3/600和Cy5/700通道。强度代码的第一位数代表Cy3通道中的强度水平。强度代码的第二位数代表Cy5通道中的强度水平。

图3示出了标记方案-2。（a）直接标记。（b）间接标记。（c）通过分支DNA扩增的间接标记。此处使用两个颜色通道：Cy3/600和Cy5/700通道。强度代码的第一位数代表Cy3通道中的强度水平。强度代码的第二位数代表Cy5通道中的强度水平。

图4示出了标记方案-3。（a）直接标记。（b）间接标记。（c）通过分支DNA扩增的间接标记。强度代码的第一位数代表Cy3/600通道中的强度水平。强度代码的第二位数代表Cy5/700通道中的强度水平。

图5示出了一种可替代的信号扩增方法，该方法通过滚环扩增来实现用于基于核酸的靶检测的各种强度代码。（a）滚环扩增的探针标记的不同组分的实例。（b）具有各种强度代码的成像探针。（c）以一个靶为例的信号扩增方案。每个唯一的靶由靶唯一引物、具有靶唯一标识符的靶唯一挂锁探针进行标记。通过滚环扩增来扩增靶唯一标识符。最后，具有靶唯一染料组合的成像探针与扩增的标识符杂交，以实现靶特异性强度编码。通过成像探针与不同数量和不同种类的染料附接，可以获得各种强度代码。

图6示出了加入用于对非特异性结合进行纠错的参考染料。Cy3、Alexa 546、Cy5、Cy5.5用于强度编码。使用Alexa 488作为参考染料以去除非特异性结合信号。（a）加入参考染料用于标记方案-2。（b）加入参考染料用于标记方案-3。此处使用三个颜色通道：Alexa488/500通道、Cy3/600和Cy5/700通道。500通道不用于强度编码。强度代码的第一位数代表Cy3通道中的强度水平。强度代码的第二位数代表Cy5通道中的强度水平。

图7示出了用于标记方案2和方案3的区别化标记方法。不同的染料与不同的初级探针（直接结合靶的探针）相关联。（a）用于标记方案-2的区别化标记。（b）用于标记方案-3的区别化标记。强度代码的第一位数代表Cy3通道中的强度水平。强度代码的第二位数代表Cy5通道中的强度水平。

图8示出了用于区别化标记的交替标记方法。与不同标记相关联的初级探针被设计成以交替的方式与同一个靶结合。强度代码的第一位数代表Cy3通道中的强度水平。强度代码的第二位数代表Cy5通道中的强度水平。

图9示出了可替代的标记方案-3：每个靶一种染料，但是不同的靶与在至少两个颜色通道中具有重叠光谱的不同染料相关联。（a）每个靶一种染料标记方案。由具有2个颜色通道的3种染料产生3个强度比值代码。（b）由具有重叠光谱的3种染料产生的3个不同强度比值代码簇的图示。每个簇在较低强度端被强度阈值截断，以去除背景和非特异性结合信号。强度代码的第一位数代表通道A中的强度水平。强度代码的第二位数代表通道B中的强度水平。

图10示出了Alexa 647和Alexa 700的重叠发射光谱。可以使用两个颜色通道来产生用于Alexa 647和Alexa 700的两个强度比值，使得可以通过这两个颜色通道来区分这两种染料。（a）将两种染料与两个靶、以及一对的两个颜色通道匹配。（b）两个颜色通道中Alexa 647和Alexa 700的重叠光谱。通道A：650 nm至710 nm。通道B：745 nm至805 nm。

图11示出了通过猝灭的标记方案-4。通过各种猝灭设计，诸如FRET（d-h）、在有限距离内积累更多相同染料的自猝灭（i、j、l）、以及猝灭剂（k和m），可以精细地调节强度水平和强度变化。

图12示出了通过强度编码进行的蛋白质标记。（a）附接有靶特异性寡核苷酸序列作为初级探针的蛋白质靶。（b）通过标记方案-2进行的蛋白质编码的图示。（c）通过标记方案-3进行的蛋白质编码的图示。（d）通过滚环扩增进行的可替代信号扩增。图12（d）中，靶（诸如蛋白质）被附接有靶唯一寡核苷酸的靶特异性抗体所标记。抗体可被其它靶特异性接头取代，诸如HA或SNAP标记之类的小表位。具有靶唯一标识符的靶唯一挂锁探针与抗体上的寡核苷酸杂交，然后通过连接进行循环。通过滚环扩增来扩增靶唯一标识符。最后，具有靶唯一染料组合的成像探针与扩增的标识符杂交，以实现靶特异性强度编码。通过将成像探针附接到不同数量和不同种类的染料，可以获得各种强度代码。图左侧示出了3个强度代码（1：0、1：1、3：1）。

图13示出了强度编码的不同应用。（a）检测不同细胞类型。不同的数字代表具有不同细胞标记的不同细胞类型。（b）检测随机分布在固体支架（诸如载玻片）上的蛋白质。不同种类的蛋白质与光学标记的不同组合相关联。（c）以微阵列上的空间模式同时检测多个靶。用以不同强度比值编程的探针对不同空间位置上的不同靶进行编码。

图14示出了具有寡核苷酸DNA探针的单分子RNA FISH的结果，以及2种颜色强度编码的模拟。（a）图像是HeLa细胞中的TFRC RNA FISH。右侧图像是左侧图像选定区域的放大图。（b）TFRC FISH斑点的强度分布。比值1：0是单个Cy3标记的TFRC探针检测到的790个斑点的实验结果。比值2：0和3：0分别是基于比值1：0的模拟数据，分别每个斑点具有两倍强度和三倍强度。比值2：0与比值1：0重叠的斑点有40%。比值3：0与比值1：0重叠的斑点小于5%。（c-d）示出了8比值编码方案的强度分布模拟结果。（c）示出了当第二强度水平具有第一强度水平的2×（2倍）强度时，N=2且M=2的8比值编码方案。（d）示出了当第二强度水平具有第一强度水平的3×强度时，N=2且M=2的8比值编码方案。

图15示出了标记方案-3的强度比值成像结果。（a）-（b）用Cy5（a）和Cy3（b）标记的端粒的共焦成像，a和b呈现在相同的强度显示范围中。（c）-（d）用Cy5（c）和Alexa532（d）标记的着丝粒的共焦成像，c和d呈现在相同的强度显示范围中。（e）-（f）具有不同染料对的端粒和着丝粒探针的强度分布：（e）Tel-Cy5-Cy3、Cen-Cy5.5-Cy3、Cen-Cy5-A532和（f）Tel-Cy5-Cy3、Cen-Cy5-Atto590、Cen-Cy5-A546。（e）：Tel-Cy5-Cy3与Cen-Cy5.5-Cy3重叠，但与Cen-Cy5-A532很好地隔开。（f）：Tel-Cy5-Cy3与Cen-Cy5-Atto590重叠，但与Cen-Cy5-A546显著区分。（g）对于不同的染料对，颜色通道700和600之间的强度比值的直方图。

图16示出了使用标记方案-3通过强度编码的RNA FISH的结果。用Cy5.5和A546标记POLR2A。用Cy5和Cy3标记CTNNB1。（a）在700通道中共标记POLR2A和CTNNB1的图像。（b）在600通道中共标记POLR2A和CTNNB1的图像。（c）仅在700通道中标记CTNNB1的图像。（d）仅在600通道中标记CTNNB1的图像。（e）仅在700通道中标记POLR2A的图像。（f）仅在600通道中标记POLR2A的图像。（g）在700通道中不标记初级探针的阴性对照。（h）在600通道中不标记初级探针的阴性对照。在阴性对照中加入用于两个RNA靶的扩增分子（amplifier）和成像探针。

图17示出了使用参考强度代码图为FISH斑点分配强度代码的方式。（a）通过分别用Cy5和Cy3标记CTNNB1、用Cy5.5和Alexa 546标记POLR2A而产生的参考强度代码图。绘制每种染料组合的边界。左上方的簇代表用Cy5.5和Alexa 546共标记的POLR2A的强度分布。右下方的簇代表用Cy5和Cy3共标记的CTNNB1的强度分布。（b）CTNNB1和POLR2A共标记的细胞1的2D强度图。（c）CTNNB1和POLR2A共标记的细胞2的2D强度图。（d）CTNNB1和POLR2A共标记的细胞3的2D强度图。用Cy5.5和Alexa 546标记POLR2A。用Cy5和Cy3标记CTNNB1。

图18示出了通过强度编码进行4 RNA共标记的结果。（a）700通道中MEF细胞的多重标记图像。（b）600通道中MEF细胞的多重标记图像。（c）（a）和（b）的重叠图像，具有如（d）所示的放大区域。（d）在（c）中选定的区域的放大图像。不同的形状标示不同RNA拷贝的位置，其中用圆形标示HOXB1的每一个拷贝，用方形标示POLR2A的每一个拷贝，用菱形标示TFRC的每一个拷贝，并且用六边形标示CTNNB1的每一个拷贝。（e）2D强度分布图以对数刻度表示，其中4个斑点簇清楚地彼此区分。

图19示出了基于强度比值在原发组织中分离2个DNA位点的结果（a-c：小鼠脑组织中的端粒和着丝粒位点，d-f：人PBMC细胞中的染色体1重复位点（Chi-Re）和着丝粒位点）。（a）基于其可分辨的强度比值分布，隔开两个强度比值簇。（b）-（c）基于具有（c）中放大区域的强度比值代码（b）的分配，端粒和着丝粒的识别结果。（d）基于其可分辨的强度比值分布，隔开两个强度比值簇。（e）-（f）基于具有（f）中的放大区域的强度比值代码（e）的分配，Ch1-Re和着丝粒的识别结果。

图20示出了通过不同强度编码探针的DNA FISH结果。（a-b）在端粒探针的两个颜色通道（每个初级探针1个Cy5和10个Cy3）中的图像。（a）：Cy5/700通道，（b）：Cy3/600通道。（c）端粒标记的2D强度分布，其中一个强度比值为1 Cy5：10 Cy3。（d）端粒标记的2D强度分布，一个强度比值为1 Cy5：2 Cy3。（e）端粒标记的2D强度分布，一个强度比值为1 Cy5：30Cy3。（c-e）共用同一参考线。

详细说明

在各种实施方案中，本发明描述了用于对分子、分子复合物、细胞或组织等进行高容量检测的组合物和方法。在一些实施方案中，与通常所做的相比，高容量可归因于使用数量更多的标记手段，其可以相互区别。如此处所示，此类标记手段可以是单个分子，或者两个或更多个分子的组合。此外，标记手段之间的差异可以是不同颜色或光谱、不同强度，或两者兼有。

A.高容量单分子FISH（HC-smFISH）

本技术的一个实施方案在“高容量单分子FISH”或HC-smFISH中示出。HC-smFISH使用强度比值编码方案（或称为“强度编码”、“颜色比值编码”或“光谱比值编码”），具有单分子检测灵敏度，并且基因组分辨率高（>20nt）。HC-smFISH使得能够比常规FISH技术获得显著更多的RNA种类或DNA位点的可视化。在常规的FISH技术中，可同时显现的RNA种类或DNA位点的数量受限于所用显微方法可用的不同荧光颜色的数量。对于HC-smFISH，可以对大的DNA/RNA包、甚至整个转录组或基因组进行图谱分析。

HC-smFISH使用来自一个或多个颜色通道的强度比值（或称为颜色比值）作为强度编码来区分RNA种类或DNA位点。由于强度变化，通常，两个或更多个颜色通道之间的强度比值用于多重条形码，使得任何两个强度代码上的强度重叠可以最小化。理论上，可用的强度组合或强度比值组合的数量可以由寡核苷酸探针标记方案进行编程。例如，2种颜色以及每种颜色2个强度水平的标记方案产生8个强度组合（1：0、2：0、0：1、0：2、1：1、1：2、2：1、2：2），因此可以编码细胞内多达8个RNA种类或DNA位点。（图1）。

理想地，来自相同RNA种类或DNA位点的单个FISH斑点的强度组合或强度比值组合应当与它们由具有相同标记设计的探针检测时的强度组合或强度比值组合相同。实验中，由来自相同RNA种类或DNA位点的单个FISH斑点产生的强度值可能偏离指定的强度代码。通过比较每个实验强度组合与指定组合的距离，可以将每个FISH斑点分配给最近的强度代码（图1c）。对于具有模糊强度值（在两个指定比值的中间）的FISH斑点，它们将被丢弃。

理论上，荧光颜色和强度水平的数量确定HC-smFISH的容量，即标记方案的编程比值的最大数量或每轮FISH检测的RNA种类或DNA位点的最大数量，由下式预测：P _max =(M+1) ^N – 1。此处，P代表可被检测的不同靶的数量，诸如RNA种类或DNA位点（即，每轮FISH的多重容量），M代表由探针标记方案确定的每种颜色的强度水平（不包括零）的数量，N代表可从显微镜获得的荧光颜色的数量（即，颜色通道）。因此，每种颜色具有2个强度水平（包括第一强度水平（或称为强度水平1）和第二强度水平（或称为强度水平2），不包括强度水平0）的2种荧光颜色可编码多达8个RNA种类或DNA位点，并且每种颜色具有3个强度水平的4种颜色可编码255个RNA种类或DNA位点。在HC-smFISH设计中，可以使用至少一个非零强度水平（M≥1）来产生每轮杂交和成像的远远更大的编码尺寸。

对于强度编码，颜色通道的数量定义每个强度代码的位数。如果只有一个颜色通道用于代码，诸如1：0，则它是一位数代码。如果两个颜色通道用于代码，诸如1：2，则该代码是两位数代码。

因此，HC-smFISH与其它FISH技术相比，每轮FISH的多重容量可以达到高10-100×。每轮HC-smFISH可以用4-5种荧光颜色来成像数百个RNA基因。

对于实际应用，诸如对用于单细胞基因表达分析的大RNA包进行图谱分析，HC-smFISH可以将强度编码方案与纠错代码相结合。基本原理是设计一组稀疏地占据整个编码空间的代码，以便仅能检测和校正一个颜色通道中的误分配（miss-assignment）。例如，对于N=5和M=3，P _max =1023但选择P=200。在杂交、成像和去杂交的连续的轮中与编码整合使得能够以直接的方式进一步扩展检测能力。

可由下式预测组合比值代码的数量：Q _max = ((M+1)^N)^K-1。此处，Q表示组合强度比值代码的总数，M表示强度水平（不包括零），N表示颜色的数量（即颜色通道），K表示连续的轮的数量。因此，如果M=3，N=5，则Q _max =1023，但是如果Q被选择为200，则3轮5色成像原则上可以产生覆盖整个人或小鼠转录组的组合编码（大约20,000个蛋白质编码基因）。与P值小得多的MERFISH和seqFISH相比，因为每轮分析的长成像时间有利于进行更少轮，HC-smFISH的高多重容量对于大尺寸组织的分析特别有利。

为了使用强度编码的最佳性能，当在此使用强度编码时，任何两个核酸靶的拷贝应当以超过成像***的光学分辨率在空间上分离。通常，当在常规光学显微镜上使用可见光学标记时，该光学分辨率为大约250 nm。然而，通过先进的光学成像方法，该光学分辨率可以提高到小于100 nm甚至小于20 nm，从而可以在相同的空间中检测更多的分子，并且可以通过强度编码获得更高的检测效率。

B.其它种类靶的高容量检测

HC-smFISH是高容量检测技术的实例。本发明的高容量检测技术除可用于RNA和DNA检测外，还可用于检测在空间上彼此分离的其它非核酸基生物分子、颗粒、细胞和组织样品，诸如蛋白质、碳水化合物、脂质、络合物、细胞器、细胞、组织和微生物等。此处的一般原理是：首先用编程的寡核苷酸或肽对多个靶进行条形码编码（每种靶都用唯一的寡核苷酸或肽序列编程），然后使用HC-smFISH的强度编码探针标记方案和基于杂交的探针来检测与各种靶相关联的编程寡核苷酸或肽。寡核苷酸可由天然核苷酸或非天然核苷酸（诸如LNA）组成。肽可以由天然氨基酸或非天然氨基酸组成。可替代地，可以使用杂交寡核苷酸和肽序列。

为了使用强度编码的最佳性能，当在此使用强度编码时，非核酸靶的任意两个拷贝应当以超过成像***的光学分辨率在空间上分离。通常，空间分辨率大于250 nm。在一些情况下，使用超分辨率成像设置和算法，分辨率可以低至20 nm。

C.用于高容量强度编码的标记方案

如图2至图4所示的三种基本标记方案分别命名为标记方案-1（图2）、标记方案-2（图3）和标记方案-3（图4）。在每个基本标记方案中，可以进一步实现三种基本变化：直接标记（图2至图4的图a）、没有信号扩增的间接标记（图2至图4的图b）、具有信号扩增的间接标记（图2至图4的图c）。在标记方案-1中，与光学标记数量成比例的靶结合探针或初级探针的数量定义了每个颜色通道中的强度水平，每个光学标记与靶相关联。在标记方案-2中，与初级探针相关联的光学标记的数量定义了强度水平，而不是初级探针的数量定义了强度水平。在标记方案-3中，只有与靶相关联的染料的种类定义了每个颜色通道中的强度水平，而不是光学标记或探针的数量定义了每个颜色通道中的强度水平。

如图2至图4所示，每个水平的长、粗和实线表示检测的靶。靶可以是分子（例如RNA、DNA、蛋白质、碳水化合物、脂质）、复合物（例如抗原-抗体复合物、配体-受体复合物、凝血酶原复合物）、细胞器、细胞、组织或微生物。

每个靶直接或间接结合由短实线代表的多个探针。多条短线可以结合单条长线，代表多个探针结合到靶。如图2至图4的图c所示，多条短线可以结合单条短线，代表多个探针结合中间探针。一些实线还耦合到代表附接有光学标记的成像探针的一个或多个实线形状（例如星形和方形）。每个形状表示不同的光学标记。例如，如图2所示，深色星形代表Cy3，Cy3是一种亮绿黄色荧光染料，而深色方形代表Cy5，Cy5是一种亮远红荧光染料。

如图2的图a所示，每个靶与多个光学标记（例如Cy3和/或Cy5）相关联。第一行的靶（标记为“2：0”）可以很容易与第二行的靶（标记为“0：2”）区分。在图a中，第一行的靶与4种Cy3染料相关联，不与Cy5染料相关联；第二行的靶不与Cy3染料相关联，而与4种Cy5染料相关联。因此，在显微镜下，第一靶在Cy3颜色通道中呈现亮绿黄色，而第二靶在Cy5颜色通道中呈现亮红色。第三行的第三靶（标记为“1：1”）与2种Cy3染料和2种Cy5染料相关联。因此，第三靶将在Cy3和Cy5通道中都显示出强信号，但是其强度明显弱于两个通道中的第一靶和第二靶。如果我们定义第一强度水平被每个颜色通道中的2种染料区分开来并且每个通道中的第二强度水平被4种染料区分开来，则上述每个靶在不同通道中的强度可以被分配以不同的强度水平。因此，每个靶都用唯一的强度代码来编码。例如，第三靶在两个通道中都具有第一强度水平，使得它被强度代码1：1标记。第一靶在Cy3通道中具有第二强度水平，在Cy5通道中没有强度，分配其强度代码2：0。第二靶在Cy5通道中具有第二强度水平，而在Cy3通道中没有强度，分配其强度代码0：2。

