CN113969238A - 一种用于基因扩增荧光检测的便携式可视化成像*** - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于基因扩增荧光检测的便携式可视化成像***,包括阵列式反应芯片,荧光检测***,控制监测终端;所述荧光检测***包括成像设备,安装架,激发光源,可控温度台;所述安装架顶面设有视窗玻璃片,所述激发光源置于安装架一侧,所激发光源前方设有滤光片Ⅱ,所述滤光片Ⅱ前方设有准直透镜;所述安装架内部设有二向色镜,所述二向色镜与准直透镜的夹角为45°,所述可控温度台置于安装架底部,所述阵列式反应芯片置于可控温度台上方;所述可视化成像***完整的集核酸扩增和荧光检测为一体,便携、并能进行现场操作,大大降低了基因扩增荧光检测的时间和检测成本,有效节省人力和物力。
Description
技术领域
本发明属于检测设备及方法,具体是涉及一种用于基因扩增荧光检测的便携式可视化成像***。
背景技术
传统病菌的检测中,基因扩增产物的荧光检测技术融汇了基因特异性扩增、DNA杂交的特异性和光谱灵敏特异的优点,直接探测基因扩增产物的荧光,不需要做分离、衍生等后处理或另外检测,完全闭管操作。利用探针或引物修饰等途径,可以引入四氯荧光素(TET)、羧基荧光素(FAM)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等荧光基团。实时荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)(Quantitative Real-time PCR)技术在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和强度变化。荧光定量PCR法检测目标核酸可起到全封闭自动化检测,但是仪器昂贵,操作场地要求要求,检测成本高,限制了核酸检测的现场应用。
除了需要热循环的PCR技术,基因等温扩增技术也引入荧光探针,对基因的扩增过程或产物进行监测或检测。目前的基因扩增荧光检测方法多以实时检测荧光信号为主,具有激发光、发射光检测器和信号处理器,需要复杂的信号处理器和软件,不能便携和进行现场操作。如果对扩增产物进行终端检测,目前大多采用紫外手电筒或蓝光切胶仪等进行可视化成像检测,尚无完整的集基因扩增和荧光检测为一体的便携式可视化成像***,不能完成病菌的现场快速检测。
发明内容
为了弥补上述现有技术的不足,本发明提出一种用于基因扩增荧光检测的便携式可视化成像***,完整的集核酸扩增和荧光检测为一体,便携、并能进行现场操作,大大降低了基因扩增荧光检测的时间和检测成本,有效节省人力和物力。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的,一种用于基因扩增荧光检测的便携式可视化成像***,包括阵列式反应芯片,荧光检测***,控制监测终端;其技术要点是:所述荧光检测***包括成像设备,安装架,激发光源,可控温度台;
所述安装架一侧下部设有样品放置窗,所述安装架顶面设有视窗玻璃片,所述全透明视窗玻璃的透光度大于90%,厚度为0.5-2mm;所述全透明视窗玻璃片下方设有滤光片Ⅰ,所述滤光片Ⅰ波长为515-560nm;
所述激发光源置于安装架一侧,所述激发光源包括LED面阵列和LED阵列控制器,所述LED阵列波长范围为420-488nm;
所激发光源的LED面阵列前方设有滤光片Ⅱ,所述滤光片Ⅱ前方设有准直透镜,所述准直透镜为平凸透镜,所述准直透镜的焦距和准直透镜至LED阵列的距离相等;
所述安装架内部设有二向色镜,所述二向色镜与准直透镜的夹角为45°;所述二向色镜的波长为495nm或565nm;
所述可控温度台置于安装架底部,所述阵列式反应芯片置于可控温度台上方;
所述阵列式反应芯片由三层组成,从下至上依次为导热底层、反应中层、透光上盖,所述反应中层设有多个反应孔,所述底层材质玻璃或有机玻璃;反应中层材质为硅烷化处理后的聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷;透光上盖。
