CN113975289A - 褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖在抗衰老的应用 - Google Patents

褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖在抗衰老的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖在抗衰老的应用，用于解决现有抗衰老药物副作用大，效果一般的问题，其中褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖在抗衰老的应用通过增强细胞活力，延缓细胞衰老，改善胰岛β细胞的衰老相关蛋白的表达，改善胰岛β细胞的功能的方式，达到抗衰老的目的。

Description

褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖在抗衰老的 应用
技术领域
本发明涉及药学领域，具体涉及一种褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖在抗衰老的应用。
背景技术
进入21世纪后,人类面临人口老龄化的严峻挑战,许多国家(包括我国) 已经进入人口老龄化社会,≥60岁的老年人占总人口的10％以上。目前,我国老年人(包括一部分中年人)受到衰老的严重困扰,直接影响他们的健康状况和生活质量。如何完整地阐明衰老的发病机理,如何提高老年人的健康状况和生活质量,是当前研究者们需要着重解决的问题。近年来,随着科技的发展, 研究手段的不断提高,现代人们研究的焦点是这些中草药的西医抗衰老机制及药用潜力,正展现出巨大的诱人前景。
细胞衰老是指细胞在应激后导致的不可逆的永久性细胞周期停滞状态。细胞损伤本身并不直接导致明显的衰老迹象，而是当损伤累积和达到一定的限度，细胞停止增殖,导致肉眼可见的组织衰弱和生理上的衰老表型。一些衰老诱导因素(包括DNA损伤、致癌突变、活性代谢产物、高促***原和营养信号增加mTOR活动、蛋白毒性压力)可以单独或协同作用于细胞，通过p16INK4a/Rb、p53/p21通路或其他路径导致细胞衰老。这些可能导致普遍的基因表达变化和染色质重塑(异染色质的形成)，这些是SASP、衰老相关生长停滞以及形态学变化的基础。
研究表明衰老和糖尿病是有关联的。糖尿病及糖尿病前期的患病率随着年龄显著增长，胰岛β细胞随着年龄增加增殖潜能显著下降，增加了糖尿病在老人中的患病比例，提示糖尿病是一种与年龄密切相关的疾病。随着年龄增长，胰岛β细胞分泌功能降低，细胞再生能力降低，会导致胰岛β细胞衰老积聚，从而导致葡萄糖耐量降低和糖尿病的发生。同时衰老也会导致的胰岛β细胞凋亡增加，进一步影响胰岛β细胞功能。胰岛β细胞的衰老不仅与年龄有关，还受到其他因素的影响，比如肥胖和糖脂代谢异常会使体内的衰老细胞数量增加，加速细胞衰老。当细胞发生衰老时，具有衰老表型的通用标志物，衰老相关的酸性β-半乳糖苷酶活性，p21Cis1， p16Ink4a在衰老细胞中表达增加，同时Ki67阳性细胞的比例明显降低，胰岛的代偿性增生受到抑制，衰老相关的分泌谱(SASP)分泌因子也是增加的。虽然胰岛β细胞衰老和糖尿病的关系非常明确，衰老胰岛细胞引起糖尿病的关注相对较少，制约了其药物开发的进程。
我国中药资源丰富，目前用于抗衰老的药物也很多，其中的中药多糖具有良好的抗衰老活性。相比于传统药物，多糖类药物本身并非药品，没有任何毒性，但确能带来多方面的药理活性，在人们越来越关注药物毒性的今天，多糖能够有效对抗化学药物治标不治本的多种慢性病。而海洋类多糖是来源于独特的海洋生态环境的生物，其合成的组分具有鲜明的海洋特色和独特的化学特征，并呈现独特药理活性，其安全性高、毒副作用小等，成为药物开发的新趋势。
海洋褐藻中的多糖种类繁多，结构复杂多样，仅硫酸多糖就包括三大类，一类是岩藻聚糖硫酸酯(也称为褐藻多糖硫酸酯)，是由岩藻糖为组成单糖的硫酸多糖组分，另一类是由岩藻糖和半乳糖组成的硫酸多糖，即半乳岩藻聚糖硫酸酯，此外褐藻中还普遍存在一类富含糖醛酸的低硫酸化杂聚糖，其单糖组成比较复杂，包含甘露糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、半乳糖等多种单糖，在对褐藻中的硫酸多糖组分通过阴离子凝胶色谱进行分级纯化时，一般含葡萄糖醛酸的低硫酸化杂聚糖组分会被低浓度的电解质首先洗脱下来。由于化学特性差异较大，低硫酸化杂聚糖与岩藻聚糖硫酸酯生物活性差异很大。例如，Croci等报道了褐藻Laminaria saccharina中分离到两种硫酸多糖，一种属于低硫酸化杂聚糖，称为岩藻甘露葡萄糖醛酸聚糖 (Fucomannoglucuronans)，另一种为岩藻聚糖，他们对两种不同多糖的活性比较研究后得出结论为，是岩藻聚糖而不是岩藻甘露葡萄糖醛酸聚糖决定了褐藻Laminaria saccharina中硫酸多糖的生物活性，包括抗凝血、抗肿瘤、抗炎等活性。(Fucans,but not fucomannoglucuronans,determine the biological activitiesofsulfated polysaccharides from Laminaria saccharina brown seaweed,PLoSONE2011,6(2):1-10)。前期我们发现低硫酸化杂聚糖在治疗帕金森病方面具有显著功效，在治疗和/或预防2型糖尿病方面也具有显著功效，本发明进一步发现了硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(结构与低硫酸化杂聚糖相似)在抗衰老中的显著作用。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，根据多次细胞实验，阐明了褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖的新应用及其作用机制，并进行了试验验证。
本发明是通过以下技术方案实现的：