仍然在图2的图a中，第四行的靶和第五行的靶都与Cy3和Cy5染料两者相关联。然而，与第五行的第五靶相比，第四行的第四靶具有更少的Cy3（2：4）和更多的Cy5（4：2）。第四靶被分配以1：2的强度代码。第五靶被分配以2：1的强度代码。因此，不仅可以通过颜色来区分它们，而且可以通过颜色与它们各自强度的组合来区分它们。

因此，根据本发明的一些实施方案，本发明提供了一种被制备用于检测的样品，包括第一多个探针和第二多个探针，所述第一多个探针直接或间接结合生物样品中的第一靶分子、细胞或组织，所述第二多个探针直接或间接结合生物样品中的第二靶分子、细胞或组织。在一些实施方案中，每个探针都附接有一种或多种光学标记，使得至少第一光学标记与第一靶和第二靶两者相关联，但是第一靶和第二靶与不同数量的第一光学标记相关联。此外，在一些实施方案中，第一靶和第二靶在激发时与从光学标记发出的不同颜色、颜色的不同强度，或其组合相关联，使得第一靶和第二靶可以在光学上被区分开来。

如本文所用，术语“探针”指偶联到可检测标记上，或适于间接偶联到可检测标记上的分子或聚集分子组。探针的非限制性实例包括DNA或RNA寡核苷酸、非天然寡核苷酸、肽核酸（PNA）、抗体、受体、配体、诸如树枝状聚合物之类的合成聚合物以及各种化合物。通常，使用基于杂交的核酸探针，或基于杂交的肽探针，诸如PNA探针。直接附接有光学标记的探针被称作“成像探针”。成像探针可以仅与一种光学标记相关联。可替代地，成像探针可以与两种或更多种相同类型的光学标记相关联。可替代地，成像探针可以与两种或更多种不同类型的光学标记相关联。对于核酸靶，与靶直接结合的寡核苷酸或肽探针被称作“初级探针”或“靶结合探针”。对于非核酸靶，与靶相关联的第一探针被称作“初级探针”，然后通过一系列杂交将更多的光学探针（包括成像探针和中间探针）与第一探针相关联以检测靶。

术语“光学标记”或简称为“标记”，是指一种分子或生物部分，其在适当的激发下能够发出可通过光学手段检测到的信号。实例包括荧光染料（诸如Cy3、Cy5、Alexa532）、荧光蛋白（诸如GFP、YFP和RFP）、显色染料、量子点以及其它种类的纳米粒子。在一些实施方案中，光学标记是反应性的，并且可以附接到另一个分子上，诸如探针。实例包括羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、级联蓝（Cascade Blue）、太平洋蓝（Pacific Blue）、太平洋橙（Pacific Orange）、荧光黄、NBD、R-藻红蛋白（PE）、PE-Cy5缀合物、PE-Cy7缀合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、Fluorescein、BODIPY-FL、G-Dye100、G-Dye200、G-Dye300、G-Dye400、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、德州红、别藻蓝蛋白（APC）和APC-Cy7缀合物。在一些实施方案中，光学标记是可光转换的染料，诸如可光转换的罗丹明酰胺。在一些实施方案中，通过化学缀合将光学标记附接在探针上。在一些实施方案中，仅通过物理结合而不是化学反应，将光学标记附接在探针上。在一些实施方案中，通过物理相关联和化学反应将光学标记附接在探针上。

术语“颜色通道”、“颜色光谱”或简称为“颜色”、“光谱”是指发射光谱的窗口（例如650-700 nm）、激发光谱的窗口（例如640 nm或635-645 nm），或这两种光学性质的组合。可替代地，术语“颜色通道”或“通道”是指定义或选择这两种光学特性的窗口的光学部件的组合。例如，这些部件可以是但不限于发射滤波器（例如，具有650-700 nm的发射带通窗口的滤波器）、激发滤波器（例如，具有635-645 nm的激发带通窗口的滤波器），或包括二向色镜、发射滤波器和激发滤波器的物理滤波器组。物理上但实际上并非通过伪颜色来实现的可用颜色通道的数量受限于所使用的显微镜***。通常，荧光显微镜可获得3-5个颜色通道，而基于激发波长和发射波长以及相应的滤光器，相邻通道之间没有串扰。通常，在本专利申请中，我们使用2至3个通道来成像不同的光学标记：Cy5/700通道来成像Cy5、Cy5.5染料；Cy3/600通道来成像Cy3、Alexa 546、Alexa 532染料；Alexa 488/500通道来成像Alexa 488染料。更具体地，在“实施例”部分中，Alexa 488/500通道在525/50m处配备有发射滤波器，Cy3/600通道在600/50m处配备有发射滤波器，Cy5/700通道在700/75m处配备有发射滤波器。

在一些实施方案中，一种用于检测的生物样品，包括第一多个探针和第二多个探针，所述第一多个探针直接或间接结合生物样品中的第一靶分子、细胞或组织，所述第二多个探针直接或间接结合至生物样品中的第二靶分子、细胞或组织，其中第一光学标记与第一靶相关联，第二光学标记与第二靶相关联，与第一靶相关联的第一光学标记的数量和与第二靶相关联的第一光学标记的数量相差至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500。此类差异可以有助于确保在不同强度（基于所使用的光学标记的数量）下相同颜色（或类似颜色）可以彼此区分。在一些实施方案中，用于检测两种不同类型靶的光学标记的数量之差不大于200、500、1000、2000、5000或10000。

在一些实施方案中，一种用于检测的生物样品包括第一多个探针和第二多个探针，所述第一多个探针直接或间接结合生物样品中的第一靶分子、细胞或组织，所述第二多个探针直接或间接结合生物样品中的第二靶分子、细胞或组织，其中第一光学标记与第一靶相关联，第二光学标记与第二靶相关联，与第一靶相关联的第一光学标记的数量和与第二靶相关联的第一光学标记的数量的比值为至少2，在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记的数量和与第二靶相关联的第一光学标记的数量的比值为至少2.5、3、4、5、5.6、7、8或10。

在一些实施方案中，探针是单链寡核苷酸或肽。在一些实施方案中，光学标记是荧光染料、显色染料、荧光蛋白、量子点或其它类型的纳米颗粒。在一些实施方案中，第一靶和第二靶还与附接到探针的第二光学标记相关联，但是与不同数量的第二光学标记相关联。

在一些实施方案中，探针是嵌合聚合物。在一些实施方案中，嵌合聚合物由天然聚合物（诸如核酸或蛋白质）和合成聚合物组成。在一些实施方案中，探针是合成聚合物。在一些实施方案中，探针是单链寡核苷酸。在一些实施方案中，探针是肽。在一些实施方案中，探针是肽核酸（PNA）。在一些实施方案中，探针是与肽缀合的寡核苷酸。在一些实施方案中，探针是与其它合成聚合物（诸如树枝状聚合物）连接的寡核苷酸。在一些实施方案中，探针是与其它合成聚合物（诸如树枝状聚合物）连接的肽。在一些实施方案中，探针可以是多链复合物的一部分。

在一些实施方案中，单链寡核苷酸探针可以由DNA、RNA或具有其它磷酸-糖主链的核酸样结构（例如LNA、XNA）组成。在一些实施方案中，单链探针由包括非磷酸-糖部分（例如肽核酸和吗啉代）的主链组成。在一些实施方案中，单链寡核苷酸探针可以包括次级结构，诸如发夹环。

在一些实施方案中，与靶相关联的多个探针仅包括一个探针。在一些实施方案中，与靶相关联的多个探针由至少两个具有不同序列的探针组成。在一些实施方案中，与靶相关联的多个探针由至少4个或12个不同序列的探针组成。

在一些实施方案中，与靶相关联的多个初级探针由至少一个探针组成。在一些实施方案中，与靶相关联的多个初级探针由至少两个具有不同靶结合序列的探针组成。在一些实施方案中，与靶相关联的多个初级探针由至少5、10、20、30或50个不同序列的探针组成。在一些实施方案中，与靶相关联的多个初级探针由不超过100个不同序列的探针组成。

在一些实施方案中，第一靶和第二靶还与附接到探针的第二光学标记相关联，但是与相同数量的第二光学标记相关联。在一些实施方案中，第一靶和第二靶还与附接到探针的第二光学标记相关联，但是与不同数量的第二光学标记相关联。在一些实施方案中，第一靶与附接到探针的第三光学标记相关联，而第二靶不与第三光学标记相关联。

在一些实施方案中，第一多个探针中的每一个都附接有单个光学标记。在一些实施方案中，第一多个探针中的至少两个探针附接有不同的光学标记。在一些实施方案中，第一多个探针中的至少两个探针附接有两个以上不同的光学标记。

在一些实施方案中，第一多个探针中的每个探针附接有两个或更多个不同的光学标记，或者两个或更多个不同数量的相同光学标记。在一些实施方案中，第一多个探针中的每个探针与相同的颜色相关联。

在一些实施方案中，与靶相关联的多个探针仅由初级探针组成。在一些实施方案中，与靶相关联的多个探针由两层探针组成：初级探针和成像探针（或称为次级探针）。在一些实施方案中，与靶相关联的多个探针由两层以上的探针组成。在一些实施方案中，与靶相关联的多个探针由4层探针组成：初级探针、初级扩增分子（或称为初级扩增探针）、次级扩增分子（或称为次级扩增探针）和成像探针。

在一些实施方案中，一种用于检测的生物样品包括第一多个探针和第二多个探针，所述第一多个探针直接或间接结合生物样品中的第一靶分子、细胞或组织，所述第二多个探针直接或间接结合生物样品中的第二靶分子、细胞或组织，其中每个靶与至少两种光学标记相关联，第一光学标记与第一靶相关联，第二光学标记与第二靶相关联，第一光学标记和第二光学标记在第一颜色通道中具有重叠的光谱，第三光学标记与第一靶和第二靶两者相关联并由第二颜色通道检测；其中第一靶和第二靶在激发时与来自两个颜色通道的不同信号强度比值相关联。在一些实施方案中，第四光学标记还与第一靶和第二靶两者相关联，并且第一靶和第二靶在激发时与来自三个颜色通道的不同信号强度比值相关联。

在一些实施方案中，一种用于检测的生物样品，包括第一多个探针和第二多个探针，所述第一多个探针直接或间接结合生物样品中的第一靶分子、细胞或组织，所述第二多个探针直接或间接结合生物样品中的第二靶分子、细胞或组织，其中每个靶与至少两种光学标记相关联，第一光学标记和第二光学标记与第一靶相关联，第三光学标记和第四光学标记与第二靶相关联，第一光学标记和第三光学标记在第一颜色通道中具有重叠的光谱，第二光学标记和第四光学标记在第二颜色通道中具有重叠的光谱；其中第一靶和第二靶在激发时与来自两个颜色通道的不同信号强度比值相关联。在一些实施方案中，第四光学标记还与第一靶和第二靶两者相关联，并且第一靶和第二靶在激发时与来自三个颜色通道的不同信号强度比值相关联。在一些实施方案中，第五光学标记还与第一靶和第二靶两者相关联，并且第一靶和第二靶在激发时与来自三个颜色通道的不同信号强度比值相关联。

在一些实施方案中，一种用于检测的生物样品包括第一多个探针和第二多个探针，所述第一多个探针直接或间接结合生物样品中的第一靶分子、细胞或组织，所述第二多个探针直接或间接结合生物样品中的第二靶分子、细胞或组织，其中每个靶仅与一种光学标记相关联，第一光学标记与第一靶相关联，第二光学标记与第二靶相关联，第一光学标记和第二光学标记在第一颜色通道和第二颜色通道中具有重叠的光谱；其中第一靶和第二靶在激发时与来自两个颜色通道的不同信号强度比值相关联。在一些实施方案中，第三光学标记还与同一样品中的第三靶相关联，第三光学标记在第一颜色通道和第二颜色通道的相同组合中具有与第一光学标记和第二光学标记重叠的光谱，其中第一靶、第二靶和第三靶在激发时与来自这两个颜色通道的三个不同信号强度比值相关联。

在一些实施方案中，多个成像探针中的每个探针附接有两种不同的发射光谱部分或完全重叠的光学标记，诸如峰值发射波长被小于100 nm、小于50 nm或小于20 nm隔开的两种标记。在一些实施方案中，两种或两种以上发射波长相近的光学标记的荧光通过同一颜色通道以便成像。在一些实施方案中，具有重叠发射光谱的两种或两种以上光学标记的荧光依次或同时通过至少两个颜色通道以便成像。

在一些实施方案中，第一多个成像探针中的每个探针仅附接有第一光学标记，第二多个成像探针中的每个探针仅附接有第二光学标记。此处第一光学标记和第二光学标记具有部分或完全重叠的激发或发射光谱，诸如峰值发射波长被小于100 nm、小于50 nm或小于20 nm隔开的两种标记。每种光标记由至少两个颜色通道检测，以形成强度比值，不同的光标记由相同的颜色通道组合进行检测，以产生不同的强度比值。

1．标记方案-1和标记方案-2

用于颜色通道中的靶的标记方案1和方案2的强度水平都由与该颜色通道中的靶相关联的染料总数确定。不同的染料与不同的颜色通道相匹配。然而，在标记方案-1中，附接在靶上的每种染料的数量和与该靶上的该染料相关联的靶结合探针（即初级探针）的数量成正比。因此，对于每个颜色通道和所选择的染料，与相应染料相关联的靶结合探针（或初级探针）的数量定义了强度水平，但是与初级探针相关联的染料的数量不定义强度水平。图2中，图a示出了实现标记方案-1的最简单方式：直接标记。基本上，核酸或其它种类的靶直接附接到成像探针，而不需要任何其它基于中间杂交的探针。图a中，每个靶结合多个探针，每个探针都附接有光学标记。该标记被称作报告标记。如果使用染料，则该染料被称作“报告染料”。每个探针只附接一种报告标记。可替代地，只要每种类型的染料的每种探针的染料数量保持相同，每种探针就可以缀合多种相同类型的染料。由图2a中从上到下的五个靶可见，与Cy3染料相关联的探针数量和与Cy5染料相关联的探针数量之间的强度比值代码分别为2：0、0：2、1：1、1：2和2：1。

图2b示出了实现标记方案-1的间接标记方法。基本上，核酸或其它种类的靶首先与初级探针附接，然后初级探针与成像探针结合。

图2c示出了与分支DNA扩增方法一起进行间接标记以实现标记方案-1。基本上，核酸或其它种类的靶首先与初级探针附接，然后初级探针与2层信号扩增探针（第一扩增探针和第二扩增探针）结合，最后第二扩增探针与成像探针结合。如果需要，可以使用更多层的扩增探针。

标记方案-2可以以不同的方式实现这些相同的比值。与标记方案-1相反，强度水平仅与用于每个颜色通道的染料数量成正比，而与每个靶的靶结合探针或初级探针的数量无关。不同的初级探针与相同数量和种类的染料相关联。图3的图a示出了实现标记方案-2的最简单方式：直接标记而没有任何中间探针。每个靶结合多个探针，该多个探针具有用于同一靶上不同探针的相同组的光学标记。通过改变每个探针上的光学标记的数量和种类，可以实现各种强度水平和比值代码。例如，在第一靶上，每个探针与两个Cy3缀合，但不与Cy5缀合，对应于2：0的强度代码。在第五靶上，每个探针与两个Cy3和一个Cy5缀合，对应于2：1的强度代码。

图3b示出了实现标记方案2的间接标记方法。基本上，核酸或其它种类的靶首先与初级探针连接，然后初级探针与成像探针结合。

图3c示出了与分支DNA扩增方法一起进行间接标记以实现标记方案-2。基本上，核酸或其它种类的靶首先与初级探针连接，然后初级探针与两层信号扩增探针（第一扩增探针和第二扩增探针）结合，最后第二扩增探针与成像探针结合。如果需要，可以使用更多层的扩增探针。

可以容易地调节光学标记的相对强度和比值以满足要求。例如，为了达到1：2（红色：绿色）的强度比值，可以将10种红色染料与20种绿色染料混合。为了达到不同的比值，可以将10种红色染料与15种绿色染料混合。然而，如下文将进一步描述的，可以有意地在不同的颜色/强度代码之间设计颜色/强度间隙，以减少或防止不正确检测，该不正确检测归因于由光学标记引起的强度变化、探针在不同靶和位置上的结合变化以及其它实验条件。

图2和图3所示的实施方案可以具有不同的优点。例如，图2所示的方案在探针设计或合成方面更简单，特别是对于图2a和图2b所示的直接和间接标记方法。然而，如果初级探针以不同的亲和力或效率结合靶，结合中缺乏均匀性可能导致用不同于设计的颜色或强度来标记靶。此类差别对于图2a中的第一靶并不重要，图2a中的第一靶仅结合具有一种光学标记的探针。然而，它可能对第三靶具有更显著的影响，第三靶通过设计应该具有1：1的比值。如果Cy5-标记的探针之一不能结合靶，那么得到的比值将为2：1，而不是1：1。图3所示的标记方案-2可以避免此类问题，因为与靶结合的每个探针具有相同的染料组合。因此，即使一些探针不能与靶结合，对所得标记的影响也可能不显著。至少颜色比值是恒定的。例如，在图3a的最后一个样品中，如果一个探针不能与靶结合，那么比值仍然是2：1。

考虑图2中所示的标记方案-1可以更适合于具有长DNA或RNA序列的FISH，其中多个初级探针可以用于检测，并且不同结合区域之间的结合变化并不影响靶的多个探针的强度变化。另一方面，图3中所示的标记方案-2可以更适合于短DNA或RNA序列，其中只有有限数量的初级探针可以用于检测，并且不同结合区域之间的结合变化可以显著影响靶的探针组的强度变化。

标记方案-1和标记方案-2可以一起用于标记样品中的不同靶。例如，对于由不同长度的基因转录物组成的RNA组，较长的转录物可以用图2中所示的标记编码方案来标记，而较短的转录物可以用图3中所示的标记编码方案来标记。

2．标记方案-3

然而，实现高容量检测的另一种方法使用具有重叠色谱的不同光学标记，使得可以用相同的颜色通道获得多个强度水平。这在图4的图a-c中示出，并被称作“标记方案-3”；在该方案中，使用较暗的光学标记（例如Cy3，其具有黄色荧光颜色），以及具有相似颜色或重叠光谱的较亮的标记（例如Alexa 546，其具有甚至更亮的黄色荧光颜色）。通常，它们的峰值发射波长被隔开小于100 nm。可替代地，它们被隔开小于50 nm、小于40 nm、小于20nm、小于10 nm或小于5 nm。

图4a示出了实现标记方案3的直接标记方法。基本上，核酸或其它种类的靶直接与成像探针连接，而不需要任何其它基于中间杂交的探针。

图4b示出了实现标记方案3的间接标记方法。基本上，核酸或其它种类的靶首先与初级探针连接，然后初级探针与成像探针结合。

图4c示出了与分支DNA扩增方法一起进行间接标记以实现标记方案-3。基本上，核酸或其它种类的靶首先与初级探针连接，然后初级探针与两层信号扩增探针（第一扩增探针和第二扩增探针）结合，最后第二扩增探针与成像探针结合。如果需要，可以使用更多层的扩增探针。

