CN113999866B - 一种高密度展示的噬菌粒载体及其用途 - Google Patents

一种高密度展示的噬菌粒载体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种高密度展示的噬菌粒载体，包括所述载体在随机多肽文库构建中的应用。本发明通过分子克隆技术，基于pIII展示的噬菌粒pComb3xss，构建了可用于高密度展示外源蛋白的噬菌粒载体pComb‑pVIII。该载体将外源蛋白展示于丝状噬菌体pVIII蛋白N端，通过柔性连接臂GGGSS将二者连接，由乳糖启动子和操纵子调控下游外源蛋白基因的表达。该载体引入了无法切割随机多肽编码序列的限制性核酸酶切位点，避免了随机多肽库多样性的丢失。本发明还涉及该噬菌粒载体在随机多肽文库构建中的应用。基于该噬菌粒构建的噬菌体展示随机多肽库，具有空载率低、库容量大、展示密度高等优点，在具有生物功能的多肽的筛选方面具有良好的应用价值。

Description

一种高密度展示的噬菌粒载体及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种高密度展示的噬菌粒载体，包括所述载体在噬菌体展示随机多肽库构建中的应用。
背景技术
噬菌体展示技术(Phage Display Technology)由Smith于1985年发明，原理是在不影响噬菌体正常功能的情况下，将外源蛋白基因***于丝状噬菌体外壳蛋白基因，从而使外源蛋白在丝状噬菌体外壳蛋白上表达。丝状噬菌体遗传信息明确、基因组简单，易于通过常规分子克隆技术进行改造，可便捷的构建大容量的噬菌体展示外源蛋白库。
丝状噬菌体包含五种外壳蛋白，常用于外源蛋白展示的是pVIII和pIII蛋白。pVIII蛋白共50个氨基酸，约2700个拷贝，为噬菌体外壳的主要组成蛋白，可用于高密度展示外源蛋白；pIII蛋白共406个氨基酸，有5个拷贝，位于噬菌体一端，负责噬菌体对大肠杆菌的侵染，可用于低密度展示外源蛋白。高密度展示与低密度展示的区别在于，低密度展示易于筛选到高亲和力的配体，而高密度展示则在筛选获得概率低的配体时更有优势。根据所用载体类型的不同，噬菌体展示技术可分为噬菌体展示***和噬菌粒展示***。噬菌体载体在组装过程中，外壳蛋白完全由外源蛋白-外壳蛋白嵌合蛋白构成，这种展示模式可能会对噬菌体的侵染或组装能力产生较大的影响；而噬菌粒载体在组装过程中，外壳蛋白由外源蛋白-外壳蛋白嵌合蛋白和辅助噬菌体提供的外壳蛋白共同组成，用pIII蛋白进行展示时，会展示1-5个拷贝的外源蛋白，用pVIII蛋白进行展示，则会展示几十至几百个拷贝的外源蛋白(取决于嵌合蛋白的表达水平)，可避免噬菌体载体的缺陷。
基于噬菌体展示的随机多肽文库在具有生物功能的多肽的筛选、蛋白/配体相互作用分析等方面有着广泛的应用。随机多肽文库通常由含5-20个氨基酸的随机多肽构成，每个氨基酸由简并密码子NNK编码(N代表脱氧核苷酸A、T、C或G；K代表T或G)，可为20种天然氨基酸的任意一种，并最大程度减少终止码子的出现。连续的NNK序列能够被大量限制性核酸内切酶切割，从而导致大量随机多肽序列在多肽文库构建时因酶切而丢失，降低了多肽文库的理论库容量，影响功能多肽的获得。目前，国内外已报道和商业化的噬菌体展示***(噬菌粒或噬菌体载体)的克隆位点(限制性内切酶位点)多含有NNK序列特征。因此，构建含有无NNK序列特征克隆位点的高密度展示的噬菌粒载体，对保障多肽库的理论多样性(库容量)，提高功能多肽的淘选成功率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种不含NNK序列特征克隆位点、能够用于高密度展示多肽的噬菌粒载体，及相关载体在随机多肽文库构建中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
(1)通过合成寡核苷酸链、退火延伸的方式，合成含噬菌体pVIII蛋白信号肽及KpnI酶切位点的基因片段1，通过Sac I和Mfe I酶切位点，***pComb3xss中，替换原本的Omp A信号肽(命名为pComb-1)；
(2)通过合成寡核苷酸链、退火延伸的方式，合成含噬菌体pVIII蛋白及Xho I酶切位点的基因片段2，通过Spe I和Afl II酶切位点，***pComb-1中，替换原本的噬菌体pIII蛋白(命名为pComb-pVIII)；
(3)通过合成寡核苷酸链、退火延伸的方式，合成含Kpn I和Xho I酶切位点、随机多肽编码序列(NNK)的双链片段，通过Kpn I和Xho I酶切位点，***构建的pComb-pVIII噬菌粒中；
