CN113999833A - 毛霉发酵产蛋白酶的培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种毛霉发酵产蛋白酶的培养基，包括基础组分和添加剂，基础组分包括第一榆黄蘑、麸皮和水组成，第一榆黄蘑与麸皮的质量比为(4.5～5.5):(9.5～10.5)，添加剂包括外加碳源、外加氮源和外加微量元素化合物，外加碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的一种或多种，外加氮源选自第二榆黄蘑、豆粕、酵母抽提物和蛋白胨中的一种或多种，微量元素选自钙、锌、镁和钠中的一种或多种。本发明还公开了一种毛霉发酵产蛋白酶的方法，将毛霉在上述实施例的毛霉发酵产蛋白酶的培养基中进行发酵。本发明还公开了上述的方法得到的蛋白酶。本发明还公开了一种催化蛋白质水解的方法，包括使用上述蛋白酶对蛋白质进行水解。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，具体涉及一种毛霉发酵产蛋白酶的培养基及其应用。
背景技术
蛋白酶(Protease)广泛存在于动植物及微生物中，是一类催化蛋白质水解生成多肽和氨基酸的酶，在生物体中执行着不同的生理功能和代谢活性。蛋白酶在工业上有着广泛而巨大的应用，据统计，在所有工业用酶制剂中，蛋白水解酶所占的比例大约为75％。目前商业上所生产的蛋白酶来源主要有动物、植物以及微生物。但是受到资源缺乏和分离提纯技术成本高的限制，使得动植物蛋白酶的制备均面临难于大规模生产的难题。微生物由于生长速度快、可巧性强、所需空间和时间少，且具有生化多样性等特点备受关注。微生物源蛋白酶是目前工业生产中最主要的蛋白酶，大约占全世界酶制剂总量的40％。
部分商用的中性和碱性蛋白酶来源于细菌，而真菌来源的蛋白酶种类更多，包括酸性、中性和碱性蛋白酶。许多真菌如青霉菌、曲霉菌和酵母等都能产生胞外蛋白酶。真菌蛋白酶更容易通过固态发酵而获得，相对于其他微生物，真菌具有如下的优点：大部分是被公认的安全物质(GRAS)，且产生的蛋白酶以胞外酶为主，容易从发酵产物中分离提纯。米曲霉(Aspergillus oryzae)是传统植物发酵使用的最主要菌种。但其在制备植物多肽的过程中往往会产生一些苦味，含量极少的苦味就能对多肽产品的味道造成严重的负面影响，降低消费者对产品的满意度，是推广植物多肽应用时是一个亟待解决的问题。
毛霉(Hair mould)又称黑霉、长毛霉，常见种类有大毛霉和微小毛霉，广泛分布于酒曲、植物残体、腐败有机物和土壤中。毛霉可以合成并分泌多种胞外蛋白酶，多种不同类型的胞外蛋白酶构成一个复杂有序的蛋白酶体系，与一同产生的纤维素和果胶酶体系形成一个复合酶***，同时催化多种生化反应。酶解产物产生苦味的原因之一，是肽链末端的疏水性氨基酸。当蛋白被水解时，结构被破坏，内部的疏水基团暴露，苦味就会随之产生，所以蛋白内疏水性氨基酸含量越高，水解后被暴露得越多，水解产物的苦味越重，而由于毛霉蛋白酶是含有内切酶和外切酶的复合蛋白酶系，外切酶从肽链末端切除疏水性氨基酸时就起到了脱苦的作用。
榆黄蘑是一种可栽培的食用菌，被认为是健康食品，因为含有较高的蛋白和膳食纤维，低脂肪，还具有药理作用，如抗氧化、免疫调节、抗炎症反应。此外榆黄蘑中的谷氨酸和天冬氨酸含量较高，适合用来生产优质的呈味基料。利用榆黄蘑蛋白制备生物活性肽，对榆黄蘑进行深加工，拓宽应用范围，具有极大的经济和社会效益。然而商业蛋白酶的成本高，产量低，且食品级商业蛋白酶的选择有限。
发明内容
基于此，本发明创造性地将毛酶发酵产蛋白酶与榆黄蘑的发酵结合起来，提供一种低成本酶解榆黄蘑的毛霉发酵产蛋白酶的培养基及其应用。
