CN114031733B - dsRNA聚合物纳米载体的制备方法及其制备的纳米载体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，涉及农药纳米载体的制备技术领域，是基于传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题提出的。本发明还提供上述dsRNA聚合物纳米载体的制备方法制得的纳米载体，纳米载体的结构式为：
Figure DDA0003945028270000011
本发明还提供上述dsRNA聚合物纳米载体的制备方法制得的纳米载体在虫害防治领域的应用。本发明所构筑的荧光纳米载体很好的解决了传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题，由于生物体内都存在着大量ATP，而本发明的荧光纳米载体碰到ATP就会破裂开来，从而将包裹的物质释放出来。

Description

dsRNA聚合物纳米载体的制备方法及其制备的纳米载体和 应用
技术领域
本发明涉及农药纳米载体的制备技术领域，具体涉及dsRNA聚合物纳米载体的制备方法及其制备的纳米载体和应用。
背景技术
植物虫害是制约现代农作物产量和质量的重要因素，全球每年因虫害所造成的农作物减产量约占总产量的30％-40％。作物的害虫防治作为一种提高粮食产量的方法而成为了当前广受关注的前沿研究方向。传统化学农药导致了有害虫抗药性、农药残留超标、环境严重污染等一系列问题，严重影响了我国农产品质量安全、农业生态环境安全以及害虫的可持续防控。相较于化学农药，利用RNAi技术对植物虫害进行防治具有显著的优势：既不会对环境和人体造成伤害也不会使害虫产生抗药性。文献《RNA干扰技术在植物品质改良和病虫害防治中的应用》([J].浙江农业科学,2014,1(006):0-886.)应用RNAi技术改良植物营养品质和控制病虫害。但dsRNA因自身的结构特性造成dsRNA在消化***内易被酶解，且不易穿透细胞膜。这两点原因造成裸露的dsRNA在虫害细胞内RNAi效果差，效率低。纳米材料因其独特的结构、尺寸和理化性质在基因、药物的运载和靶向释放领域受到了广泛的关注。利用纳米载体对dsRNA进行运载可以有效提高dsRNA的穿膜能力以及增强其稳定性。当前，常用的dsRNA纳米载体主要有无机纳米粒子、表面活性剂以及阳离子型聚合物。国内外研究表明利用这些纳米粒子负载dsRNA可以有效的提高RNAi效率效果。
传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后如何及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题一直没有解决，这也导致了通过聚合物纳米运载dsRNA在虫害体内的RNAi效率不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备PFPMA单体
分别称取1当量重的五氟苯酚(PFP)、1-1.5当量重的三乙胺和1-2当量重的丙烯酰氯，先将五氟苯酚用四氢呋喃溶解，加入催化剂搅拌均匀，然后在氮气保护下加丙烯酰氯，在室温下反应4h后处理得到PFPMA；五氟苯酚(PFP)易于合成五氟代苯基活性酯，且易于发生聚合；
(2)制备PEG2k-CTA
分别称取3当量重的可逆加成断裂链转移剂CTA、4当量重的聚乙二醇单甲醚、3当量重1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.4当量重的4-二甲氨基吡啶并溶解在二氯甲烷里，70℃回流反应过夜；采用柱层析法进行纯化，在真空烘箱中室温干燥一夜，得到淡黄色固体PEG2k-CTA；链转移剂PEG2K-CTA一端接有PEG链段，使其具有两亲性，可以在水中自组装；
(3)称取不同比例的PFPMA和PEG2k-CTA溶于四氢呋喃中，加入聚合引发剂于安瓿瓶中，冻融循环3次，充入氮气，70℃反应24h后处理得到PFn；
(4)分别称取1当量重的罗丹明和10-20当量重的二乙烯三胺，将罗丹明和二乙烯三胺加入反应溶剂中溶解后，70℃回流反应24h后处理得到单体R；二乙烯三胺通过与罗丹明B产生一个螺旋的内酰胺环，进而破环了其共轭结构，抑制了罗丹明B荧光的发生；
(5)制备荧光纳米载体PR
分别称取1当量重的PFn、1-2当量重的R和0.1-0.2当量重的活化剂，依次溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温反应24h后处理得到PR，即为dsRNA聚合物纳米载体。