(4)通过电转化的方式，将含随机多肽基因的噬菌粒转入ER 2738大肠杆菌中，在辅助噬菌体M13KO7的协助下，扩增为噬菌体展示随机多肽文库。
本发明所述的噬菌粒载体可用于构建噬菌体展示随机多肽文库，所构建文库可用于具有生物功能的多肽的筛选。
本发明具有以下有益效果：(1)噬菌粒所用的Kpn I和Xho I酶切位点不识别编码随机多肽的核苷酸序列(NNK)，从而避免了随机多肽多样性理论上的丢失；(2)酶切位点间较大的间隔片段(1686bp)使酶切和未酶切的噬菌粒易于辨别，降低了转化子出现空载的概率；(3)连接后较小的基因组(～2920bp)确保了高的电转化效率；(4)噬菌粒通过乳糖启动子和操纵子来调控下游外源蛋白基因的表达，降低了大肠杆菌表达不同多肽的遗传偏好性，同时诱导外源蛋白的高水平表达；(5)通过基于pVIII蛋白的高密度展示，可提高获得目的蛋白的成功率。
附图说明
图1是噬菌粒的基因图谱，A是pComb3xss，B是pComb-pVIII；
图2是pComb-pVIII噬菌粒构建过程中的电泳图，A是pComb3xss，B是pComb-1；
图3是噬菌体展示随机环状8、9、10肽库构建过程中的电泳图，A是pComb-pVIII，B-D分别是随机环状8、9、10肽基因；
图4 A-C分别是噬菌体展示随机环状8、9、10肽库构建后菌落PCR的电泳图。
具体实施方式
本发明实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：
主要实验材料：
pComb3xss噬菌粒由Dr.Barbas(The Scripps Research Institute，La Jolla，CA，US)赠送。
主要试剂：
Sac I、Mfe I、Spe I、Afl II、Kpn I、Xho I、T4 DNA连接酶、10mM dNTPs、DNA聚合酶I(Klenow)大片段、辅助噬菌体M13KO7(英国NEB公司)、Taq DNA聚合酶、DL 5,000 DNAMarker、DNA片段纯化试剂盒(日本Takara公司)、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(美国Omega公司)、ER 2738电感受态细胞(美国Lucigen公司)、聚乙二醇8000(PEG)(美国Amresco公司)、酵母提取物、胰蛋白胨(美国Thermo Fisher公司)、D-(+)-葡萄糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、氨苄盐酸盐、卡那霉素、四环素(美国Sigma公司)
主要试剂配方：
1、LB培养基：每升含10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl。高压灭菌，室温贮存；
2、SB培养基：每升含32g胰蛋白胨，20g酵母提取物，5g NaCl。高压灭菌，室温贮存；
3、四环素贮液(Tet)：以20mg/mL的浓度溶于50％乙醇中，-20℃避光贮存；
4、氨苄贮存液(Amp)：以100mg/mL的浓度溶于灭菌ddH2O中，过0.22μm滤膜，-20℃贮存；
5、卡那霉素贮存液(Kan)：以10mg/mL的浓度溶于灭菌ddH2O中，过0.22μm滤膜，-20℃贮存；
6、PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5M NaCl，高压灭菌，室温贮存；
7、TE buffer：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH至8.0，室温贮存。
实施例一：pComb-pVIII噬菌粒的构建
通过寡核苷酸链退火延伸的方法，使用引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2合成含Kpn I酶切位点的M13噬菌体pVIII信号肽基因(片段1)，使用引物SEQ ID NO 3和SEQ ID NO4合成含Xho I酶切位点的M13噬菌体pVIII蛋白基因(片段2)，依次***pComb3xss噬菌粒(基因图谱见图1-A)中，构建pComb-pVIII噬菌粒(基因图谱见图1-B)。引物序列见表1。
表1 pComb-pVIII噬菌粒构建所用引物
1、电转化