Cy3和Alexa 546的颜色在发射光谱方面接近或重叠。如果单独使用它们并且用相同的颜色通道记录，则难以区分二者。然而，当它们与来自另一个颜色通道的1至2个其它光学标记组合使用时，它们的差别被增强并变得可区分。通过将这些染料与正确的颜色通道组合相匹配（例如，一个通道具有670-720 nm的发射滤光器，而另一个通道具有580-620 nm的发射滤光器），可以在两个通道上实现不同的强度比值（图1b和图4）。例如，在图4a中，在第四靶上，较亮的Cy5与较暗的Cy3结合，在第五靶上，较暗的Cy5.5与较亮的Alexa 546结合。使用一个颜色通道来检测Cy5和Cy5.5，另一个颜色通道来检测Cy3和Alexa 546，可以通过两个颜色通道之间的相对强度比值来区分这两个标记的靶。通常，3至4种染料用于形成两对染料以标记两个不同的靶，诸如Cy5-Cy3和Cy5-Alexa 546，或Cy5-Cy3和Cy5.5-Cy3。不同的染料对可以由相同的两个颜色通道成像，以产生不同的强度比值。

因此，在一些实施方案中，本发明提供一种被制备用于检测的样品，包括：第一多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第一靶向生物分子；以及第二多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第二靶向生物分子，其中每个探针都附接有一种或多种光学标记，使得：（a）第一靶与第一光学标记相关联，第二靶与第二光学标记相关联，并且（b）这两种不同类型的光学标记具有相同或重叠的色谱，但是具有不同的强度。在一些实施方案中，这两种不同类型的光学标记在颜色通道中可以具有至少相差2倍、2.5倍、3倍、4倍、4.3倍或5倍的不同强度。在一些实施方案中，两种不同类型的光学标记的不同强度相差至多10倍、8倍、7.5倍、6.3倍、5倍或4倍。

在一些实施方案中，第一靶和第二靶两者还与第三光学标记相关联。检测与第一靶相关联的第一光学标记和第三光学标记，生成第一靶的第一强度比值。检测与第二靶相关联的第二光学标记和第三光学标记，产生第二靶的第二强度比值。比较第一强度比值和第二强度比值，区分第一靶和第二靶。

还提供了包括第一探针和第二探针的探针组，其中第一探针和第二探针分别附接有具有相同或重叠的色谱但强度不同的第一光学标记和第二光学标记，其中第一探针和第二探针各自还附接有第三光学标记，并且其中第一探针和第二探针在光学上是可区分的。这些探针可具有不同的结合特异性，可用于靶向不同的靶分子。

当检测到不同的探针时，在一些实施方案中，由于强度的差异，可通过比较至少两个颜色通道中的强度比值来检测可光学区分的探针。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种被制备用于检测的样品，包括：第一多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第一靶向生物分子；以及第二多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第二靶向生物分子，其中每个探针都附接有一种或多种光学标记，使得：（a）第一靶与第一光学标记相关联，第二靶与第二光学标记相关联，（b）这两种不同类型的光学标记具有相同或重叠的色谱，但是具有不同的强度，并且（c）第一靶还与第三光学标记相关联，第二靶还与第四光学标记相关联，并且（d）第三光学标记和第四光学标记具有相同或重叠的色谱，但是具有不同的强度。检测与第一靶相关联的第一光学标记和第三光学标记，生成第一靶的第一强度比值。检测与第二靶相关联的第二光学标记和第四光学标记，产生用于第二靶的第二强度比值。比较第一强度比值和第二强度比值，区分第一靶和第二靶。

还提供了一种探针组，其包括第一探针和第二探针，其中第一探针和第二探针分别附接有具有相同或重叠的色谱但强度不同的第一光学标记和第二光学标记，其中第一探针和第二探针分别附接有具有相同或重叠的色谱但强度不同的第三光学标记和第四光学标记，并且其中第一探针和第二探针在光学上是可区分的。这些探针可具有不同的结合特异性，可用于靶向不同的靶分子。

3．间接标记和信号扩增

在一些实施方案中，当使用标记方案1-3时，靶直接结合附接有光学标记的探针，如图2至图4的图a所示。在另一种设计中，如图2至图4的图b所示，光学标记可以用中间探针间接结合靶。在图2b、图3b和图4b中，没有光学标记的初级探针（中间探针）首先与靶结合，具有光学标记的次级探针与初级探针结合，以实现多个强度水平和强度代码。在一些实施方案中，在探针已经结合靶之后，将光学标记附接到探针。

在一些实施方案中，如图3的图b所示，初级探针由杂交序列和读出序列组成。杂交序列与DNA和RNA上的靶序列互补。读出序列用于与染料标记的次级探针结合。一个初级探针可与多达2个读出探针连接，一个在5’端并且另一个在3’端。通过标记不同数量的染料和多种不同种类的染料，可以实现不同的强度代码。

在一些实施方案中，染料通过交联化学附接到寡核苷酸探针。诸如二硫键、叠氮基或炔基之类的交联剂连接到寡核苷酸探针，以促进可逆或不可逆的位点特异性染料-寡核苷酸物缀合。

在一些实施方案中，通过信号扩增技术在与靶分子相关联的初级探针之后加入中间探针。在一些实施方案中，在初级探针和成像探针的结合之间添加多于一层的中间探针。在一些实施方案中，在初级探针和成像探针的结合之间添加初级扩增分子和次级扩增分子。

在一些实施方案中，分支DNA扩增技术用于单分子强度编码，如图2至图4的图c所示。在图c中，不仅使用初级和次级探针（或称为初级扩增分子），还使用三级探针（或称为次级扩增分子）来用更多的光学标记来标记一个靶，从而可以获得更高的信号强度。也可以使用其它信号扩增技术，诸如杂交链式反应（HCR）、交换反应信号扩增（SABER）等。

在一些实施方案中，通过平衡或不平衡的分支DNA扩增技术来扩增信号强度。因为每个初级探针（即直接靶结合探针）可以在5’和3’端两者处与扩增分子相关联。对于平衡的分支DNA扩增，每个初级探针与初级探针每一端的相同数量的染料相关联，如图3c中就第三靶（以2：2标记）所示。对于不平衡的分支DNA扩增，每个初级探针在初级探针的5’和3’端处与不同数量的染料相关联，如图3c中就第四靶和第五靶所示（以1：2和2：1标记）。

在一些实施方案中，初级探针在5’端和3’端两者处与扩增分子相关联，并且初级探针在5’和3’端处与不同种类的染料相关联。在一些实施方案中，初级探针在5’端和3’两者处与扩增分子相关联，并且初级探针在5’和3’端处与相同种类的染料相关联。

在一些实施方案中，使用酶扩增方法在初级探针和成像探针的结合之间添加中间探针。酶扩增的一个实例是滚环扩增（RCA）。在图5中，首先将靶唯一识别探针附接到靶，然后加入滚环扩增（RCA）的信号扩增步骤以扩增靶唯一标识符，最后将具有不同靶的识别信息的扩增探针与成像探针相关联。这可用于核酸和非核酸标记。

4．用于标记方案1-3的可替代标记方案

在一些实施方案中，除了使用报告染料进行强度编码之外，还加入参考染料进行标记。该方法可应用于本文所述的任何公开的标记方案。参考染料不用于产生强度代码。相反，它用于区分非特异性结合和特异性结合。该参考染料由颜色通道成像，该颜色通道与用于非特异性结合信号的纠错的强度编码的颜色通道分开。通过对强度编码的报告染料和参考染料进行共定位分析，可以去除参考染料通道中没有信号的非特异性结合的FISH点。在一些实施方案中，加入与附加的多个初级探针相关联的参考染料以标记每个靶（图6）。

在一些实施方案中，当使用标记方案-2和标记方案-3时，使用区别化标记方法。换言之，不同的光学标记与用于同一靶的不同组初级探针相关联（图7）。

在一些实施方案中，与靶的不同光学标记相关联的不同初级探针以交替的顺序与靶结合。该方法可以最小化不同靶区域之间各种初级探针结合亲和力的变化对其所分配的强度代码的强度变化的影响。以标记方案-2为例，如图8b所示，对于强度代码为1：2的第一RNA靶（两个颜色通道按照Cy3和Cy5的顺序），每两个初级探针沿着RNA靶形成一组。每组包括一个与一种Cy3染料结合的初级探针以及一个与两种Cy5染料结合的初级探针。对于图8b中强度代码为2：1的第二RNA靶，每两个初级探针也沿着RNA靶形成一组。每组包括一个与两种Cy3染料结合的初级探针，一个与一种Cy5染料结合的初级探针。

在一些实施方案中，使用如图9所示的可替代标记方案-3。在这个可替代的标记方案-3中，仅使用一种光学标记来标记靶（图9）。在相同的颜色通道组合（至少两个）中，用具有重叠激发或发射光谱的不同光学标记来标记不同的靶。例如，Alexa 647和Alexa 700可用于该方案（图10，实施例10）。每个光学标记由相同的颜色通道（至少两个颜色通道）组合成像，并且其中不同的光学标记通过比较这些通道中标记的强度而产生不同的强度比值。通常，光学标记附接在寡核苷酸或肽探针上用于标记，诸如单链DNA寡核苷酸或PNA。

在一些实施方案中，使用间接标记来实现可替代的标记方案-3。在一些实施方案中，将间接标记和信号扩增相结合以实现可替代的标记方案-3。在一些实施方案中，将间接标记和分支DNA信号扩增相结合，以获得可替代的标记方案-3。在一些实施方案中，为了实现可替代的标记方案-3，使用一个初级探针和一个成像探针来检测靶。在一些实施方案中，至少2个或4个初级探针与第一靶和第一光学标记相关联。在一些实施方案中，至少12个初级探针与第一靶和第一光学标记相关联。在一些实施方案中，至少24个初级探针与第一靶相关联。

在一些实施方案中，可替代的标记方案-3与标记方案-2或方案-1组合以检测至少两个靶。例如，为了检测靶A和B，靶A的每一拷贝用一种染料A标记，靶B的每一拷贝用20种染料B标记，这两种染料由两个颜色通道检测，并为这两种靶产生两个不同的强度比值。靶A用2：1的强度代码编码，靶B用1：2的强度代码编码。

在一些实施方案中，用于检测的生物样品包括第一多个探针和第二多个探针，所述第一多个探针直接或间接结合生物样品中的第一靶分子、细胞或组织，所述第二多个探针直接或间接结合生物样品中的第二靶分子、细胞或组织，其中每个靶仅与一种光学标记相关联，第一光学标记与第一靶相关联，第二光学标记与第二靶相关联，第一光学标记和第二光学标记在第一颜色通道和第二颜色通道中具有重叠的光谱；其中第一靶和第二靶在激发时与来自两个颜色通道的不同信号强度比值相关联。在一些实施方案中，在同一样品中，第一光学标记和第二光学标记在第三颜色通道中具有重叠的光谱，其中第一靶和第二靶在激发时与来自三个颜色通道的不同信号强度比值相关联。在一些实施方案中，在同一样品中，与第一靶相关联的第一光学标记的数量和与第二靶相关联的第二光学标记的数量的比值为至少2。在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记的数量和与第二靶相关联的第二光学标记的数量的比值为至少4、4.5、6、7.2、8或10。

5．稀疏编码

在一些实施方案中，为了降低重叠率（种类分配的差错率）和控制强度编码的稀疏性，应当为实际应用选择可能代码的抗错子集。例如，在N=2和M=2的情况下，消除2：0、0：2、1：1和2：2的代码可以将强度重叠降低到小于5%，同时仍然保留仅具有2个颜色通道的4个不同强度组合（1：0、0：1、1：2、2：1）（参见实施例1）。

在一些实施方案中，当不同探针使用不同强度的光学标记时，当强度水平移动较低或较高时，确保相邻强度水平的差值高于阈值以减少不正确的检测，这是很有用的。不正确的检测可能是由于有限的检测能力、色差、不同的探针结合效率、光学标记的强度变化，或者因为不同的探针对它们的靶具有不同的可及性，但不限于此。例如，与5种Cy3染料和1种Cy5染料结合的靶DNA可以很容易地与结合1种Cy3染料和1种Cy5染料的另一种靶DNA区分开来，但是不容易与结合4种Cy3染料和1种Cy5染料的另一种靶DNA区分开来。

在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记和与第二靶相关联的第一光学标记的比值相差至少2、2.5、3、3.4、4或5倍。在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记和与第二靶相关联的第一光学标记的强度比值相差至少2、2.5、3、3.4、4或5倍。

在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记和与第二靶相关联的第一光学标记的比值相差不大于100倍。在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记和与第二靶相关联的第一光学标记的比值相差不大于50倍。在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记和与第二靶相关联的第一光学标记的比值相差不大于10倍。

在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记的数量和与第二靶相关联的第一光学标记的数量相差至少2。换言之，当两种不同的靶分子都结合相同的光学标记时，没有两种不同的靶分子仅相差一种光学标记，并且没有相同数量和类型的其它光学标记。此类排列的一个特定实例是在生物样品中仅使用奇数种特定的光学标记。在另一个实例中，仅使用偶数种光学标记。

在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记的数量和与第二靶相关联的第一光学标记的数量相差至少10、20、40、100、500或1000，但不限于此。

在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记的数量和与第二靶相关联的第一光学标记的数量相差小于1000、980、900、800、750、620、500、400、300、200、120或小于1000的任何其它整数。在一些实施方案中，与第一靶相关联的第一光学标记的数量和与第二靶相关联的第一光学标记的数量相差小于100、95、80、70、65、50或小于100的任何其它整数。

在一些实施方案中，当使用标记方案-3时，峰值发射波长被分开小于100 nm的两种光学标记与两个不同的靶相关联，并用相同的颜色通道进行检测。然而，为了减少光谱重叠并增加编码稀疏性，将第一光学标记的峰值发射波长与第二光学标记的峰值发射波长分开大于5 nm。可替代地，它们分开大于10 nm、大于15 nm、大于18 nm或大于20 nm。

在一些实施方案中，用于强度编码方案的任意两个强度水平（不包括0）之间的强度差（由强度分布直方图的峰值、平均值或中值强度所定义）被至少2、2.5、3、3.4、4、4.6或5的倍数分开。例如，对于M=3的编码方案，水平2的强度是水平1的强度的2×。水平3的强度是水平2的强度的2×、水平1的强度的4×。在一些实施方案中，用于强度编码方案的任意两个强度水平（不包括0）之间的强度差值被至少3的倍数分开。例如，对于M=3的编码方案，水平2的强度是水平1的强度的3×。水平3的强度是水平2的强度的3×、水平1的强度的9×。两个强度水平之间的差异不限于特定倍数。倍数差值也不限于整数，可以是分数，诸如3.5×、5.2×或10.6×。

6．组合多个标记方案

在一些实施方案中，组合多个标记方案以增加相邻强度代码的强度间隙和检测精度。在一些实施方案中，使用多个标记方案来同时标记靶组中的不同靶。例如，使用标记方案-1来检测组中的第一靶，使用标记方案-3来检测同一组中的第二靶。在一些实施方案中，组合多个标记方案以标记相同的靶。例如，组合标记方案-2和方案-3以检测组中的第一靶，以及组合标记方案-1和方案-3以检测同一组中的第二靶。

在一些实施方案中，组合标记方案-2和方案-3以更好地分离两个强度代码。例如，不是仅仅使用Cy5-Cy3（每个初级探针1种Cy5染料和1种Cy3染料）和Cy5.5-Alexa 546（每个初级探针1种Cy5.5染料和1种Alexa 546染料）的染料对来标记两个靶，可以使用2Cy5-Cy3（每个初级探针2种Cy5染料和1种Cy3染料）来标记第一靶，可以使用Cy5.5-2Alexa 546（每个初级探针1种Cy5.5染料和2种Alexa 546染料）来标记第二靶。

在一些实施方案中，区分化标记和标记方案-3组合以检测至少2个靶。例如，使用4种具有重叠光谱的染料（Cy5、Cy5.5在颜色通道-1中具有重叠的发射光谱；Cy3、Alexa 546在颜色通道-2中具有重叠的发射光谱）来检测2个靶A和B。Cy5和Cy3一起用于检测靶A，但是这2种染料与2组不同的初级探针相关联。Cy3和Alexa 546用于检测靶B，但是这两种染料与两组不同的初级探针相关联。

在一些实施方案中，非天然核酸和基于非核酸的分子（诸如LNA、PNA和异种核酸（XNA））对天然核酸的结合亲和力高于天然核酸之间的结合亲和力，并且它们本身可用于不同种类的探针，诸如初级探针、扩增探针、成像探针。此类应用可以提高DNA/RNA靶的基因组分辨率。换言之，与针对同一靶使用天然寡核苷酸相比，用这种方法可以设计更多的探针，每个探针具有更短的序列。该策略适用于上述所有标记方案。

在一些实施方案中，肽和寡核苷酸序列的杂交体用作探针，诸如PNA和天然核苷酸的杂交体。

7．标记方案-4

另一种在单分子水平上调节强度水平和分布的方法是通过荧光增强或荧光猝灭。这被命名为标记方案-4。该方案可用于调整强度变化或创建新的强度水平。通过将报告染料与强度增强分子或猝灭化学基团缀合，可以产生荧光增强或猝灭。如图11所示，可以采用多种方式诱导荧光猝灭，诸如将染料与猝灭化学基团（如BHQ（黑洞猝灭剂染料））相关联、将染料与另一种染料相关联以产生FRET染料对（例如将Cy3和Cy5连接在一起）、缩短沿靶向核酸序列的相邻染料的距离。

在一些实施方案中，与靶相关联的至少一个光学标记附接有更多相同的光学标记。在一些实施方案中，与靶相关联的至少一个光学标记附接有能够通过FRET猝灭光学标记的不同光学标记。在一些实施方案中，与靶相关联的至少一个光学标记附接有猝灭剂化学基团如BHQ。在一些实施方案中，与靶相关联的至少两个相同的光学标记被不超过10个核苷酸分开。

增加寡核苷酸探针的标记密度可以诱导光猝灭。例如，将100 nt的寡核苷酸与少于5个的光学标记相关联可能不会引起猝灭，但是将光学标记增加到多于5个光学标记将引起荧光团猝灭。在一些实施方案中，寡核苷酸探针与多个光学标记相关联，使得探针序列的每100 nt探针与多于5个光学标记相关联。在一些实施方案中，寡核苷酸探针与多个光学标记相关联，使得每100 nt探针序列与多于6、8、10或15个光学标记相关联。在一些实施方案中，寡核苷酸探针与多个光学标记相关联，使得每100 nt探针序列与多于50、60、80或100个光学标记相关联。