为实现上述目的，本发明提供一种褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖在抗衰老的应用，其特征在于，所述褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖通过增强细胞活力，延缓细胞衰老，改善胰岛β细胞的衰老相关蛋白的表达，改善胰岛β细胞的功能的方式，达到抗衰老的目的。
优选的，上述增强细胞活力为增强β细胞系的活力。
优选的，上述延缓细胞衰老为修复细胞周期变化。
优选的，上述改善胰岛β细胞的衰老相关蛋白的表达为降低衰老相关蛋白p53、p21和p16的表达，同时缓解衰老相关分泌表型IL-1β， TNFa,CXCL4和CXCL10。
优选的，上述改善胰岛β细胞的功能为修复胰岛细胞胰岛素合成损伤。
优选的，上述的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖主要组成单糖包括葡萄糖醛酸、甘露糖、半乳糖和岩藻糖；其水解硫酸基含量为2％-12％，岩藻糖含量3％-10％，糖醛酸含量20-40％。
所述硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖具有如下结构特征：
(1)组成糖包括：甘露糖，葡萄糖醛酸，半乳糖，岩藻糖；
(2)甘露糖和葡糖糖醛酸以α(1→4)糖苷键连接；葡萄糖醛酸和甘露糖以β(1→2)糖苷键连接；
(3)葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸之间以β(1→3)糖苷键连接；
(4)半乳糖主要以β(1→6)糖苷键连接；
(5)岩藻糖以α(1→3)糖苷键连接，C2或C4位硫酸化；或以支链形式以α(1→3)糖苷键连接甘露糖；
(6)包含如下结构单元(Ⅰ)，(Ⅱ)，(Ⅲ)，(IV)不同结构单元之间相互交替连接；
Figure BDA0003364029410000051
其中R1为H或硫酸基，R2为硫酸化岩藻糖残基。
优选的，上述的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖来源于海洋褐藻，海洋褐藻包括海带、裙带菜、半叶马尾藻、鼠尾藻、全缘马尾藻、羊栖菜、硇洲马尾藻、莫氏马尾藻、海黍子中的一种或多种。
优选的，上述的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖分子量为 1kD～1000kD。
优选的，上述应用方法为施用有效量的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖作为药物。
优选的，上述药物为药学上可接受载体或剂型。
本发明同时提供一种褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖的制备方法，制备方法如下：采用水提的方法提取海洋褐藻中的水溶性多糖；再经过低浓度酸降解和酒精醇沉获得稀酸稳定的水溶性多糖，最后再用高浓度酸降解和酒精醇沉获得强酸稳定的水溶性多糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明具有显著抗衰老的作用，毒副作用小，安全有效，可以用于制备抗衰老药物。
(2)本发明经过研究后发现，褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖在抗衰老有非常好的治疗效果，目前还没有其他学院或机构在此方向上有所研究，本发明方案的技术进步性较大，有利于市场推广。
附图说明
图1为不同SFGG的SA-beta-gal染色
图2为细胞活力图；其中A为SFGG-SJ加入对MIN6细胞活力的影响；B为H2O2处理后，加入SFGG-SJ对细胞活力的影响。
图3为SFGG-SJ对H2O2造成的细胞周期变化图；其中S为： DNA合成期；G1为：DNA合成前期；G2为：DNA合成后期；
图4为SFGG-SJ处理后细胞衰老相关蛋白的表达；
图5为SFGG-SJ处理后衰老相关分泌表型的变化；
图6为SFGG-SJ处理后的衰老模型。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都落入本发明保护范围；且下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：海带来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SJ)的制备
(1)将1kg海带，用15倍质量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃；提取1次。除去藻体，合并提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05 mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，用截留分子量为3500Da透析袋透析2 天，浓缩透析袋内溶液，冻干得海带多糖A，得率为1.5％。
(2)将海带多糖A溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.1mol/L，80度水浴中，搅拌 2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得海带多糖B，得率为53.5％。
(3)将海带多糖B溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.5mol/L，80度水浴中，搅拌降解2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得海带多糖C，得率为40.4％。
(4)取海带多糖C(0.5g)溶于4毫升0.2M碳酸氢铵，上样到以 Bio-Gel P-10为载体的柱层析，0.2M碳酸氢铵为流动相，收集洗脱组分，洗脱组分浓缩，上样到以Sephadex G10为载体的柱层析脱盐，洗脱液浓缩，冻干得海带来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SJ)，得率为80.5％。对SFGG-SJ组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量和分子量等分析，结果如下表1所示。
