CN113999866B - 一种高密度展示的噬菌粒载体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,涉及一种高密度展示的噬菌粒载体,包括所述载体在随机多肽文库构建中的应用。本发明通过分子克隆技术,基于pIII展示的噬菌粒pComb3xss,构建了可用于高密度展示外源蛋白的噬菌粒载体pComb‑pVIII。该载体将外源蛋白展示于丝状噬菌体pVIII蛋白N端,通过柔性连接臂GGGSS将二者连接,由乳糖启动子和操纵子调控下游外源蛋白基因的表达。该载体引入了无法切割随机多肽编码序列的限制性核酸酶切位点,避免了随机多肽库多样性的丢失。本发明还涉及该噬菌粒载体在随机多肽文库构建中的应用。基于该噬菌粒构建的噬菌体展示随机多肽库,具有空载率低、库容量大、展示密度高等优点,在具有生物功能的多肽的筛选方面具有良好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种高密度展示的噬菌粒载体,包括所述载体在噬菌体展示随机多肽库构建中的应用。
背景技术
噬菌体展示技术(Phage Display Technology)由Smith于1985年发明,原理是在不影响噬菌体正常功能的情况下,将外源蛋白基因***于丝状噬菌体外壳蛋白基因,从而使外源蛋白在丝状噬菌体外壳蛋白上表达。丝状噬菌体遗传信息明确、基因组简单,易于通过常规分子克隆技术进行改造,可便捷的构建大容量的噬菌体展示外源蛋白库。
丝状噬菌体包含五种外壳蛋白,常用于外源蛋白展示的是pVIII和pIII蛋白。pVIII蛋白共50个氨基酸,约2700个拷贝,为噬菌体外壳的主要组成蛋白,可用于高密度展示外源蛋白;pIII蛋白共406个氨基酸,有5个拷贝,位于噬菌体一端,负责噬菌体对大肠杆菌的侵染,可用于低密度展示外源蛋白。高密度展示与低密度展示的区别在于,低密度展示易于筛选到高亲和力的配体,而高密度展示则在筛选获得概率低的配体时更有优势。根据所用载体类型的不同,噬菌体展示技术可分为噬菌体展示***和噬菌粒展示***。噬菌体载体在组装过程中,外壳蛋白完全由外源蛋白-外壳蛋白嵌合蛋白构成,这种展示模式可能会对噬菌体的侵染或组装能力产生较大的影响;而噬菌粒载体在组装过程中,外壳蛋白由外源蛋白-外壳蛋白嵌合蛋白和辅助噬菌体提供的外壳蛋白共同组成,用pIII蛋白进行展示时,会展示1-5个拷贝的外源蛋白,用pVIII蛋白进行展示,则会展示几十至几百个拷贝的外源蛋白(取决于嵌合蛋白的表达水平),可避免噬菌体载体的缺陷。
基于噬菌体展示的随机多肽文库在具有生物功能的多肽的筛选、蛋白/配体相互作用分析等方面有着广泛的应用。随机多肽文库通常由含5-20个氨基酸的随机多肽构成,每个氨基酸由简并密码子NNK编码(N代表脱氧核苷酸A、T、C或G;K代表T或G),可为20种天然氨基酸的任意一种,并最大程度减少终止码子的出现。连续的NNK序列能够被大量限制性核酸内切酶切割,从而导致大量随机多肽序列在多肽文库构建时因酶切而丢失,降低了多肽文库的理论库容量,影响功能多肽的获得。目前,国内外已报道和商业化的噬菌体展示***(噬菌粒或噬菌体载体)的克隆位点(限制性内切酶位点)多含有NNK序列特征。因此,构建含有无NNK序列特征克隆位点的高密度展示的噬菌粒载体,对保障多肽库的理论多样性(库容量),提高功能多肽的淘选成功率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种不含NNK序列特征克隆位点、能够用于高密度展示多肽的噬菌粒载体,及相关载体在随机多肽文库构建中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现:
(1)通过合成寡核苷酸链、退火延伸的方式,合成含噬菌体pVIII蛋白信号肽及KpnI酶切位点的基因片段1,通过Sac I和Mfe I酶切位点,***pComb3xss中,替换原本的Omp A信号肽(命名为pComb-1);
(2)通过合成寡核苷酸链、退火延伸的方式,合成含噬菌体pVIII蛋白及Xho I酶切位点的基因片段2,通过Spe I和Afl II酶切位点,***pComb-1中,替换原本的噬菌体pIII蛋白(命名为pComb-pVIII);
(3)通过合成寡核苷酸链、退火延伸的方式,合成含Kpn I和Xho I酶切位点、随机多肽编码序列(NNK)的双链片段,通过Kpn I和Xho I酶切位点,***构建的pComb-pVIII噬菌粒中;