进一步的,所述可控温度台包括加热台、温度传感器、加热元件、PID控制器、直流电源和固态继电器;所述加热台置于加热元件上方,所述温度传感器***加热台内,所述温度传感器与PID控制器连接,所述固态继电器连接PID控制器、加热元件、直流电源。
进一步的,所述可视化成像***的应用方法包括以下步骤:
(1)制备检测样品
DNA扩增,获得检测样品;
(2)加样
将检测样品加载到用于基因扩增荧光检测的可视化成像***的阵列式反应芯片的反应孔中;
(3)获得检测结果
将阵列式反应芯片通过样品窗放进检测***中可控温度台上,所述可控温度台预设温度38℃,在反应的同时,可获得反应芯片中样品的荧光图像,绿色代表阳性扩增。
进一步的,成像***由相机和镜头组成,位于全透明视窗玻璃片上方,通过调节镜头焦距,使反应芯片位于镜头焦点上,通过相机拍摄反应芯片反应孔中的检测荧光物质的图像。
进一步的,控制监测终端为电脑或可移动式终端计算机。
本发明的有益效果:
(1)传统PCR-凝胶电泳检测需要对PCR产物进行额外的电泳检测,所需时间长,且存在加样错误或污染的风险。实时荧光PCR,需要复杂的数据采集组件,对发射光进行复杂计算,仪器成本高。采用本检测方法,可实现扩增与可视化成像同时进行,省略了扩增后再检测的时间,避免了吸取扩增产物可能带来的潜在污染。
(2)本发明采用的等温扩增技术,在38℃即可进行,且可同时观察扩增情况,一组样品30分钟左右,可观察到阳性样品足够强的荧光图像。
附图说明
图1为本可视化成像***的结构示意图;
图2为本可视化成像***的结构示意图的原理图;
图3为阵列式反应芯片的结构示意图;
图4为反应物添加图;
图5为LED阵列的结构示意图;
图6为具体实施案例中油菜茎基溃疡病菌核酸的等温扩增荧光检测结果;
图7为可控温度台的结构示意图。
图1-图7中,各结构的具体名称为:阵列式反应芯片1,导热底层1-1,反应中层1-2,透光上盖1-3,荧光检测***2,控制监测终端3,成像设备4,安装架5,激发光源6,LED面阵列6-1,LED阵列控制器6-2,样品放置窗7,视窗玻璃片8,滤光片Ⅰ9,滤光片Ⅱ10,准直透镜11,二向色镜12,可控温度台13,加热台13-1,温度传感器13-2,加热元件13-3,PID控制器13-4,直流电源13-5,固态继电器13-6。
具体实施方式
以下结合附图和实施例可以具体说明本发明的技术方案,但并不构成对本发明的保护范围的限制。
实施例1一种用于基因扩增荧光检测的可视化成像***
见图1-5,本实施例的具体结构为一种用于基因扩增荧光检测的可视化成像***,包括阵列式反应芯片1,荧光检测***2,控制监测终端3;
所述荧光检测***2包括成像设备4,安装架5,激发光源6,可控温度台13;
所述安装架5一侧下部设有样品放置窗7,所述安装架5顶面设有视窗玻璃片8,全透明视窗玻璃的透光度为90%以上,减少荧光信号的损失,厚度为0.5-2mm,具有一定的强度,用于保护内部的其它光学器件,所述全透明视窗玻璃片8下方设有滤光片Ⅰ9,所述滤光片Ⅰ9参数范围为515-560nm,滤光片I是可置换的部件,根据检测的荧光物质发射波长进行更换,一般情况下为525/50(绿色荧光)、605/70(红色荧光);
所述激发光源6置于安装架一侧,所述激发光源6包括LED面阵列6-1和LED阵列控制器6-2,所述LED阵列波长范围为420-488nm,所述LED阵列的波长可根据检测荧光物质的激发波长进行更换,一般情况下为470/40(蓝光激发)、545/25(绿光激发);所述LED阵列的的尺寸与反应芯片尺寸相匹配,让LED阵列的光能够完全照射到反应芯片;
所激发光源6的LED面阵列6-1前方设有滤光片Ⅱ10,所述滤光片Ⅱ10前方设有准直透镜11,所述准直透镜11为平凸透镜,所述准直透镜11的焦距和准直透镜到LED面阵列6-1的距离相等;