本发明的第一目的在于提供一种毛霉发酵产蛋白酶的培养基，包括基础组分和添加剂，所述基础组分包括第一榆黄蘑、麸皮和水，所述第一榆黄蘑与所述麸皮的质量比为(4.5～5.5):(9.5～10.5)，所述添加剂包括外加碳源、外加氮源和外加微量元素化合物，所述外加碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的一种或多种，所述外加氮源选自第二榆黄蘑、豆粕、酵母抽提物和蛋白胨中的一种或多种，所述微量元素选自钙、锌、镁和钠中的一种或多种。
本发明的第二目的在于提供一种毛霉发酵产蛋白酶的方法，将毛霉在上述实施例的毛霉发酵产蛋白酶的培养基中进行发酵。
本发明的第三目的在于提供上述任一实施例所述的方法得到的蛋白酶。
本发明的第四目的在于提供一种催化蛋白质水解的方法，包括使用上述任一实施例所述的蛋白酶对蛋白质进行水解。
本发明利用微生物发酵法可以将蛋白酶的发酵生产和榆黄蘑多肽的酶解有机地结合在一起。通过利用榆黄蘑作为发酵培养基诱导毛霉分泌适合酶解榆黄蘑的蛋白酶。榆黄蘑多肽在微生物代谢活动产生的混合酶系作用下被释放的同时，微生物借助多肽水解液提高生长及产酶的效率，降低了榆黄蘑肽生产成本。同时使用毛霉发酵也克服了酶水解法制备的多肽产品会出现较重苦味和口感差等缺点，具有良好的应用前景。对毛酶发酵生长条件进行了优化，探索了碳源、氮源、无机盐、时间、温度、水料比和接种量等因素对发酵榆黄蘑的蛋白酶酶活力的影响，对培养基成分和培养条件进行了进一步的优化，进一步提高毛霉产蛋白酶酶活力，以期为蛋白酶在榆黄蘑中的应用提供理论依据。
附图说明
图1为本发明一实施例的毛霉产蛋白酶种类的测定结果图；
图2为本发明一实施例的不同碳源对毛霉蛋白酶活力的影响图；
图3为本发明一实施例的不同氮源对毛霉蛋白酶活力的影响图；
图4为本发明一实施例的不同微量元素对毛霉蛋白酶活力的影响图；
图5为本发明一实施例的接种量对毛霉蛋白酶活力的影响图；
图6为本发明一实施例的料水比对毛霉蛋白酶活力的影响图；
图7为本发明一实施例的发酵温度对毛霉蛋白酶活力的影响图；
图8为本发明一实施例的发酵时间对毛霉蛋白酶活力的影响图；
图9为本发明一实施例的蛋白酶的最适温度图；
图10为本发明一实施例的蛋白酶温度稳定性图；
图11为本发明一实施例的蛋白酶的最适pH值及pH值稳定性图；
图12为本发明一实施例的金属离子对蛋白酶活力的影响图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
第一方面，本发明实施例提供一种毛霉发酵产蛋白酶的培养基，包括基础组分和添加剂，所述基础组分包括第一榆黄蘑、麸皮和水，所述第一榆黄蘑与所述麸皮的质量比为(4.5～5.5):(9.5～10.5)，所述添加剂包括外加碳源、外加氮源和外加微量元素化合物，所述外加碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的一种或多种，所述外加氮源选自第二榆黄蘑、豆粕、酵母抽提物和蛋白胨中的一种或多种，所述微量元素选自钙、锌、镁和钠中的一种或多种。
本发明利用微生物发酵法可以将蛋白酶的发酵生产和榆黄蘑多肽的酶解有机地结合在一起。通过利用榆黄蘑作为发酵培养基诱导毛霉分泌适合酶解榆黄蘑的蛋白酶。榆黄蘑多肽在微生物代谢活动产生的混合酶系作用下被释放的同时，微生物借助多肽水解液提高生长及产酶的效率，降低了榆黄蘑肽生产成本。同时使用毛霉发酵也克服了酶水解法制备的多肽产品会出现较重苦味和口感差等缺点，具有良好的应用前景。对毛酶发酵生长条件进行了优化，探索了碳源、氮源、无机盐、时间、温度、水料比和接种量等因素对发酵榆黄蘑的蛋白酶酶活力的影响，对培养基成分和培养条件进行了进一步的优化，进一步提高毛霉产蛋白酶酶活力，以期为蛋白酶在榆黄蘑中的应用提供理论依据。在一些实施方式中，所述外加碳源与所述基础组分的质量比为(5～7):100，例如5:100、5.5:100、6:100、6.5:100、7:100等；所述外加氮源与所述基础组分的质量比为(3～6):100，例如3:100、3.5:100、4:100、4.5:100、5:100、5.5:100、5:100等；所述外加微量元素化合物与所述基础组分的质量比为(0.05～0.4):100，例如0.05:100、0.1:100、0.15:100、0.2:100、0.25:100、0.3:100、0.35:100、0.4:100等。
