CN114002444A - β-人绒毛膜***检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β‑人绒毛膜***检测试剂盒，包括有试剂R1、试剂R3和试剂R4；其中，所述试剂R1具有链霉亲和素包被的磁性微粒和三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液，所述试剂R3具有吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体和磷酸盐缓冲液，所述试剂R4具有生物素标记的鼠抗人HCG抗体和吗啉乙磺酸MES；还包括有校准品和质控品。在试剂R1、试剂R3和试剂R4中均有缓冲液(试剂R4中，吗啉乙磺酸MES是缓冲液)，此外，β‑人绒毛膜***检测试剂盒包括有校准品和质控品，检测结果准确度高，抗干扰性好，稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测领域，尤其是涉及一种β-人绒毛膜***检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
人绒毛膜***(hCG)是一种带有两个非共价键结合亚基的糖蛋白。其α亚基类似于***(LH)、***(FSH)、以及促甲状腺激素(TSH)的α亚基。人绒毛膜***的β亚基不同于其他垂体糖蛋白激素，并且体现其独特的生物化学和免疫学特性。人绒毛膜***由胎盘的细胞合成并能够维护孕期内的黄体功能，是一种很好的孕检标志物，在受孕后的一周就可以检测出来。
在孕期，人绒毛膜***(hCG)水平以指数规律上升，并持续到末次月经后大约8到10周。在孕期的后期，大约受孕后12周时，由于胎盘开始产生类固醇激素，hCG的浓度开始降低。人绒毛膜***值下降表示流产、***、妊毒症等。
目前临床实验室对人绒毛膜***的检测，主要采用化学发光法和酶联免疫荧光法。临床和实验室常用的检测方法主要有酶联免疫法、免疫荧光法、化学发光法等。
在中国专利文献CN107677837A中，公开了一种β人绒毛膜***检测试剂盒的制备方法，包括试剂R1和试剂R2的制备；试剂R1的制备包括：向MES缓冲液中添加叠氮钠、蔗糖、Tween-80和PEG-8000，制得试剂R1；试剂R2的制备包括：(1)向MES缓冲液中添加NaCl、叠氮钠、牛血清蛋白、甘油，制得乳胶微球溶解试剂；(2)将β-人绒毛膜***抗体包被到乳胶微球中，制得抗体胶乳；(3)将抗体胶乳离心去上清液，然后用乳胶微球溶解试剂溶解沉淀物，超声分散，制得试剂R2。
上述技术方案的β人绒毛膜***检测试剂盒检测效果不是很理想，究其原因，和试剂种类的选择以及含量有密切关系。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种β-人绒毛膜***检测试剂盒，能够提高睾酮检测的准确度，抗干扰性好，稳定性好。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该β-人绒毛膜***检测试剂盒包括有试剂R1、试剂R3和试剂R4；其中，所述试剂R1具有链霉亲和素包被的磁性微粒和三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液，所述试剂R3具有吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体和磷酸盐缓冲液，所述试剂R4具有生物素标记的鼠抗人HCG抗体和吗啉乙磺酸MES；
还包括有校准品和质控品。
检验原理为采用双抗体夹心法进行检测，将样本、生物素标记的HCG+β单克隆抗体以及链霉亲合素包被的磁性微粒在温育条件下反应，抗体捕获样本中的抗原，形成抗原抗体复合物，结合到磁性微粒上，孵育结束后，加磁场沉淀，去掉上清液，用清洗液清洗沉淀复合物，并吸干废液，除去未与磁性微粒结合的物质，加入吖啶酯标记的另外一株HCG+β单克隆抗体在温育条件下反应，形成抗原抗体夹心复合物，检测读数：温育结束后，加磁场沉淀，去掉上清液，用清洗液清洗沉淀复合物，并吸干废液，除去未与磁性微粒结合的物质，再将反应杯送入测量室中。仪器自动泵入激发液，使复合物产生化学发光信号，通过光电倍增器测量发光强度，仪器自动通过工作曲线计算得出检测结果。
在本发明中，在试剂R1、试剂R3和试剂R4中均有缓冲液(试剂R4中，吗啉乙磺酸MES是缓冲液)，此外，β-人绒毛膜***检测试剂盒包括有校准品和质控品，检测结果准确度高，抗干扰性好，稳定性好。
优选的，所述试剂R1、所述试剂R3和所述试剂R4中均含有防腐剂Proclin 300。
优选的，所述校准品和质控品为冻干粉状态的通过体外重组获得的人绒毛膜***重组抗原；所述防腐剂Proclin 300为1g/L。
优选的，在所述试剂R1中，所述链霉亲和素包被的磁性微粒为2.5g/L，所述三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液为50mmol/L；在所述试剂R3中，所述吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体为0.15mg/L，所述磷酸盐缓冲液为100mmol/L；在所述试剂R4中，所述生物素标记的鼠抗人HCG抗体为0.78mg/L，所述吗啉乙磺酸MES为100mmol/L。