所述安装架5内部设有二向色镜12,所述二向色镜12与准直透镜11的夹角为45°;所述二向色镜12二向色镜的波长根据检测荧光物质进行选择,一般为495nm(绿色荧光)或565nm(红色荧光)。
所述可控温度台13置于安装架5底部,所述阵列式反应芯片1置于可控温度台13上方,所述温度控制台尺寸和反应芯片尺寸相配,将反应芯片放置在可控温度台表面,能够保证整个芯片都得到均匀的加热;
所述可控温度台13由加热台13-1、温度传感器13-2、加热元件13-3、PID控制器13-4、直流电源13-5和固态继电器13-6构成。其连接关系如图7;所述加热台13-1置于加热元件13-3上方,所述温度传感器13-2***加热台13-1内,所述温度传感器13-2与PID控制器13-4连接,所述直流电源13-5连接加热元件13-3,所述固态继电器13-6连接PID控制器13-4、加热元件13-3、直流电源13-5。
加热台13-1由导热性好的金属加工而成,如铝、铜。温度传感器***到加热台13-1里面(温度传感器可用热电偶、热敏电阻、电阻温度检测器(RTD)和IC温度传感器等不同类型的传感器);加热元件13-3固定在加热台底部(加热元件可以薄膜加热器或PTC加热器,实现对加热台均匀加热)。PID控制器13-4、固态继电器13-6和直流电源均在市面上购买。
工作原理:PID控制器13-4与温度传感器13-2相连,通过温度传感器13-2实时检测加热台13-3的温度;将加热台13-1的温度与设定的温度进行比较,通过PID算法输出控制信号,控制固态继电器13-6;PID控制器13-4通过控制固态继电器来控制直流电源13-5与加热元件13-3的联通或断开。当直流电源13-5与加热元件13-3联通,加热元件13-3控制加热台13-1温度升高;当直流电源13-5与加热元件13-3断开,加热元件13-3不对加热台13-1加热。通过这种方式将加热台13-1温度控制在设定的温度值。
所述反应芯片1由三层组成,从下至上依次为导热底层1-1、反应中层1-2、透光上盖1-3,所述反应中层1-2设有多个反应孔,所述导热底层1-1和反应中层1-2一体成型,构成反应孔,即样品池;所述底层1-1由具有优良导热能力的材料构成,例如玻璃等;反应中层1-2具有良好的生物相容性,防止样品中生物物质在样品池壁的非特异性吸附,例如有硅烷化处理后的聚苯乙烯(PP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等;透光上盖1-3具有优良的透光性能,同时能够紧密地覆盖在样品池上,防止反应过程中样品池中样品的蒸发。
成像***:由相机和镜头组成,位于全透明视窗玻璃片上方,通过调节镜头焦距,使反应芯片位于镜头焦点上,通过相机拍摄反应芯片反应孔中的检测荧光物质的图像:相机可以为CCD或CMOS相机。相机通过数据线与监测终端相连接,用于相机的控制和图像数据的传输。
控制监测终端3,所述控制监测终端可为电脑或可移动式终端计算机组成;所述电脑或可移动式终端计算机安装的控制软件,所述控制软件包括能够设定和实时显示温度控制台的温度;能够控制相机拍摄参数,如曝光时间、拍摄图像格式、图像存储位置、拍摄间隔等参数);软件能够对拍摄的图像进行分析,通过荧光阈值检测识别反应孔中的荧光物质,量化荧光物质的平均荧光强度,生成平均荧光强度-时间的曲线;通过荧光强度对待测基因的含量进行计算。
本发明的使用过程:将待测样品基因、含荧光的扩增反应试剂加载阵列式反应芯片的样品池中,通过样品窗放进检测***中;通过可控温度台控制反应芯片中的样品进行扩增(比如PCR或等温扩增方法),样品基因的扩增数量与样品荧光成正比;通过可控温度台控制反应芯片中的样品进行基因扩增;通过荧光检测模块和成像***实时或终点拍摄反应芯片中各样品荧光图像,通过控制监测终端进行图像分析,获得样品基因扩增结果;样品的荧光也可以通过肉眼进行观察,通过样品是否有荧光进行定性分析。
实施例2油菜茎基溃疡病菌的等温扩增荧光检测