所述dsRNA聚合物纳米载体的制备路线如下：
Figure GDA0003945028260000031
本发明所构筑的荧光纳米载体很好的解决了传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题，由于生物体内都存在着大量ATP，而本发明的荧光纳米载体碰到ATP就会破裂开来，从而将包裹的物质释放出来。
优选地，所述步骤(1)中催化剂为三乙胺。
优选地，所述步骤(2)中聚乙二醇单甲醚的平均分子量为2000。
优选地，所述步骤(2)中柱层析的溶剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1。
优选地，所述步骤(3)中聚合引发剂为偶氮二异丁腈。
优选地，所述步骤(3)中引发剂和单体的比例为1:30。
优选地，所述步骤(4)中反应溶剂为乙醇。
优选地，所述步骤(5)中活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
本发明还提供上述制备方法制得的纳米载体材料，所述纳米载体材料的结构式如下式所示：
Figure GDA0003945028260000041
本发明还提供上述dsRNA聚合物纳米载体的制备方法制得的纳米载体在虫害防治领域的应用。
本发明具有如下的有益效果：
1、本发明所构筑的荧光纳米载体很好的解决了传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题，由于生物体内都存在着大量ATP，而本发明的荧光纳米载体碰到ATP就会破裂开来，从而将包裹的物质释放出来。
2、本发明通过可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)将五氟苯酚单体与链转移剂(PEG2k-CTA)共聚，获得各种比例的高分子，然后再用疏水荧光基团R替换掉五氟苯酚部分，这种聚合物具有两亲性和生物相容性。
3、相较于传统的纳米载体，本发明利用ATP的磷酸基团与多个氨基之间的氢键作用来打开螺旋内酰胺环，使得该纳米载体具有良好的荧光性能和实时定位，以便更好地确认载体包裹的物质是否到达目标位置。
附图说明
图1为本发明实施例制备的PFPMA单体的核磁氢谱图；
图2为本发明实施例制备的PEG2k-CTA的核磁氢谱图；
图3为本发明实施例制备的PFPMA单体核磁碳谱图；
图4为本发明实施例制备的PF聚合物的核磁氟谱图；
图5为本发明实施例制备的PEG2k-CTA、聚合物PF和PR的凝胶渗透色谱图；
图6为本发明实施例制备的单体R、聚合物PF和PR的傅里叶变换光谱图；
图7为本发明实施例PR随着加入不同摩尔量ATP时的Zeta电位变化情况图；
图8为本发明实施例制备的聚合物PR的透射电镜、原子力和扫描电镜图像；
图9为本发明实施例制备的聚合物PR的动态光散射曲线图；
图10为本发明实施例的ATP和PR加入ATP后的核磁磷谱的变化图；
图11为本发明实施例的ATP、PR以及PR加入ATP后的傅里叶变换光谱变化图；
图12为本发明实施例的PR随着加入不同摩尔量ATP后的紫外和荧光的光谱变化图；
图13为本发明实施例的PR荧光纳米载体在20℃、30℃、40℃加入ATP后的紫外和荧光随着时间的变化情况以及在561.5nm处的紫外和荧光变化曲线图；
图14为本发明实施例的PR包载荧光标记的dsRNA和裸露的荧光标记dsRNA与果蝇细胞共孵育2小时后，果蝇细胞内检测到的荧光强度值图；
图15为本发明实施例的PR包载dsRNA的凝胶电泳图定量数据图；
图16为本发明实施例的PR包载dsRNA饲喂五天后的蚕(下)与对照组蚕(上)的数码照片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明附图说明和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
使用五氟苯酚和丙烯酰氯制备出丙烯酸五氟苯酚酯单体(PFPMA)，罗丹明B(RB)和二乙烯三胺反应制备出含有螺旋内酰胺环的单体R；然后用丙烯酸五氟苯酚酯(PFPMA)和链转移剂(PEG2k-CTA)发生可逆加成断裂转移聚合(RAFT)，生成不同比例各种聚合物，最后再用R取代掉聚合物中的PFP部分。技术路线如下：
Figure GDA0003945028260000071
实施例2
PFPMA单体的制备：
