CN113969262B - 一种用于肺癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于培养肺癌上皮细胞的原代细胞培养基，含有MST1/2激酶抑制剂；***1；表皮细胞生长因子；肝细胞生长因子；神经调节蛋白‑1；选自胰岛素‑转铁蛋白‑硒复合物、B27添加剂和N2添加剂中的至少一种的添加剂；选自Y27632、法舒地尔、和H‑1152中的至少一种的ROCK激酶抑制剂。本发明还提供使用该原代细胞培养基的培养方法、以及该培养基和培养方法用于药物的疗效评估和筛选的方法和应用。

Description

一种用于肺癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及用于在体外培养或扩增原代肺癌上皮细胞的培养基及培养方法，还涉及培养得到的细胞在药物的疗效评估和筛选中的方法和应用。
背景技术
肺癌目前仍是最常见和致死性最高的肿瘤之一，全世界每年有160万例与肿瘤相关的死亡。肺癌是一种多样的、复杂的、治疗具有挑战性的疾病。在过去的十年里，随着个性化医疗的出现，对肺癌的基础生物学和分子机制有了进一步的理解。肺癌不再是一种单一的疾病实体，现在被细分为分子亚型，分别对应于专门的针对性化疗策略。
功能性测试是指在体外对抗肿瘤药物在癌症患者细胞上的敏感性进行检测的方法。应用这一方法的关键在于开发生长周期短且能够代表肺癌患者自身生物学特性的肿瘤细胞模型。另外，所述细胞模型应操作便捷且能快速高效地预测临床用药的疗效，从而及时给予癌症患者精准用药指导。然而，取自癌症患者的原代肿瘤细胞在体外建立细胞模型成功率往往很低，生长周期长，并存在成纤维细胞等***过度增殖等问题，制约着这一领域的发展。目前有两种培养原代上皮细胞/干细胞的技术在肿瘤细胞功能性测试应用领域发展得相对成熟，一种是使用经辐射的滋养细胞和ROCK激酶抑制剂来促进原代上皮细胞的生长以考察个体患者的药物敏感性的技术，即细胞条件重编程技术(Liu等，Am.J.Pathol.，180：599-607，2012)。另一种技术是体外3D培养成体干细胞从而获得类似于组织器官的类器官技术(Hans Clevers等，Cell，11，172(1-2)：373-386，2018)。
然而，类器官技术是将患者自体原代上皮细胞包埋在细胞外基质内进行体外三维立体培养的技术，但是该技术的培养基内需添加多种特定的生长因子(如Wnt蛋白和R-spondin家族蛋白)，成本昂贵，不适于普及到临床进行大规模应用。另外，类器官在整个培养过程中均需将细胞包埋在细胞外基质胶中，其细胞接种、传代和药物敏感性测试的铺板步骤相较于2D培养操作繁琐费时，且该技术所形成的类器官大小尺寸不好控制，易出现部分类器官生长过大而导致内部发生坏死的情况。因此，类器官技术相较于2D培养技术可操作性和适用性不强，需要专业技术人员操作，不适合大规模广泛应用于临床体外药物敏感性检测(Nick Barker，Nat.Cell Biol.，18(3)：246-54，2016)。
细胞重编程技术是一种将患者自体原代上皮细胞与鼠源性饲养细胞共培养的技术，现有文献中用于体外扩增肺癌原代细胞的培养基中含血清成分，由于血清成分不明确，不同批次之间差异大，容易对实验结果产生一定干扰。
鉴于以上技术的局限性，临床上需要开发一种原代肺癌上皮细胞培养技术，其培养周期短，成本可控，操作便捷，在将该技术应用于构建原代肺癌肿瘤细胞模型时，所培养的肺癌肿瘤细胞能代表肺癌患者自身的生物学特性。通过体外评估抗肿瘤药物在不同癌症患者个体所衍生的细胞模型上的敏感性，来提高临床上抗肿瘤药物的响应率，减少不合适的药物给患者造成的痛苦及医疗资源的浪费。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种用于培养原代肺癌上皮细胞的培养基以及使用该培养基的原代肺癌上皮细胞的培养方法。采用本发明的原代肺癌上皮细胞培养基和培养方法，能够达到体外培养周期短、成本可控、操作便捷的目的。在该技术应用于构建原代肺癌肿瘤细胞模型时，能够获得具有肺癌患者自身生物学特性的原代肺癌肿瘤细胞，并能够应用于新药筛选和体外药物敏感性检测。
本发明的一个方面在于提供一种用于培养原代肺癌上皮细胞的原代细胞培养基，其含有MST1/2激酶抑制剂；***1(IGF-1)；表皮细胞生长因子(EGF)；肝细胞生长因子(HGF)；神经调节蛋白-1；选自胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(ITS)、B27添加剂和N2添加剂中的至少一种的添加剂；选自Y27632、法舒地尔、和H-1152中的至少一种的ROCK激酶抑制剂，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物。
其中，
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C2-C6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地R6取代的芳基(例如苯基和萘基等)、芳基C1-C6烷基(例如苯甲基等)和杂芳基(例如噻吩基等)；
R2和R3各自独立地选自C1-C6烷基，优选C1-C3烷基，更优选甲基；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C4-C8环烷基烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基氨基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、和C3-C6杂环基C1-C6烷基(所述杂环基选自例如哌啶基、四氢吡喃基等)；
R6选自卤素(优选氟和氯，更优选氟)、C1-C6烷基(优选甲基)、C1-C6烷氧基(优选甲氧基)、和C1-C6卤代烷基(优选三氟甲基)。
优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，
其中，
R1选自C1-C6烷基、任选地被1-2个独立地R6取代的苯基、任选地被1-2个独立地R6取代的噻吩基、和任选地被1-2个独立地R6取代的苯甲基，R1更优选为任选地被1-2个独立地R6取代的苯基；
R5选自氢、C1-C6烷基、和C3-C6环烷基，R5更优选为氢；
R6各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、和C1-C6卤代烷基，R6更优选为氟、甲基或三氟甲基。
优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。
最优选地，本发明的MST1/2激酶抑制剂为化合物1。
在本发明的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂在培养基中的含量通常为0.625μM～20μM，优选为0.625μM～10μM，更优选为2.5μM。
在优选的实施方式中，所述***1的含量优选为1.25～80ng/ml，更优选为5～80ng/ml；所述肝细胞生长因子的含量优选为5～80ng/ml，更优选为20～80ng/ml；所述表皮细胞生长因子的含量优选为10～80ng/ml，更优选为10～40ng/ml；所述神经调节蛋白-1的含量优选为10～80ng/ml，更优选20～80ng/ml；所述添加剂的含量优选体积比1:200～1:25，更优选体积比1:50～1:25，且所述添加剂优选为胰岛素-转铁蛋白-硒复合物，其中胰岛素/转铁蛋白/***钠各自的含量优选分别为2.5～20μg/ml-1.25～10μg/ml-1.25～10ng/ml，更优选分别为10～20μg/ml-5～10μg/ml-5～10ng/ml；所述ROCK激酶抑制剂的含量优选为1.25～20μM，更优选为2.5～10μM，所述ROCK激酶抑制剂优选为Y27632。