优选的，在所述试剂R1、所述试剂R3和所述试剂R4中均含有牛血清白蛋白BSA，所述牛血清白蛋白BSA为10g/L。
本发明要解决的另一个问题是提供一种β-人绒毛膜***检测试剂盒的制备方法，所述β-人绒毛膜***检测试剂盒包括有试剂R1、试剂R3和试剂R4，包括以下步骤：
S1所述试剂R1的制备：取直径1uM链霉亲和素包被的磁性微粒，用磁珠稀释液稀释浓度，搅拌混匀；
S2所述试剂R3的制备：将一株针对HCG抗原表位的鼠抗人HCG抗体，与吖啶酯混合后进行吖啶酯标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到一株针对HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体；
将得到的一株针对HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液稀释浓度；
S3所述试剂R4的制备：将鼠抗人HCG抗体用缓冲液稀释浓度，与生物素混合后进行生物素标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到生物素标记的鼠抗人HCG抗体；
将得到的生物素标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液稀释浓度；
S4分装试剂：将制备好的所述试剂R1、所述试剂R3和所述试剂R4进行分装，于2-8℃避光存储；
所述β-人绒毛膜***检测试剂盒还包括有校准品和质控品。
优选的，在所述步骤S1中，磁珠稀释液包含Tris作为缓冲剂，BSA作为封闭剂和Proclin300作为防腐剂；在所述步骤S2中，稀释液包括二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠作为缓冲剂，BSA、酪蛋白作为封闭剂，Proclin 300作为防腐剂，Tween-20作为表面活性剂；在所述步骤S3中，稀释液的主要成分为MES。
优选的，在所述步骤S2和所述步骤S3中，均采用Zeba脱盐离心柱进行离心脱盐纯化；在所述步骤S2中，进行标记时，是在37℃反应90分钟进行标记；在所述步骤S3中，进行标记时，是在37℃反应60分钟进行标记。
其中，Zeba脱盐离心柱为7K MWCO，0.5mL货号：89883规格。
优选的，还包括有步骤S5贴标：将射频卡粘贴在试剂盒上，再将标签覆盖与所述射频卡之上；所述射频卡含有试剂批号、盒号、使用期限、项目代码、项目名称和试剂规格信息。
优选的，在所述步骤S1中，链霉亲和素包被的磁性微粒用磁珠稀释液稀释至2.5g/L的浓度；在所述步骤S2中，每株鼠抗人HCG抗体与吖啶酯的摩尔比为1:10，将得到的一株针对HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液配成0.15mg/L的浓度；在所述步骤S3中，将鼠抗人HCG抗体用缓冲液稀释至0.78mg/L的浓度，鼠抗人HCG抗体与生物素的摩尔比为1:10，将得到的生物素标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液配成0.78mg/L的浓度。
具体实施方式
下面结合本发明的实施方式进一步详细说明：
本实施例的β-人绒毛膜***检测试剂盒，包括有试剂R1、试剂R3和试剂R4；其中，所述试剂R1具有链霉亲和素包被的磁性微粒和三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液，所述试剂R3具有吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体和磷酸盐缓冲液，所述试剂R4具有生物素标记的鼠抗人HCG抗体和吗啉乙磺酸MES；
还包括有校准品和质控品。
所述试剂R1、所述试剂R3和所述试剂R4中均含有防腐剂Proclin 300。
所述校准品和质控品为冻干粉状态的通过体外重组获得的人绒毛膜***重组抗原；所述防腐剂Proclin 300为1g/L。
在所述试剂R1中，所述链霉亲和素包被的磁性微粒为2.5g/L，所述三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液为50mmol/L；在所述试剂R3中，所述吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体为0.15mg/L，所述磷酸盐缓冲液为100mmol/L；在所述试剂R4中，所述生物素标记的鼠抗人HCG抗体为0.78mg/L，所述吗啉乙磺酸MES为100mmol/L。
在所述试剂R1、所述试剂R3和所述试剂R4中均含有牛血清白蛋白BSA，所述牛血清白蛋白BSA为10g/L。
本实施例的上述β-人绒毛膜***检测试剂盒的制备方法，所述β-人绒毛膜***检测试剂盒包括有试剂R1、试剂R3和试剂R4，包括以下步骤：
S1所述试剂R1的制备：取直径1uM链霉亲和素包被的磁性微粒，用磁珠稀释液稀释浓度，搅拌混匀；