(1)从-80℃冰箱取出制备的ER2738电感受态，-20℃冰箱取出提取预冷的0.1cm电击杯，立即插在冰上，等待5min使感受态融化，提前设置电转仪条件为1.8KV，4ms；
(2)在超净台中将要转化的DNA缓慢加入已化冻的ER2728电感受态中，轻轻搅动混匀；
(3)将与连接产物混匀后的感受态缓慢加入电击杯中，进行电击；
(4)电击结束后，立即加入950μL 37℃预热的SOC培养基，于37℃摇床中250rpm复苏1h。
2、含Kpn I酶切位点的pVIII信号肽基因的合成、***
(1)退火：
反应体系共50μL，95℃孵育20min，然后缓慢退火至室温。
(2)延伸：
反应体系共200μL，分装于4个200μL离心管中，50μL/管，25℃延伸15min，75℃孵育20min灭活Klenow片段，DNA片段纯化试剂盒按说明书步骤纯化延伸产物，Nanodrop One紫外分光光度计测定DNA浓度。
(3)片段1的酶切：
反应体系共100μL，混匀后分装于2个200μL离心管中，50μL/管，37℃反应1h，DNA片段纯化试剂盒纯化酶切产物。
(4)pComb3xss的酶切：
反应体系共250μL，混匀后分装于5个200μL离心管中，50μL/管，37℃反应1h，1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，胶回收试剂盒回收酶切后载体片段(电泳结果见图2-A)。
(5)酶切后片段1与pComb3xss载体的连接：
反应体系共10μL，于16℃过夜连接，然后65℃ 15min灭活T4 DNA连接酶，DNA片段纯化试剂盒纯化连接产物，Nanodrop One紫外分光光度计测定DNA浓度。
(6)电转化：
取2μL纯化后连接产物，按步骤1进行电转化。复苏结束后，取100μL菌液，用LB培养液稀释适当倍数后，涂布于LB-Amp固体培养基上，37℃培养12h，挑单克隆，于3mL LB-Amp培养液中过夜培养，收集菌液，用质粒提取试剂盒按说明书步骤提取噬菌粒，Nanodrop One紫外分光光度计测定DNA浓度，并对噬菌粒测序。将第一步改造后噬菌粒命名为pComb-1。
3、含Xho I酶切位点的pVIII蛋白基因的合成、***
(1)退火：所用引物为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4，体系、步骤与2(2)相同；
(2)延伸：体系、步骤与2(2)相同；
(3)片段2的酶切：所用限制性内切酶为Spe I和Afl II，体系、步骤与2(3)相同；
(4)pComb-1噬菌粒的酶切：所用限制性内切酶为Spe I和Afl II，体系、步骤与2(4)相同(电泳结果见图2-B)；
(5)酶切后片段2与pComb-1噬菌粒的连接：体系、步骤与2(5)相同；将连接后噬菌粒命名为pComb-pVIII(SEQ ID NO 5)；
(6)电转化：步骤与2(6)相同
实施例二：噬菌体展示随机环状8、9、10肽库的构建
通过寡核苷酸链退火延伸的方法，使用引物SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7～9分别合成由NNK编码的随机8、9、10肽基因，由Xho I和Kpn I酶切后***pComb-pVIII噬菌粒，使随机多肽序列位于噬菌体pVIII蛋白N端与其信号肽之间。所用引物见表2，具体步骤如下：
表2噬菌体展示随机环状8、9、10肽库构建过程中所用引物
1、随机环状8、9、10肽基因的合成、***
(1)退火
反应体系共50μL，95℃孵育20min，缓慢退火至室温。
(2)延伸：体系、步骤与实施例一2(2)相同
(3)随机环状8、9、10肽基因的酶切：所用限制性内切酶为Kpn I和Xho I，体系、步骤与实施例一2(3)相同。酶切结束后，取1μL延伸及酶切产物进行8％非聚丙烯酰胺凝胶电泳，验证酶切效率(电泳结果见图3-B-D)。
(4)pComb-pVIII的酶切：
反应体系共1mL，混匀后分装于200μL离心管中，50μL/管，37℃孵育1h，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段(结果见图3-A)，胶回收试剂盒回收酶切后片段。
(5)在正式建库前，对酶切后随机环状8、9、10肽基因与噬菌粒最佳连接比例进行优化。设置酶切后随机环状8、9、10肽基因与噬菌粒摩尔比分别为1∶1、1∶3、1∶5的三个处理、1个不加***片段的处理(CK)进行连接反应，反应体系、步骤与实施例一2(5)相同。连接结束后，取2μL纯化后连接产物按步骤1进行电转。复苏结束后，用LB培养液稀释适当倍数，取100μL涂LB-Amp平板，37℃培养12h，计算平板上菌落数，根据以下公式计算转化率：转化率(cfu/μg)＝(10×稀释倍数×菌落数)/DNA质量。实验结果如表3所示，选择转化率最高的连接比例(1∶3)进行后续实验。