该培养基配方成分与细胞条件重编程培养基和类器官培养基成分相比，添加了MST1/2激酶抑制剂，但不包含血清、牛垂体提取物等不确定成分，也不包含Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂等类器官培养所必须的龛因子，并且不包含烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸，从而大大降低了培养基的成本，简化了配制培养基的操作流程，实现了成本可控和操作便捷的原代肺癌上皮细胞的体外培养。
本发明中，原代肺癌上皮细胞可以为肺癌肿瘤细胞、正常肺癌上皮细胞、肺癌上皮干细胞。
本发明的一个方面在于提供一种原代肺癌上皮细胞的培养方法，其包括以下步骤：
(1)按上述配方配制本发明的原代细胞培养基。
(2)使用辐照后的滋养细胞预铺培养容器。
具体地，所述的滋养细胞例如可以为辐照后的NIH-3T3细胞，辐照源为X射线或者γ射线，优选为γ射线，辐照剂量为30～50Gy，优选为35Gy。具体的，将辐照后的NIH-3T3细胞按照2×104个/cm2接种在培养容器例如48孔板、24孔板、12孔板、6孔板或者T25细胞培养瓶中，待细胞贴壁后备用。
(3)从肺癌组织分离得到原代肺癌上皮细胞。
原代肺癌上皮细胞例如可以来源于肺癌组织样本和肺癌穿刺或者肺支气管内镜样本。肺癌组织样本例如来源于进行过说明并获得同意的肺癌肿瘤患者手术切除的癌组织样本，肺癌穿刺或者支气管内镜样本例如来源于进行过说明并获得同意的肺癌肿瘤患者进行活体检查时所取的穿刺或者支气管内镜样本。在患者手术切除或活检后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm3以上，将其置于预冷的3-5mL DMEM/F12培养基中，培养基盛在塑料无菌带盖离心管内，冰上运输至实验室；其中，DMEM/F12培养基中含有1-2体积％青霉素/链霉素、和/或0.2-0.4体积％Primocin(以下简称组织运输液)。当使用链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25～400μg/mL，优选为50～200μg/mL，更优选为200μg/mL，青霉素浓度范围为25～400U/mL，优选为50～200U/mL，更优选为200U/mL；当使用Primocin时，浓度范围为25～400μg/mL，优选为50～200μg/mL，更优选为100μg/mL。
在生物安全柜内，将组织样本转移至细胞培养皿内，用运输液润洗组织样本，将组织样本表面的血细胞清洗掉。将润洗后的组织样本转移至另一个新的培养皿内，加入1-3mL运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm3的组织碎块。
将组织样本碎块转移至离心管内，用台式离心机(Sigma公司3-18K)以1000～3000转/分钟离心3～5分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量约为每10mg组织使用5mL组织消化液，其中组织消化液的配制方法为：将1～2mg/mL胶原酶Ⅱ、1～2mg/mL胶原酶Ⅳ、50～100U/mL脱氧核糖核酸Ⅰ、0.5～1mg/mL透明质酸酶、0.1～0.5mg/mL氯化钙、5～10mg/mL牛血清白蛋白溶于体积比1:1的HBSS和RPMI-1640中)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、200～300转恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)消化，每间隔1小时观察消化是否完成；若未见明显组织块即可终止消化，否则继续消化，直至消化充分，消化时间范围为4～8小时。消化完成后，细胞滤网(细胞筛孔径为例如70μm)过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，用台式离心机以1000～3000转/分钟离心3～5分钟。弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加1～5mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解10～20分钟，5分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出，以1000～3000转/分钟离心3～5分钟。弃上清，加入本发明的原代细胞培养基重悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。
(4)在预接种有滋养细胞的培养器皿内接种步骤(3)中分离得到的原代肺癌上皮细胞，并采用步骤(1)中的原代细胞培养基进行培养。
更具体而言，预先在多孔板的一个孔中按2×104～4×104个/cm2(例如2×104个/cm2)的密度接种35Gy辐照剂量γ射线辐照后的NIH-3H3细胞，待细胞贴壁后，按2×104～8×104个/cm2(例如4×104个/cm2)的密度接种原代肺癌肿瘤细胞，每孔加入0.5～2mL原代上皮细胞培养基，在例如37℃、5％CO2的条件下于细胞培养箱中培养8-16天，期间每4天换成新鲜的原代细胞培养基，在原代肺癌上皮细胞长至占多孔板底面积80％～90％左右的细胞密度时进行消化传代。
该步骤相比类器官技术，无需在冰上将原代细胞和基质胶混匀后形成胶滴，并等待胶滴凝固后加入培养基。此外，还节约了价格昂贵的细胞外基质胶的使用量，简化了操作步骤。
任选地，接种后的原代肺癌上皮细胞在培养8～16天后，当培养容器内形成的细胞克隆汇合达到底面积80％，弃去上清，加入1～2mL0.25％胰酶(购自Thermo Fisher公司)消化1分钟，随后吸出0.25％胰酶，再加入1～2mL 0.05％胰酶进行细胞消化，室温下孵育5～20分钟；然后用含有例如5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的培养液2～4mL重悬消化处理后的细胞，以1000～3000转/分钟离心3～5分钟，使用本发明的原代细胞培养基将消化后的单细胞重悬，将所得到的细胞悬液置入预铺有滋养细胞的T25细胞培养瓶中继续扩大培养。T25细胞培养瓶的预处理操作同步骤(2)。
扩增的肺癌上皮细胞呈2D生长，避免了类器官技术扩增出现的类器官大小不均一和生长过大的类器官出现内部坏死等情况。
另一方面，由本发明的原代肺癌上皮细胞的培养方法培养得到的肺癌上皮细胞、特别是肺癌肿瘤细胞，能够用于药物的疗效评估和筛选，所述方法包括以下步骤：
(1)获取原代肺癌上皮细胞，特别优选获取源自肺癌患者的癌组织样本或活检癌组织样本，分离得到原代肺癌上皮细胞，根据如上所述的原代肺癌上皮细胞的培养方法培养并扩增原代肺癌上皮细胞(特别是原代肺癌肿瘤细胞)达至少105数量级、优选至少106数量级的细胞数目。
(2)选定需要检测的药物。
(3)药物以其最大血浆浓度Cmax为参考，以2-5倍Cmax为起始浓度，稀释多个不同的药物浓度梯度，例如5-10个、优选6-8个药物浓度梯度。
