CN113956307B

CN113956307B - 黄酮苷类化合物、法国梧桐树叶提取物及其制备方法和制药用途

Info

Publication number: CN113956307B
Application number: CN202110749741.XA
Authority: CN
Inventors: 胡金锋; 熊娟; 武喜营; 江维; 姜春筱
Original assignee: Taizhou University
Current assignee: Taizhou University
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-07-02
Also published as: CN113956307A

Abstract

本申请公开一种黄酮苷类化合物、法国梧桐树叶提取物及其制备方法和制药用途，黄酮苷类化合物的结构式为：

Description

黄酮苷类化合物、法国梧桐树叶提取物及其制备方法和制药用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种黄酮苷类化合物、法国梧桐树叶提取物及其制备方法和在制备治疗金黄色葡萄球菌感染药物中的用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种能感染人和动物的高致病力革兰氏阳性球菌，是许多浅表性感染、毒素介导性感染或侵袭性感染的罪魁祸首。金黄色葡萄球菌引起的浅表病变从轻微的丘疹、疖子到严重的脓肿、痈肿等，不一而足。一旦穿透皮肤屏障，金黄色葡萄球菌就能引起肌肉和骨骼感染，如骨髓炎和化脓性关节炎；这些内部感染可能进一步导致更严重的肺炎、菌血症、心内膜炎和败血症。由于金黄色葡萄球菌能够产生脱落毒素、超抗原和细胞毒素等，它也是食物中毒、中毒性休克综合征和烫伤皮肤综合征等许多毒素介导感染的病原体。在过去的一个世纪里，金黄色葡萄球菌已经成为社区获得性感染以及医院获得性感染的主要感染源(Hemmadi&Biswas,2021,Arch. Microbiol.203,481-498)。

抗生素在畜牧业、植物农业和生物技术中的广泛使用也迅速降低了抗生素分子的效力(Chevrette et al.,2019,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.46,257-271)。大量耐药菌株的出现使得金黄色葡萄球菌(S.aureus)已经演变为一种高度传染性的实体。

尤其是，甲氧西林耐药株和万古霉素耐药株的出现，打破了抗生素的最后一道防线。尽管新的治疗药物被批准用于临床治疗耐药株的感染，例如头孢洛林可抑制甲氧西林耐药株的生长，但随着用药的增加，新的抗生素也面临耐药性增加的难题。金黄色葡萄球菌在很短的时间内对多种抗生素产生抗药性，使得开发新抗生素的努力几乎是徒劳的。因此，亟需新的策略或研发抗生素替代物来治疗金黄色葡萄球菌的感染及缓解其耐药性问题。

天然产物一直是临床批准的抗生素以及抗癌、免疫抑制剂和其他治疗相关分子的主要来源，尤其为抗感染类疾病的药物研发提供了重要的基础(Newman&Cragg,2020,J.Nat.Prod.83,770-803)。而且，不断发现有抗菌作用的植物次生代谢产物拥有抗生素及其它化学药无可比拟的纯天然、低毒副、不抗药、结构多样和多靶点等众多优势。因此，从丰富的植物资源中寻找新型的抗细菌药物是现代医药行业发展的重要方向。

悬铃木属(Platanus)为悬铃木科(Platanaceae)植物，含有7个种和12个亚种，广泛分布在世界各地(Thai et al.,2016,Phytochemistry 130,170-181)。我国仅有3种，分别为一球悬铃木(Platanus occidentalis Linn.)、二球悬铃木 (Platanus acerifoliaWilld.)和三球悬铃木(Platanus orientalis Linn.)。一球悬铃木(P.occidentalis)原产北美洲，又名美国梧桐，在我国北部及中部均有引种。三球悬铃木(P.orientalis)原产欧洲东南部及亚洲西部，在中国树木学又名法国梧桐。本申请中的法国梧桐包括二球悬铃木(P.acerifolia)和三球悬铃木(P. orientalis)。