在一些实施方案中，组合标记方案-4和其它标记方案以标记靶。在一些实施方案中，组合标记方案4和2以检测靶。在一些实施方案中，组合标记方案-2、3和4以检测靶。

8．非核酸基靶的高容量检测

高容量原位生物分子检测：开发的用于RNA和DNA原位检测的强度编码技术可扩展到其它生物分子的原位检测，诸如蛋白质、脂质、糖分子、表位基因组修饰和表位脚本修饰，通常的标记方案是首先将非核酸靶与靶特异性寡核苷酸或肽序列（诸如PNA）附接，以将强度条形码分配给靶，然后通过杂交将强度编码的检测探针与靶特异性寡核苷酸或肽相关联。靶特异性寡核苷酸或肽可以通过各种接头或中间分子与靶向分子连接。

在一些实施方案中，不同的靶与不同种类的初级探针相关联。在一些实施方案中，不同的靶与不同数量和种类的初级探针相关联。在一些实施方案中，至少第一靶与两个或多于两个的初级探针相关联。在一些实施方案中，第一靶与两个或多于两个的相同初级探针相关联。在一些实施方案中，第一靶与两个或多于两个的不同初级探针相关联。

9．高容量原位蛋白质检测

图12中示出了用于标记蛋白质靶的标记方案并在下面进行描述。在一个实施方案中，蛋白质被初级抗体识别。初级抗体与靶特异性初级寡核苷酸或肽核酸（PNA）附接。不同种类的蛋白质与不同的靶特异性初级寡核苷酸或肽核酸相关。然后可以加入光学探针来识别不同的靶特异性初级探针，以得到不同的强度比值代码。在寡核苷酸和抗体结合化学的基础上，还可以增加滚环扩增、分支DNA扩增等信号扩增技术来检测单个蛋白，从而获得更多的强度水平和多种强度比值代码。

在一些实施方案中，蛋白质可以与小分子或大分子（诸如生物素、GFP、HA-tag、SNAP-tag、Halo-tag）附接，以促进位点特异性标记。不同的蛋白质具有不同的表位，这些表位被不同的抗体识别。不同的抗体与不同的靶特异性初级探针连接。通过不同的光学探针来检测不同的初级探针，得到不同的强度比值代码。

在一些实施方案中，不同的蛋白质靶与不同种类的初级探针相关联。在一些实施方案中，不同的蛋白质靶与不同数量的初级探针相关联。在一些实施方案中，至少第一蛋白质靶与两个或多于两个的初级探针相关联。在一些实施方案中，第一蛋白质靶与两个或多于两个的相同初级探针相关联。在一些实施方案中，第一蛋白质靶与两个或多于两个的不同初级探针相关联。

10．表观遗传修饰的高容量原位检测

表观遗传修饰是指与基因组功能相关的改变，其不涉及核苷酸序列的改变，诸如DNA或RNA甲基化、组蛋白修饰。为了进行强度编码，可以首先用识别并结合表观遗传修饰的寡核苷酸附接抗体或任何寡核苷酸附接分子来检测这些修饰。然后这些寡核苷酸可以作为初级探针，进一步与不同强度编码的探针杂交，获得各种强度比值代码。通常，诸如分支DNA扩增或滚环扩增等信号扩增技术与寡核苷酸标记的抗体结合以获得各种强度水平和强度比值代码。

11．高容量细胞检测

通过强度比值编码的高容量检测可用于对颜色数量有限和光学标记种类有限的多个细胞群进行检测、区分和分类。该方案是通过细胞类型特异性生物标志物（诸如RNA和蛋白质）来标记不同的细胞类型（图13a）。不同的细胞标志物与不同强度编码的光学探针相关联。例如，此处开发的强度比值编码可用于共同检测4种蛋白CD34、CD45、CD9、广谱细胞角蛋白。这4种蛋白中的每一种都是细胞标志物。因此，可以通过这4种蛋白的强度条形码来区分至少4种细胞类型。

12．高容量体外分子或颗粒检测

通过强度比值编码的高容量检测可用于体外检测和区分单个分子或单个颗粒。例如，如图13b所示，单个蛋白质可以随机和稀疏地捕获在玻璃基质上，并由具有不同强度比值代码的寡核苷酸探针进行检测。可替代地，如图13c所示，不同种类的分子可被捕获在基底上并以有序图案彼此空间分离。然后用强度编码的光学探针检测不同位置的不同组分子。

D．光学设置

光学设置：对于强度编码的样品成像，可以使用至少两种仪器：显微镜和流式细胞术。对于显微镜成像，生物样品通常附接在玻璃支架上，并由具有CCD或照相机的显微镜成像。为了通过显微镜进行强度成像的最佳性能，需要激光激发的荧光显微镜（诸如旋转盘共焦显微镜）和高灵敏度的照相机（诸如EMCCD或sCMOS照相机），以获得具有最佳信号背景比和信噪比的高质量图像。对于流式细胞术，用强度条形码探针来标记样品，然后用PMT进行检测。然而，对于一些其它样品，可通过其它种类的仪器（诸如酶标仪）来检测它们。

E．图像分析：标准化和纠错

1．强度标准化

该步骤可用于将与诸如FISH斑点的光斑相关的所有颜色通道的强度值转换为单独的强度比值。以RNA FISH为例，根据RNA编码所用的强度代码，可以用各颜色通道的绝对强度值或不同颜色通道之间的相对强度比值来计算FISH斑点的强度比值。例如，如果使用1：1和2：2的2色编码方案来标记两种RNA种类，则需要使用绝对强度值来计算每个FISH斑点的强度比值（参见实施例1）。然而，如果仅使用来自整个代码谱的代码的一部分来使任意两个强度代码之间的强度重叠最小化，则可以仅使用不同通道（至少两个颜色通道）之间的相对强度来计算强度比值（参见实施例1）。

2．使用参考强度代码图的代码分配

如上所述，使用稀疏编码可以有助于在相邻强度之间留下适当的空间，从而减少重叠信号并减少差错。然而，在一些实施方案中，可以采用纠错来进一步确保信号读取精度。

在一些实施方案中，纠错需要精确地测量每个强度代码及其相应的探针设计方案的强度变化（或强度比值变化）。每个强度代码的强度变化由探针标记方案的强度变化所决定，探针标记方案的强度变化与多个因素有关，诸如精确的探针序列设计、光学标记的设计、关注的靶、所用样品、染色和成像条件。可以用参考样品来测量所有强度代码的强度变化的参考图。基于此类参考强度代码图，可以确定强度代码的强度分布的边界及其标记方案（参见实施例4）。也可以相应地确定任意两个强度代码的重叠率。

在实施例1中示出了测量强度代码的强度变化和重叠率的简单模拟。

代码分配和斑点拒绝

如图1c所示，理想地，基于班点的测量强度（或强度比值）与强度坐标图中预定强度代码的面心强度（或强度比值）的距离，将来自光学图像的每个FISH斑点或强度斑点分配给其最近的强度代码。与两个附近强度代码距离相等的班点将被丢弃。

计算强度距离的公式如下：

式中，D代表从实验样品到预定强度代码的面心强度的强度斑点的测量强度的距离。（x₁、y₁、z₁、……）代表特定颜色通道中强度斑点的测量强度。（x₀、y₀、z₀、……）代表特定颜色通道中的预定强度代码的单独强度，在此称作网格强度坐标。如果使用多于3种颜色的强度编码方案，则可以将除x、y和z之外的附加变量添加到上述公式的右侧。

以N=2和M=2（2个颜色和2个强度水平）为例，如果强度代码具有1：2的强度（颜色通道-1中的强度是1，颜色通道-2中的强度是2）。x₀=1、y₀=2代表该代码在2色或2维强度坐标图上的位置。如果测得的来自FISH斑点的强度为1：1.7，则x₁=1，y₁=1.7。通过计算其与周围4个网格坐标的距离，可以将该FISH斑点赋值为1：2的强度代码。如果测得的来自FISH斑点的强度为1：1.5，则x₁=1，y₁=1.5。通过计算其与周围4个网格坐标的距离，其与网格坐标（1，1）和（1，2）具有相等的距离。由于代码分配的模糊性，该FISH斑点被拒绝。

实际上，各种因素可以改变探针标记方案的强度分布。因此，所选择的探针标记方案的强度分布和相应的强度代码可以在强度坐标图中具有不规则的边界（图1d）。为了将所有强度点分配给正确的强度棒（rode），需要使用参考样品来实验地确定所有强度代码的边界。通过用在与实验样品相似的参考样品中设计的强度代码和标记方案来标记关注的靶，可以单独测量每个标记方案的强度分布及其对应的强度代码。然后，基于从参考样品产生的所有强度斑点的密度分布，可以确定边界。将来自实验样品的强度斑点的测量强度与用参考样品确定的边界进行比较，如果强度位于强度代码的边界中，则将该斑点分配给相应的强度代码，否则拒绝该斑点；如果强度位于两个强度代码的两个边界中，则由于分配的模糊性而拒绝该斑点。

确定强度代码边界的一种方法是使用下面的公式来测量强度坐标图中任意两个强度斑点的强度距离：

式中，D代表来自参考样品的一个随机强度斑点的测量强度与来自参考样品的另一个随机强度斑点的测量强度的距离。（x₁、y₁、z₁、……）和（x₂、y₂、z₂、……）代表特定颜色通道中随机强度斑点的测量强度。如果使用多于3种颜色的强度编码方案，则可以将除x、y和z之外的附加变量添加到上述公式的右侧。可以将强度距离低于一定范围的强度斑点分组在一起，形成强度斑点簇，从而生成簇的边界，即强度代码。

差错稳健强度编码

对于强度编码，将使用基于实验强度比值到标记方案的预定强度代码的面心位置的距离的纠错方案（图1c）。具体地，为了更稳健的检测，如果实验比值与两个相邻网格坐标的距离差在一定范围内，诸如对于两种颜色强度编码为±0.01，则可以认为该实验比值具有模糊性，并且丢弃相应的FISH斑点以进行代码分配。

实际上，用于强度编码的纠错方案是基于参考样品中强度代码的强度分布来生成参考强度代码图（实施例4）。将来自实验样品的强度斑点的强度与参考强度代码图中所有强度代码的强度边界进行比较，可以用正确的强度代码分配或拒绝一个强度斑点。

另一种纠错是利用整个编码空间的稀疏性。HC-smFISH和通过强度编码的高容量检测中的一个主要差错来源是两个强度代码之间的强度重叠，导致强度代码的误分配。为了解决这个错误，可以选择可用的一部分强度代码，以便增加相邻两个强度代码之间的强度间隙以及在整个编码空间中使用的代码的稀疏性。

F．用于强度编码的成像方案的概述

总而言之，本发明提供了一种使用有限数量的颜色通道（该数量表示为N）和多种光学标记（不同标记的数量表示为L）来检测大量不同靶（不同靶的数量表示为P）的方法，其数量大于可用的颜色通道的数量。通常，被检测的靶的数量可以用下式表示：P≥2^N（N≥1）。在一些实施方案中，我们使用比颜色通道的数量更多的光学标记来检测P种靶（P>N，L>N），这是标记方案-3的情况。在一些实施方案中，我们使用与颜色通道数量相同数量的光学标记来检测P种靶（P>N，L=N），这是标记方案-1和2的情况。在一些实施方案中，我们使用与颜色通道数量相同数量或更多的光学标记来检测P种靶（P>N，L≥N），这是可替代标记方案-3的情况。通常使用基于杂交的探针分析，但不限于基于杂交的探针，用于在此实现各种强度编码方案。

实施例

包括以下实施例以说明本发明的具体实施方案。本领域的技术人员应当理解，以下实施方案中公开的技术代表了在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成了用于其实践的具体模式。然而，根据本发明，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方案中进行多种改变，并且仍然获得相似或类似的结果。

实施例1．单分子RNA FISH的强度变化和2色HC-smFISH的模拟。

单分子RNA FISH：使用来自LGC Biosearch Technologies的TFRC mRNA探针在HeLa细胞中进行快速RNA FISH。TFRC探针由48个寡核苷酸探针组成。每个探针长20nt，在5’端用一个Quasar 570染料标记。8孔玻璃底部培养室（Ibidi）用于样品成像。在室温下将细胞固定在4%多聚甲醛（PFA；Electron Microscopy Sciences）中5-10分钟，然后在纯甲醇（Sigma）中渗透5-10分钟。然后通过以下步骤处理样品：（1）在80%-甲酰胺（Sigma）和2×SSC缓冲液的干燥浴中，在75℃下彻底热变性10分钟；（2）在10%甲酰胺、20%硫酸葡聚糖（Sigma，MW>500,000）和2×SSC的杂交缓冲液中加入短DNA寡核苷酸探针，杂交时间为10分钟；（3）用2×SSC缓冲液洗涤2-3次；（3）对样品成像。杂交过程中探针浓度为100nM。

成像设置：在具有Plan apo VC 100× 1.45 N.A.油浸物镜的倒置荧光显微镜（Ti-E；Nikon，Melville，NY）上获得荧光图像。将Andor Borealis CSU-W1旋转盘共焦连接到显微镜主体的左端口。配备4个激光器（405、561和640 nm处的100 mW；488 nm处的150mW）以在DAPI、FITC、Cy3和Cy5通道中产生荧光激发和发射。CSU-W中的内部二向色性用于入射激光器。没有附加的激发滤光器用于旋转盘共焦成像。使用4个激光器，并与4个发射滤光器（Chroma）匹配：405 nm激光器，发射滤光器在450/50m处；488 nm激光器，发射滤光器在525/50m处；561 nm激光器，发射滤光器在600/50m处；640 nm激光器，发射滤光器在700/75m处。将所有发射滤光器安装到电动滤光轮（Lambda 10-B；Sutter Instrument，Novato，CA）中。使用电动显微镜载物台（Applied Scientific Instrumentation（ASI），Eugene，OR）来控制样品的xy和z平移。具有200 ms曝光时间的sCMOS照相机（Andor Zyla 4.2 sCMOS照相机）记录荧光图像。通过软件Micro-Manager（www.micro-manager.org）中的定制配置来控制显微镜、光源、电动载物台、电动滤光轮和照相机。

图像分析：首先用抑制像素噪声和长波长图像变化的真实空间带通滤波器处理图像。然后用一种算法对带通图像进行应用，以找到像素级精度的局部最大值，从而获得对荧光斑点中心的粗略推测。为了将荧光斑点与由非特异性结合探针产生的背景信号区分开，在这个步骤中需要建立强度阈值，其中我们只拾取强度是没有荧光斑点的区域的平均强度的四倍的斑点。然后通过高斯拟合算法进一步拟合拾取的局部最大值，以得到荧光斑点位置的强度、斑点数和亚像素分辨率，假设所有合理的荧光斑点被限制在10像素×10像素区域内。

结果和讨论：比值1：0是由单个Quasar-570染料标记的TFRC探针检测到的790个斑点的实验结果。比值2：0和3：0分别是基于比值1：0的模拟数据，每个斑点两倍强度和三倍强度。比值2：0与比值1：0重叠的斑点为40%。比值3：0与比值1：0重叠的斑点小于5%。Quasar-570标记的TFRC斑点的强度变化表明，很好地分离1：0和3：0两个比值是可行的，斑点重叠或误识别率小于5%（图14b）。

在此使用TFRC转录物（LGC Biosearch Technologies）的单个Quasar570染料标记的寡核苷酸探针的强度分布进行模拟。

如下进行模拟：

（1）我们首先从实施例4中单一染料标记的TFRC RNA分子的实验结果中获得强度分布（光子数），并进行直方图分析；

（2）然后根据直方图拟合不同光子数的概率密度函数（PDF）；

（3）基于PDF，我们可以模拟每个比值的数据集。由于PDF给出了所有值的概率，所以我们的仿真根据随机数的概率使用Matlab（R2016a）中的随机数生成器来生成随机数。例如，对于1：0，我们仅使用PDF来模拟500个值，这给出了用于1：0数据的500个点的x值；

（4）为了模拟强度比值为1：1的500个点，我们模拟来自步骤2的PDF的500个值以给出500个点的x值，然后模拟来自相同PDF的另外500个值以给出500个点的y值，这是由于点的x值和y值是独立的，并且遵守与我们的当前模拟中假定的相同的PDF；

（5）为了模拟强度比值为1：2的500个点，我们通过对从步骤2获得的PDF和相同的PDF进行卷积，计算强度水平更高（此处为双倍强度）的PDF。然后如我们在步骤4中所做的那样，我们模拟强度比值1：2。

（6）为了模拟强度比值为1：3的500个点，我们通过将来自步骤2用于单个染料的PDF和来自步骤5用于两个染料的PDF进行卷积，计算强度水平更高（此处为三个染料）的PDF。然后如我们在步骤4中所做的那样，我们模拟强度比值1：3。

图14c示出了具有2个颜色和2个强度水平（N=2和M=2）的网点重叠的模拟结果。比值1：0、2：0、0：1、0：2可以很好地与中间4个强度比值分开，因为前4个比值中的一个颜色通道没有信号。中间4个强度比值之间的重叠率列于下表中。1：1与2：2以及1：2与2：1的重叠率小于10%，这明显小于其它4种组合的重叠率，如下表中所列出的，这4种组合的重叠率在10%和70%之间。

图14d示出了点与2个颜色和2个强度水平重叠、但在第一强度水平和第二强度水平之间具有较大强度间隙的模拟结果。第二强度水平的平均强度为第一强度水平的3倍。任意两个强度比值代码的重叠率小于1%，这意味着它们彼此很好地分开，如下表中所列。如果在同一轮FISH成像中使用这8个代码进行8个RNA检测，则应将大于99%的FISH点正确地分配给正确的RNA种类。

基于上述结果，为了使任何强度代码之间的强度重叠最小化，强度间隙应当足够大。通过这种方式，可以使单分子检测效率最大化。

然而，由于基因可及性在不同的DNA或RNA靶以及不同种类的细胞和组织样品之间变化很大，用于DNA/RNA包的强度代码的实际重叠率必须通过实验来验证，以获得最佳的精确码分配和最高的DNA/RNA检测效率。

实施例2．产生多个染料标记的寡核苷酸探针

可以将相同颜色或不同颜色的多个染料缀合到用于多色强度编码的每个寡核苷酸探针。对于每个寡核苷酸的两个染料标记，我们可以使用短的寡核苷酸（通常为20-50nt），并在每个寡核苷酸的两端进行末端标记。对于三-和四-染料标记，我们将使用更长的寡核苷酸探针，但仍≤100 nt以适应每个寡核苷酸的多种染料缀合。每个长探针由杂交序列和读出序列组成。杂交序列与天然核苷酸的长度为20至40 nt。读出序列的长度通常为至少15 nt。染料标记密度将被控制在每个染料大于10 nt（通常为每个染料大约20 nt），以使相邻染料之间的能量转移和猝灭最小化。

寡核苷酸-染料缀合物：有多种方法将多个不同的染料缀合到同一寡核苷酸以达到不同的强度水平：（1）在寡核苷酸合成过程中掺入具有不同染料的核苷酸衍生物；（2）在寡核苷酸合成过程中掺入具有不同表位的核苷酸，然后通过正交标记化学（诸如点击化学）缀合染料；（3）（1）和（2）的组合。此外，使用KREATECH通用连接***（Leica Biosystems）可以将多种相同颜色的染料缀合到具有预编程序列的DNA寡核苷酸。因此，为了实现2种颜色编码，诸如1：2，我们可以在每个寡核苷酸的5’或3’端处掺入一个红色染料，并且用KREATECH标记方法通过内部和末端标记将2个绿色染料与每个寡核苷酸的末端偶联。可替代地，可以将明亮染料如Cy5（与Cy5.5相比）和较暗的染料如Cy3（与Alexa 546相比）配对，使得每个寡核苷酸仅使用2个染料就达到1：2的强度比值。为了实现3和4种颜色编码，诸如1：1：1：1，可以使用两种点击化学（（1）叠氮和炔反应，（2）四嗪和乙烯基反应）在同一寡核苷酸上标记多达4个不同的染料。