在一些实施方式中，所述外加微量元素化合物可以选自微量元素的氯盐和硫酸盐，例如氯化钙、氯化锌、氯化镁、氯化钠、硫酸钙、硫酸锌、硫酸镁、硫酸钠中的一种或多种。
在一些具体实施方式中，所述外加碳源选自蔗糖，所述蔗糖与所述基础组分的质量比为(6～6.5):100；所述外加氮源选自第二榆黄蘑，所述第二榆黄蘑与所述基础组分的质量比为(4.5～5.5):100；所述外加微量元素化合物选自硫酸镁和氯化钙，所述硫酸镁与所述基础组分的质量比为(0.04～0.06):100，所述氯化钙与所述基础组分的质量比为(0.02～0.04):100。
第二方面，本发明实施例提供一种毛霉发酵产蛋白酶的方法，将毛霉在上述实施例的毛霉发酵产蛋白酶的培养基中进行发酵。
毛霉的初始数量决定了在一定时间内毛霉繁殖情况和孢子的数量，进而影响了毛霉产蛋白酶的能力。在一些实施方式中，所述毛酶在所述毛霉发酵产蛋白酶的培养基中的接种量为0.5×106个/g～1.5×106个/g。
底物含水量的变化对微生物的生长及代谢能力有重要影响。低水分将降低营养物质传输、微生物生长、酶稳定性和基质膨胀；高水分将导致颗粒结块、通气不畅和染菌。因此，在微生物发酵过程中一定要将初始含水量控制在合适的范围内。在一些实施方式中，所述毛霉发酵产蛋白酶的培养基的料液比为1:(1.2～1.5)。“料液比”指的是培养基中的固相与液相的质量比。
适宜的温度是菌体生长所必需的，它直接影响微生物的生长、蛋白质合成、酶和细胞活性及代谢产物合成，另外培养温度的高低可相应延长或缩短发酵周期，所以在发酵过程中一定要选择合适的发酵温度。在发酵过程中产物的浓度是变化的，但到一定时间产率提高减缓，甚至下降。因此，无论是获得菌体还足代谢产物，微生物发酵都有最佳时间阶段。在很多情况下，发酵时间是与发酵温度相关的。在一些实施方式中，所述发酵的温度为27℃～29℃，所述发酵的时间为72h～120h。
优选的，发酵温度27.03℃、发酵时间103.95h、水料比为1.43。为了配置的方便，优选的，发酵温度27℃，发酵时间104h，水料比1.4。
优选的，所述毛霉发酵产蛋白酶的培养基的料液比为1:(1.4～1.5)，所述发酵的温度为27℃～27.5℃，所述发酵的时间为100h～110h。
第三方面，本发明实施例提供上述任一实施例所述的方法得到的蛋白酶。该培养基的发酵方法下得到的蛋白酶包括碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶。
第四方面，本发明实施例提供一种催化蛋白质水解的方法，包括使用上述任一实施例所述的蛋白酶对蛋白质进行水解。
温度是影响酶促反应的重要因素，温度升高可以促进蛋白酶的反应速率，但当升高到一定温度时，酶蛋白就开始发生变性，从而导致酶活力损失。在一些实施方式中，所述水解的温度为45℃～55℃。具体可以为45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃。
在一些实施方式中，所述水解的pH为6.5～7.5。具体可以为6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5。
在一些实施方式中，所述水解的反应体系中加入金属离子磷酸盐缓冲液，所述金属离子选自Mg2+、K+和Ga2+中的任意一种或多种。所述金属离子还可选自Fe2+、Zn2+中的任意一种或两种。
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。
以下实施例所用的检测方法为：
水分含量的测定：
直接干燥法/GB5009.3—2016
食品安全国家标准食品中水分的测定。
粗蛋白的测定：
凯氏定氮法/GB5009.5—2016
食品安全国家标准食品中蛋白质的测定。
