CN113968881B - 线粒体靶向光激活荧光成像的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药材料技术领域，公开了线粒体靶向光激活荧光成像的化合物及其制备方法和应用。该化合物的结构式如式I所示：其中，R表示C1‑20亚烷基；R1、R2分别独立表示氢、C1‑30烷基、C1‑30亚烷基、芳基、杂芳基、甲氧基、卤素。本发明的化合物在光照的条件下可实现活细胞内线粒体靶向的特异性光激活荧光成像，而且具有光激活效率高、信噪比高、进入细胞能力强等优点。在线粒体成像或生物成像中具有易于调控和高时空分辨率的优点。
Description
技术领域
本发明属于医药材料技术领域，特别涉及线粒体靶向光激活荧光成像的化合物及其制备方法和应用。
背景技术
线粒体是细胞的“动力工厂”，具有重要的生理功能。光激活荧光成像具有高时空分辨的优势，有利于线粒体的生理功能研究，进而有助于对细胞病变方面的研究。现有技术中，针对线粒体的光激活成像的分子研究很少，或成像效果差，或成像不可控。
因此，亟需提供一种具有线粒体靶向光激活荧光成像的物质，该物质对线粒体成像效果好或成像可控，进而有助于开展在生物医学领域的应用研究。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出线粒体靶向光激活荧光成像的化合物及其制备方法和应用，所述化合物，在光照后，表现出荧光点亮成像功能，成像效果好，成像可控。
本发明的第一方面提供线粒体靶向光激活荧光成像的化合物。
具体的，线粒体靶向光激活荧光成像的化合物，其结构式如式I所示：
其中，R表示C1-20亚烷基；
其中R1、R2分别独立表示氢、C1-30烷基、C1-30亚烷基、芳基、杂芳基、甲氧基、卤素。
优选的，所述C1-30烷基为直链或支链烷基；进一步优选的，所述C1-30烷基选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基中的任一种。
优选的，所述C1-20亚烷基或C1-30亚烷基为直链或支链亚烷基；进一步优选的，所述C1-20亚烷基或C1-30亚烷基选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、异丙基、异丁基、异戊基中的至少一种。
优选的，R表示C1-10亚烷基。
优选的，所述芳基表示具有6-20个碳原子的单环或多环芳族基团；进一步优选的，所述芳基包括苯基、萘基、蒽基、芘基中的至少一种。
优选的，所述杂芳基表示具有1-20个碳原子、1-4个选自N、S、O杂原子的单环或多环杂芳族基团；进一步优选的，所述杂芳基包括吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、氮杂萘基、氮杂蒽基、氮杂芘基中的至少一种。
优选的，所述卤素选自氯或溴。
优选的，所述R为亚戊基；R1、R2分别独立表示氢、C1-30烷基、甲氧基、氯。
优选的，与苯环相连的R1、R2可分别独立表示2个甲氧基，即当R1为甲氧基时，可表示同时有2个甲氧基与苯环相连；当R2为甲氧基时，可表示同时有2个甲氧基与苯环相连。
优选的，所述线粒体靶向光激活荧光成像的化合物的结构式如下任意一种：
Ph表示苯基，Me表示甲基。
本发明的第二方面提供线粒体靶向光激活荧光成像的化合物的制备方法。
具体的，本发明的第一方面提供线粒体靶向光激活荧光成像的化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)化合物IV的制备：
将化合物V、化合物VI、碱金属盐、溶剂混合，反应，制得化合物IV，所述化合物V的结构式为所述化合物VI的结构式为/>所述化合物IV的结构式为/>
(2)化合物III的制备：将化合物IV、三苯基膦溶于溶剂中，反应，制得化合物III，所述化合物III的结构式为
(3)将化合物III、水合肼、醇溶剂混合，反应，制得所述线粒体靶向光激活荧光成像的化合物。
优选的，步骤(1)中，所述碱金属盐为钾盐或钠盐；进一步优选的，所述碱金属盐为碳酸钾。
优选的，步骤(1)中，所述溶剂为有机溶剂；进一步优选的，所述溶剂为丙酮。
优选的，步骤(1)中，所述化合物V、化合物VI的摩尔比为1：(0.5-1.5)；进一步优选的摩尔比为1：(0.8-1.2)。
优选的，步骤(1)中，所述反应的温度为40-70℃，所述反应的时间为10-12小时。
优选的，步骤(1)中，反应结束后，还包括分离提纯过程。
优选的，步骤(2)中，所述化合物IV、三苯基膦的摩尔比为0.5：(0.3-1.0)；进一步优选的摩尔比为1：(0.4-0.6)。
优选的，步骤(2)中，所述溶剂为有机溶剂；进一步优选的，所述溶剂为氯仿。
优选的，步骤(2)中，所述反应的温度为50-80℃，所述反应的时间为10-12小时。
优选的，步骤(2)中，反应结束后，还包括分离提纯过程。
优选的，步骤(3)中，所述反应的温度为25-80℃，所述反应的时间为2-5小时。