实施例3．用标记方案-3和DNA FISH筛选强度编码

该实施例使用小鼠细胞中的重复DNA序列来筛选用于标记方案-3的良好染料对。在实验中单独测试每个染料对。

小鼠基因组中端粒和着丝粒重复区域的探针序列从IDT订购：

端粒探针，Tel-Cy5-Cy3：CCCTAACCCTAACCCTAA，5’用Cy5标记；3’用Cy3标记；

着丝粒探针-1，Cen-Cy5.5-Cy3：ATTCGTTGGAAACGGGA，5’用Cy5.5标记；3’用Cy3标记；

着丝粒探针-2，Cen-Cy5-A532：ATTCGTTGGAAACGGGA，5’用Cy5标记；3’用Alexa532标记；

着丝粒探针-3，Cen-Cy5-A546：ATTCGTTGGAAACGGGA，5’用Cy5标记；3’用Alexa546标记；

着丝粒探针-4，Cen-Cy5-Atto590：ATTCGTTGGAAACGGGA，5’用Cy5标记；3’用Atto590标记。

小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞上的DNA杂交如下进行：将MEF细胞接种在#1.5玻璃底部8孔室上，并在补充有10%FBS和1%青霉素的DMEM中培养至少12小时。在除去DMEM溶液后，立即用4%多聚甲醛（PFA，Electron Microscopy Sciences）固定MEF细胞10分钟。在除去PFA并用2×SSC洗涤3次之后，MEF细胞在4℃用70%乙醇渗透至少1小时。然后除去乙醇溶液，用2×SSC洗涤MEF细胞3次，然后在80%甲酰胺（Sigma）、2×SSC中于90℃变性10分钟。除去变性溶液后，将MEF细胞与含有10%甲酰胺、2X盐水-柠檬酸钠、20%葡聚糖硫酸酯（Sigma，MW>500,000）和200 nM DNA探针的200 uL探针缓冲液在37℃孵育4小时。用一种探针孵育室的每个孔，仅检测DNA位点的强度比值。然后在37℃用10%甲酰胺在2×SSC中洗涤MEF细胞2分钟，两次后在旋转盘共焦显微镜上用激光激发成像。

显微镜配置：包括滤光器的成像设置与实施例1中使用的相同。

成像：用同一激光器激发具有重叠发射光谱的多种染料，并用同一通道同时成像。基本上，用Cy5/700通道记录由激光640 nm激发的所有荧光。用Cy3/600通道记录由激光561nm激发的荧光。

图像分析：首先叠加来自相同FOV的3D扫描图像，并以最大强度投影。对700和600通道都进行该步骤。用高斯函数拟合最大强度投影图形，以获得其峰值强度及其在两个通道中的空间位置。然后将来自700通道的拟合斑点与来自600通道的斑点对齐，如果它们被分开，则认为是相同的端粒或着丝粒斑点在两个通道中的三个像素内。然后拾取来自相同荧光斑点的700通道和600通道的强度，以计算斑点的这两个通道的强度比值。然后用所有荧光斑点的强度比值创建2D（700和600通道）强度比值分布图。对于均出现在700和600通道中的那些斑点，我们绘制了以700通道为x轴的强度和以600通道为y轴的强度。在该图中，每个点代表FISH斑点在两个颜色通道上的强度比值。

结果和讨论：我们计算染料对之间的重叠比值（列于下表中），并创建2D强度分布图和1D强度比值直方图（图15e-g）。如图15e所示，由Tel-Cy5-Cy3和Cen-Cy5-A532的染料对探针标记的FISH斑点的2D强度分布彼此完全分开。此外，Tel-Cy5-Cy3的FISH斑点的强度分布与Cen-Cy5-A546的强度分布可显著区分开来（图15f）：9.14%来自Tel-Cy5-Cy3的点与Cen-Cy5-A546重叠，而22.35%来自Cen-Cy5-A546的点与Tel-Cy5-Cy3重叠，如下表中所列。此外，Tel-Cy5-Cy3的强度分布与Cen-Cy5.5-Cy3的强度分布仅部分可区分：34.13%Tel-Cy5-Cy3的点与Cen-Cy5.5-Cy3重叠，82.28%Cen-Cy5.5-Cy3的点与Tel-Cy5-Cy3重叠。Tel-Cy5-Cy3的强度分布与Cen-Cy5-Atto590很难区分：90.86%Tel-Cy5-Cy3的点与Cen-Cy5-Atto590重叠，而85.13%Cen-Cy5-Atto590的点与Tel-Cy5-Cy3重叠（图15g），如下表中所列。最后，Cen-Cy5-A532和Cen-Cy5.5-Cy3的强度分布彼此完全分开。Cen-Cy5-Atto590和Cen-Cy5-A546的强度分布彼此稍微重叠（大约2%，图15g），如下表中所列。

实施例4：在培养细胞中用标记方案-3进行多重RNA检测

此处我们使用标记方案-3来检测具有2个颜色通道的MEF细胞中的2个RNA靶（PORL2A，CTNNB1）。用Cy5和Cy3的染料组合来标记CTNNB1。用Cy5.5和Alexa 546的染料组合来标记POLR2A。

探针设计的一般原理：此处我们使用间接标记和分支DNA扩增来实现标记方案-3。我们对每个染料和每个初级探针使用5×5分支DNA信号扩增。通过这种方式，每个初级探针与具有5个重复的初级扩增分子结合，然后每个初级扩增分子与5个次级扩增分子结合，其中每个次级扩增分子具有5个重复，最后这5个次级扩增分子与具有多达25个成像探针的相同初级探针相关联。

4层探针设计的细节（初级探针、初级扩增分子、次级扩增分子、成像探针）：我们为每个RNA种类设计了48个初级探针。每个初级探针由与靶RNA序列互补的20nt靶结合序列、以及在20nt靶结合序列的5’和3’侧两者处的20nt读出序列组成。用于相同RNA种类的所有初级探针包括相同的读出序列。不同RNA种类的初级探针具有不同的读出序列，并且与不同的初级扩增分子和次级扩增分子相关联，以避免不同种类RNA靶之间的交叉结合。两种RNA种类的每个初级探针都与初级扩增分子结合。每个初级扩增分子具有与相应初级探针上的读出序列互补的20nt序列。每个初级扩增分子具有5个重复，以使其能够结合5个次级扩增分子。每个次级扩增分子具有与相应初级扩增分子上的重复序列互补的20nt序列。每个次级扩增分子具有5个重复，以使其能够结合5个成像探针。通过这种方式，对每种荧光染料实现了5×5的扩增。每个成像探针的长度为20nt，在其5’端具有荧光染料。两种成像探针用于CTNNB1：一种成像探针与一个Cy5染料缀合，另一种成像探针与一个Cy3染料缀合。两种成像探针用于POLR2A：一种成像探针与一个Cy5.5染料缀合，另一种成像探针与一个Alexa 546染料缀合。CTNNB1的每个初级探针可在5’端与多达25个Cy5染料相关联，并在3’端与多达25个Cy3染料相关联。POLR2A的每个初级探针可在5’端与多达25个Cy5.5染料相关联，并在3’端与多达25个Alexa 546染料相关联。因此，理论上，如果所有探针的结合效率为100%，总共1200（48×5×5）个Cy5染料、1200个Cy3染料可以与CTNNB1的RNA拷贝相关联。如果所有探针的结合效率为100%，总共1200个Cy5.5染料、1200个Alexa 546染料与CTNNB1的RNA拷贝相关联。然而，由于结合不充分，每个靶的染料总数可能远低于增加强度代码强度变化的这一数量。

用于初级探针靶结合序列的设计：从基因组和转录组数据库（诸如NCBI或UCSC）中提取RNA靶序列。靶结合序列要求GC含量在45-65%范围内。针对该物种的整个基因组和转录组在每个探针上进行BLAST查询，以去除具有高冗余性的序列。加入并调节最小探针间距（>2nt）以促进探针结合并使荧光团猝灭或FRET最小化。探针间距是指沿RNA靶的探针结合位点之间的最小核苷酸数。

初级探针的读出序列、初级扩增探针的序列、次级扩增探针的序列和成像探针的序列被设计成与小鼠转录组具有最小的非特异性结合。

强度代码：利用上述的寡核苷酸探针设计，我们分配了两个强度代码来检测CTNNB1和POLR2A。由于在该实验中，Cy5在700通道中比Cy5.5亮大约2倍，Alexa 546在600通道中比Cy3亮大约2倍，强度水平1可定义为用1200个Cy3或Cy5.5来标记靶，强度水平2可定义为用1200个Alexa 546或1200个Cy5来标记靶。因此，CTNNB1和POLR2A分别用2个强度代码（1：2）和（2：1）编码，此处采用寡核苷酸设计。在这两个强度代码中，第一位数代表600通道中的强度水平，第二位数代表700通道中的强度水平。

RNA FISH如下进行：将MEF细胞接种在#1.5玻璃底部8孔室（Ibidi）上，并在补充有10%FBS和1%青霉素的DMEM中培养至少12小时。除去DMEM溶液后，立即用4%多聚甲醛（PFA）固定MEF细胞10分钟。在除去PFA并用2×SSC洗涤3次之后，MEF细胞在4℃用70%乙醇渗透至少1小时。然后除去乙醇溶液，并用2×SSC洗涤MEF细胞3次，然后将其置于洗涤缓冲液（10%甲酰胺和2×SSC）中。除去洗涤溶液后，将MEF细胞与含有10%甲酰胺、2×盐水-柠檬酸钠、10%葡聚糖硫酸酯（Sigma，>500,000）和多个初级DNA寡核苷酸库（IDT，每种初级探针10nM）的200uL探针缓冲液在37℃孵育过夜。将室的每个孔与1-2种初级探针孵育以检测MEF细胞中的1-2种RNA种类（PORL2A，CTNNB1）。孵育过夜后，MEF细胞用10%甲酰胺在2×SSC中于37℃洗涤2分钟，洗涤两次。然后将细胞与10nM初级扩增探针在200 uL杂交缓冲液中于37℃孵育1小时。在洗涤缓冲液中洗涤5分钟后，进行两次洗涤，然后将MEF细胞与10nM次级扩增探针在200 uL杂交缓冲液中于37℃孵育1小时。在洗涤缓冲液中洗涤5分钟后，进行两次洗涤，然后将MEF细胞与100nM成像探针在200 uL杂交缓冲液中于37℃孵育1小时。最后一轮在洗涤缓冲液中洗涤5分钟后，然后将MEF细胞与浓度为0.001mg/mL的DAPI孵育1分钟，然后在旋转盘共焦显微镜上用激光激发成像（Nikon Ti显微镜，Yokogawa CSU-W1共焦扫描仪，sCMOS照相机Andor Zyla 4.2，100×油浸物镜）。在实施例1中使用的相同装置上进行荧光成像。依次对每个视场（FOV）进行700通道（640 nm激光激发，具有700/75m的发射滤光器）和600通道（561 nm激光激发，具有600/50m的发射滤光器）两者的3D扫描。在200ms曝光时间下获得每个荧光图像。

以与实施例3中用于DNA FISH的相同方法提取单个FISH斑点的强度和位置。对于每个RNA FISH图像，仔细选择并优化强度阈值，以从阳性信号中分离非特异性结合信号和背景。对于具有2个染料共标记的RNA斑点的2D强度分布，仅选择两个通道中强度高于阈值的斑点进行分析，否则拒绝斑点。

具有参考强度代码图的指引的斑点分配：

1．生成参考图：我们以其编码强度比值分别对POLR2A和CTNNB1进行染色和成像。然后我们从大约100个细胞的图像中获得单个RNA种类标记的所有FISH斑点的2D（700通道和600通道）强度分布。我们可以在相同的2D强度图中分别获得POLR2A和CTNNB1的两个独立的强度簇。

2．然后我们试图找到每种染料组合的每个簇的最密集区域，包括大约95%的所有斑点。该算法的工作方式如下：如果两点之间的距离小于25个像素，则每个点与相邻点聚类，这可以是用户定义的，并且可以被增加以并入更稀疏分布的点。对于新产生的代表每个染料组合的最密集区域的斑点簇，我们通过选择一系列符合2D边界的点来找到每个簇的边界，所述2D边界包围来自每个簇的所有点。由一系列点代表的该边界将用于我们的下一步骤，以在混合标记的染料组合中定义我们的特定信号区域。

3．在根据参考图确定了每个染料组合的边界的情况下，我们从由染料组合的边界包围的混合标记簇中选择那些斑点。通过计算包括在边界中或从边界中排除的斑点数与斑点总数之间的比值，我们可以对特异性结合和非特异性结合信号进行量化。

结果和讨论：此处图16示出了单个RNA标记和两个RNA共标记的代表性原始图像。与两种染料组合（Cy5+Cy3、Cy5.5+A546）相关联的两个强度代码在参考图上成功地彼此分开。因此，成功地确定了每个强度代码的边界。图17（a）示出了两种具有特定边界的染料组合的来自单一RNA染色的参考图。图17（b）-（d）示出了将参考图应用于具有分别示出的三个细胞的混合标记数据中。下表示出了每个细胞的统计结果。斑点或者被成功地分配给用唯一染料组合（即强度代码）编码的RNA靶，或者由于模糊性或非特异性结合而被丢弃。

由于mRNAs通常在哺乳动物细胞中以单拷贝表达，因此可以通过此处开发的高容量FISH方法来检测它们。然而，由于光学成像的物理分辨率有限，该方法要求每个RNA在大于衍射极限光学分辨率（通常大约为发射波长的一半）的距离处彼此分开，以便它们能够被精确地区分。如果多个mRNAs以高水平表达，它们可能相互重叠，从而有损高容量FISH成像的检测精度。

实施例5：在培养细胞中用标记方案-2进行多重RNA检测

此处我们使用标记方案-2以2个颜色通道来检测MEF细胞中的2个RNA靶（POLR2A，CTNNB1）。

探针设计和合成：此处我们使用间接标记和分支DNA扩增来实现标记方案-2。我们为每个RNA种类设计了48个初级探针。它们与实施例4中使用的那些相同。我们对POLR2A不使用（或1×1）扩增，对CTNNB1使用不平衡的3×3扩增。每个POLR2A的初级探针具有与一个成像探针杂交的20nt读出序列。POLR2A的每个成像探针在5’端与一个Cy5染料缀合，并在3’端与一个Cy3染料缀合。CTNNB1的每个初级探针在5’和3’端都具有一个20nt读出序列，使得5’端可与一个初级扩增分子杂交，并且3’端可以与直接缀合Cy5染料的图像探针杂交。CTNNB1的每个初级探针的3’端没有信号扩增。CTNNB1的每个初级探针的5’端的初级扩增分子具有3个重复（每个重复20nt）以与3个次级扩增分子杂交。CTNNB1的每个次级扩增分子具有3个重复（每个重复20nt）以与3个成像探针杂交。与CTNNB1的次级扩增分子杂交的每个成像探针在成像探针的5’端与Cy3染料缀合。通过这种方式，POLR2A的每个初级探针与一个Cy5以及一个Cy3染料相关联。CTNNB1的每个初级探针可以间接地与一个Cy5以及9个Cy3染料相关联。

强度代码：利用上述的寡核苷酸探针设计，我们分配了两个强度代码来检测CTNNB1和POLR2A。CTNNB1的每一拷贝与48个Cy5和432个Cy3相关联，POLR2A的每一拷贝与48个Cy5和48个Cy3相关联。强度水平1可定义为用48个Cy3或Cy5来标记靶，强度水平2可定义为用432（48×3×3）个Cy3或Cy5来标记靶。分别用2个强度代码（2：1）和（1：1）编码CTNNB1和POLR2A，此处采用寡核苷酸设计。在这两个强度代码中，第一位数代表600通道中的强度水平，第二位数代表700通道中的强度水平。2：1的强度代码对应于9：1的强度比值。1：1的强度代码对应于1：1的强度比值。

FISH染色、成像和图像分析与实施例4相同。使用与实施例4中所述相同的FISH斑点分配方法，我们可以将2D强度分布数据分成两个簇，从而检测2种RNA种类：CTNNB1和POLR2A。

实施例6：在培养细胞中用标记方案2和3进行多重RNA检测

该实施例示出了我们如何结合标记方案-2和方案-3以改进实施例4中检测2个RNA靶（POLR2A，CTNNB1）的结果。此处使用与实施例4相同的包括颜色通道的设置。仍然用Cy5和Cy3的染料组合来标记CTNNB1。仍然用Cy5.5和Alexa 546的染料组合来标记POLR2A。然而，我们可以调节与RNA靶相关联的每种染料的数量，以增加这两种染料组合的强度间隙，从而可以更好地分离这两种染料组合产生的强度代码，从而提高两种RNA靶的检测效率。

策略-1：改变与一个靶相关联的染料的数量。例如，我们仍然可以对Cy5、Cy3和Alexa 546使用5×5分支DNA扩增，但是对与POLR2A相关联的Cy5.5仅使用3×2分支DNA扩增，使得使用该RNA的Cy5.5染料的数量减少76%（1-6/25）。通过这种方式，当进行这两个RNA靶的共染色时，2D强度分布图（图17b）中的POLR2A的强度簇将向左偏移，从而使得POLR2A的簇和CTNNB1的簇之间的强度间隙将变大。

策略-2：同时改变与两个靶相关联的染料的数量。例如，我们仍然可以对Cy5和Alexa 546使用5×5分支DNA扩增，但是对与POLR2A相关联的Cy5.5仅使用3×2分支DNA扩增，而对与CTNNB1相关联的Cy3仅使用3×2分支DNA扩增，从而使POLR2A的Cy5.5染料的数量和CTNNB1的Cy3染料的数量均减少76%（1-6/25）。通过这种方式，当进行这两个RNA靶的共染色时，2D强度分布图（图17b）中的POLR2A的强度簇将向左偏移，同时同一图（图17b）中的CTNNB1的强度簇将向下偏移。通过这种方式，POLR2A的簇和CTNNB1的簇之间的强度间隙将变得甚至大于由策略-1产生的强度间隙。

实施例7：在培养细胞中用多个标记方案进行4-plex RNA检测

在本实施例中，我们使用N=2和M=2来实现4重RNA检测。使用3种光学标记：Cy5、Cy3和Alexa 546染料。在此与多种标记方案一起使用具有分支DNA信号扩增的间接标记来检测MEF细胞中的4种RNA种类（HOXBL、TFRC、POLR2A、CTNNB1）。对于间接标记，初级探针（即靶结合探针）首先与初级扩增探针结合，然后与次级扩增探针结合，最后与成像探针结合。