(4)通过电转化的方式,将含随机多肽基因的噬菌粒转入ER 2738大肠杆菌中,在辅助噬菌体M13KO7的协助下,扩增为噬菌体展示随机多肽文库。
本发明所述的噬菌粒载体可用于构建噬菌体展示随机多肽文库,所构建文库可用于具有生物功能的多肽的筛选。
本发明具有以下有益效果:(1)噬菌粒所用的Kpn I和Xho I酶切位点不识别编码随机多肽的核苷酸序列(NNK),从而避免了随机多肽多样性理论上的丢失;(2)酶切位点间较大的间隔片段(1686bp)使酶切和未酶切的噬菌粒易于辨别,降低了转化子出现空载的概率;(3)连接后较小的基因组(~2920bp)确保了高的电转化效率;(4)噬菌粒通过乳糖启动子和操纵子来调控下游外源蛋白基因的表达,降低了大肠杆菌表达不同多肽的遗传偏好性,同时诱导外源蛋白的高水平表达;(5)通过基于pVIII蛋白的高密度展示,可提高获得目的蛋白的成功率。
附图说明
图1是噬菌粒的基因图谱,A是pComb3xss,B是pComb-pVIII;
图2是pComb-pVIII噬菌粒构建过程中的电泳图,A是pComb3xss,B是pComb-1;
图3是噬菌体展示随机环状8、9、10肽库构建过程中的电泳图,A是pComb-pVIII,B-D分别是随机环状8、9、10肽基因;
图4 A-C分别是噬菌体展示随机环状8、9、10肽库构建后菌落PCR的电泳图。
具体实施方式
本发明实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下:
主要实验材料:
pComb3xss噬菌粒由Dr.Barbas(The Scripps Research Institute,La Jolla,CA,US)赠送。
主要试剂:
Sac I、Mfe I、Spe I、Afl II、Kpn I、Xho I、T4 DNA连接酶、10mM dNTPs、DNA聚合酶I(Klenow)大片段、辅助噬菌体M13KO7(英国NEB公司)、Taq DNA聚合酶、DL 5,000 DNAMarker、DNA片段纯化试剂盒(日本Takara公司)、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(美国Omega公司)、ER 2738电感受态细胞(美国Lucigen公司)、聚乙二醇8000(PEG)(美国Amresco公司)、酵母提取物、胰蛋白胨(美国Thermo Fisher公司)、D-(+)-葡萄糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、氨苄盐酸盐、卡那霉素、四环素(美国Sigma公司)
主要试剂配方:
1、LB培养基:每升含10g胰蛋白胨,5g酵母提取物,5g NaCl。高压灭菌,室温贮存;
2、SB培养基:每升含32g胰蛋白胨,20g酵母提取物,5g NaCl。高压灭菌,室温贮存;
3、四环素贮液(Tet):以20mg/mL的浓度溶于50%乙醇中,-20℃避光贮存;
4、氨苄贮存液(Amp):以100mg/mL的浓度溶于灭菌ddH2O中,过0.22μm滤膜,-20℃贮存;
5、卡那霉素贮存液(Kan):以10mg/mL的浓度溶于灭菌ddH2O中,过0.22μm滤膜,-20℃贮存;
6、PEG/NaCl:20%(w/v)PEG-8000,2.5M NaCl,高压灭菌,室温贮存;
7、TE buffer:10mM Tris-HCl,1mM EDTA,调pH至8.0,室温贮存。
实施例一:pComb-pVIII噬菌粒的构建
通过寡核苷酸链退火延伸的方法,使用引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2合成含Kpn I酶切位点的M13噬菌体pVIII信号肽基因(片段1),使用引物SEQ ID NO 3和SEQ ID NO4合成含Xho I酶切位点的M13噬菌体pVIII蛋白基因(片段2),依次***pComb3xss噬菌粒(基因图谱见图1-A)中,构建pComb-pVIII噬菌粒(基因图谱见图1-B)。引物序列见表1。
表1 pComb-pVIII噬菌粒构建所用引物
1、电转化
(1)从-80℃冰箱取出制备的ER2738电感受态,-20℃冰箱取出提取预冷的0.1cm电击杯,立即插在冰上,等待5min使感受态融化,提前设置电转仪条件为1.8KV,4ms;
(2)在超净台中将要转化的DNA缓慢加入已化冻的ER2728电感受态中,轻轻搅动混匀;
(3)将与连接产物混匀后的感受态缓慢加入电击杯中,进行电击;