S2所述试剂R3的制备：将一株针对HCG抗原表位的鼠抗人HCG抗体，与吖啶酯混合后进行吖啶酯标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到一株针对HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体；
将得到的一株针对HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液稀释浓度；
S3所述试剂R4的制备：将鼠抗人HCG抗体用缓冲液稀释浓度，与生物素混合后进行生物素标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到生物素标记的鼠抗人HCG抗体；
将得到的生物素标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液稀释浓度；
S4分装试剂：将制备好的所述试剂R1、所述试剂R3和所述试剂R4进行分装，于2-8℃避光存储；
所述β-人绒毛膜***检测试剂盒还包括有校准品和质控品。
在所述步骤S1中，磁珠稀释液包含Tris作为缓冲剂，BSA作为封闭剂和Proclin300作为防腐剂；在所述步骤S2中，稀释液包括二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠作为缓冲剂，BSA、酪蛋白作为封闭剂，Proclin 300作为防腐剂，Tween-20作为表面活性剂；在所述步骤S3中，稀释液的主要成分为MES。
在所述步骤S2和所述步骤S3中，均采用Zeba脱盐离心柱进行离心脱盐纯化；在所述步骤S2中，进行标记时，是在37℃反应90分钟进行标记；在所述步骤S3中，进行标记时，是在37℃反应60分钟进行标记。
还包括有步骤S5贴标：将射频卡粘贴在试剂盒上，再将标签覆盖与所述射频卡之上；所述射频卡含有试剂批号、盒号、使用期限、项目代码、项目名称和试剂规格信息。
在所述步骤S1中，链霉亲和素包被的磁性微粒用磁珠稀释液稀释至2.5g/L的浓度；在所述步骤S2中，每株鼠抗人HCG抗体与吖啶酯的摩尔比为1:10，将得到的一株针对HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液配成0.15mg/L的浓度；在所述步骤S3中，将鼠抗人HCG抗体用缓冲液稀释至0.78mg/L的浓度，鼠抗人HCG抗体与生物素的摩尔比为1:10，将得到的生物素标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液配成0.78mg/L的浓度。
在本实施例中，试剂盒1的试剂R1、试剂R3和试剂R4的具体组分和含量如下表1所示：
表1
表1中的生物素标记的鼠抗单克隆抗体即为生物素标记的鼠抗人HCG抗体；吖啶酯标记的鼠抗单克隆抗体即为HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体；
在本实施例中，试剂盒2的试剂R1、试剂R3和试剂R4具体组分和含量如下表2所示：
表2
表2中的生物素标记的鼠抗单克隆抗体即为生物素标记的鼠抗人HCG抗体；吖啶酯标记的鼠抗单克隆抗体即为HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体；
将上述试剂盒1和试剂盒2进行抗干扰性测试，结果如下表3所示：
表3
从上述测试结果来看，试剂盒1的抗干扰性较好，试剂盒1的偏差相对试剂盒2的偏差较小。
将上述试剂盒1和试剂盒2进行稳定性测试，结果如下表4所示：
表4
从上述测试结果来看，试剂盒1的稳定性较好，试剂盒1的信号保留率相对试剂盒2的信号保留率较高；表中的A、B、C、D、E表示不同浓度的校准品编号，浓度即为编号后面的数值，单位为ng/mL。
发明人经过研究发现，试剂盒1中试剂R4的生物素浓度对于试剂盒的抗干扰性有影响，具体数据表格如下表5所示：
表5
结果显示，生物素的浓度为30mIU/mL抗干扰性最好。
采用本实施例的β-人绒毛膜***检测试剂盒进行人绒毛膜***检测时，检测结果出来后，阳性判断值或者参考区间如下表6所示：
表6
由于地理、人种、性别和年龄等差异，建议各实验室建立自己的参考范围。
1.人绒毛膜***项目的默认结果单位使用mIU/mL(或IU/L)；
2.由于方法学不同或抗体特异性等原因，不同生产商的试剂检测结果之间可能存在偏差，因此不应直接相互比较，以免造成错误的医学解释；
3.当样本中HCG+β的浓度超过8000mIU/mL时，可用样本稀释液对样本进行稀释(推荐稀释倍数为100倍)后再进行检测；
4.人绒毛膜***浓度低于检测下限报告为＜0.600mIU/mL，而高于检测上限的则报告为＞8000mIU/mL。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种β-人绒毛膜***检测试剂盒，其特征在于，包括有试剂R1、试剂R3和试剂R4；其中，所述试剂R1具有链霉亲和素包被的磁性微粒和三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液，所述试剂R3具有吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体和磷酸盐缓冲液，所述试剂R4具有生物素标记的鼠抗人HCG抗体和吗啉乙磺酸MES；