寡核苷酸探针的设计：

初级探针可以是40nt或60nt长，其含有（1）20nt靶结合序列和（2）位于靶结合序列一端或两端的一个或两个20nt读出序列，如实施例4中所述。每个mRNA靶使用48个初级探针。使用在成像探针上标记染料的不同组合或不同数量的成像探针或这两种探针的组合来实现不同靶的不同强度比值。每个靶的初级探针的设计如下所列：

在该实施例中，TFRC和HOXB1的每个初级探针具有两个相同的读出序列，一个在5’端，另一个在3’端。POLR2A的每个初级探针具有两个不同的读出序列，一个在5’端，另一个在3’端。CTNNB1的每个初级探针只在5’端具有一个读出序列。

在该实施例中，所有4种RNA种类的初级扩增分子都是130nt长，其含有（1）与靶结合探针的读出序列结合的一个20nt序列，和（2）与相应的次级扩增探针结合的20nt序列的5个重复。重复序列之间有2nt间隔。在第一个重复序列和与读出序列结合的序列之间也存在2nt间隔。

在该实施例中，基于相应的成像探针是双标记的（每个成像探针两个染料标记）还是单标记的（每个成像探针一个染料标记），存在两种不同的次级扩增探针设计。对于与单标记成像探针结合的次级扩增探针，它含有（1）与相应的初级扩增探针结合的一个20nt序列，和（2）与相应的成像探针结合的20nt序列的5个重复。在第一个重复序列和与初级扩增探针结合的序列之间也存在2nt间隔。此处，该第一设计应用于POLR2A、CTNNB1和TFRC。对于与双标记成像探针结合的次级扩增探针，相应的次级扩增探针含有（1）与相应的初级扩增探针结合的一个20nt序列，和（2）与相应的成像探针结合的20nt序列的五个重复，和（3）在任意两个重复之间的22nt***物。此处，该第二设计应用于HOXB1。

在该实施例中，用（1）在5’或3’端上的一个染料标记（每个探针一个染料）（2）在5’或3’端两者上的一个染料（每个探针两个染料）来标记成像探针。4个RNA靶各自在标记方案2和方案3中具有其自己的间接标记的实现方式，对应于成像探针的4种类型的标记。这4种类型的成像探针的标记如下所列：

初级探针的靶识别序列的设计遵循与实施例4中所述相同的寡核苷酸设计原则。读出序列、初级扩增探针序列、次级扩增探针序列和成像探针序列的设计也遵循与实施例4中所述相同的寡核苷酸设计原则。

在该实施例中，我们使用四个强度代码来检测四个RNA靶：2：2、0：1、2：1和2：0。在该实施例中，每个mRNA靶结合48个靶结合探针。因此，在这个实例中，每个靶结合探针的信号被扩增5×5=25或5×5×2=50。每组靶结合探针的扩增如下所列：

强度水平1被定义为用1200个cy3或cy5（25×48=1200）来标记靶，而强度水平2被定义为对于Cy3/600通道用1200个Alexa 546或2400个Cy3来标记靶，或者对于Cy5/700通道用2400个Cy5来标记靶。

每个mRNA的强度比值代码如下所列。在Cy3和Alexa 546的600荧光通道中使用2个强度水平（1，2），在Cy5的700荧光通道中使用2个强度水平（1和2）。

寡核苷酸探针的合成：所有寡核苷酸探针都是从IDT订购的。

以与实施例4中所述相同的方式进行FISH染色和成像过程。对于成像分析，用实施例3中用于DNA FISH的相同方法获得所有FISH斑点的2D强度分布。此后，用期望-最大（Expectation-Maximum）算法将这些斑点分成两个簇，而不使用参考强度代码图。成功地分离了两个用2位强度比值编码的簇。这两个簇中的每一个代表一种RNA种类。我们根据用单一RNA标记的阳性对照的强度分布将上述簇分配给POLR2A，将下面的簇分配给HOXB1。

结果和讨论：

图18a和图18b中分别示出了MEF细胞的700和600通道多重标记的结果共焦图像。重叠图像和一个放大区域如图18c和图18d所示。图18d示出了不同的形状以标记每个RNA的位置，其中HOXB1用圆形标示，POLR2A用方形标示，TFRC用菱形标示，CTNNB1用六边形标示。在该细胞中，检测到54个HOXB1斑点、117个POLR2A斑点、157个CTNNB1斑点和136个TFRC斑点，这些斑点接近于由不采用强度编码的常规单分子RNA FISH所确定的拷贝数计数。

图18e中以对数比例示出了相应的2D强度图，其中4个点簇被清楚地彼此区分。在本实施例中，使用HOXB1的探针设计，Cy3通道中的HOXB1和POLR2A的设计强度水平是相同的，并且它们的强度比值分布可能不会彼此分离。然而，根据图18e中的2D强度分布图，成功地分离了两个簇。与阳性对照结果比较，HOXB1的强度低于Cy3/600通道中POLR2A的强度。我们将上面的簇分配给POLR2A，下面的簇分配给HOXB1。我们得出结论，在此，染料对标记方案为Cy3-Cy5的成像探针可能存在染料猝灭，这是标记方案-4的应用。这可通过在同一细胞系中用相同染料组合单独染色HOXB1的阳性对照结果得以进一步证实。因此，HOXB1的设计强度代码实际上是1：1，而不是2：2。换言之，在这种情况下，2：2和1：1的强度代码彼此重叠并且不能很好地分离。

由于仅用Cy5标记CTNNB1，并且仅在700通道中示出，因此它们突出于在700和600通道中都示出的HOXB1和POLR2A。类似的规则适用于用Cy3标记的TFRC，并且仅在600通道中示出。

总而言之，使用标记方案-2、方案-3和方案-4的组合成功地识别了代表四个不同靶的四个唯一簇。

实施例8：用标记方案-3和区别化标记的多重RNA检测

我们在此将标记方案-3和区别化标记相结合以2个颜色通道检测MEF细胞中的2个RNA靶（POLR2A、MTOR）。

我们设计了60个初级探针来标记POLR2A、60个初级探针用于MTOR。每个初级探针的长度为40nt，其中20nt是靶结合序列。初级探针的每个靶结合序列在其5’端与20nt读出序列连接。与实施例4相似，我们对每个初级探针使用5×5分支DNA扩增。因此，每个初级探针首先与具有5个重复的初级扩增分子结合，然后与25个次级扩增分子结合，最后与25个用染料标记的成像探针结合。

区别化标记：为了实现标记方案-3，将Cy5和Cy3组合以标记POLR2A，将Cy5.5和Alexa 546组合以标记MTOR。通过这种方式，用2个不同的强度比值来标记POLR2A和MTOR。将POLR2A的初级探针分成两组：30个探针在5’端用Cy5染料间接标记，30个探针在5’端用Cy3染料间接标记。MTOR的初级探针分成两组：30个探针在5’端用Cy5.5染料间接标记，30个探针在5’端用Alexa 546染料间接标记。因此，我们使用700通道中部分重叠的染料Cy5和Cy5.5以及600通道中部分重叠的染料Cy3和Alexa 546来检测这两种RNA种类，这是标记方案-3的应用。MTOR RNA的每一拷贝设计为与多达750（30×5×5）个Cy5.5染料和750个Alexa546染料相关联。POLR2A的每一拷贝设计为与多达750（30×5×5）个Cy5染料和750个Cy3染料相关联。

FISH染色、成像和图像分析与实施例4相同。在该实施例中的设计中，POLR2A应当在2D强度分布图上与MTOR很好地分离。

实施例9：用标记方案-1和方案-3的多重RNA检测

我们在此结合标记方案-1和方案-3以2个颜色通道检测MEF细胞中的2个RNA靶（MTOR、CTNNB1）。我们使用不同数量的初级探针来标记这两种RNA种类，这是标记方案-1的应用。我们在700个通道中使用部分重叠的染料Cy5和Cy5.5，在600个通道中使用部分重叠的染料Cy3和Alexa 546来检测这两种RNA种类，这是标记方案-3的应用。

探针设计和合成：我们在此使用间接标记和分支DNA扩增。与实施例4不同，我们仅设计了CTNNB1的24个初级探针和MTOR的96个探针。除了RNA靶的初级探针的数量不同外，两种RNA的所有其它探针设计与实施例4中的相同。换言之，用Cy5和Cy3来标记MTOR。仍然用Cy5.5和Alexa 546来标记CTNNB1。将每个初级探针扩增5×5，在5’端与25个Cy5染料相关联，在3’端和25个Cy3染料相关联。如果所有探针杂交效率都是100%，MTOR的每一拷贝可以与多达2400（96×5×5）个Cy5和2400个Cy3染料相关联，并且CTNNB1的每一拷贝可与多达600（24×5×5）个Cy5.5和600个Alexa 546染料相关联。

FISH染色、成像和图像分析与实施例4相同。我们期望POLR2A在2D强度分布图上与CTNNB1很好地分离。与实施例4中的POLR2A的2D强度分布相比，此处的MTOR应当由于初级探针数量较多而向右上方偏移。与实施例4中的CTNNB1的2D强度分布相比，此处的CTNNB1应当由于初级探针数量较少而向左下方偏移。

实施例10：用可替代标记方案-3的多重RNA检测

我们在此说明如何仅使用每个靶一个染料的方法来实现可替代的标记方案-3。

我们可以分别使用Alexa 647来标记POLR2A mRNA和Alexa 700来标记CTNNB1mRNA。这两种染料具有如图10所示的重叠发射光谱。用48个初级探针来标记POLR2A的每一拷贝，连同5×5分支DNA扩增。用48个初级探针来标记CTNNB1的每一拷贝，连同5×5分支DNA扩增。用一个Alexa 647染料来标记POLR2A的成像探针。用一个Alexa 700染料来标记CTNNB1的成像探针。每层探针（包括初级探针、初级扩增分子、次级扩增分子、成像探针）的所有序列设计与实施例4中使用的相同。

我们定制两个发射滤光器以记录Alexa 647和Alexa 700的荧光：650-710 nm、745-805 nm。两种染料由633 nm的同一激光线激发。在650-710 nm的颜色通道中，当对两种RNA种类使用相同数量的染料时，Alexa 647发出的强度明显高于Alexa 700。在745-805 nm的颜色通道中，Alexa 700可以发出比Alexa 647更高的强度。当进行成像时，使用相同的633 nm激发，并用上述两个发射滤光器依次或同时检测两个颜色通道中的荧光，记录两个颜色图像。通过这种方式，Alexa 647和Alexa 700可以在相同的两个颜色通道上产生两个不同的强度比值，从而可以区分POLR2A和CTNNB1。通过计算每种染料在颜色通道中的光谱面积，我们估计在650-710 nm和745-805 nm通道中Alexa 647的强度比值为3：1（第一位数为650-710 nm通道中的强度），Alexa 700的强度比值为1：2.85（第一位数为650-710 nm通道中的强度）。因此，POLR2A和CTNNB1可以通过这两种染料以及上面设计的两个通道来加以区分。为了进一步调整每个靶的强度分布，使得这两个靶的强度簇能够更好地分离，我们可以调整与POLR2A相关联的Alexa 647的数量，或者与CTNNB1相关联的Alexa 700的数量，或者这两种数量。此外，我们可以改变滤光器设计（例如，增加或缩短发射滤光器的发射窗口，或改变发射滤光器的光子传输效率），以调整每种染料在两个颜色通道上的强度比值，从而获得更好的RNA检测效率。

除了上述染料标记和滤光器之外，所有其它过程，包括探针设计、FISH染色实验、成像和图像分析，都可以用实施例4中的相同方法进行。

实施例11：具有4个颜色通道的多重RNA检测

在该实施例中，我们计划使用3个颜色通道（N=3，M=2）用于强度编码，另外的1个颜色通道用于非特定结合的纠错。用于强度编码的3个颜色通道与实施例1中所使用的相同。此外，我们增加了一个颜色通道来检测Cy7染料。此处使用12个小鼠mRNA基因进行测试：TFRC、MTOR、EGFR、HER2、TBP、TOP1、PRDM4、BRAC1、POLR2A、STAT3、NOTCH1、WNT11。

探针设计和染料标记：可从NCBI基因数据库获得小鼠RNA序列。对于每个RNA，根据其长度，我们设计了24-48个用于强度编码的初级探针。我们为每个RNA设计了附加的24-48个初级探针，并进行了纠错。此处6种染料用于强度编码：Cy5、Cy5.5、Cy3、Alexa546、Alexa488和Alexa514。Cy7染料仅用于非特异性结合的纠错，而不用于强度编码。分支DNA扩增也被组合以微调每个强度代码的强度水平和变化。因此，整合标记方案-1、方案-2、方案-3和用于纠错的可替代方案的组合，以实现RNA检测效率的最佳性能。

强度编码：我们使用2个强度水平和3种颜色来检测12种RNA。12个强度代码被分配给12个RNA种类，其方式是具有更多数字的代码被分配给下表中列出的更长RNA。例如，3位编码1：1：2被分配给标记较长的RNA POLR2A，1位编码1：0：0被分配给标记较短的RNA AKT1。对于该表中的每个强度代码，第一位数是Cy5/700通道，第二位数是Cy3/600通道，第三位数是Alexa488/500通道。例如，强度代码1：0：0代表第一种颜色是Cy5，强度水平别为1，而第二种和第三种颜色没有强度；1：2：1代表第一种颜色为Cy5，强度水平为1，第二种颜色为Cy3，强度水平为2，第三种颜色为Atto488，强度水平为1。

设置和FISH实验：我们可以使用旋转盘共焦显微镜（Nikon，Ti-E）和Andor sCMOS照相机对用探针染色的MEF细胞成像。显微镜装有5个激光器和5个颜色通道：405 nm激光器，具有450/50m的发射滤光器；488 nm激光器，具有525/50m的发射滤光器；561 nm激光器，具有600/50m的发射滤光器；640 nm激光器，具有700/75m的发射滤光器；750 nm激光器，具有810/90m的发射滤光器。FISH类染色实验可以以与实施例4中相同的方式进行。

图像分析：可以以与实施例4中使用的相同方式分析单分子强度分布。

实施例12：在培养细胞中用标记方案1进行多重DNA检测

为了实施方案I，我们设计了两组初级探针，它们由以下区域构建：Chr21:18627683-18727683（总共100kb，称为SI1）和Chr19: 29120001-29220001（总共100kb，称为SI2）。选择与上述关注的基因组区域互补的42-nt靶序列，以覆盖在100kb基因组区域上平铺有1000个探针的SI1和在100kb基因组区域上平铺有1000个探针的SI2。然后，我们每个初级探针的侧面在3’侧设置有用于分支DNA信号扩增的读出序列。我们将3×3分支DNA扩增用于两个靶的所有初级探针。扩增探针以与实施例4相同的方式设计用于RNA FISH，不同的是每个初级和次级扩增分子仅含有3个重复用于扩增。此外，对于靶向SI1的1000个探针，100个探针通过信号扩增用Cy5染料间接标记，900个探针通过信号扩增用Cy3染料间接标记。对于靶向SI2的1000个探针，其中100个探针通过信号扩增用Cy3染料间接标记，而900个探针通过信号扩增用Cy5染料间接标记。

强度编码：此处，我们定义第一强度水平为900（100×3×3）个Cy3或Cy5染料，第二强度水平为8100（900×3×3）个Cy3或Cy5染料。基于上述的寡核苷酸设计，SI1以2：1（600通道：700通道）的强度代码进行编码，对应于9：1的设计染料比（Cy3：Cy5）。SI2用1：2的强度代码（600通道：700通道）进行编码，对应于1：9的设计染料比（Cy3：Cy5）。

FISH实验、成像和图像分析：我们在此使用HeLa细胞进行DNA FISH。染色方案与实施例3相同，除了在初级探针与靶结合后增加更多层中间探针之外。中间探针结合的杂交和洗涤条件与实施例3中的成像探针结合相同。可以按照与实施例3相同的方式进行成像处理和图像分析。

实施例13：在原发组织中用标记方案1和3进行多重DNA检测

我们设计了探针来检测小鼠脑组织和人PBMC细胞中的两个染色质位点（端粒和着丝粒）。我们设计了一种识别端粒重复序列的探针和另一种识别着丝粒重复序列的探针。由于不同小鼠或人染色体上不同的端粒或着丝粒位点具有不同数量的重复细胞，它们可以与不同数量的端粒或着丝粒探针结合，这是标记方案-1的应用。同时，在此使用具有不同荧光强度的部分重叠的染料来区分这两个DNA片段，这是标记方案-3的应用。

对于小鼠组织样品，此处使用来自C57BL/6小鼠的脑组织。通常，该小鼠品系中的端粒长度在10 kb-50 kb之间变化。因此原则上，每一个端粒位点可能存在几百至数千个端粒重复细胞。不同染色体的小鼠着丝粒在100 kB-1 Mb之间变化。

对于人细胞，端粒长度在1 kb -10 kb之间变化。不同染色体间的人着丝粒在0.5-10 Mbp之间变化。

用于小鼠组织中端粒和着丝粒标记的探针：

小鼠基因组中端粒和着丝粒重复区域的探针序列从IDT订购：

端粒探针，Tel-Cy5-Cy3：CCCTAACCCTAACCCTAA，5’用Cy5标记；3’用Cy3标记

着丝粒探针，Cen-Cy5-A532：ATTCGTTGGAAACGGGA，5’用Cy5标记；3’用Alexa532标记。

人细胞中染色体1和着丝粒重复序列的探针：染色体1上重复DNA片段的染色体1探针Chr1-TYE665-Cy3（Ch1-Re）：CCAGGTGAGCATCTGACAGCC，5’用TYE665标记，3’用Cy3标记；着丝粒探针，Cen-Cy5-A546：ATTCGTTGGAAACGGGA，5’用Cy5标记；3’用Alexa 546标记。杂交缓冲液中各探针的浓度为200 nM。

小鼠脑组织上的DNA FISH进行如下：将小鼠脑组织块（从Cell Biologics订购）用OCT包埋并冷冻切割成8 um的切片。切片附接在聚赖氨酸（PLL，CultreX）涂覆的网格盖片（网格玻璃盖片网格-500，#1.5H（170 um）D 263 Schott玻璃，ibidi）上。组织切片在室温下立即用4%PFA固定12分钟。然后用2×SSC洗涤固定的组织3次，并在室温下用70%乙醇渗透至少1小时。然后除去乙醇溶液，用2×SSC洗涤组织3次，然后在80%甲酰胺、2×SSC中于90℃变性10分钟。变性后，将组织与含有10%甲酰胺、2X盐水-柠檬酸钠、20%葡聚糖硫酸酯（Sigma，>500,000）和200 nM DNA探针的200 uL探针缓冲液于37℃孵育4小时。此处使用浓度为200nM的端粒探针和着丝粒探针。然后用10%甲酰胺在2×SSC中于37℃洗涤该组织2分钟，洗涤两次之后在实施例16中使用的相同装置上成像。3D扫描每个FOV以覆盖所有信号，并在200ms曝光时间内获得每个荧光图像。用具有700/75m发射滤光器的700颜色通道对Cy5染料成像，用具有600/50m发射滤光器的600颜色通道对Cy3和Alexa532染料成像。