(4)电击结束后,立即加入950μL 37℃预热的SOC培养基,于37℃摇床中250rpm复苏1h。
2、含Kpn I酶切位点的pVIII信号肽基因的合成、***
(1)退火:
反应体系共50μL,95℃孵育20min,然后缓慢退火至室温。
(2)延伸:
反应体系共200μL,分装于4个200μL离心管中,50μL/管,25℃延伸15min,75℃孵育20min灭活Klenow片段,DNA片段纯化试剂盒按说明书步骤纯化延伸产物,Nanodrop One紫外分光光度计测定DNA浓度。
(3)片段1的酶切:
反应体系共100μL,混匀后分装于2个200μL离心管中,50μL/管,37℃反应1h,DNA片段纯化试剂盒纯化酶切产物。
(4)pComb3xss的酶切:
反应体系共250μL,混匀后分装于5个200μL离心管中,50μL/管,37℃反应1h,1%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段,胶回收试剂盒回收酶切后载体片段(电泳结果见图2-A)。
(5)酶切后片段1与pComb3xss载体的连接:
反应体系共10μL,于16℃过夜连接,然后65℃ 15min灭活T4 DNA连接酶,DNA片段纯化试剂盒纯化连接产物,Nanodrop One紫外分光光度计测定DNA浓度。
(6)电转化:
取2μL纯化后连接产物,按步骤1进行电转化。复苏结束后,取100μL菌液,用LB培养液稀释适当倍数后,涂布于LB-Amp固体培养基上,37℃培养12h,挑单克隆,于3mL LB-Amp培养液中过夜培养,收集菌液,用质粒提取试剂盒按说明书步骤提取噬菌粒,Nanodrop One紫外分光光度计测定DNA浓度,并对噬菌粒测序。将第一步改造后噬菌粒命名为pComb-1。
3、含Xho I酶切位点的pVIII蛋白基因的合成、***
(1)退火:所用引物为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4,体系、步骤与2(2)相同;
(2)延伸:体系、步骤与2(2)相同;
(3)片段2的酶切:所用限制性内切酶为Spe I和Afl II,体系、步骤与2(3)相同;
(4)pComb-1噬菌粒的酶切:所用限制性内切酶为Spe I和Afl II,体系、步骤与2(4)相同(电泳结果见图2-B);
(5)酶切后片段2与pComb-1噬菌粒的连接:体系、步骤与2(5)相同;将连接后噬菌粒命名为pComb-pVIII(SEQ ID NO 5);
(6)电转化:步骤与2(6)相同
实施例二:噬菌体展示随机环状8、9、10肽库的构建
通过寡核苷酸链退火延伸的方法,使用引物SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7~9分别合成由NNK编码的随机8、9、10肽基因,由Xho I和Kpn I酶切后***pComb-pVIII噬菌粒,使随机多肽序列位于噬菌体pVIII蛋白N端与其信号肽之间。所用引物见表2,具体步骤如下:
表2噬菌体展示随机环状8、9、10肽库构建过程中所用引物
1、随机环状8、9、10肽基因的合成、***
(1)退火
反应体系共50μL,95℃孵育20min,缓慢退火至室温。
(2)延伸:体系、步骤与实施例一2(2)相同
(3)随机环状8、9、10肽基因的酶切:所用限制性内切酶为Kpn I和Xho I,体系、步骤与实施例一2(3)相同。酶切结束后,取1μL延伸及酶切产物进行8%非聚丙烯酰胺凝胶电泳,验证酶切效率(电泳结果见图3-B-D)。
(4)pComb-pVIII的酶切:
反应体系共1mL,混匀后分装于200μL离心管中,50μL/管,37℃孵育1h,通过0.7%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段(结果见图3-A),胶回收试剂盒回收酶切后片段。
(5)在正式建库前,对酶切后随机环状8、9、10肽基因与噬菌粒最佳连接比例进行优化。设置酶切后随机环状8、9、10肽基因与噬菌粒摩尔比分别为1∶1、1∶3、1∶5的三个处理、1个不加***片段的处理(CK)进行连接反应,反应体系、步骤与实施例一2(5)相同。连接结束后,取2μL纯化后连接产物按步骤1进行电转。复苏结束后,用LB培养液稀释适当倍数,取100μL涂LB-Amp平板,37℃培养12h,计算平板上菌落数,根据以下公式计算转化率:转化率(cfu/μg)=(10×稀释倍数×菌落数)/DNA质量。实验结果如表3所示,选择转化率最高的连接比例(1∶3)进行后续实验。