用50mL四氢呋喃在250mL干燥的圆底烧瓶中溶解5g五氟苯酚，用注射器吸取4.6mL的三乙胺加入圆底烧瓶中；在氮气保护下，将3.2mL丙烯酰氯溶在10mL四氢呋喃中圆底烧瓶中，用滴液漏斗缓慢滴入圆底烧瓶中，完成滴加后，关闭氮气，室温反应4h；减压除去大部分四氢呋喃，加入100mL饱和碳酸氢钠溶液，将混合物溶液倒入分液漏斗中然后加入二氯甲烷萃取取有机层；向得到的二氯甲烷中加入无水硫酸镁干燥，然后过滤除去无水硫酸镁；过滤后的液体旋蒸除去二氯甲烷，再使用柱层析法(石油醚)进行纯化，得到PFPMA单体。
实施例3
PEG2k-CTA的制备：
分别称取238mg CTA、1.33g聚乙二醇单甲醚、192mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和16mg 4-二甲氨基吡啶溶解在7mL二氯甲烷里，70℃回流反应过夜；采用柱层析法(二氯甲烷:甲醇＝10:1)进行纯化，在真空烘箱中室温干燥一夜，得到淡黄色固体PEG2k-CTA。
实施例4
分别称取200mg PFPMA与61mg PEG2k-CTA加入安瓿瓶并且溶于2mL THF中，将偶氮二异丁腈(AIBN)配成10mg/mL的THF溶液，取92ul加入安瓿瓶中，将安瓿瓶密封；混合溶液经过三次冻融循环后，在氮气环境下70℃反应24h；将反应物在石油醚：乙酸乙酯＝10:1中纯化得到PF的高分子聚合物。
实施例5
称取4g罗丹明B加入250mL圆底烧瓶中，并用50mL的乙醇溶解，待完全溶解后，量取20mL二乙烯三胺加入圆底烧瓶中，在70℃条件下回流反应24h；加入100mL H2O终止反应，将混合物溶液倒入分液漏斗中加入二氯甲烷取有机层，在所得溶液中加入无水硫酸镁除水，然后过滤除去无水硫酸镁，将得到的混合溶液通过旋蒸除去二氯甲烷，再使用柱层析法(二氯甲烷:甲醇＝8:1-2:1)进行纯化，得到单体R。
实施例6
取上述实施例3中合成的PFn聚合物与相同摩尔量的R单体溶于5mL DMF中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)，然后在室温下反应24h，用截留分子量为7000的透析袋透析48h，其过程中至少换五次水，得到dsRNA聚合物纳米载体(PR)。
分析试验
1、对上述实施例制备的PFPMA单体、PEG2k-CTA、PF、单体R和dsRNA聚合物纳米载体(RP)分别进行表征分析，分析的结果如下：
图1为实施例2制备的PFPMA单体的核磁氢谱图，根据图1的结果分析表明实施例2制备的PFPMA单体双键的成功修饰。
图2为实施例3制备的PEG2k-CTA的核磁氢谱图，根据图2的结果表明引发剂的成功合成。
图3为实施例2制备的PFPMA单体的核磁碳谱图，图3的结果表明合成了结构清晰的单体。
图4为实施例6制备的dsRNA聚合物纳米载体(RP)的核磁氟谱图，图4的结果表明单体成功发生了聚合。
图5为上述实施例制备的PEG2k-CTA、聚合物PF和PR的凝胶渗透色谱图，从图5可以看出PEG2k-CTA、聚合物PF和PR的分子量，以及分布情况，随着峰的左移，说明产物的分子量变大，证明了反应的发生。
图6为本发明实施例制备的单体R、聚合物PF和PR的傅里叶变换光谱图，1785cm-1处酯键的消失和1678cm-1处酰胺键的出现证明了反应的发生；
2、取上述实施例制备的dsRNA聚合物纳米载体(PR)，向dsRNA聚合物纳米载体(PR)加入ATP，对混合有ATPdsRNA聚合物纳米载体(PR)进行表征，表征结果如图7-13所示；纳米载体材料的结构及其与ATP作用机理如下：
Figure GDA0003945028260000101
图7为本发明实施例PR随着加入不同摩尔量ATP时的Zeta电位变化情况，PR上氨基呈正电，随着带负电的ATP的加入，电位由正变负，说明PR与ATP发生了结合；
图8为本发明实施例6制备的聚合物PR的透射电镜、原子力和扫描电镜图像，根据图8的结果可以看出，实施例6制备的聚合物PR的形貌为分散均匀的球形；
图9为本发明实施例6制备的聚合物PR的动态光散射曲线，其动力学直径为152.2nm；
图10为本发明实施例的ATP和PR加入ATP后的核磁磷谱的变化，加入前后磷谱的峰发生了偏移，证实了氢键的形成；
图11为本发明实施例的ATP、PR以及PR加入ATP后的傅里叶变换光谱变化，PR加入ATP后酰胺键的红外峰发生了偏移证明了氢键的形成；
图12为本发明实施例的PR随着加入不同摩尔量ATP后的紫外和荧光的光谱变化，结果证明ATP与PR形成了氢键，破坏了螺旋的内酰胺环，使罗丹明B重新形成了共轭结构，从而导致紫外和荧光强度的增强；