实施例2：海带来源的低分子量岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖 (DSFGG-SJ)的制备
(1)将海带多糖A溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入30mM抗坏血酸和30mM过氧化氢，常温反应2小时。将该反应液用截留分子量为3500Da的透析袋分别在自来水和蒸馏水透析，之后浓缩，冻干。得到低分子量海带多糖D。
(2)将低分子量海带多糖D溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.1mol/L，80度水浴中，搅拌2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得海带多糖E，得率为55.7％。
(3)将海带多糖E溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入 4mol/L盐酸使其终浓度为0.5mol/L，80度水浴中，搅拌降解2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得海带多糖F，得率为48.5％。
(4)取海带多糖F(0.5g)溶于4毫升0.2M碳酸氢铵，上样到以 Bio-Gel P-10为载体的柱层析，0.2M碳酸氢铵为流动相，收集洗脱组分，洗脱组分浓缩，上样到以Sephadex G10为载体的柱层析脱盐，洗脱液浓缩，冻干得海带来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(DSFGG-SJ)，得率为85.3％。对DSFGG-SJ组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量和分子量等分析，结果如下表1所示。
实施例3：半叶马尾藻来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SH) 的制备
(1)将1kg半叶马尾藻，用15倍质量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃；提取1次。除去藻体，合并提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，用截留分子量为3500Da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液，冻干得半叶马尾藻多糖A，得率为4.6％。
(2)将半叶马尾藻多糖A溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.1mol/L，80度水浴中，搅拌2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得半叶马尾藻多糖B，得率为60.5％。
(3)将半叶马尾藻多糖B溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.5mol/L，80度水浴中，搅拌降解2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得半叶马尾藻多糖SFGG-SH，得率为43.3％。对SFGG-SJ组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量和分子量等分析，结果如下表1所示。
实施例4：羊栖菜来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SF) 的制备
(1)将1kg羊栖菜，用15倍质量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃；提取1次。除去藻体，合并提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05 mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，用截留分子量为3500Da透析袋透析2 天，浓缩透析袋内溶液，冻干得羊栖菜多糖A，得率为3.5％。
(2)将羊栖菜多糖A溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.1mol/L，80度水浴中，搅拌 2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得羊栖菜多糖B，得率为40.5％。
(3)将羊栖菜多糖B溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.5mol/L，80度水浴中，搅拌降解2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得半叶马尾藻多糖SFGG-SF，得率为 33.3％。对SFGG-SF组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量和分子量等分析，结果如下表1所示。
实施例5：鼠尾藻来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-ST) 的制备
(1)将1kg鼠尾藻，用15倍质量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃；提取1次。除去藻体，合并提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05 mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，用截留分子量为3500Da透析袋透析2 天，浓缩透析袋内溶液，冻干得鼠尾藻多糖A，得率为5.8％。