(4)将步骤(1)中培养得到的肺癌上皮细胞消化成单细胞悬液，用流式图像计数仪进行计数，用本发明的原代细胞培养基将单细胞悬液稀释，按每孔2000-4000个的密度将稀释后的细胞悬液均匀地加入到多孔板内，例如每孔50μL细胞稀释液，并进行过夜贴壁。
该步骤避免了细胞重编程技术出现的由于饲养细胞的存在而干扰原代细胞计数和后续的原代细胞活力检测的问题，也无需像类器官技术一样，在冰上将细胞悬液与基质胶混合包埋再铺板的繁琐步骤，从而大大简化了操作流程，增强了技术的可操作性和实用性。由于接种的细胞为单细胞悬液而不是像类器官一样的3D结构，所以该技术与类器官技术相比，铺板的细胞数更加均一，铺板产生的孔间细胞数差异小，也更适合进行后续的高通量药物筛选操作。
(5)采用高通量自动化工作站，对步骤(4)中得到的贴壁细胞添加梯度稀释后的所选定的传统化疗药物、靶向药物、抗体药物或几种药物组合等候选药物，进行处理。
(6)加药处理数小时后，例如72小时后，采用Cell-Titer Glo发光法细胞活力检测试剂盒(购自Promega公司)检测肺癌上皮细胞的存活率，进行药物活性筛选。
具体而言，向每孔加入例如10μL Cell Titer-Glo试剂(购自Promega公司)，均匀震荡后，用荧光酶标仪测量各孔的化学发光强度，根据测得的数值，以药物浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，应用GraphPad Prism软件绘制药物量-效曲线，计算各个药物对所测试细胞的增殖的抑制强度。
在本发明的原代肺癌肿瘤细胞在药物筛选和体外药物敏感性检测的应用中。由于细胞呈2D生长，与药物的作用时间也比类器官技术的药物检测时间短(类器官技术的平均给药时间为6天)。
本发明的有益效果还包括：
(1)提高原代肺癌上皮细胞培养的成功率，成功率达到85％以上；
(2)保证体外原代培养的肺癌上皮细胞能够保持原代细胞来源病人的病理表型和异质性；
(3)培养基成分不含血清，所以不受不同批次血清质量和数量的影响；
(4)扩增肺癌上皮细胞效率高，只要有104级别的细胞数量就可在两周左右时间内成功扩增出106数量级的肺癌上皮细胞，扩增出的肺癌上皮细胞还可以连续传代；
(5)传代步骤无需冰上操作和解离基质胶，10-15分钟内即可完成细胞的消化传代；
(6)培养成本可控：原代肺癌癌培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂等因子，节约了细胞培养的成本；
(7)操作便捷，该技术相比类器官技术，无需像类器官技术一样将细胞包埋于基质胶内，所述技术操作步骤简便易行；
(9)所述技术培养获得的肺癌上皮细胞数量大，均一化程度高，适合高通量筛选新候选化合物，并为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。
采用本实施方式的细胞培养基，可培养来源于包括人的或其他哺乳动物的肺癌上皮细胞，包括肺癌肿瘤细胞、正常肺癌上皮细胞、肺癌上皮干细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织。同时本发明技术的培养基还可以用于开发体外肺癌原代细胞扩增培养的试剂盒。
另外，通过本实施方式的培养方法获得的细胞可应用于再生医疗、肺癌上皮细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、以及来源于肺癌疾病的新药研发等。
附图说明
图1A-1F为显示培养基中不同因子对肺癌原代细胞增殖的影响的图。
图2是显示培养基中不同因子递增对肺癌原代细胞增殖的影响的图。
图3A-3G是显示各添加因子的浓度对肺癌原代细胞增殖的影响的图。
图4A和4B是将从1例肺癌临床组织样本(编号0B0003)分离得到的细胞采用本发明的培养基LM分别培养至第5天和第10天的肺癌肿瘤细胞在倒置显微镜下拍摄的照片。
图5是16例样本初次培养周期和所得细胞数的汇总图。
图6是从8例肺癌穿刺样本(编号0B0002、0B0004、0B0006、0B0009、0B0010、0B0011、0B0012、0B0013)分离得到的细胞在LM培养基条件下持续培养得到的生长曲线图。
图7是将从1例肺癌临床组织样本(编号0B0004)分离得到的细胞分别采用5种不同培养基条件下培养所获得的细胞总数图。
图8是将从1例肺癌临床组织样本(编号0B0004)分离得到的细胞分别采用5种不同培养基条件下培养所获得的细胞生长曲线对比图。
图9A是从1例肺癌手术切除样本(编号0B0015)分离得到的细胞采用本发明的培养基LM培养获得肺癌肿瘤细胞后，使用非特异性荧光染料DAPI染细胞核的图片，图9B是将如上所述获得的肺癌肿瘤细胞使用肺腺癌特异性抗体NapsinA染色的图片，图9C是图9A和图9B合并后得到的图片。
图10A-10D是从1例肺癌手术切除样本(编号0B0004)的原始组织细胞和采用该细胞以本发明的培养基LM培养而获得的肺癌肿瘤细胞的免疫组化结果对比图。
图11表示从同一例肺癌患者的穿刺得到的癌组织样本(编号0B0011)采用本发明的培养基LM培养至第一代和第五代的肺癌肿瘤细胞对不同靶向药物的剂量-效应曲线图。
具体实施方式
本说明书中，上皮细胞包括从上皮组织获取的已分化的上皮细胞及上皮干细胞。“上皮干细胞”是指具有长期的自我更新能力和向上皮细胞分化的细胞，是指来源于上皮组织的干细胞。作为上皮组织，可例举例如角膜、口腔粘膜、皮肤、结膜、膀胱、肾小管、肾脏、消化器官(食道、胃、十二指肠、小肠(包括空肠及回肠)、大肠(包括结肠))、肝脏、胰脏、乳腺、唾液腺、泪腺、***、毛根、气管、肺等。其中，本实施方式的细胞培养基较好是用于来源于肺癌上皮细胞的培养基。
此外，本说明书中，“上皮肿瘤细胞”是指来源于上述的上皮组织的细胞肿瘤化而得的细胞。
本说明书中，“类器官”是指通过使细胞在受控的空间内高密度地自发组织和聚集而成的三维立体的、类似于器官的细胞组织体。
[MST1/2激酶抑制剂的制备实施例]
本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制剂例如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结构具有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST2结合并降低其活性的化合物。
1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧 代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺1
2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。
2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃，接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系在室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留物经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。
2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经***洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。