蛋白酶活力的测定：
福林法/SB/T10317—1999、GB/T23527-2009
中华人民共和国行业标准SB/T10317—1999蛋白酶活力测定法
中华人民共和国国家标准GB/T23527-2009蛋白酶制剂。
实施例1外加添加剂对产蛋白酶的影响
探索了碳源、氮源、微量元素等因素对蛋白酶酶活力的影响。
毛霉产蛋白酶种类的测定结果：
毛霉发酵后可以分泌多种蛋白酶系，为了确定其高产蛋白酶的种类，于28℃下培养96h使其在基础培养基(榆黄蘑5g，麸皮10g，去离子水15g)充分发酵产酶后，测定了粗酶液的三种蛋白酶酶活力，结果见图1。
由图1可知，两种毛霉菌经发酵培养后均可分泌碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶，其中中性蛋白酶的酶活力较高，因此，后续实验酶活力的测定指标为毛霉中性蛋白酶酶活力。
1.1外加碳源的筛选
在基础培养基(榆黄蘑5g，麸皮10g，去离子水15g)，分别加一定量的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉作为外加碳源物质，以6％的添加量加入到基础培养基中，121℃灭菌30min，趁热摇散，室温冷却至30℃左右。毛霉接种量1×106个/g培养基，置于28℃霉菌培养箱中，培养96h后，测定蛋白酶活力。以基础培养基作为空白对照，在最适发酵条件下进行培养测定其蛋白酶活力，结果如图2所示。
结果表明，不同碳源对毛霉产蛋白酶的影响不一样，一般情况下，容易被利用的碳源有利于微生物生长，而缓慢分解的碳源有利于产蛋白酶。由图2可知，毛霉对碳源的利用广泛，碳源的种类对于毛霉蛋白酶的合成有较大的影响，其中蔗糖较其他碳源更利于毛霉产蛋白酶，可能是蔗糖对蛋白酶的合成有诱导作用；葡萄糖、麦芽糖、淀粉都会抑制毛霉蛋白酶的分泌，可能是它们的分解代谢产物对蛋白酶有阻遏作用。综上所述，选择蔗糖作为发酵培养基的碳源。
1.2外加氮源的筛选
在基础培养基(榆黄蘑5g，麸皮10g，去离子水15g)，分别加一定量的榆黄蘑、豆粕、酵母浸膏、蛋白胨作为外加氮源物质，以3％的添加量加入到基础培养基中，121℃灭菌30min，趁热摇散，室温冷却至30℃左右。毛霉接种量1×106个/g培养基，置于28℃霉菌培养箱中，培养96h后，测定蛋白酶活力。以基础培养基作为空白对照，在最适发酵条件下进行培养测定其蛋白酶活力，结果如图3所示。
结果表明，相对于空白对照，豆粕、酵母浸膏、蛋白胨作为外加氮源物质反而会不利于蛋白酶产生。榆黄蘑作为外加氮源物质有利于蛋白酶产生。
1.3外加微量元素的筛选
在基础培养基(榆黄蘑5g，麸皮10g，去离子水15g)，分别加一定量的氯化钙、硫酸锌、硫酸镁和氯化钠作为培养基微量元素，以0.3％的添加量加入到基础培养基中，121℃灭菌30min，趁热摇散，室温冷却至30℃左右。毛霉接种量1×106个/g培养基，置于28℃霉菌培养箱中，培养96h后，测定蛋白酶活力。以基础培养基作为空白对照，在最适发酵条件下进行培养测定其蛋白酶活力，结果如图4所示。
由图4中可知，无机盐的种类对蛋白酶酶活的影响较大。氯化钙和硫酸镁相对于其他无机盐在提高蛋白酶酶活力的影响较为显著，其中添加硫酸镁的培养基中，毛霉的蛋白酶酶活力最高。由于镁离子是生物代谢途径中多种酶的激活剂，所以硫酸镁能够提高蛋白酶活力。毛霉蛋白酶的酶活力与钙离子密切相关，符合真菌蛋白酶的特性，钙离子是该蛋白酶合成的有效诱导剂。综上所述，毛霉发酵培养基的无机盐选择为硫酸镁和氯化钙。
1.4外加添加剂优化
为了进一步优化发酵培养基的组成，在初步探索各单因素对蛋白酶活力影响的基础上，按照表1所示的因素水平表，选用均匀设计表U10(108)，进行均匀设计实验对外加添加剂进行优化，确定毛霉产蛋白酶的最佳发酵培养基组成。
表1均匀设计因素水平表
根据单因素试验所得结果，选取碳源、氮源、无机盐为因素，以培养基中的蛋白酶酶活力为指标，优化毛霉发酵产蛋白酶培养基最佳配比，试验结果如表2所示。