还包括有校准品和质控品。
2.根据权利要求1所述的β-人绒毛膜***检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1、所述试剂R3和所述试剂R4中均含有防腐剂Proclin 300。
3.根据权利要求2所述的β-人绒毛膜***检测试剂盒，其特征在于，所述校准品和质控品为冻干粉状态的通过体外重组获得的人绒毛膜***重组抗原；所述防腐剂Proclin300为1g/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的β-人绒毛膜***检测试剂盒，其特征在于，在所述试剂R1中，所述链霉亲和素包被的磁性微粒为2.5g/L，所述三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液为50mmol/L；在所述试剂R3中，所述吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体为0.15mg/L，所述磷酸盐缓冲液为100mmol/L；在所述试剂R4中，所述生物素标记的鼠抗人HCG抗体为0.78mg/L，所述吗啉乙磺酸MES为100mmol/L。
5.根据权利要求4所述的β-人绒毛膜***检测试剂盒，其特征在于，在所述试剂R1、所述试剂R3和所述试剂R4中均含有牛血清白蛋白BSA，所述牛血清白蛋白BSA为10g/L。
6.一种β-人绒毛膜***检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述β-人绒毛膜***检测试剂盒包括有试剂R1、试剂R3和试剂R4，包括以下步骤：
S1所述试剂R1的制备：取直径1uM链霉亲和素包被的磁性微粒，用磁珠稀释液稀释浓度，搅拌混匀；
S2所述试剂R3的制备：将一株针对HCG抗原表位的鼠抗人HCG抗体，与吖啶酯混合后进行吖啶酯标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到一株针对HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体；
将得到的一株针对HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液稀释浓度；
S3所述试剂R4的制备：将鼠抗人HCG抗体用缓冲液稀释浓度，与生物素混合后进行生物素标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到生物素标记的鼠抗人HCG抗体；
将得到的生物素标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液稀释浓度；
S4分装试剂：将制备好的所述试剂R1、所述试剂R3和所述试剂R4进行分装，于2-8℃避光存储；
所述β-人绒毛膜***检测试剂盒还包括有校准品和质控品。
7.根据权利要求6所述的β-人绒毛膜***检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1中，磁珠稀释液包含Tris作为缓冲剂，BSA作为封闭剂和Proclin 300作为防腐剂；在所述步骤S2中，稀释液包括二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠作为缓冲剂，BSA、酪蛋白作为封闭剂，Proclin 300作为防腐剂，Tween-20作为表面活性剂；在所述步骤S3中，稀释液的主要成分为MES。
8.根据权利要求6所述的β-人绒毛膜***检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2和所述步骤S3中，均采用Zeba脱盐离心柱进行离心脱盐纯化；在所述步骤S2中，进行标记时，是在37℃反应90分钟进行标记；在所述步骤S3中，进行标记时，是在37℃反应60分钟进行标记。
9.根据权利要求6-8任一项所述的β-人绒毛膜***检测试剂盒的制备方法，其特征在于，还包括有步骤S5贴标：将射频卡粘贴在试剂盒上，再将标签覆盖与所述射频卡之上；所述射频卡含有试剂批号、盒号、使用期限、项目代码、项目名称和试剂规格信息。
10.根据权利要求6-8任一项所述的β-人绒毛膜***检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1中，链霉亲和素包被的磁性微粒用磁珠稀释液稀释至2.5g/L的浓度；在所述步骤S2中，每株鼠抗人HCG抗体与吖啶酯的摩尔比为1:10，将得到的一株针对HCG抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液配成0.15mg/L的浓度；在所述步骤S3中，将鼠抗人HCG抗体用缓冲液稀释至0.78mg/L的浓度，鼠抗人HCG抗体与生物素的摩尔比为1:10，将得到的生物素标记的鼠抗人HCG抗体用稀释液配成0.78mg/L的浓度。
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