2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2克)和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9毫升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经***洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H325.0。
4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应结束后，过滤，甲醇和***洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。
2.本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备
本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法合成，其结构及质谱数据如下表所示。
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[实施例1]
人原代肺癌上皮细胞的分离
肺癌组织样本来源于三例进行过说明并获得同意的肺癌肿瘤患者手术切除癌组织样本，它们分别是样本编号0B0010、0B0011、0B0012。下面以其中一例样本(编号0B0010)进行说明。
在患者手术切除或活检后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm3以上，将其置于预冷的4mL组织运输液(具体配制见表1)中，运输液盛在5mL塑料无菌带盖冻存管(购自广州洁特生物)内，冷链(0-10℃)运输至实验室。
表1组织运输液配方
表2组织消化液配方
组织消化液成分 供应商 终浓度
HBSS Gibco 50％(体积)
RPMI-1640 康宁 50％(体积)
胶原酶Ⅱ Sigma 2mg/mL
胶原酶Ⅳ Sigma 2mg/mL
脱氧核糖核酸Ⅰ Sigma 50U/mL
透明质酸酶 Sigma 0.5mg/mL
氯化钙 上海生工 0.33mg/mL
牛血清白蛋白 上海生工 10mg/mL
在生物安全柜内，将组织样本(编号0B0010)转移至100mm细胞培养皿(购自NEST公司)内，用组织运输液润洗组织样本，将组织样本表面的残留的血液清洗掉，并剔除组织样本表面的脂肪等多余的组织。将润洗后的组织样本转移至另一个新的100mm培养皿内，加入2mL运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm3的组织碎块。
将组织样本碎块转移至15mL离心管内，用台式离心机(Sigma公司3-18K)以1500转/分钟离心4分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量约为每10mg组织使用5mL组织消化液，具体配制见表2)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、300转恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)消化，每间隔1小时观察消化是否完成。
消化完成后，70μm滤网过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，1500转/分钟离心4分钟。
弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加3mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解15分钟，5分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出，以1500转/分钟离心4分钟。弃上清，得到消化分离后的肺癌原代细胞，加入基础培养基(BM)重悬，其中，基础培养基是由市售的DMEM/F-12培养基中加入0.2体积％Primocin(购自Invivogen公司，浓度为50mg/mL)，以得到100μg/mL的最终浓度。使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数为10万。
另外两例肺癌肿瘤组织样本按照以上同样的方法进行分离，得到的细胞总数分别为10万(0B0011)和8万(0B0012)。
[实施例2]
原代肺癌上皮细胞培养基的优化
(1)不同因子的作用
以0.25％胰酶(购自Thermo Fisher公司)将培养的NIH-3T3细胞(购自ATCC，使用含10％的胎牛血清的DMEM培养液进行培养)消化，用含有5％(v/v)胎牛血清(购自依科赛公司)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液(购自康宁公司)终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用上述含10％的胎牛血清的DMEM培养液重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，用35Gy辐照剂量γ射线进行辐照，随后按2×104个/cm2的密度接种至培养器皿中。在37℃培养箱内培养，待细胞贴壁。接种原代细胞前，移除培养器皿中培养基。
配制基础培养基(缩写为BM)：向市售的DMEM/F-12培养基中加入0.2体积％Primocin(购自Invivogen公司，浓度为50mg/mL)，以得到100μg/mL的最终浓度，配制得到BM。
接着，在基础培养基(BM)中分别加入不同种类和不同浓度的添加剂因子(表3)，配制成含有不同添加成分的肺癌上皮细胞培养基。
表3不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)
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将不同成分的培养基按500μl/孔体积加入预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的48孔培养板内。将按照实施例1相同方法从肺癌组织分离得到的肺癌肿瘤细胞(编号0B0014)以4×104个/孔的细胞数量接种在上述预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的48孔培养板内，表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)，使相同数量的新鲜分离的肺癌肿瘤细胞(编号0B0014)在不同的培养基配方条件下进行培养。培养开始后每4天进行一次培养基的更换和滋养细胞的补充。培养7天后，进行细胞计数。其中，作为实验对照，使用未添加任何添加剂的基础培养基(BM)。将结果示于图1A-F。
图中纵坐标表示不同培养基培养之后得到的细胞数与基础培养基BM培养之后得到细胞数的比值。如图所示，在BM基础上加入表3中不同浓度不同因子对细胞增殖产生不同的作用。其中，在特定浓度范围下，B27添加剂、N2添加剂、胰岛素-转铁蛋白-硒复合物、肝细胞生长因子、胰岛素样本生长因子1、成纤维细胞生长因子7、神经调节蛋白-1、化合物1和Y27632对细胞增殖有一定的促进作用。
(2)培养基中不同因子递增对本专利方法获得的肺癌原代细胞增殖的影响