表2U10(108)优化毛霉产蛋白酶培养基结果
1.5毛霉发酵产蛋白酶的验证试验
根据均匀设计优化得出培养基最佳配比，即榆黄蘑的添加量为5.0％，蔗糖的添加量为6.1437％，硫酸镁的添加量为0.0513％，氯化钙的添加量为0.03％的条件下进行验证试验，结果见表3。结果表明，优化培养基配比条件下得到的蛋白酶活力为99.7229U/g。
表3模型预报值与试验验证结果
实施例2发酵条件对产蛋白酶的影响
2.1接种量的筛选
取5个250mL三角瓶，加入实施例1的1.5的最佳配比的发酵培养基，121℃灭菌30min，趁热摇散，室温冷却至30℃左右。毛霉的接种量分别为1×104个/g、1×105个/g、1×106个/g、1×107个/g、1×108个/g置于28℃霉菌培养箱中培养96h，测定蛋白酶活力。结果如图5所示。图中，4：1.0×104个/g；5：1.0×105个/g；6：1.0×106个/g；7：1.0×107个/g；8：1.0×108个/g。
从图5可以看出，接种量对于蛋白酶的合成影响较大。蛋白酶活随接种量变化的大致规律为当接种量小于1×106个/g时，酶活随接种量的增加而增加，此后随着接种量的增加，酶活逐渐下降。这可能是因为接种量高，会造成菌种繁殖过快，导致培养基中的营养成分不能满足菌体正常生长代谢，产生竞争性抑制，不利于菌种生长，从而毛霉产蛋白酶的能力降低。而接种量过低，超出毛霉最低生长限度，菌种生长缓慢，菌丝产量少，产生的蛋白酶活力低。因此选择接种量为1×106个/g。
2.2料水比的筛选
取5个250mL三角瓶，各加入榆黄蘑5g、麸皮10g，再分别加7.5g、10.5g、15g、19.5g、22.5g去离子水制成基础培养基，121℃灭菌30min，趁热摇散，室温冷却至30℃左右。毛霉的接种量1×106个/g置于28℃霉菌培养箱中培养96h，测定蛋白酶活力。结果如图6所示。
毛霉生长需要一定量的水分，但含水量不宜过高。由图6看出，当料水比为1：1.3时，毛霉蛋白酶的活力最大。当料水比例过大时，会减少培养基内气体的体积，影响气体交换，容易粘结成团，不利于固体培养基的通气和散热，无菌丝体生长，酶活力自然不高；当料水比例过小时，培养基水份含量低，不能提供毛霉生长所需的足够水份。因此，培养基含水量要控制在一定的范围内才适合毛霉产蛋白酶。选取料水比是1：1.3作为最适比例。
2.3发酵温度的筛选
取5个250mL三角瓶，加入实施例1的1.5的最佳配比的发酵培养基，121℃灭菌30min，趁热摇散，室温冷却至30℃左右。毛霉接种量1×106个/g培养基，分别在20℃、24℃、28℃、32℃、36℃，培养96h，测定蛋白酶活力。结果如图7所示。
可以得出，培养温度对毛霉产蛋白酶有较大影响，温度较低时，毛霉生长较慢，蛋白酶合成相对滞后，而温度较高时，毛霉仍然生长的很好，但菌种衰退较快，蛋白酶合成也相应的减慢。因此，选择毛霉的培养温度为28℃。
2.4发酵时间的筛选
取6个250mL三角瓶，加入实施例1的1.5的最佳配比的发酵培养基，121℃灭菌30min，趁热摇散，室温冷却至30℃左右。毛霉接种量1×106个/g培养基，置于28℃霉菌培养箱中，分别在24h、48h、72h、96h、120h、144h时取样，测定蛋白酶活力。结果如图8所示。
从图8中可以看到，不同的培养时间毛霉蛋白酶的活力不同。毛霉在培养72h后相对酶活力就可达到较高水平，培养96h酶活达到最高峰，培养120h后,酶活性有所降低。菌种发酵存在最佳时间阶段，时间过短，菌丝生长不完全，产生的蛋白酶活力较低；时间过长，由于生长环境已经不利于毛霉生长，菌种衰退，产蛋白酶能力降低。因此，选择毛霉的培养时间为96h。
2.5产蛋白酶最适发酵条件的优化
首先对发酵条件进行单因素分析，再利用Design-Expert 8.06响应面分析法对发酵条件进行优化，确定最适发酵条件。