人PBMC细胞上的DNA FISH进行如下：从全血中分离的人PBMC细胞固定在3：1（v/v）甲醇和乙酸溶液的组合中。此后，将细胞附接在#1.5玻璃底部8孔室上，用2×SSC洗涤3次，然后在80%甲酰胺、2×SSC中于90℃变性10分钟。除去变性溶液后，将血细胞与含有10%甲酰胺、2×SSC、20%葡聚糖硫酸酯和200 nM DNA探针的200 uL探针缓冲液于37℃孵育1小时。然后在37℃用10%甲酰胺在2×SSC中洗涤血细胞2分钟，洗涤两次之后在旋转盘共焦显微镜上成像，其与实施例16中的相同。3D扫描每个FOV以覆盖所有信号，并在200 ms曝光时间内获得每个荧光图像。

图像分析：用相同方法分析小鼠和人血细胞的成像数据。首先叠加来自相同FOV的3D扫描图像，并以最大强度投影。对700和600通道都进行该步骤。用高斯函数拟合最大强度投影图形，得到其对于700和600通道的峰值强度及其2D位置。然后将来自700通道的拟合点与来自600通道的点对齐，如果它们位于3个像素内，则认为来自相同的端粒或着丝粒点。然后拾取来自同一点的700和600通道的强度，用于下游分析。然后根据两个点簇之间的明显间隔绘制分离线。然后基于其唯一的强度比值分布将每个斑点分配给端粒或着丝粒。然后基于上述分配对同一图像中的端粒和着丝粒进行不同的标记。

小鼠组织中DNA FISH的结果和讨论：基于实施例3中获得的每种染料对的强度分布的特征，我们选择将两种染料对Cy5-Cy3和Cy5-A532探针组合以同时检测端粒和着丝粒。来自每对染料的强度点簇如预期的那样彼此分离（图19a）。图19b-c中示出了DNA FISH图像中每个端粒和着丝粒斑点的识别。

人细胞中DNA FISH的结果和讨论：基于实施例3中获得的每个染料对的强度分布的特征，我们选择结合两个染料对Cy5-Alexa 546和TYE665-Cy3，以同时标记两个DNA重复序列Ch1-Re和着丝粒。来自每对染料的强度点簇如预期的那样彼此分离（图19d）。图19e-f示出了一幅DNA FISH图像中Ch1-Re和着丝粒斑点的识别。在图19f中，通过强度比值编码成功地将来自Ch1-Re的两个斑点与所有其它着丝粒斑点分离。

实施例14：在培养细胞中用标记方案-2和方案-4的DNA FISH

在该实施例中，我们说明了标记方案-2和方案-4如何可用于调节同一靶的强度水平。

探针：我们设计了3组寡核苷酸探针，以实现同一端粒靶的3种不同强度比值：1Cy5：2 Cy3、1 Cy5：10 Cy3、1 Cy5：30 Cy3。端粒的探针序列为：CCCTAACCCTAACCCTAA。探针组-1包括初级探针、成像探针。探针组-2包括初级探针、初级扩增分子、成像探针。探针组3包括初级探针、初级扩增分子、成像探针。所有三个初级探针共用同一个探针人基因组中端粒重复区域的靶结合序列，其与实施例13中使用的相同。所有三个初级探针都在内部用一个Cy5染料（靶结合序列的3’端）标记。所有初级探针具有两个不同的20nt读出序列，一个在5’端，另一个在3’端。探针组-1的每个初级探针与两个20nt的成像探针结合，一个在5’端，另一个在3’端。探针组-1的每个成像探针在探针的3’端具有1个Cy3标记。探针组-2和探针组-3的初级探针的序列与探针组-1的初级探针相同。探针组-2和探针组-3的每个初级探针结合2个不同的初级扩增分子，一个在5’端，另一个在3’端。探针组2的每个初级扩增分子具有20 nt序列以与该组的初级探针的读出序列互补，并且具有5个重复的20nt序列以与5个成像探针结合。探针组-2的每个成像探针具有20nt序列，并在3’端用Cy3染料标记。探针组-3的每个初级扩增分子具有20nt序列以与该组的初级探针的读出序列互补，并且具有15个重复的20nt序列以与15个成像探针结合。探针组-3的每个成像探针具有20nt序列，并在3’端用Cy3染料标记。通过这种方式，探针组-1的每个初级探针可以与1Cy5和2Cy3相关联。探针组-2的每个初级探针可以与1个Cy5和10个Cy3相关联。探针组-3的每个初级探针可以与1个Cy5和30个Cy3相关联。

DNA FISH实验：将HeLa细胞附接在涂覆有聚赖氨酸（PLL，CultreX）的玻璃-底部8孔室（#1.5H（170 um）D 263 Schott Glass，ibidi）上。将3批细胞附接到3个不同的孔中，用3组不同的探针染色。在每个孔中，按照以下顺序进行FISH染色实验：在室温下立即用4%PFA固定细胞5-10分钟。然后用2×SSC洗涤固定的细胞3次，并在室温下用70%乙醇渗透至少1小时。然后除去乙醇溶液，用2×SSC洗涤细胞3次，然后在80%甲酰胺、2×SSC中于90℃变性10分钟。变性后，细胞与含有10%甲酰胺、2X盐水-柠檬酸钠、20%葡聚糖硫酸酯（Sigma，>500,000）和200 nM初级探针的200 uL探针缓冲液于37℃孵育至少4小时。用10%甲酰胺在2×SSC中于37℃洗涤HeLa细胞2分钟，洗涤两次。然后将细胞与10 nM初级扩增探针在200 uL杂交缓冲液中于37℃孵育1小时（如果不使用初级扩增分子，则跳过该步骤）。在洗涤缓冲液中洗涤5分钟，洗涤两次后，然后将HeLa细胞与100 nM成像探针在200 uL杂交缓冲液中于37℃孵育1小时。最后一轮洗涤在缓冲液中洗涤5分钟，然后将细胞与浓度为0.00l mg/ml的DAPI孵育1分钟，然后在旋转盘共焦显微镜上用激光激发成像（Nikon Ti显微镜，Yokogawa CSU-W1共焦扫描仪，sCMOS照相机Andor Zyla 4.2，100×油浸物镜）。荧光成像在实施例1中使用的相同装置上进行。依次对每个视场（FOV）进行700通道（使用700/75m的发射滤光器的640 nm激光激发）和600通道（使用600/50m的发射滤光器的561 nm激光激发）的3D扫描。在200 ms曝光时间下获得每个荧光图像。

用实施例3中用于DNA FISH的相同方法进行图像分析。

结果和讨论：图20c-e示出了三个编程强度比值的强度分布结果。将它们都与同一参考线进行比较。比较图20c和图20d，Cy3/600通道中具有1 Cy5：10 Cy3比值的端粒染色的强度大部分高于参考线，并且高于1 Cy5：2 Cy3，表明增加每个靶点的Cy3染料的数量可以增加Cy3/600通道中的强度。在图20e中，具有1 Cy5：30 Cy3比值的端粒染色的强度大部分低于参考线且远低于图20c中的1 Cy5：10 Cy3，表明由于染料非常靠近在一起时相互猝灭的拥挤猝灭效应，每个靶增加太多的染料数量可能降低Cy3/600通道中的强度。

实施例15：用于细胞类型分析的多重蛋白检测

该实施例说明了如何使用强度编码来对多个蛋白质生物标记进行条形码编码以检测不同的细胞类型（图13a）。在本实施例中，每个蛋白质生物标记代表一种细胞类型。本实施例中使用的蛋白质靶点是CD34、CD45、CD9、广谱细胞角蛋白。每种蛋白质标志物代表不同的细胞类型。

对于蛋白质的多重检测，我们可以分别使用（1）具有Cy5和Cy3染料的N=2和M=2（标记方案-2）以及（2）具有Cy5、Cy3、Alexa 546和Cy5.5染料的N=2和M=2（标记方案-3），以分别实现4重蛋白质检测。每个标记方案使用间接标记和信号扩增。对于如图12b-c所示的此类间接标记，直接连接到靶的初级探针（即靶结合探针）首先结合次级探针，然后与初级扩增探针和次级扩增探针相关联。染料标记的成像探针与相应的次级扩增探针结合。

抗体-寡核苷酸物缀合物的设计：如图12所示，抗体-寡核苷酸物缀合物由抗体、用作初级探针的寡核苷酸物以及将寡核苷酸物连接到抗体以形成缀合物的接头组成。

抗体-寡核苷酸缀合物的抗体：针对靶蛋白并用于制备抗体-寡核苷酸缀合物的初级抗体从销售商处订购。抗体应在偶联前进行纯化。

抗体-寡缀合物的接头设计：接头可以是当激活抗体进行缀合时加入到抗体中的化合物或聚合物。接头也可以是化合物或聚合物，当激活寡核苷酸进行缀合时，该化合物或聚合物被加入到寡核苷酸中。当合成寡核苷酸时，接头也可以是寡核苷酸的一部分。接头的长度可以是柔性的。在该实施例中，接头是多聚T（10个T），其将作为待缀合到抗体上的寡核苷酸的一部分而被合成。

抗体-寡核苷酸缀合物的条形码寡核苷酸的设计：为了特异性，用于抗体-寡核苷酸缀合的寡核苷酸含有在研究的生物体中未发现的序列。每种类型的抗体与寡核苷酸缀合，寡核苷酸具有该类型抗体所特有的序列，并且起到抗体靶的强度条形码的作用。寡核苷酸含有作为抗体和寡核苷酸之间的接头的多聚T序列（10个T），接头对于每种靶是唯一的。对于缀合，寡核苷酸在5’端具有胺基团。

用于强度编码和信号扩增的寡核苷酸探针的设计：

以与实施例4相似的方式，设计用于标记方案2和3中的间接标记（具有扩增作用）的初级探针、次级探针、初级扩增探针、次级扩增探针和成像探针的寡核苷酸序列，使得它们对靶物种的RNA转录组和基因组具有最小的非特异性结合。

在标记方案2和3的间接标记（具有扩增作用）中，所有的次级探针含有（1）与条形码初级探针的唯一区域或靶结合寡核苷酸结合的一个20nt初级探针结合序列，和（2）在初级探针结合序列的一端上用于两位数强度代码的一个20nt读出序列，或在初级探针结合序列的每一端上用于两位数强度代码的一个20nt读出序列。虽然图12b和图12c中的每一个初级探针 仅与所有靶的一个次级探针结合，但是在此实施例中，所有四个靶的每个初级探针与6个次级探针结合。成像探针（全部20nt）结合次级扩增探针以间接标记靶。每个成像探针仅用一个染料进行标记。对于标记方案2中具有2位数强度代码的CD9和CD34，使用不平衡扩增来扩增Cy5/700和Cy3/600通道中的染料。每个靶的探针扩增数量和染料选择以及标记方案列于下表中。

利用上表中所使用的探针设计和强度代码，使用标记方案-2的强度水平1被定义为Cy3或Cy5通道中的12（6×2×1）个Cy3或Cy5染料。使用标记方案-2的强度水平2定义为Cy3或Cy5通道中的96（6×4×4）个Cy3或Cy5染料。

对于标记方案-3中具有2位数强度代码的CD9和CD34，使用平衡扩增来扩增Cy5/700和Cy3/600通道中的染料。每个靶的探针扩增数量和染料选择以及标记方案列于以下两个表中。

利用上表中所使用的探针设计和强度代码，使用标记方案-3的强度水平1被定义为Cy5或Cy3通道中的96（6×4×4）个Cy5.5或Cy3染料。使用标记方案-3的强度水平2被定义为Cy5或Cy3通道中的96个Cy5或Alexa 546染料。

寡核苷酸探针的合成：所有的寡核苷酸组以管或板的形式从IDT订购。

抗体寡核苷酸缀合：缀合过程包括三个主要步骤：抗体活化、寡核苷酸活化和抗体-寡核苷酸缀合。

根据寡核苷酸与抗体的缀合如何影响抗体的抗原结合活性，寡核苷酸可通过多种方式缀合于抗体，例如（但不限于）与胺基、羧基、巯基的缀合。测试抗体与其特异性抗原在靶蛋白上的结合能力，以确保寡核苷酸缀合物不会破坏抗体-抗原相互作用，或对抗体-抗原相互作用的影响最小。在此实施例中，抗体通过二苯并环辛炔（DBCO）和叠氮化物之间的无铜点击化学缀合到寡核苷酸。

抗体活化：在此实施例中，寡核苷酸通过抗体上的胺基与抗体缀合。用PBS将纯化的抗体调节至1 mg/ml的浓度。将溶解在无水DMSO中的DBCO-NHS酯以各种摩尔过量加入纯化的抗体中。通过凝胶过滤柱除去未反应和过量的DBCO-NHS。

寡核苷酸活化（以制备叠氮化物改性的寡核苷酸）：将胺改性的寡核苷酸溶解在PBS中（pH 7.4）与过量的3-叠氮丙酸磺基-NHS酯（3AA-NHS）在25℃无水条件下混合2小时。使用旋转柱通过凝胶过滤除去过量的3AA-NHS。

抗体-寡核苷酸物缀合：在微量离心管中将过量活化的叠氮化物-寡核苷酸物与DBCO-抗体-DBCO溶液（PBS，pH 7.2）在25℃混合1小时。用缀合物清除试剂（来自Abcam）纯化缀合物，并在微量离心管中离心。

蛋白质染色实验的一个实例：可以从销售商处订购新鲜冷冻的人乳腺癌肿瘤组织载玻片。为了染色，切片在4% PFA溶液中固定30分钟，并在PBS中洗涤15分钟。在此阶段，可以任选地在PBS中用1% H₂O₂进行温和的1小时预漂白（对于TSA）。用含有2% BSA和0.1%Triton X-100的PBS封闭样品1小时，缓冲液换液三次。将DNA缀合的初级抗体稀释在补充有0.2 μg ml⁻¹剪切的鲑鱼***DNA、0.05%葡聚糖硫酸酯和任选的4 mM EDTA的封闭溶液中，并与样品在室温下孵育1小时。通过用含有2% BSA和0.1-0.3% Triton X-100的PBS在室温下洗涤三次15分钟，并用PBS洗涤两次5分钟来除去过量的抗体。然后将结合的抗体用5 mM BS（PEG）在PBS中在室温下后固定30分钟，随后在100 mM NH₄Cl中在PBS中猝灭5分钟，并用具有0.1% Triton X-100的PBS在室温下洗涤15分钟。用次级探针、初级扩增分子或次级扩增分子在37℃、20-30%甲酰胺、10%葡聚糖硫酸酯和0.1%（体积/体积）Tween-20、在2×SSC中、用0.2 mg/ml剪切的鲑鱼***DNA孵育1-2小时。探针以100 nM的最终浓度稀释在该缓冲液中。为了多重作用，同时培育同一层信号扩增中的所有探针。在每一层探针杂交之后，样品在室温下用50%甲酰胺在PBS中洗涤5分钟，并在37℃用PBS+0.1% Triton X-100洗涤3次各10分钟。

成像设置和成像处理可以以与实施例1和2中所述相同的方式进行。可以使用ImageJ手动进行细胞分割。然后提取每个细胞的染色区域中的每个像素的平均强度用于强度比值分析。排除每个细胞中的未染色区域用于强度比值分析。通过这种方式，每个细胞可以根据其700和600通道中的染色区域的平均强度被赋予一个强度比值。然后可以以与实施例4中RNA FISH相同的方式绘制所有关注的细胞的2D强度分布。此处也可以使用基于参考强度代码图分配强度代码的相同方法。

实施例16：用微阵列进行体外多重蛋白质检测

此实施例说明了高容量强度比值条形码在体外蛋白质检测中的应用。不同的蛋白质在不同的空间位置附接到载玻片上以形成微阵列。

此处，我们使用2个颜色通道和2个强度水平来检测微阵列上的4种蛋白质：CD34、CD45、CD9、广谱细胞角蛋白。我们在实施例15中使用4×4分支DNA扩增和用于标记方案3的相同探针组来扩增信号并编码这4种蛋白质。通过它们与蛋白质特异性寡核苷酸缀合的抗体来检测不同的蛋白质，蛋白质特异性寡核苷酸用作与强度编码的寡核苷酸探针结合的初级探针。4个成像探针用于检测4种蛋白质：仅用Cy3染料来标记用于广谱细胞角蛋白的成像探针-1，强度代码为1：0；仅用Cy5染料来标记CD45的成像探针-2，强度代码为0：2；分别在5’和3’端用Cy5和Cy3染料来标记CD9的成像探针-3，强度代码为1：2；分别在5’和3’端用Cy5.5染料和Alexa 546染料来标记CD34的成像探针-4，强度代码为2：1。此处所有四个强度代码的第一位数代表Cy3/600通道中的强度水平，第二位数代表Cy5/700通道中的强度水平。

阵列制备和蛋白质染色：用表面处理将这4种蛋白质的初级抗体点样到载玻片上，以便以空间分离的模式很好地附接抗体。每个斑点的尺寸为大约1 mm，并且任意两个斑点相隔2 cm。每种蛋白质具有10个斑点。因此总共形成40个斑点以捕获4种不同的蛋白质。将纯化的蛋白质溶解在1 mg/ml的PBS缓冲液中，并在室温下与点样玻片一起孵育至少1小时。然后将与编码寡核苷酸缀合的初级抗体与载玻片一起再孵育1小时，并在室温下用洗涤缓冲液洗去过量的抗体温度。此后，将多层强度编码探针（100 nM）与捕获的蛋白质一起与载玻片孵育。每层探针标记在室温下持续1小时，用洗涤缓冲液洗涤掉过量的探针。最后，用具有2个颜色通道（Cy5/700 nm通道，Cy3/600 nm通道）的PMT扫描载玻片。700通道由640 nm激光器激发，并安装有700/75m的发射滤光器。用561 nm激光激发600通道，并安装600/50m的发射滤光器。

图像分析：分析单个蛋白质斑点的平均强度，并在2D强度分布图中绘制。然后将具有相似强度比值的蛋白质斑点聚类在一起。类似于RNA FISH的实施例4，每个簇都配有参考强度代码图，然后被分配以最佳的强度代码。通过这种方式，成功检测蛋白质。

本发明的各个方面

方面1．一种被制备用于检测的样品，包括：第一多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第一靶分子；以及第二多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第二靶分子，其中每个探针附接到一种或多种光学标记，使得：（a）第一种光学标记与第一靶分子结合，并且（b）第二种光学标记与第二靶分子结合，其中每个靶与至少两种光学标记相关联，第一多个探针附接有至少第一种光学标记，第二多个探针附接有至少第二种光学标记，并且其中第一靶分子和第二靶分子在激发时与来自两个或多于两个的颜色通道的信号强度的不同比值相关联。

方面2．根据方面1的样品，其中第一种光学标记与第一靶分子和第二靶分子两者相关联，第二种光学标记与第一靶分子和第二靶分子两者相关联，与第一靶分子相关联的第一种光学标记的数量和第二种光学标记的数量的比值以及与第二靶分子相关联的该比值相差至少2、2.3、3.5、5、8.1、10、20、50或100倍。

方面3．根据方面2的样品，其中第一多个探针和第二多个探针中的每个探针仅与一种光学标记相关联，并且用于第一靶的第一多个探针的数量不同于用于第二靶的第二多个探针的数量。