图13为本发明实施例的PR荧光纳米载体在20℃、30℃、40℃加入ATP后的紫外和荧光随着时间的变化情况以及在561.5nm处的紫外和荧光变化曲线，结果说明温度越高，形成氢键的速度越快；
图14为本发明实施例的PR包载荧光标记的dsRNA和裸露的荧光标记dsRNA与果蝇细胞共孵育2小时后，果蝇细胞内检测到的荧光强度值图，荧光强度的增加表明PR增强了dsRNA进入细胞的能力；
图15为本发明实施例的PR包载dsRNA的凝胶电泳图定量数据，结果表明PR对于dsRNA的包裹能力；
图16为本发明实施例的PR包载dsRNA饲喂五天后的蚕(下)与对照组蚕(上)的数码照片，图16的结果可以说明PR成功将dsRNA运输进蚕细胞体内并且dsRNA对蚕的生长产生了抑制作用。
综上，本发明所构筑的荧光纳米载体很好的解决了传统聚合物纳米载体进入虫害细胞后无法及时、有效地将dsRNA进行释放出来的问题，由于生物体内都存在着大量ATP，而本发明的荧光纳米载体碰到ATP就会破裂开来，从而将包裹的物质释放出来；本发明通过可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)将五氟苯酚单体与链转移剂(PEG2k-CTA)共聚，获得各种比例的高分子，然后再用疏水荧光基团R替换掉五氟苯酚部分，这种聚合物具有两亲性和生物相容性；相较于传统的纳米载体，本发明利用ATP的磷酸基团与多个氨基之间的氢键作用来打开螺旋内酰胺环，使得该纳米载体具有良好的荧光性能和实时定位，以便更好地确认载体包裹的物质是否到达目标位置。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备PFPMA单体
分别称取1当量重的五氟苯酚、1-1.5当量重的三乙胺和1-2当量重的丙烯酰氯，先将五氟苯酚用四氢呋喃溶解，加入催化剂搅拌均匀，然后在氮气保护下加丙烯酰氯，在室温下反应4h后处理得到PFPMA；
(2)制备PEG2k-CTA
分别称取3当量重的可逆加成断裂链转移剂CTA、4当量重的聚乙二醇单甲醚、3当量重1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.4当量重的4-二甲氨基吡啶并溶解在二氯甲烷里，70℃回流反应过夜；采用柱层析法进行纯化，在真空烘箱中室温干燥一夜，得到淡黄色固体PEG2k-CTA；所述柱层析的溶剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1；
(3)称取不同比例的PFPMA和PEG2k-CTA溶于四氢呋喃中，加入聚合引发剂于安瓿瓶中，冻融循环3次，充入氮气，70℃反应24h后处理得到PFn；所述聚合引发剂为偶氮二异丁腈；
(4)分别称取1当量重的罗丹明和10-20当量重的二乙烯三胺，将罗丹明和二乙烯三胺加入反应溶剂中溶解后，70℃回流反应24h后处理得到单体R；
(5)制备荧光纳米载体PR
分别称取1当量重的PFn、1-2当量重的R和0.1-0.2当量重的活化剂，依次溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室温反应24h后处理得到PR，即为dsRNA聚合物纳米载体；所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
2.根据权利要求1所述的dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中催化剂为三乙胺。
3.根据权利要求1所述的dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中聚乙二醇单甲醚的平均分子量为2000。
4.根据权利要求1所述的dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中引发剂和单体的比例为1:30。
5.根据权利要求1所述的dsRNA聚合物纳米载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中反应溶剂为乙醇。
6.根据权利要求1-5任一项所述的dsRNA聚合物纳米载体的制备方法制得的纳米载体，其特征在于：所述纳米载体的结构如下式所示：
Figure FDA0003961989230000021
7.根据权利要求1-5任一项所述的dsRNA聚合物纳米载体的制备方法制得的纳米载体在虫害防治领域的应用。
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