(2)将鼠尾藻多糖A溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.1mol/L，80度水浴中，搅拌 2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得鼠尾藻多糖B，得率为37.3％。
(3)将鼠尾藻多糖B溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.5mol/L，80度水浴中，搅拌降解2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得鼠尾藻多糖SFGG-ST，得率为31.2％。对SFGG-ST组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量和分子量等分析，结果如下表1所示。
实施例6：裙带菜来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-UP) 的制备
(1)将1kg裙带菜，用15倍质量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃；提取1次。除去藻体，合并提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05 mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，用截留分子量为3500Da透析袋透析2 天，浓缩透析袋内溶液，冻干得裙带菜多糖A，得率为2.5％。
(2)将裙带菜多糖A溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.1mol/L，80度水浴中，搅拌 2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得裙带菜多糖B，得率为38.2％。
(3)将裙带菜多糖B溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.5mol/L，80度水浴中，搅拌降解2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得裙带菜多糖SFGG-UP，得率为30.8％。对SFGG-UP组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量和分子量等分析，结果如下表1所示。
实施例7：海黍子来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SHO) 的制备
(1)将1kg海黍子，用15倍质量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃；提取1次。除去藻体，合并提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05 mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，用截留分子量为3500Da透析袋透析2 天，浓缩透析袋内溶液，冻干得海黍子多糖A，得率为1.8％。
(2)将海黍子多糖A溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.1mol/L，80度水浴中，搅拌 2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得海黍子多糖B，得率为43.2％。
(3)将海黍子多糖B溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.5mol/L，80度水浴中，搅拌降解2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得海黍子多糖SFGG-SHO，得率为35.2％。对SFGG-SHO组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量和分子量等分析，结果如下表1所示。
实施例8：硇洲马尾藻来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SN) 的制备
(1)将1kg硇洲马尾藻，用15倍质量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃；提取1次。除去藻体，合并提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，用截留分子量为3500Da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液，冻干得硇洲马尾藻多糖A，得率为5.5％。
(2)将硇洲马尾藻多糖A溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.1mol/L，80度水浴中，搅拌2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得硇洲马尾藻多糖B，得率为50.2％。
(3)将硇洲马尾藻多糖B溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.5mol/L，80度水浴中，搅拌降解2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得硇洲马尾藻多糖SFGG-SN，得率为41.3％。对SFGG-SN组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量和分子量等分析，结果如下表1所示。
实施例9：全缘马尾藻来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SI) 的制备