优选的，步骤(3)中，反应结束后，还包括分离提纯过程。
本发明的第三方面提供线粒体靶向光激活荧光成像的化合物的制备方法中涉及到的一些中间体。
具体的，制备所述化合物的中间体，其结构式如下：
所述化合物的经光照反应后的产物，所述产物的结构式如下：
其中，R表示C1-20亚烷基；
其中R1表示氢、C1-30烷基、C1-30亚烷基、芳基、杂芳基、甲氧基、卤素。
优选的，所述光照为紫外光或近红外双光子，光照的强度为1-150mW/cm2；进一步优选的，光照的强度为1-100mW/cm2。
将线粒体靶向光激活荧光成像的化合物(式I所示的化合物)作为光激活线粒体染料对线粒体进行染色后，在光照射下，生成具有荧光性质的式II所示的化合物，从而对线粒体进行荧光成像。通过将式I所示的化合物在光照后与商用线粒体染料MitoTracker Red进行共染实验证实了式I所示的化合物具有良好的光激活染色线粒体成像的效果。
需强调的是，在现有技术中，未有文献报道过本发明的式I所示的化合物可以通过光剪切反应实现线粒体荧光成像(简称“光剪切激活荧光”)。
在本发明中，“光剪切激活荧光”是指一类光响应的分子，在光照下发生光剪切反应，生成具有荧光发射能力的分子，在线粒体成像或生物成像中具有易于调控和高时空分辨率等优势。
本发明的第三方面提供线粒体靶向光激活荧光成像的化合物的应用。
一种检测试剂，包括上述化合物。
优选的，所述检测试剂用于线粒体成像。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明的化合物在光照的条件下可实现活细胞内线粒体靶向的特异性光激活荧光成像，而且具有光激活效率高、信噪比高、进入细胞能力强等优点。在线粒体成像或生物成像中具有易于调控和高时空分辨率的优点。
附图说明
图1为化合物IV-1的核磁共振氢谱图；
图2为化合物IV-1的核磁共振碳谱图；
图3为化合物IV-1的高分辨质谱图；
图4为化合物III-1的核磁共振氢谱图；
图5为化合物III-1的核磁共振碳谱图；
图6为化合物III-1的高分辨质谱图；
图7为化合物I-1的核磁共振氢谱图；
图8为化合物I-1的核磁共振碳谱图；
图9为化合物I-1在紫外光照下随光照时间的增加的荧光光谱变化图；
图10为化合物I-1在紫外光照下转变为化合物II-1的光剪切反应示意图；
图11为HeLa细胞中化合物I-1在365nm下光照10min后和MitoTracker Red的共染图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1：线粒体靶向光激活荧光成像的化合物的制备、中间体的制备
(1)化合物IV-1的制备：
将化合物V-1(276mg，1.0mmol)、化合物VI-1(301mg，1.0mmol)溶解于丙酮(即acetone)中(10mL)、然后加入碳酸钾(137mg，1.0mmol)、混合形成反应液，反应液在回流下反应12小时，反应结束后，冷却至室温(例如20℃)，旋蒸除去丙酮，残余物通过氯仿和水萃取，进一步在正己烷和乙酸乙酯中重结晶得到化合物IV-1(460mg，产率93％)；
图1为化合物IV-1的核磁共振氢谱图；图2为化合物IV-1的核磁共振碳谱图；图3为化合物IV-1的高分辨质谱图(图3中的横坐标“m/z”表示质荷比，纵坐标“Intens”表示相对强度)。核磁共振氢谱和核磁共振碳谱的横坐标表示化学位移，单位为ppm。
化合物IV-1的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和质谱表征结果为：1H NMR(CDCl3,400MHz):δ10.2(s,1H),7.77–7.74(m,3H),6.61–6.58(m,2H),5.52(s,2H),4.07(s,3H),4.04(t,J＝6.0Hz,2H),3.97(s,3H),3.42(t,J＝6.8Hz,2H),1.90–1.83(m,4H),1.52–1.50(m,4H)；13CNMR(CDCl3,100MHz):188.0,165.7,161.0,154.3,147.9,138.6,134.1,128.4,119.1,109.7,107.9,106.7,99.8,68.3,67.3,56.7,56.4,33.6,32.5,28.8,27.8,25.2；HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C22H27BrNO7:496.0971，found:496.0972。
(2)化合物III-1的制备：
将化合物IV-1(248mg,0.5mmol)、三苯基膦(即PPh3，131mg,0.5mmol)溶于氯仿(6mL)中，随后在回流下反应12小时，进一步冷却至室温，旋蒸除去溶剂，残余物通过柱层析分离得到化合物III-1(273mg，产率72％)；
图4为化合物III-1的核磁共振氢谱图；图5为化合物III-1的核磁共振碳谱图；图6为化合物III-1的高分辨质谱图(图6中的横坐标“m/z”表示质荷比，纵坐标“Intens”表示相对强度)。核磁共振氢谱和核磁共振碳谱的横坐标表示化学位移，单位为ppm。