表3测试连接结果
(6)酶切后随机环状8、9、10肽基因和pComb-pVIII的连接:
反应体系共846μL,充分混匀后分装于200μL离心管中,20μL/管,16℃孵育12h,65℃孵育15min灭活T4 DNA连接酶,DNA片段纯化试剂盒纯化连接产物,Nanodrop One紫外分光光度计测定DNA浓度。
(7)电转化:按实施例一步骤1方法,将纯化后连接产物按50ng/次电转化入ER2738电感受态细胞中,按实施例二步骤1(5)方法,计算噬菌体展示随机环状8、9、10肽库的转化率和库容量,结果如表4所示。
表4噬菌体展示随机环状8、9、10肽库的转化率和库容量
2、噬菌体库的扩增
将上步所有菌液混匀后,按1∶40的比例等量加入4个含400mL SB-Amp(50μg/mL)-Tet(20μg/mL)-葡萄糖(20mM)培养液的锥形瓶中,37℃ 250rpm振荡培养至OD600=0.5,加入辅助噬菌体M13KO7,使侵染复数(辅助噬菌体数/大肠杆菌数)>20,37℃静置侵染1h后,将菌液6000g 4℃离心15min,弃上清,将沉淀重悬后等量加入4个含400mL SB-Kan(50μg/mL)-Amp(50μg/mL)-IPTG(0.1mM)培养液的锥形瓶中,37℃ 250rpm振荡培养12h后,将菌液14000g 4℃离心15min,上清倒入新的250mL离心管中,加入1/4体积的20%PEG/2.5M NaCl,4℃静置大于4h,使噬菌体充分沉淀,14000g 4℃离心30min,弃上清,每个离心管中沉淀用400μL灭菌PBS重悬,合并混匀后分装为400μL每管,加入等体积的甘油、混匀,按实施例二步骤3测定滴度后,于-80℃保存,即为pVIII展示噬菌体展示随机环状8、9、10肽库,其滴度分别为2.6×1013、4.5×1013和1.0×1014pfu/mL。
3、噬菌体滴度的测定
(1)从-80℃取出保存的ER 2738大肠杆菌,待其化冻后,用接种环蘸取菌液,于LB/Amp(50μg/mL)平板上画线,37℃培养过夜培养;
(2)用接种环挑取单菌落于3mL LB-Amp(50μg/mL)培养液中,37℃ 250rpm振荡培养至OD600=0.5;
(3)将用于滴度测定的噬菌体用LB培养液稀释适当倍数后,取10μL,加入100μL步骤(2)的ER2738大肠杆菌中,37℃静置30min,将菌液涂布于LB-Amp平板上,37℃培养12h,计算平板上菌落数,根据以下公式计算噬菌体滴度:噬菌体滴度(pfu/mL)=100×稀释倍数×菌落数
4.电转结束后,对噬菌体展示随机环状八、九、十肽库分别挑取24个单菌落进行菌落PCR。菌落PCR所用引物SEQ ID NO 10和11如表5所示,体系如下:
表5菌粒PCR所用引物
按比例配制好反应体系后,分装于200μL离心管中,将离心管置于冰上,用灭菌牙签蘸取单菌落后,在离心管中轻轻搅动,然后放于PCR仪上进行扩增,共进行35个循环,反应条件如下:
PCR反应结束后,取5μLPCR产物,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小,判断空载率。由上游、下游引物与载体结合的位置可推断出:若载体为空载,则菌落PCR片段为2085bp;若载体与***片段连接成功,则菌落PCR片段为467bp。实验结果如图4,归功于pComb-pVIII噬菌粒酶切位点间较大的间隔片段(1686bp),所构建噬菌体展示随机多肽库不存在空载现象。
本发明所建立的噬菌体展示***通过Xho I和Kpn I两个无法识别NNK的酶切位点,将外源蛋白高密度的展示于噬菌体pVIII蛋白上,避免了随机多肽多样性理论上的丢失,同时克服了基于噬菌体载体的pVIII展示***对噬菌体组装效率的影响。所构建的噬菌体随机环状多肽文库不存在空载现象,转化率高、库容量大、展示密度高,具有良好的实际应用价值。
Claims (2)
1.一种噬菌粒载体pComb-pVIII,其DNA序列如SEQ ID NO 5所示。
2.权利要求1所述的噬菌粒载体pComb-pVIII在构建噬菌体展示随机多肽库中的应用。
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GR01 | Patent grant | ||
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