方面4．根据方面1和2的样品，其中第一种光学标记和第二种光学标记分别具有相同或部分重叠的色谱，但是在第一颜色通道中具有不同的强度，第一靶与第三种光学标记相关联。

方面5．根据方面4的样品，其中第二靶与第四种光学标记相关联，第三种光学标记和第四种光学标记分别具有相同或部分重叠的色谱，但是在第二颜色通道中具有不同的强度。

方面6．根据方面4和5的样品，其中第一种光学标记和第二种光学标记的数量不同。

方面7．根据方面6的样品，其中第一多个探针和第二多个探针的数量不同。

方面8．根据前述任一方面的样品，其中第三多个探针直接或间接结合生物样品中的第一靶分子和第二靶分子，并且第三多个探针中的每一个探针都附接有第五种光学标记。

方面9．根据前述任一方面的样品，其中不同种类的光学标记和与同一靶分子相关联的多个探针中的不同探针附接。

方面10．根据方面9的样品，其中与不同光学标记相关联的不同探针以交替的顺序结合靶分子。

方面11．根据前述任一方面的样品，其中与靶分子相关联的任何多个探针包括至少2个探针。

方面12．根据方面11的样品，其中与靶分子相关联的第一多个探针或第二多个探针具有至少12个探针。

方面13．根据前述任一方面的样品，其中第一靶分子或第二靶分子与至少3种不同种类的光学标记相关联，并由至少3个颜色通道检测。

方面14．根据前述任一方面的样品，其中多个探针中的每个探针连接到两种或更多种不同种类的光学标记，或两种或更多种不同数量的相同光学标记。

方面15．根据前述任一方面的样品，其中至少一个光学标记附接有猝灭或信号增强分子。

方面16．根据前述任一方面的样品，其中至少一个光学标记附接有多个相同的光学标记，或者附接有第五种光学标记。

方面17．根据前述任一方面的样品，其中与同一靶相关联的至少两个相同的光学标记沿探针序列隔开不超过10个核苷酸。

方面18．根据方面1-5的样品，其中附接有光学标记的第一多个探针或第二多个探针通过初级探针与靶分子相关联。

方面19．根据方面18的样品，其中在初级探针与靶分子相关联之后，第一多个探针或第二多个探针还与至少一层中间探针相关联。

方面20．根据方面19的样品，其中在初级探针与靶分子相关联之后，第一多个探针或第二多个探针还与初级扩增分子以及次级扩增分子相关联。

方面21．根据方面18-20的样品，其中第一靶与第一种光学标记和第二种光学标记两者相关联，并且靶上的每个初级探针与第一种光学标记和第二种光学标记两者相关联。

方面22．根据方面21的样品，其中与同一初级探针相关联的第一种光学标记和第二种光学标记的数量相等。

方面23．根据方面22的样品，其中与同一初级探针相关联的第一种光学标记和第二种光学标记的数量不同。

方面24．根据方面22和23的样品，其中与同一初级探针相关联的第一种光学标记和第二种光学标记被标记在初级探针的不同端，5’或3’端。

方面25．根据方面18-20的样品，其中第一靶分子与第一种光学标记和第二种光学标记两者相关联，并且它们的数量不同。

方面26．根据方面25的样品，其中检测同一靶分子的不同种类的光学标记与不同的初级探针相关联。

方面27．根据方面18-27的样品，其中第一种光学标记与第一靶分子和第二靶分子两者相关联，第一靶分子的第一光学标记的数量与第二靶分子的第一光学标记的数量的比值为至少2、2.5、3、3.3、4、4.2、5、8、8.9或10。

方面28．根据方面18和19的样品，其中所述第一多个探针或第二多个探针通过酶信号扩增与它们的初级探针相关联，诸如滚环扩增。

方面29．根据前述任一方面的样品，其中探针是单链寡核苷酸或肽。

方面30．根据前述任一方面的样品，其中光学标记是荧光染料、荧光蛋白或纳米颗粒。

方面31．根据前述任一方面的样品，其中靶分子包括RNA分子、RNA片段、不大于100kb的DNA分子或不大于100 kb的DNA片段。

方面32．根据方面1-31中任一方面的样品，其中靶分子包括蛋白质、脂质、多糖或颗粒。

方面33．根据方面1-31中任一方面的样品，其中靶分子包括DNA修饰、RNA修饰或蛋白质修饰。

方面34．根据方面32和33中任一方面的样品，其中附接有光学标记的探针通过寡核苷酸或肽与靶分子相关联。

方面35．根据前述任一方面的样品，其中靶分子位于细胞、组织中，或附接在固体支架上。

方面36．一种用于杂交的试剂盒、包装，或探针的混合物，包括：第一多个探针，每个探针可结合第一靶分子，或者第一多个探针和一个或多个中间探针，所述中间探针允许第一多个探针间接结合第一靶分子；以及第二多个探针，每个探针可结合第二靶分子，或者第二多个探针和一个或多个中间探针，所述中间探针允许第二多个探针间接结合第二靶分子，其中第一多个探针上附接有至少第一种光学标记，第二多个探针上附接有至少第二种光学标记，每个靶与至少两种光学标记相关联，其中第一靶分子和第二靶分子在激发时与来自两个或多于两个的颜色通道的不同信号强度比值相关联。

方面37．一种检测样品中两个或更多个靶分子的方法，包括在允许探针与靶分子结合的条件下，将方面36的探针混合到包括第一靶分子和第二靶分子的样品中，其中不同种类的靶分子与不同的光学标记组合相关联，每个靶由至少2个颜色通道检测以产生强度比值，不同的靶由不同的强度比值进行区分。

方面38．根据方面37的方法，其中与靶分子相关联的不同强度比值与参考强度代码图相匹配，以允许检测不同种类的靶分子。

方面39．根据方面38的方法，其中可从参考强度代码图获得的强度比值代码的一部分被用于设计探针。

方面40．根据方面38和39的方法，其中检测包括将检测到的强度比值与参考强度代码图中的强度代码的分布进行比较。

方面41．根据方面40的方法，其中比较包括将检测到的强度比值分配给参考强度代码图中的强度代码。

方面42．根据方面41的方法，其中如果定向的强度比值距强度代码图中的任何强度代码的预定截止值更远，则拒绝检测到的强度比值。

方面43．根据方面37-42中任一方面的方法，其中任意两个靶分子被空间上隔开至少250 nm。

方面44．一种被制备用于检测的样品，包括：附接有第一种光学标记的第一多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第一靶分子；以及附接有第二种光学标记的第二多个探针，其直接或间接结合生物样品中的第二靶分子，其中第一多个探针附接有第一种光学标记，第二多个探针附接有第二种光学标记，不同的靶与不同种类的光学标记相关联，第一种光学标记和第二种光学标记在第一颜色通道和第二颜色通道中具有重叠的激发或发射光谱，其中第一靶分子和第二靶分子在激发时与来自两个颜色通道的不同信号强度比值相关联。

方面45．根据方面44的样品，其中每个探针是单链寡核苷酸、肽，或寡核苷酸和肽的杂交体。

方面46．根据方面44和45的样品，其中与第一靶分子相关联的第一光学标记的数量不同于与第二靶分子相关联的第一光学标记的数量。

方面47．根据方面45和46的样品，其中用于第一靶的第一光学标记和用于第二靶的第二光学标记与不同数量的初级探针相关联。

方面48．根据方面45-47的样品，其中每个多个探针包括至少2个探针。

方面49．根据方面48的样品，其中每个多个探针包括至少12个探针。

方面50．根据方面44-49中任一方面的样品，其中任意两个靶分子在空间上分隔至少250 nm。

方面51．根据方面44-50中任一方面的样品，其中附接有第二种光学标记的第三多个探针直接或间接结合生物样品中的第三靶分子，第三光学标记与第三靶相关联，第三光学标记在第一颜色通道和第二颜色通道中具有与第一光学标记和第二光学标记重叠的光谱。

方面52．根据方面51的样品，其中第三靶分子在激发时与来自两个颜色通道的不同信号强度比值相关联。

方面53．一种用于杂交的试剂盒、包装，或探针的混合物，包括：第一多个探针，每个探针可结合第一靶分子，或者第一多个探针和一个或多个中间探针，所述中间探针允许第一多个探针间接结合第一靶分子；以及第二多个探针，每个探针可结合第二靶分子，或者第二多个探针和一个或多个中间探针，所述中间探针允许第二多个探针间接结合第二靶分子，其中第一多个探针附接有第一种光学标记，第二多个探针附接有第二种光学标记，不同的靶与不同种类的光学标记相关联，第一种光学标记和第二种光学标记在第一颜色通道和第二颜色通道中具有重叠的激发或发射光谱，其中第一靶分子和第二靶分子在激发时与来自两个颜色通道的不同信号强度比值相关联。

方面54．一种检测样品中两个或更多个靶分子的方法，包括在允许探针与靶分子结合的条件下，将方面53的探针混合到包括第一靶分子和第二靶分子的样品中，其中不同种类的靶分子与不同的光学标记组合相关联，每个靶由至少2个颜色通道检测以产生强度比值，不同的靶由不同的强度比值进行区分。

方面55．根据方面54的方法，其中与靶分子相关联的不同强度比值与参考强度代码图相匹配，以允许检测不同种类的靶分子。

方面56．根据方面55的方法，其中可从参考强度代码图获得的强度比值代码的一部分被用于设计探针。

方面57．根据方面54-56中任一方面的方法，其中检测包括将检测到的强度比值与参考强度代码图中的强度代码的分布进行比较。

方面58．根据方面57的方法，其中比较包括将检测到的强度比值分配给参考强度代码图中的强度代码。

方面59．根据方面58的方法，其中如果定向的强度比值距强度代码图中的任何强度代码的预定截止值更远，则拒绝检测到的强度比值。

方面60．根据方面54-59中任一方面的方法，其中任意两个靶分子被空间上隔开至少250 nm。

方面61．一种被制备用于检测的样品，包括：附接有第一种光学标记的第一多个成像探针，其直接或间接结合生物样品中的第一靶分子；以及附接有第一种光学标记的第二多个成像探针，其直接或间接结合生物样品中的第二靶分子，其中与第一多个成像探针相关联的光学标记的数量和与第二多个成像探针相关联的光学标记的数量的比值大于2，其中第一靶分子和第二靶分子在激发时与来自第一颜色通道的不同信号强度比值相关联。

方面62．根据方面61的样品，其中第一多个成像探针还与第一多个初级探针相关联，第一多个初级探针与第一靶分子相关联，并且初级探针中的每个探针直接或间接与多于一个的光学标记相关联。

方面63．根据方面61和62的样品，其中第一靶分子和第二靶分子被隔开至少20nm、l00 nm或250 nm。

方面64．根据方面61的样品，其中与第一多个成像探针相关联的光学标记的数量和与第二多个成像探针相关联的光学标记的数量的比值为至少3、4或5。

方面65．一种用于杂交的试剂盒、包装，或探针的混合物，包括：第一多个探针，每个探针可结合第一靶分子，或者第一多个探针和一个或多个中间探针，所述中间探针允许第一多个探针间接结合第一靶分子；以及第二多个探针，每个探针可结合第二靶分子，或者第二多个探针和一个或多个中间探针，所述中间探针允许第二多个探针间接结合第二靶分子，其中第一多个探针和第二多个探针都附接有第一种光学标记，但数量不同，其中第一靶分子和第二靶分子在激发时与来自相同颜色通道的不同信号强度相关联。

方面66．一种检测样品中两个或更多个靶分子的方法，包括在允许探针与靶分子结合的条件下，将方面65的探针混合到包括第一靶分子和第二靶分子的样品中，其中不同种类的靶分子与相同种类的光学标记相关联，但数量不同，任意两个靶分子在空间上隔开至少20 nm，与靶分子相关联的不同强度与参考强度代码图谱匹配，以允许检测不同种类的靶分子。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

此处说明性描述的发明可以在不存在此处未具体公开的任何要素、限制或多种限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广泛地而非限制地进行解读。此外，本文中使用的术语和表达已被用作描述性而非限制性的术语，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示和所描述的特征或其部分的任何等效物，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。

因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案和可替代特征具体公开，但是本领域技术人员可以诉诸此处公开的本发明的修改、改进和变化，并且此类修改、改进和变化被认为在本发明的范围内。此处提供的材料、方法和实例是优选实施方案的代表，是示例性的，并不旨在限制本发明的范围。

本发明已经在本文中进行了广泛和一般性的描述。属于一般公开内容的每个较窄的种类和亚属组也构成本发明的一部分。这包括对本发明的一般性描述，带有从属中去除任何主题的附带条件或否定限制，无论此处是否具体列举了切除的材料。

此外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也由此根据马库什组的任何个体成员或成员子组进行描述。

此处提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都被明确地全文引入作为参考，其程度如同各自被单独引入作为参考一样。如有冲突，以本说明书（包括定义）为准。

应当理解，虽然已经结合上述实施方案描述了本发明，但是上述描述和实施方案旨在说明而非限制本发明的范围。本发明范围内的其它方面、优点和修改对于本发明所属领域的技术人员来说是显而易见的。

Claims (37)

1.一种被制备用于检测的生物样品，包括：

第一靶分子，其直接或间接结合第一光学标记，以及

第二靶分子，其直接或间接结合第二光学标记，

其中通过（a）如果所述第一光学标记与所述第二光学标记相同，则每个靶分子结合不同数量的光学标记，或（b）所述第一光学标记与所述第二光学标记之间的相似颜色的不同强度，从而在一个或多个颜色通道中使所述第一靶分子和所述第二靶分子光学上可区分。

2.根据权利要求1所述的生物样品，其中所述第一光学标记与所述第二标记相同，并且其中所述第一靶分子还结合第三光学标记，所述第三光学标记不同于所述第一光学标记和所述第二光学标记。

3.根据权利要求2所述的生物样品，其中所述第一靶分子结合第一探针，所述第一探针包括第一数量的所述第一光学标记和所述第三光学标记。

4.根据权利要求3所述的生物样品，其中所述第二靶分子结合第二探针，所述第二探针包括第二数量的所述第二光学标记，所述第二数量不同于所述第一数量。

5.根据权利要求4所述的生物样品，其中所述第二探针还包括所述第三光学标记。

6.根据权利要求1所述的生物样品，其中所述第一光学标记和所述第二光学标记具有由小于100 nm、小于50 nm或小于20 nm隔开的峰值发射波长。

7.一种被制备用于检测的生物样品，包括多个不同的靶分子，每个靶分子都结合一个或多个光学标记，其中所述靶分子在一个或多个颜色通道中彼此光学上可区分，并且所述靶分子中的至少两个靶分子结合相同的光学标记但由于结合所述靶分子的不同光学标记的比值不同而光学上可区分。

8.根据权利要求7的样品，其中所述比值相差至少2、2.3、3.5、5、8.1、10、20、50或100倍。

9.根据权利要求7所述的样品，其中所述至少两个靶分子各自结合至少三个不同的光学标记。

10.根据权利要求7所述的样品，其中所述靶分子中的每个靶分子结合一个或多个探针，并且结合一个靶分子的所述探针与结合其它靶分子中每个靶分子的探针光学上可区分。

11.根据权利要求7所述的样品，其中所述靶分子中的每个靶分子结合一个或多个探针，并且结合一个靶分子的所述探针不必与结合其他靶分子中每个靶分子的探针光学上可区分，但是结合靶分子的所有探针的组合使得所述靶分子与其它靶分子光学上可区分。

12.一种被制备用于检测的生物样品，包括多个不同的靶分子，每个靶分子结合一个或多个光学标记，其中所述靶分子在一个或多个颜色通道中彼此光学上可区分，并且所述靶分子中的至少两个靶分子结合一个共同的第一光学标记，并且分别结合具有相似颜色的第二光学标记和第三光学标记，但是由于所述第二光学标记和所述第三光学标记具有不同的强度而光学上可区分。

13.根据权利要求12所述的样品，其中所述至少两个靶分子结合不同数量的所述第一光学标记。

14.根据权利要求12所述的样品，其中每个靶分子结合一个或多个探针，并且结合一个靶分子的所述探针与结合其它靶分子中每个靶分子的探针光学上可区分。

15.根据权利要求12所述的样品，其中所述第二光学标记和所述第三光学标记具有被小于100 nm、小于50 nm或小于20 nm隔开的峰值发射波长。

16.根据前述权利要求中任一项所述的样品，其中至少一个靶分子还结合猝灭分子或信号增强分子。

17.根据前述权利要求中任一项所述的样品，其中与相同靶分子相关联的至少两个相同的光学标记足够接近以引起信号猝灭。

18.根据权利要求17所述的样品，其中每个靶分子结合一个或多个初级探针。

19.根据权利要求18所述的样品，其中每个光学标记与标记探针相关联。

20.根据权利要求19所述的样品，其中每个初级探针结合两个或更多个标记探针。

21.根据前述权利要求中任一项所述的样品，其中所述光学标记是荧光染料、荧光蛋白或纳米颗粒。

22.根据前述权利要求中任一项所述的样品，其中所述靶分子包括RNA分子、RNA片段、DNA分子或DNA片段。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的样品，其中所述靶分子包括蛋白质、脂质、多糖或颗粒。

24.根据权利要求1至21中任一项所述的样品，其中所述靶分子包括DNA修饰、RNA修饰或蛋白质修饰。

25.根据前述权利要求中任一项所述的样品，其中所述靶分子位于细胞、组织中，或附接在固体支架上。

26.一种用于杂交的试剂盒、包装或探针混合物，包括探针，用适于制备权利要求1至25中任一项所述的样品的光学标记来标记所述探针。

27.一种检测样品中两个或更多个靶分子的方法，包括在允许探针与靶分子结合的条件下，将权利要求26中所述的探针混合到包括靶分子的样品中，其中不同种类的靶分子与不同的光学标记组合相关联，每个靶分子由至少两个颜色通道检测。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述光学标记与所述靶分子相关联，与所述光学标记相关联的不同光学信号与参考光学代码图相匹配，以允许检测不同的靶分子。

29.根据权利要求28所述的方法，其中可从参考强度代码图获得的强度比值代码的一部分被用于设计所述探针。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中任意两个靶分子在空间上隔开至少250 nm。

31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中每个光学标记与成像探针相关联，所述成像探针与初级探针相关联，并且所述初级探针附接到靶分子。

32.根据权利要求31所述的方法，其中每个初级探针与至少两个光学标记相关联，并且这些光学标记附接到所述初级探针的5’或3’端而非两端。

33.根据权利要求31所述的方法，其中每个初级探针与至少两个光学标记相关联，并且这些光学标记都附接到所述初级探针的5’和3’端。

34.根据权利要求33所述的方法，其中每个初级探针的所述5’和3’端具有不同数量的光学标记。

35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中每个光学标记与成像探针相关联，所述成像探针与一层或多层中间探针相关联，所述中间探针与初级探针相关联，所述初级探针附接到靶分子。

36.根据权利要求35所述的方法，其中多个相同或不同种类的成像探针与中间探针相关联。

37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中至少一个成像探针与两个或更多个相同或不同种类的光学标记相关联。

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