向基础培养基BM中分别依次递加不同小分子、添加剂以及生长因子(表4)，配制成含有不同添加成分的肺癌上皮细胞培养基。
表4不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)
将不同成分的培养基按500μl/孔体积加入预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的48孔培养板内，同时将BM培养基作为实验对照。将按照实施例1的方法从肺癌组织分离得到的肺癌肿瘤细胞(编号0B0016)以4×104个/孔的细胞数量接种在上述预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的48孔培养板内，表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)，使相同数量的新鲜分离的肺癌肿瘤细胞(编号0B0016)在不同的培养基配方条件下进行培养。培养7天后，进行细胞计数。将实验结果示于图2。
如图所示，确定NO.7为本专利最优选的培养基用于培养扩增肺癌原代细胞(下文缩写为LM)。
(3)所添加因子的不同浓度对本专利获得的肺癌原代细胞的增殖作用
使用与实施例1同样的方法从肺癌患者的癌组织(样本编号0B0002)中分离获得癌组织来源的肺癌上皮细胞。接着，将癌组织来源的肺癌肿瘤细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×104个/cm2密度接种至预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的12孔板内。向12孔板中添加2mL制备好的上述原代肺癌上皮细胞培养基NO.7(LM)，置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)中进行培养。在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去12孔板内的培养基上清，加入0.5mL0.25％胰酶(购自Thermo Fisher公司)消化1分钟，随后吸出0.25％胰酶，再加入0.5mL0.05％胰酶进行细胞消化，室温下孵育5～20分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOSM500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用基础培养基BM重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。所得细胞用于以下培养实验。
接着，配制以下7种配方培养基进行实验：
配方1：培养基LM组分中不含化合物1；
配方2：培养基LM组分中不含Y27632；
配方3：培养基LM组分中不含***1；
配方4：培养基LM组分中不含肝细胞生长因子；
配方5：培养基LM组分中不含胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；
配方6：培养基LM组分中不含表皮细胞生长因子；
配方7：培养基LM组分中不含神经调节蛋白-1。
分别使用上述配方1～7来稀释上述消化后的细胞悬液，按照每孔1万细胞，250微升体积种入预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的48孔板中。
在使用配方1的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的化合物1每孔250微升，化合物1的终浓度分别为40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM；并使用配方1的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方2的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的Y27632每孔250微升，Y27632的终浓度分别为40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM；并使用配方2的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方3的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的***1每孔250微升，***1的终浓度分别为80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml；并使用配方3的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方4的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的肝细胞生长因子每孔250微升，肝细胞生长因子的终浓度分别为80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml；并使用配方4的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方5的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物每孔250微升，胰岛素-转铁蛋白-硒复合物的终浓度分别为1:1600、1:800、1:400、1:200、1:100、1:50、1:25；并使用配方5的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方6的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的表皮细胞生长因子每孔250微升，表皮细胞生长因子的终浓度分别为80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方7的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的神经调节蛋白-1每孔250微升，神经调节蛋白-1的终浓度分别为80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml；并使用配方7的培养基设置对照孔(BC)。
待细胞扩增至48孔的85％左右消化计数，分别参比对照孔(BC)细胞数计算比值，将结果分别示于图3A～3G。图3A～图3G中，比值为使用各培养基培养一代得到的细胞数与对应的对照孔培养一代得到的细胞数的比。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基；比值小于1，则说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基促增殖效果弱。