化合物III-1的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和质谱表征结果为：1H NMR(CDCl3,400MHz):δ10.13(s,1H),7.82–7.66(m,16H),7.19–7.10(m,2H),6.66–6.53(m,2H),5.46(s,2H),4.03(s,3H),3.98(t,J＝6.0Hz,2H),3.92(s,3H),3.73(t,J＝6.4Hz,2H),1.73–1.47(m,8H)；13CNMR(CDCl3,100MHz):188.0,165.6,160.8,154.2,147.8,138.6,134.9,133.6,133.5,130.4,130.3,128.2,118.9,118.6,117.7,110.1,107.8,106.7,99.8,68.3,67.3,56.7,56.3,29.9,29.8,28.5,25.4,22.5；HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C40H42BrNO7P:758.1882；found:758.1711；
(3)线粒体靶向光激活荧光成像的化合物的制备：
将化合物III-1(189mg,0.25mmol)溶解于无水乙醇中(10mL)，随后加入水合肼(12.5mg,0.125mmol)，反应液回流反应4小时，进一步冷却至室温，随后旋蒸除去溶剂，进而通过柱层析分离得到化合物I-1(170mg，产率90％)。
图7为化合物I-1的核磁共振氢谱图；图8为化合物I-1的核磁共振碳谱图。核磁共振氢谱和核磁共振碳谱的横坐标表示化学位移，单位为ppm。
化合物I-1的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱表征结果为：1H NMR(CDCl3,400MHz):δ9.10(s,2H),7.99–7.38(m,32H),7.38(s,2H),6.54-6.49(m,4H),5.50(s,4H),3.99–3.79(m,20H),1.73–1.48(m,16H)；13C NMR(CDCl3,100MHz):δ162.8,158.6,156.1,153.9,147.8,138.8,134.9,133.5,133.4,130.4,130.3,128.4,118.5,117.7,115.8,109.7,107.9,107.1,100.0,67.9,67.4,56.4,56.3,30.0,29.8,28.6,25.4,22.4。
实施例2
将实施例1制得的化合物I-1滴加到湿润的滤纸上，随后在紫外光(365nm)照射下，随光照时间的增加，测量其荧光光谱变化，荧光光谱结果如图9所示。图9为化合物I-1在紫外光照下随光照时间的增加的荧光光谱变化图，从图9可以看出，随着光照时间的增加，荧光强度也增强，表明化合物I-1在7分钟内即可有效完成光剪切反应，相对于光照前，其荧光强度增加明显，具有光激活效率高、信噪比高的有效，为细胞的高信噪比光激活成像奠定了基础。图10为化合物I-1在紫外光照下转变为化合物II-1的光剪切反应示意图。
实施例3
将实施例1制得的化合物I-1加入到HeLa细胞培养液中(3μmol/L)，随后在紫外光(365nm下光照10min，进一步与商用线粒体染料MitoTracker Red共染图。图11为HeLa细胞中化合物I-1在365nm下光照10min后和MitoTracker Red的共染图。图11中的(a)表示HeLa细胞明场图；(b)表示化合物I-1在365nm下光照10min后的细胞荧光染色图；(c)表示MitoTracker Red的细胞荧光染色图；(d)表示细胞成像叠加图。从图11中得出的结论是，化合物I-1在光照后具有优异的线粒体特异性和高信噪比成像能力。
需要指出的是，在本发明请求保护的范围内，例如在发明内容部分列举了线粒体靶向光激活荧光成像的化合物的9种具体的结构式，具体实施方式部分只列举了其中一种结构式的成像效果，但其余8种具体结构式对应的成像效果也是类似的(即9种化合物结构式的线粒体成像效果类似)。另外，当通式式I中的R、R1、R2基团在本发明限定的范围类进行选择，其对应的具体化合物的线粒体成像效果与上述化合物I-1类似。
本发明建立了线粒体靶向化合物的简便高效的制备方法。线粒体靶向化合物在光照下，可发生光剪切反应，进而点亮荧光，可作为线粒体靶向的光激活荧光探针。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.结构式如式I-1所示的化合物：
2.一种检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的化合物。
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