根据单因素试验所得结果，选取发酵温度、发酵时间、水料比三个因素作中心组合，蛋白酶活力为检验指标作响应面分析，以期探讨毛霉发酵产蛋白酶最适发酵条件组合，试验结果如表4所示。
表4响应面法优化毛霉生长条件的实验设计和结果
蛋白酶活力响应面模型的方差分析结果如表5所示。从表5中可以看出，模型F值为模型的值为69.62、“Prob＞F”＜0.0001，说明总体该模型高度显著。该模型失拟项的“Prob＞F”为0.3972，大于0.05，失拟项不显著，说明该模型选择合适，可以用于分析蛋白酶酶活的变化。
表5蛋白酶酶活的响应面二次模型方差分析结果
注：*表示在0.05水平显著；**表示在0.01水平显著；***表示在0.001水平显著
对蛋白酶酶活的响应面模型进行数学分析，以蛋白酶活力最大化为指标，得到制曲的最优条件为：发酵温度27.03℃、发酵时间103.95h、水料比为1.43，此条件下蛋白酶活力的预测值为129.192U/g。考虑到实际操作的可行性及简化工艺，将培养条件修正为：发酵温度27℃，发酵时间104h，水料比1.4，以该培养条件进行实际发酵试验，蛋白酶的平均酶活为132.4536U/g。
实施例3蛋白酶酶学性质的研究
3.1蛋白酶的提取
3.1.1粗酶液的制备
发酵产物加入5倍体积的无菌水，分散均匀，4℃浸提24h，用8层无菌纱布过滤，将滤液离心(10000r/min，20min)，得到的上清液即为粗酶液。
3.1.2硫酸铵分级沉淀
取20ml的粗酶液7份样品，然后依次缓慢加入固体硫酸铵，使硫酸铵质量分数分别为20％、40％、60％、80％、100％，溶解后4℃浸提24h，然后4℃冷冻离心(10000r/min，30min)去沉淀。取上清液，用蒸馏水透析24h，然后4℃冷冻离心(10000r/min，30min)，取上清液调整到相同体积后，分别测定蛋白质含量和蛋白酶活力。
3.2蛋白酶的最适温度和温度对蛋白酶活力的影响
将酶液分别放在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和70℃的水浴中保温反应，测定其蛋白酶活力，计算不同温度条件下的相对酶活力，酶活力最高的温度即为最适温度。
将蛋白酶样品分别在30℃、40℃、50℃、60℃的水浴条件下精确保温20min、40min、60min、80min和100min，测定其蛋白酶活力，保温前的酶活力被定义为100％，计算其他条件下的相对酶活力。
如图9所示，在30～50℃，蛋白酶活力呈现增加的趋势，在50℃时酶活力最高。温度升高超过60℃时，该蛋白酶酶活力急剧下降，说明温度过高蛋白酶迅速变性失活。因此，该蛋白酶的最适作用温度范围为45-55℃。
如图10所示，该蛋白酶在30℃和40℃下，由于温度较低，对蛋白酶的影响较小，所以蛋白酶酶活保持较稳定，30℃和40℃保持100min，酶活力分别保留88.14％和92.64％。在50℃和60℃时随着保温时间延长，蛋白酶活力迅速下降，保温100min后，酶活力分别保留34.62％和4.8％，表明该蛋白酶不是耐高温的蛋白酶类。
3.3蛋白酶的最适作用pH和pH对蛋白酶活力的影响
将酶液分别用pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0和pH10.0的缓冲液调节至相应的pH值，测其蛋白酶活力，计算不同pH值的相对酶活力。
用不同的缓冲液分别调节酶液pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，置于40℃恒温水浴中保温120min，测定其蛋白酶活力，保温前的酶活定义为100％，计算其他条件下的相对酶活力。
如图11所示，pH 5～7，酶活力呈现增加的趋势，pH 7时酶活力最高。当pH值继续升高时，酶活力呈下降趋势，但在pH 9.0时酶活力一个明显的峰值，表明毛霉含有碱性蛋白酶。综上所述，该蛋白酶最适pH值为7.0。每一种酶均具有最适pH值，是由于Hofmeister效应，在不同pH值的体系中，酶表面的氨基基团和羧基基团的电荷分布受到影响，进而影响酶与底物的结合以及催化效率。