以试剂盒为例,取试剂盒自带的再水化缓冲液29.5μL,引物和探针混合液(比例为3.5:3.5:1)4.8μL,DNA 2.0μL,去离子水11.2μL,混匀后加至含有冻干酶粉(试剂盒自带)的0.2mL TwistAmpExo反应管(试剂盒自带)中,充分溶解,加入醋酸镁溶液(280mmol/L)2.5μL,混合均匀后,加载到阵列式反应芯片的样品池中,通过样品窗放进检测***中预设温度38度的可控温度台上,在扩增的同时,可观察反应芯片中样品的荧光图像,用手机拍摄荧光图像,并进行分析。
反应体系中,引物F、引物R、探针P均以工作液形式加至反应体系中,引物F、引物R和探针P在工作液中的浓度均为10μmol/L。
结果如图6所示,其中绿色代表阳性扩增。
引物F、引物R、荧光探针P参考文献:
R.Lei,J.Kong,Y.H.Qiu,N.Z.Chen,S.F.Zhu,X.Y.Wang,P.S.Wu,Rapid detectionof the pathogenic fungi causing blackleg of Brassica napus using a portablereal-time fluorescence detector.Food Chem.288(2019)57-67.https://10.1016/j.foodchem.2019.02.089。
采用本成像***的结构,可实现扩增与可视化成像同时进行,省略了扩增后再检测的时间,避免了吸取扩增产物可能带来的潜在污染。如PCR-凝胶电泳检测需要对PCR产物进行额外的电泳检测,所需时间长,且存在加样错误或污染的风险。实时荧光PCR,需要复杂的数据采集组件,对发射光进行复杂计算,仪器成本高。本发明采用的等温扩增技术,在38度即可进行,且可同时观察扩增情况,一般30分钟左右,可观察到阳性样品足够强的荧光图像。
本发明的原理:
(1)荧光检测***由激发光源、激发滤光片、准直透镜、二向色镜、样品放置窗、发射滤镜片、全透明视窗玻璃组成
(2)激发光源:由具有白色光源LED阵列构成,LED阵列的光强可通过控制器进行调整。LED阵列的尺寸大小可根据所检测的样品尺寸进行选择。
(3)LED阵列前的滤光片Ⅱ为激发滤光片:根据检测荧光的激发波长选择所需的激发光滤光片,激发光滤光片通过使LED阵列所发的关中特定波长的光通过。
(4)准直透镜:将激发光变成一个平行光(激发光),同时使激发光光强均匀,由平凸透镜构成。
(5)二向色镜:将激发光进行折射垂直照射到样品上,同时将样品的被激发的荧光进行透射,用于检测或观察。
(6)视窗玻璃片下方的滤光片Ⅰ为发射滤光片,发射滤光片只通过荧光物质被激发后的发射波长,降低背景光信号干扰。
(7)全透明视窗玻璃片:在带通滤光片上面,保护***中的光学元件被污染。
(8)可控温度台:将反应芯片固定置于温度台表面,控制芯片上样品的问题。可控温度台可以根据反应需要进行恒温控制和编程控制(温度随时间变化)。
(9)阵列式反应芯片:反应芯片由三层组成:底层和中层结合在一起,构成样品池;底层由具有优良导热能力的材料构成,例如玻璃等;中层具有良好的生物相容性,防止样品中生物物质在样品池壁的非特异性吸附,例如有硅烷化处理后的聚苯乙烯(PP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等;上层具有优良的透光性能,同时能够紧密地覆盖在样品池上,防止反应过程中样品池中样品的蒸发。
(10)成像设备:用于对样品被激发荧光进行检测成像,进而获取样品的荧光图像,分析荧光强度。通过控制成像设备进行连续定时拍摄,可分析样品的荧光变化,由CCD或COMS成像设备构成。成像设备也可用人肉眼代替,直观地观察到样品的荧光状态。
(11)控制监测终端:可由电脑、可移动式终端计算机组成。通过安装特定的控制软件,用于控制***LED激光光源光强度、温控台温度、样品荧光图像的采集和分析、结果数据的存储、管理和发送等。
Claims (5)