根据图3A～3G的结果，化合物1的含量优选为0.625μM～20μM，更优选为0.625μM～10μM；Y27632的含量优选为1.25μM～20μM，更优选为2.5μM～10μM；***1的含量优选为1.25ng/ml～80ng/ml，更优选为5ng/ml～80ng/ml；肝细胞生长因子的含量优选为5ng/ml～80ng/ml，更优选为20ng/ml～80ng/ml；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物的体积浓度优选为1:25～1:200(胰岛素/转铁蛋白/***钠各自的含量分别为2.5～20μg/ml-1.25～10μg/ml-1.25～10ng/ml)，更优选1:25～1:50(胰岛素/转铁蛋白/***钠各自的含量分别为10～20μg/ml-5～10μg/ml-5～10ng/ml)；表皮细胞生长因子的含量优选为10ng/ml～80ng/ml，更优选为10ng/ml～40ng/ml；神经调节蛋白-1在培养基中的含量优选为10～80ng/ml，更优选20～80ng/ml。
[实施例3]
人肺癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞的培养
使用与实施例1同样的方法从肺癌患者的癌组织(样本编号0B0003)中分离获得癌组织来源的肺癌上皮细胞。接着，将癌组织来源的肺癌肿瘤细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×104个/cm2密度接种至预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的12孔板内。向12孔板中添加2mL制备好的原代肺癌上皮细胞培养基LM，置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)中进行培养。
图4A是本实施例按4×104个/cm2密度接种预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的12孔板，自接种开始后培养至第5天的镜下照片(100倍倒置相差显微镜拍照)。镜下观察可见，所培养的癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞已经形成较大克隆。图4B是本实施例自接种后培养第10天的镜下照片(100倍倒置相差显微镜拍照)，视野中细胞已经长满。从图4A和4B两张图可以看出，分离后得到肺癌原代细胞在体外培养5天在镜下就可以看到明显的克隆形成，并且经过10天的扩增，细胞数目得到显著的扩增，提示本发明技术是一种高效的体外扩增肺癌上皮细胞的技术。
[实施例4]
肺癌初次培养周期和细胞数统计及Population Doubling(PD)值计算
按照实施例1的方法消化肺癌穿刺组织样本(样本编号0B0001～0B0016号)获得肺癌原代细胞。对于所获得的肺癌原代细胞，使用LM培养基，按照活细胞密度4×104个/cm2将细胞接种在12孔板中并进行培养，待细胞扩增至85％后消化并计数，同时记录直至消化时培养的天数，将该直至消化时培养的天数作为一个培养周期。如图5所示，16例肺癌样本培养起始时的平均细胞数是7.2万，首次扩增后得到的平均细胞数是121.2万，所需平均培养周期是12.6天。
在该实验条件下持续培养样本编号0B0002、0B0004、0B0006、0B0009、0B0010、0B0011、0B0012、0B0013总共8例样本，将扩增所得的细胞进行不同代数扩增，每一代进行消化后计数并记录相应培养的周期，根据公式Population Doubling(PD)＝3.32*log10(消化后细胞总数/初始种入细胞数)计算PD，如图6所示，横坐标表示细胞培养的天数，纵坐标是累计的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数，数值越大表示细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞数也就越多，斜率代表的是细胞扩增的速率。
从图6可以看出，使用本发明的肺癌原代细胞培养基对上述8例样本进行培养时，扩增58天后的细胞扩增速率基本保持不变，仍具有继续扩增的能力。
[实施例5]
不同培养基对肺癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞的促增殖效果
(1)不同培养基对初代原代细胞增殖效果的比较
使用与实施例2同样的方法制备原代肺癌上皮细胞培养基LM，和作为对照的基础培养基BM。另外制备细胞条件重编程技术文献中所用培养基FM作为另一对照例，配制步骤参见(Liu等，Nat.Protoc.，12(2):439-451，2017)，培养基配方见表5。同时，作为另外对照例，制备肺癌原代细胞培养基LM1，配方是在LM基础上使用1:50体积比的B27添加剂替换胰岛素-转铁蛋白-硒复合物。此外，作为另一对照例，自STEMCELL公司购买商品化培养基EpiCultTM Plus Medium，以下也称“Epi培养基”)，培养基配方见表6。
表5细胞条件重编程技术文献中所用培养基(FM)成分
表6商品化培养基EpiCultTM Plus Medium(Epi)成分
培养基成分 供应商 终浓度
EpiCultTM Plus Basal Medium STEMCELL 99体积％
EpiCultTM Plus Supplement STEMCELL 1体积％
使用与实施例1同样的方法获得肺癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞(编号0B0006)。接着，按照相同的密度(4×104个/cm2)分别在以下5种培养条件下培养：
A.本发明技术：按4×104个/cm2接种密度将原代肺癌肿瘤细胞接种至预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞(购自ATCC公司)的24孔板内，采用1mL的本发明的原代肺癌上皮细胞培养基LM进行培养；
B.细胞条件重编程技术：按4×104个/cm2接种密度将原代肺癌肿瘤细胞接种至预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞(购自ATCC公司)上，采用1mL细胞条件重编程技术培养基FM在24孔板中进行培养(具体步骤参见(Liu等，Nat.Protoc.，12(2):439-451，2017)；
C.按4×104个/cm2接种密度将原代肺癌肿瘤细胞接种至预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞(购自ATCC公司)的24孔板内，采用1mL的培养基LM1在24孔板中进行培养；
D.按4×104个/cm2接种密度将原代肺癌肿瘤细胞接种至24孔板内，采用1mL的商品化培养基Epi在24孔板中进行培养。
E.按4×104个/cm2接种密度将原代肺癌肿瘤细胞接种至预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞(购自ATCC公司)的24孔板内，采用1mL的基础培养基BM在24孔板中进行培养。
上述五种培养中，每5天对五种培养条件下培养的细胞进行换液。同时观察24孔板中各培养基培养下细胞形成克隆和细胞增殖状态，使用显微镜(Invitrogen公司EVOSM500)进行拍照记录细胞生长状况。
对于采用本发明技术培养的原代肺癌肿瘤细胞(编号0B0006)，分别在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去24孔板内的培养基上清，加入0.5mL 0.25％胰酶(购自Thermo Fisher公司)消化1分钟，随后吸出0.25％胰酶，再加入0.5mL 0.05％胰酶进行细胞消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用本发明的培养基重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数为44.6万。另4种培养条件下培养的细胞采用如上述同样的操作方式进行消化和计数，使用培养基FM、LM1、Epi和BM培养得到的细胞总数分别是29.6万、39.6万、25万和6.9万。