(1)将1kg全缘马尾藻，用15倍质量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃；提取1次。除去藻体，合并提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，用截留分子量为3500Da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液，冻干得全缘马尾藻多糖A，得率为4.2％。
(2)将全缘马尾藻多糖A溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.1mol/L，80度水浴中，搅拌2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得全缘马尾藻多糖B，得率为46.1％。
(3)将全缘马尾藻多糖B溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.5mol/L，80度水浴中，搅拌降解2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得全缘马尾藻多糖SFGG-SI，得率为39.8％。对SFGG-SI组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量和分子量等分析，结果如下表1所示。
实施例10：莫氏马尾藻来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖 (SFGG-SM)的制备
(1)将1kg莫氏马尾藻，用15倍质量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃；提取1次。除去藻体，合并提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，用截留分子量为3500Da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液，冻干得莫氏马尾藻多糖A，得率为5.2％。
(2)将莫氏马尾藻多糖A溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.1mol/L，80度水浴中，搅拌2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得莫氏马尾藻多糖B，得率为37.3％。
(3)将莫氏马尾藻多糖B溶于水配成浓度为1％(质量浓度)的溶液，加入4mol/L盐酸使其终浓度为0.5mol/L，80度水浴中，搅拌降解2小时，然后用氢氧化钠中和，浓缩，倒入等体积无水乙醇中。离心，红外烤干获得莫氏马尾藻多糖SFGG-SM，得率为35.2％。对SFGG-SM组分进行化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量和分子量等分析，结果如下表1所示。
Figure BDA0003364029410000161
实施例11：褐藻来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG)对MIN6细胞活力的影响
MIN6是小鼠的胰岛β细胞系，胰岛素分泌功能好，是研究胰岛功能作用的常用细胞系。过氧化氢预处理胰岛β细胞MIN6后，加入实施例1-10中 100μg/ml SFGG进行药物处理24h，CCK8检测细胞活力。表2总结了实施例1-10中SFGG能改善过氧化氢导致的MIN6细胞活力降低。
表2不同SFGG处理后MIN6细胞活力
Figure BDA0003364029410000171
实施例12：褐藻来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG)延缓MIN6细胞衰老
用过氧化氢预处理MIN6细胞后，加入实施例1-10中100μg/ml浓度的 SFGG进行药物处理24h，如图1所示，衰老相关半乳糖苷酶SA-β-gal染色可以明显的看出SFGG能够明显减少衰老的细胞。
实施例13：海带来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SJ)增强MIN6 细胞活力
用过氧化氢预处理MIN6细胞后，加入实施例1中不同浓度的多糖进行药物处理24h，图2结果显示不同浓度的SFGG-SJ对细胞没有毒性作用；过氧化氢处理后，随着SFGG-SJ的浓度增大，可以改善MIN6细胞活力。
实施例14：海带来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SJ)延缓MIN6 细胞衰老
如图3所示，进一步对细胞周期的检测发现SFGG-SJ能够改善H2O2造成的细胞周期变化，细胞周期的间期分为三期、即DNA合成前期(G1期)、 DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)：
(1)G1期(first gap)从有丝***到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S 期的DNA复制作好物质和能量的准备。
(2)S期(synthesis)即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。
(3)G2期(second gap)期为DNA合成后期，是有丝***的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。
由图3的结果可知，加入SFGG-SJ后，可以改善H2O2引起的细胞周期变化，从而达到修复的作用。
实施例15：海带来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SJ)改善MIN6 细胞的衰老相关蛋白的表达
在正常人类细胞，p53或者p21基因失活可以延长细胞的复制性寿命，提示这条通路与细胞衰老有密切关系。p53介导了细胞对DNA损伤反应， p53既能介导由端粒缩短导致的复制性衰老，也能介导应激导致的早老，它的下游靶分子是p21。p21是cyclin依赖的蛋白激酶的抑制剂，能抑制细胞周期，使细胞进入不可逆性生长停滞。p21是广谱的细胞周期抑制剂，通过特异性抑制cyclinD1-CDK4/CDK6、cyclinE-CDK2、cyclinA-CDK2的蛋白激酶活性，既可导致G1期停滞也可以导致G2期停滞。