1.一种用于基因扩增荧光检测的便携式可视化成像***,包括阵列式反应芯片,荧光检测***,控制监测终端;其特征是:所述荧光检测***包括成像设备,安装架,激发光源,可控温度台;
所述安装架一侧下部设有样品放置窗,所述安装架顶面设有视窗玻璃片,所述全透明视窗玻璃的透光度大于90%,厚度为0.5-2mm;所述全透明视窗玻璃片下方设有滤光片Ⅰ,所述滤光片Ⅰ波长为515-560 nm;
所述激发光源置于安装架一侧,所述激发光源包括LED面阵列和LED阵列控制器,所述LED阵列波长范围为420-488 nm;
所激发光源的LED面阵列前方设有滤光片Ⅱ,所述滤光片Ⅱ前方设有准直透镜,所述准直透镜为平凸透镜,所述准直透镜的焦距和准直透镜至LED阵列的距离相等;
所述安装架内部设有二向色镜,所述二向色镜与准直透镜的夹角为45°;所述二向色镜的波长为495nm或565nm;
所述可控温度台置于安装架底部,所述阵列式反应芯片置于可控温度台上方;
所述阵列式反应芯片由三层组成,从下至上依次为导热底层、反应中层、透光上盖,所述反应中层设有多个反应孔,所述底层材质玻璃或有机玻璃;反应中层材质为硅烷化处理后的聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷;透光上盖。
2.根据权利要求1所述的一种用于基因扩增荧光检测的便携式可视化成像***,其特征是:所述可控温度台包括加热台、温度传感器、加热元件、PID控制器、直流电源和固态继电器;所述加热台置于加热元件上方,所述温度传感器***加热台内,所述温度传感器与PID控制器连接,所述固态继电器连接PID控制器、加热元件、直流电源。
3.根据权利要求1所述的一种用于基因扩增荧光检测的便携式可视化成像***,其特征是:所述可视化成像***的应用方法包括以下步骤:
(1)制备检测样品
DNA扩增,获得检测样品;
(2)加样
将检测样品加载到用于基因扩增荧光检测的可视化成像***的阵列式反应芯片的反应孔中;
(3)获得检测结果
将阵列式反应芯片通过样品窗放进检测***中可控温度台上,所述可控温度台预设温度38℃,在反应的同时,可获得反应芯片中样品的荧光图像,绿色代表阳性扩增。
4.根据权利要求1所述的一种用于基因扩增荧光检测的便携式可视化成像***,其特征是:所述成像设备由相机和镜头组成,位于全透明视窗玻璃片上方,通过调节镜头焦距,使反应芯片位于镜头焦点上,通过相机拍摄反应芯片反应孔中的检测荧光物质的图像。
5.根据权利要求1所述的一种用于基因扩增荧光检测的便携式可视化成像***,其特征是:所述控制监测终端为电脑或可移动式终端计算机。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN114860003A (zh) * | 2022-05-12 | 2022-08-05 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种pcr热循环***控制方法、装置、设备及存储介质 |
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2021
- 2021-11-15 CN CN202111344210.9A patent/CN113969238A/zh active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN114860003A (zh) * | 2022-05-12 | 2022-08-05 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种pcr热循环***控制方法、装置、设备及存储介质 |
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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