图7是编号0B0006细胞在不同条件下扩增的到的细胞总数作图。
(2)不同培养基对原代肺癌肿瘤细胞的持续培养和生长曲线的绘制
使用与本实施例(1)中同样的方法获得原代肺癌上皮细胞培养基LM，以及作为对照的培养基FM、LM1、Epi和BM。
使用与本实施例(1)中同样的方法将肺癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞(编号0B0004)分别在五种培养基培养，并进行消化传代和计数。
当传代后的细胞在培养板内生长再次达到约80％板底面积时，再次按上述操作方法消化收集所培养获得的细胞并计数。同样按4×104个/孔密度接种并持续培养。
以下为原代肺癌上皮细胞在不同技术培养条件下细胞的扩增倍数(PopulationDoubling)的计算公式：
Population Doubling(PD)＝3.32*log10(消化后细胞总数/初始种入细胞数)，公式参见(Chapman等，Stem Cell Research&Therapy 2014,5:60)。
如图8所示是采用Graphpad Prism软件绘制的五种不同培养条件下的细胞0B0004的生长曲线。横坐标表示细胞培养的天数，纵坐标是累计的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数，数值越大表示细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞数也就越多，斜率代表的是细胞扩增的速率。从图中可以确认本发明培养基LM以及LM1培养的肺癌上皮细胞的增殖速率优于其他三种培养条件，同时可以确认本发明技术可以对原代肺癌上皮细胞进行持续培养。
[实施例6]
癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞的鉴定
(1)原代肺癌组织和传代培养后的肺癌细胞免疫荧光鉴定
使用与实施例1同样的方法从肺癌患者的癌组织(样本编号0B0015)中分离获得癌组织来源的肺癌上皮细胞。接着，将癌组织来源的肺癌肿瘤细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×104个/cm2密度接种至预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的24孔板内，同时24孔板中预先放置用于免疫荧光染色的圆形细胞破片(购自赛默飞公司)。向24孔板中添加1mL制备好的原代肺癌上皮细胞培养基LM，置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)中进行培养。
待24孔板中细胞扩增80％底面积时，弃培养液，使用4％甲醛冰上固定细胞30分钟。PBS(购自上海生工)洗5分钟x 3次。弃PBS，加入通透液，避光下，摇床(100rpm左右)破膜30分钟，PBS洗5分钟x 3次。随后使用PBS+0.3％Triton X-100(购自上海生工)配制5％体积浓度的BSA(购自上海生工)溶液用于封闭，37℃封闭30分钟。
提前配制PBS+0.3％Triton X-100用于稀释抗体，按照1:50比例稀释肺腺癌特异性抗体NapsinA(购自CST公司)，弃封闭液，加入配制好的一抗稀释液，至4℃冰箱孵育过夜。4℃取出，平衡至室温，37℃继续孵育1小时，PBS洗5分钟x 3次。
提前配制PBS+0.3％Triton X-100用于二抗稀释，按照1:1000比例稀释激发光为488nm且种属为鼠的荧光二抗(购自赛默飞公司)，常温避光孵育1小时，PBS洗5分钟x 3次。
用PBS按照1:1000体积比稀释非特异性荧光染料DAPI(购自Sigma公司)，常温避光染色5分钟，PBS洗5分钟x 3次。显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下成像，拍照记录。
图9A-C分别为10倍物镜下不同条件下拍照的图片，其中图9A是使用非特异性荧光染料DAPI染细胞核的图片，图9B是使用肺腺癌特异性抗体NapsinA(定位在胞浆)染色的图片。图9C是将图9A和9B合并得到的图片。如图所示，在图9A中标记细胞核的位置在图9B中的胞浆均能被特异性抗体标记，表明培养后的细胞为肺腺癌细胞，与临床病理诊断一致。
(2)原代肺癌组织和传代培养后的肺癌细胞免疫组化鉴定
从一例肺癌患者的临床手术切除样本取出约绿豆粒大小的癌组织(样本编号0B0004)，浸泡在1mL 4％多聚甲醛中固定。剩余癌组织使用与实施例1相同的方法获得肺癌上皮细胞(样本编号0B0004)。使用实施例3的方法采用本发明的培养基LM将样本0B0004持续培养至第5代。
采用免疫组化法检测样本0B0004原始组织和持续培养至第3代得到的原代细胞中与肺癌相关的重要生物标记物的表达。4％多聚甲醛固定后的组织，经石蜡包埋，用切片机切成4μm厚的组织切片。随后进行常规的免疫组织化学检测(具体步骤参见Li等，NatureConmunication，(2018)9:2983)。所使用的一抗为甲状腺转录因子1(TTF-1)(购自CST公司)和ki-67抗体(购自R&D公司)。
图10A-10D是原始组织细胞和采用该细胞以本发明的培养基LM培养而获得的肺癌肿瘤细胞的免疫组化结果对比图。图10A和图10B分别是肺癌组织和扩增培养后得到的细胞标记甲状腺转录因子1抗体的图片，图10C和图10D分别是肺癌组织和扩增培养后得到的细胞标记ki-67抗体的图片。由此可以确认，采用本发明技术培养的肺癌肿瘤细胞(样本编号0B0004)培养至第5代时，细胞上与肺癌相关的生物标记物的表达情况与细胞来源的原始组织切片的标记物表达情况基本一致。说明采用本发明技术所培养的细胞保持了肺癌病人癌组织的原始病理特性。
[实施例7]
癌组织来源的原代肺癌肿瘤细胞在小鼠体内的异种移植成瘤实验
使用与实施例1同样的方法从一例病理诊断为肺癌患者的癌组织中分离获得肺癌肿瘤细胞(编号0B0003)，按照实施例3的方法采用本发明的培养基LM对0B0003进行培养，待肺癌肿瘤细胞数量达到1×107个时，采用实施例5的方法对肺癌肿瘤细胞进行消化，并收集。采用本发明的肺癌肿瘤细胞培养基LM和(购自BD生物科技公司)按照1:1混匀，吸取100μL与Matrigel基质胶混匀后的培养基将5×106个肺癌肿瘤细胞重悬，分别注射入6周大的雌性高度免疫缺陷小鼠(NCG)小鼠(购自南京模式动物研究所)的肺癌脂肪垫和右前肢腋下部位，每三天观察一次肺癌肿瘤细胞在小鼠体内形成肿瘤的体积和生长速率。
在肿瘤细胞接种后的第15天可观察到小鼠的两处肿瘤细胞接种部位均有瘤体形成，自第15天起至第36天，小鼠体内肿瘤增殖明显。这说明采用本发明的培养方法所培养的癌组织来源的肺癌肿瘤细胞在小鼠体内具有成瘤性。
[实施例8]
癌组织来源的肺癌肿瘤细胞的药物敏感性功能测试
下面以肺癌患者穿刺样本为例，说明由病人来源的肺癌肿瘤样本培养得到的肺癌肿瘤细胞可以用于检测病人肿瘤细胞对不同药物的敏感性。