3.4金属离子对毛霉蛋白酶酶活力的影响
将粗酶液与等量的4.0mmol/L不同的金属离子(K+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+)磷酸缓冲溶液混合得到金属离子溶液浓度为2.0mmol/L，测定其蛋白酶活力，将不加金属离子溶液的酶活力定义为100％，计算不同金属离子条件下的相对酶活力。
真菌蛋白酶一般都是金属蛋白酶，其活性主要依赖于某种金属阳离子，所以其活性会受到金属螯合物的影响。图12显示了六种金属离子对蛋白酶酶活力的影响情况。由图可知，Mg2+、K+、Ga2+对蛋白酶活力有显著的促进作用(P＜0.05)，Fe2+、Zn2+对蛋白酶活力稍有促进作用(P＞0.05)，而Cu2+对蛋白酶有显著的抑制作用，对蛋白的抑制作用达30％左右，这可能是金属离子与酶活性中心的相关基团发生作用，改变酶的构象所致。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种毛霉发酵产蛋白酶的培养基，其特征在于，包括基础组分和添加剂，所述基础组分包括第一榆黄蘑、麸皮和水，所述第一榆黄蘑与所述麸皮的质量比为(4.5～5.5):(9.5～10.5)，所述添加剂包括外加碳源、外加氮源和外加微量元素化合物，所述外加碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的一种或多种，所述外加氮源选自第二榆黄蘑、豆粕、酵母抽提物和蛋白胨中的一种或多种，所述微量元素选自钙、锌、镁和钠中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的毛霉发酵产蛋白酶的培养基，其特征在于，所述外加碳源与所述基础组分的质量比为(5～7):100，所述外加氮源与所述基础组分的质量比为(3～6):100，所述外加微量元素化合物与所述基础组分的质量比为(0.05～0.4):100。
3.根据权利要求2所述的毛霉发酵产蛋白酶的培养基，其特征在于，所述外加碳源选自蔗糖，所述蔗糖与所述基础组分的质量比为(6～6.5):100；所述外加氮源选自第二榆黄蘑，所述第二榆黄蘑与所述基础组分的质量比为(4.5～5.5):100；所述外加微量元素化合物选自硫酸镁和氯化钙，所述硫酸镁与所述基础组分的质量比为(0.04～0.06):100，所述氯化钙与所述基础组分的质量比为(0.02～0.04):100。
4.毛霉发酵产蛋白酶的方法，其特征在于，将毛霉在权利要求1～3任一项所述的毛霉发酵产蛋白酶的培养基中进行发酵。
5.根据权利要求4所述的毛霉发酵产蛋白酶的方法，其特征在于，所述毛酶在所述毛霉发酵产蛋白酶的培养基中的接种量为0.5×106个/g～1.5×106个/g；和/或，
所述毛霉发酵产蛋白酶的培养基的料液比为1:(1.2～1.5)；和/或，
所述发酵的温度为27℃～29℃，所述发酵的时间为72h～120h；
优选的，所述毛霉发酵产蛋白酶的培养基的料液比为1:(1.4～1.5)，所述发酵的温度为27℃～27.5℃，所述发酵的时间为100h～110h。
6.根据权利要求4～5任一项所述的方法得到的蛋白酶。
7.一种催化蛋白质水解的方法，其特征在于，包括使用权利要求6所述的蛋白酶对蛋白质进行水解。
8.根据权利要求7所述的催化蛋白质水解的方法，其特征在于，所述水解的温度为45℃～55℃。
9.根据权利要求7所述的催化蛋白质水解的方法，其特征在于，所述水解的pH为6.5～7.5。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的催化蛋白质水解的方法，其特征在于，在所述水解的反应体系中加入金属离子磷酸盐缓冲液，所述金属离子选自Mg2+、K+和Ga2+中的任意一种或多种。
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