p16INK4a是一种非常重要的抑癌蛋白,可通过抑制癌细胞的***和诱导癌细胞的死亡而减少癌症的发生,因此它的缺失或异常将增加患癌症的概率. 最新的研究却发现，p16INK4a还有另外一个重要作用,通过诱发老龄哺乳动物干细胞功能下降而促使衰老的产生,至少在骨髓,前脑,胰岛细胞和角化细胞等类型细胞中被证实。利用实施案例1中的SFGG-SJ处理H2O2引起的衰老模型。衰老相关蛋白p53，p21，p16也随着浓度增大减少。综上可以说明SFGG-SJ 可以随着浓度的增大，延缓MIN6细胞的衰老。同时QPCR的结果也显示衰老相关的代谢表型也得到恢复。
如图4所示，Western blot检测细胞中衰老相关蛋白p53、p21和p16的表达，结果显示，SFGG-SJ处理能修复H2O2引起的衰老，衰老相关蛋白p53， p21，p16也随着浓度增大减少。
如图5所示，qPCR检测细胞中IL-1β，TNFa,CXCL4和CXCL10等衰老相关分泌表型，结果可知，所述衰老相关的代谢表型也得到恢复。
实施例16：海带来源的岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖(SFGG-SJ)改善MIN6 细胞的功能
利用实施案例1中的SFGG-SJ处理H2O2引起的衰老模型，随着SFGG-SJ 浓度的增大，细胞内的胰岛素的水平是增强的。所以SFGG-SJ可以逆转H2O2造成的胰岛细胞胰岛素合成损伤。
DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)：是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。
Insulin(胰岛素)是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
Merge：上述两个荧光图合成。
如图6所示，随着SFGG-SJ浓度的增加(25→200)，细胞内的胰岛素水平是显著增强的，而H2O2能引起胰岛素合成损伤，说明SFGG-SJ可以逆转/ 修复H2O2造成的胰岛细胞胰岛素合成损伤。

Claims (10)

1.一种褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖在抗衰老的应用，其特征在于，所述褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖通过增强细胞活力，延缓细胞衰老，改善胰岛β细胞的衰老相关蛋白的表达，改善胰岛β细胞的功能的方式，达到抗衰老的目的。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述增强细胞活力为增强β细胞系的活力。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述延缓细胞衰老为修复细胞周期变化。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善胰岛β细胞的衰老相关蛋白的表达为降低衰老相关蛋白p53、p21和p16的表达，同时缓解衰老相关分泌表型IL-1β，TNFa,CXCL4和CXCL10。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善胰岛β细胞的功能为修复胰岛细胞胰岛素合成损伤。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖具有如下特征：其主要组成单糖包括甘露糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖和半乳糖，其水解硫酸基含量为2％-12％，岩藻糖含量3％-10％，糖醛酸含量20-40％。
所述硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖具有如下结构特征：
(1)组成糖包括：甘露糖，葡萄糖醛酸，半乳糖，岩藻糖；
(2)甘露糖和葡糖糖醛酸以α(1→4)糖苷键连接；葡萄糖醛酸和甘露糖以β(1→2)糖苷键连接；
(3)葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸之间以β(1→3)糖苷键连接；
(4)半乳糖主要以β(1→6)糖苷键连接；
(5)岩藻糖以α(1→3)糖苷键连接，C2或C4位硫酸化；或以支链形式以α(1→3)糖苷键连接甘露糖；
(6)包含如下结构单元(Ⅰ)，(Ⅱ)，(Ⅲ)，(IV)不同结构单元之间相互交替连接；
Figure FDA0003364029400000021
其中R1为H或硫酸基，R2为硫酸化岩藻糖残基。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖来源于海洋褐藻，海洋褐藻包括海带、裙带菜、半叶马尾藻、鼠尾藻、全缘马尾藻、羊栖菜、硇洲马尾藻、莫氏马尾藻、海黍子中的一种或多种。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖分子量为1kD～1000kD。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用方法为施用有效量的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖作为药物，所述药物为药学上可接受载体或剂型。
10.一种褐藻来源的硫酸化岩藻半乳甘露葡萄糖醛酸多糖的制备方法，其特征在于，制备方法如下：采用水提的方法提取海洋褐藻中的水溶性多糖；再经过低浓度酸降解和酒精醇沉获得稀酸稳定的水溶性多糖，最后再用高浓度酸降解和酒精醇沉获得强酸稳定的水溶性多糖。
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