一、原代肺癌肿瘤细胞的铺板：按照实施例1中方法得到的分离后的肺癌肿瘤细胞(编号0B0011)细胞悬液，按照4×104个/cm2密度接种至预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的6孔板内。向6孔板中添加2mL制备好的原代肺癌上皮细胞培养基LM，置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)中进行培养。在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去6孔板内的培养基上清，加入1mL 0.25％胰酶(购自Thermo Fisher公司)消化1分钟，随后吸出0.25％胰酶，再加入1mL 0.05％胰酶进行细胞消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液2mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用LM培养基重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到第一代细胞总数为160万。按2000～4000个/孔密度接种于384孔板中，使细胞贴壁过夜。剩下的细胞继续按照4×104个/cm2密度接种至预铺有γ射线辐照过后的NIH-3T3细胞的6孔板内进行持续传代4次，按照上述方法进行消化和终止消化，重悬细胞后使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到第五代细胞总数为180万。按2000～4000个/孔密度接种于384孔板中，使细胞贴壁过夜。
二、药物梯度实验：
(1)采用浓度梯度稀释的方法配制药物贮存板：分别吸取40μL的10μM待测药物母液作为最高浓度，再分别从中吸取10μL加入到含20μL的DMSO的0.5mL的EP管中，再从上述EP管中吸取10μL到第二个已装有20μL的DMSO的0.5mL的EP管中，即按照1:3稀释药品。重复以上方法，依次稀释，最后得到加药所需的7种浓度。将不同浓度的药物加入384孔药物储存板中。溶剂对照组各孔加入等体积的DMSO作为对照。本实施例中，待测药物为阿法替尼(购自MCE公司)、吉非替尼(购自MCE公司)、奥希替尼(购自MCE公司)和克唑替尼(购自MCE公司)。(2)使用高通量自动化工作站(Perkin Elmer公司JANUS)将384孔药物贮存板内的不同浓度药物和溶剂对照加入到铺有肺癌肿瘤细胞的384孔细胞培养板中，药物组和溶剂对照组都各设3个复孔。每孔加入药物体积为100nL。
(3)细胞活性检测：给药72小时后，用Cell Titer-Glo检测试剂(购自Promega公司)检测加药培养后细胞的化学发光数值，化学发光数值的大小反映细胞活力以及药物对细胞活力的影响，每孔加入10μL配制好的Cell Titer-Glo检测液，混匀后使用酶标仪(Perkin Elmer公司Envision)检测化学发光数值。
(4)细胞活性检测：按照公式细胞存活率(％)＝加药孔化学发光数值/对照孔化学发光数值*100％，计算得到不同药物作用细胞后的细胞存活率，使用Graphpad Prism软件作图并计算半数抑制率IC50，同时计算不同药物在人体内最大血药浓度Cmax对应下的细胞存活率。
(5)药物敏感性测试结果如图11所示。
图11表示从同一个肺癌患者的手术切除癌组织样本(编号0B0011)所培养获得的第1代肺癌肿瘤细胞和第5代肺癌肿瘤细胞，对靶向药物阿法替尼、吉非替尼、奥希替尼和克唑替尼的敏感性。图中横坐标上标线对应的浓度为这四种药物在人体内最大血药浓度Cmax。结果显示，同一病人的细胞对不同药物在人体内最大血药浓度时的敏感性不同，不同代数的细胞对同一种药物的敏感性基本一致。根据结果可以判断肺癌病人在临床使用该种药物时的有效性，同时可以说明根据本专利培养方法得到不同代数的肿瘤细胞对药物的敏感性是稳定的。
工业应用性
本发明提供一种用于在体外培养或扩增原代肺癌上皮细胞的培养基及培养方法，可将培养得到的细胞应用于药物的疗效评估和筛选。因而，本发明适于工业应用。
尽管本文对本发明作了详细说明，但本发明不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于培养肺癌上皮细胞的原代细胞培养基，其特征在于：
含有0.625～20μM MST1/2激酶抑制剂；1.25～80ng/ml***1；10～80ng/ml表皮细胞生长因子；5～80ng/ml肝细胞生长因子；10～80ng/ml神经调节蛋白-1；体积比为1:200～1:25的选自胰岛素-转铁蛋白-硒复合物、B27添加剂和N2添加剂中的至少一种的添加剂；1.25～20μM选自Y27632、法舒地尔、和H-1152中的至少一种的ROCK激酶抑制剂，
所述MST1/2激酶抑制剂是或其药学可接受的盐、或溶剂化物。
2.如权利要求1所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述MST1/2激酶抑制剂的含量为0.625～10μM。
3.如权利要求1或2所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述***1的含量为5～80ng/ml；
所述表皮细胞生长因子的含量为10～40ng/ml；
所述肝细胞生长因子的含量为20～80ng/ml；
所述神经调节蛋白-1的含量为20～80ng/ml；
所述添加剂的含量为体积比1:50～1:25；
所述ROCK激酶抑制剂的含量为2.5～10μM。
4.如权利要求3所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述添加剂为胰岛素-转铁蛋白-硒复合物，其中胰岛素/转铁蛋白/***钠各自的含量分别为2.5～20μg/ml，1.25～10μg/ml，和1.25～10ng/ml。
5.如权利要求4所述的原代细胞培养基，其特征在于：胰岛素/转铁蛋白/***钠各自的含量分别为10～20μg/ml，5～10μg/ml，和5～10ng/ml。
6.如权利要求3所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述ROCK激酶抑制剂为Y27632。
7.如权利要求1或2所述的原代细胞培养基，其特征在于：
不含血清、牛垂体提取物、Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂、烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸。
8.如权利要求1或2所述的原代细胞培养基，其特征在于：
所述肺癌上皮细胞选自肺癌肿瘤细胞、正常肺癌上皮细胞、和肺癌上皮干细胞。
9.一种肺癌上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制如权利要求1～8中任一项所述的原代细胞培养基；
(2)用X射线或者γ射线辐照后的滋养细胞预铺培养器皿；
(3)在预铺有滋养细胞的培养器皿内接种从肺癌组织分离得到原代肺癌上皮细胞，使用步骤(1)中的所述原代细胞培养基进行培养。
10.一种评估或筛选用于治疗肺癌疾病的药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据权利要求9所述的培养方法培养得到肺癌上皮细胞；
(2)选定需要检测的药物，稀释成不同的药物浓度梯度；
(3)向步骤(1)培养得到的肺癌上皮细胞中添加梯度稀释后的所述药物，并进行细胞活力检测。
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