表3测试连接结果
(6)酶切后随机环状8、9、10肽基因和pComb-pVIII的连接：
反应体系共846μL，充分混匀后分装于200μL离心管中，20μL/管，16℃孵育12h，65℃孵育15min灭活T4 DNA连接酶，DNA片段纯化试剂盒纯化连接产物，Nanodrop One紫外分光光度计测定DNA浓度。
(7)电转化：按实施例一步骤1方法，将纯化后连接产物按50ng/次电转化入ER2738电感受态细胞中，按实施例二步骤1(5)方法，计算噬菌体展示随机环状8、9、10肽库的转化率和库容量，结果如表4所示。
表4噬菌体展示随机环状8、9、10肽库的转化率和库容量
2、噬菌体库的扩增
将上步所有菌液混匀后，按1∶40的比例等量加入4个含400mL SB-Amp(50μg/mL)-Tet(20μg/mL)-葡萄糖(20mM)培养液的锥形瓶中，37℃ 250rpm振荡培养至OD600＝0.5，加入辅助噬菌体M13KO7，使侵染复数(辅助噬菌体数/大肠杆菌数)＞20，37℃静置侵染1h后，将菌液6000g 4℃离心15min，弃上清，将沉淀重悬后等量加入4个含400mL SB-Kan(50μg/mL)-Amp(50μg/mL)-IPTG(0.1mM)培养液的锥形瓶中，37℃ 250rpm振荡培养12h后，将菌液14000g 4℃离心15min，上清倒入新的250mL离心管中，加入1/4体积的20％PEG/2.5M NaCl，4℃静置大于4h，使噬菌体充分沉淀，14000g 4℃离心30min，弃上清，每个离心管中沉淀用400μL灭菌PBS重悬，合并混匀后分装为400μL每管，加入等体积的甘油、混匀，按实施例二步骤3测定滴度后，于-80℃保存，即为pVIII展示噬菌体展示随机环状8、9、10肽库，其滴度分别为2.6×1013、4.5×1013和1.0×1014pfu/mL。
3、噬菌体滴度的测定
(1)从-80℃取出保存的ER 2738大肠杆菌，待其化冻后，用接种环蘸取菌液，于LB/Amp(50μg/mL)平板上画线，37℃培养过夜培养；
(2)用接种环挑取单菌落于3mL LB-Amp(50μg/mL)培养液中，37℃ 250rpm振荡培养至OD600＝0.5；
(3)将用于滴度测定的噬菌体用LB培养液稀释适当倍数后，取10μL，加入100μL步骤(2)的ER2738大肠杆菌中，37℃静置30min，将菌液涂布于LB-Amp平板上，37℃培养12h，计算平板上菌落数，根据以下公式计算噬菌体滴度：噬菌体滴度(pfu/mL)＝100×稀释倍数×菌落数
4.电转结束后，对噬菌体展示随机环状八、九、十肽库分别挑取24个单菌落进行菌落PCR。菌落PCR所用引物SEQ ID NO 10和11如表5所示，体系如下：
表5菌粒PCR所用引物
按比例配制好反应体系后，分装于200μL离心管中，将离心管置于冰上，用灭菌牙签蘸取单菌落后，在离心管中轻轻搅动，然后放于PCR仪上进行扩增，共进行35个循环，反应条件如下：
PCR反应结束后，取5μLPCR产物，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小，判断空载率。由上游、下游引物与载体结合的位置可推断出：若载体为空载，则菌落PCR片段为2085bp；若载体与***片段连接成功，则菌落PCR片段为467bp。实验结果如图4，归功于pComb-pVIII噬菌粒酶切位点间较大的间隔片段(1686bp)，所构建噬菌体展示随机多肽库不存在空载现象。
本发明所建立的噬菌体展示***通过Xho I和Kpn I两个无法识别NNK的酶切位点，将外源蛋白高密度的展示于噬菌体pVIII蛋白上，避免了随机多肽多样性理论上的丢失，同时克服了基于噬菌体载体的pVIII展示***对噬菌体组装效率的影响。所构建的噬菌体随机环状多肽文库不存在空载现象，转化率高、库容量大、展示密度高，具有良好的实际应用价值。

Claims (2)

1.一种噬菌粒载体pComb-pVIII，其DNA序列如SEQ ID NO 5所示。
2.权利要求1所述的噬菌粒载体pComb-pVIII在构建噬菌体展示随机多肽库中的应用。
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