近年来，人们开始关注二球悬铃木的化学成分及药用价值。三球悬铃木在许多国家被广泛用于医疗、遮荫、燃料和防治空气污染等方面。作为一种民间传统药用植物，其主要用于治疗牙齿和膝盖疼痛、伤口、炎症和胃部不适。近年来，诸多药理研究显示，其提取物和分离出的单体化合物可直接或间接用于治疗各种疾病和不适，包括声音嘶哑和哮喘、睑缘炎和结膜炎、痢疾、牙痛、皮肤病、风湿病和肾结石。

然而，尽管“行道树”法国梧桐(二球悬铃木和三球悬铃木的统称)树叶产量极丰，但对其植物化学成分的研究并不***，尤其对其提取物和单体成分的抗菌活性缺乏报道。

发明内容

本申请提供一种新型黄酮苷类化合物、法国梧桐树叶提取物及其在制备治疗金黄色葡萄球菌感染药物中的用途，该法国梧桐树叶提取物及单体化合物抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生长，可用于制备金黄色葡萄球菌抑制剂或作为该类抗菌药物的先导化合物，在制备治疗由金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)感染引起的化脓感染、乳腺炎、肺炎、肠炎、心内膜炎、败血症和中毒性休克的药物领域有巨大的潜在用途。

一种黄酮苷类化合物或其药学上可接受的盐，所述黄酮苷类化合物的结构式如式(1)所示：

所述黄酮苷类化合物为化合物1或化合物2，其中，化合物1中R₁为 E-p-conumaroyl、R₂为Z-p-conumaroyl；化合物2中R₁为Z-p-conumaroyl、R₂为E-p-conumaroyl。

其中化合物1命名为槲皮素-3-O-α-L-(2"-E-对香豆酰基-3"-Z-对香豆酰基)- 鼠李糖苷；化合物2命名为槲皮素-3-O-α-L-(2"-Z-对香豆酰基-3"-E-对香豆酰基)- 鼠李糖苷。

本申请还提供一种所述的黄酮苷类化合物或其药学上可接受的盐在作为或制备金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑制剂中的用途。

本申请还提供一种所述的黄酮苷类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染药物中的用途。

本申请还提供一种所述的黄酮苷类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗由金黄色葡萄球菌感染引起的化脓感染、乳腺炎、肺炎、肠炎、心内膜炎、败血症或中毒性休克的药物中的用途。

本申请还提供一种法国梧桐树叶提取物，包含所述的黄酮苷类化合物，所述黄酮苷类化合物包括化合物1和/或化合物2，结构式如式(1)所示。本申请中的法国梧桐包括二球悬铃木(P.acerifolia)和三球悬铃木(P.orientalis)。以法国梧桐叶子为原料，采用溶剂提取法制成浓缩水提物或浓缩醇提取物，或进一步经浓缩水提物或醇提取物分离纯化后得到的亚组分Ⅰ和亚组分Ⅱ；所述法国梧桐叶子来自二球悬铃木(P.acerifolia)和/或三球悬铃木(P.orientalis)的树叶。

因此，可选的，所述法国梧桐树叶提取物包括法国梧桐树叶的浓缩水提物或浓缩醇提取物、经浓缩水提物或浓缩醇提取物分离纯化后的亚组分Ⅰ或亚组分Ⅱ；所述法国梧桐树叶来自二球悬铃木(P.acerifolia)和/或三球悬铃木(P. orientalis)；即浓缩水提物、浓缩醇提取物亚组分Ⅰ或亚组分Ⅱ均为所述法国梧桐树叶提取物。

可选的，所述法国梧桐树叶提取物中包括化合物1和化合物2；所述浓缩水提物或浓缩醇提取物中化合物1和化合物2总量的浓度范围为(1～20)mg/kg；所述亚组分Ⅰ中化合物1和化合物2总量的浓度范围为(100～500)mg/kg；所述亚组分Ⅱ中化合物1和化合物2总量的浓度范围为(100～500)g/kg。

本申请还提供一种所述的法国梧桐树叶提取物在作为或制备金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑制剂中的用途。

本申请还提供一种所述的法国梧桐树叶提取物在制备治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染药物中的用途。

本申请还提供一种所述的法国梧桐树叶提取物在在制备治疗由金黄色葡萄球菌引起的化脓感染、乳腺炎、肺炎、肠炎、心内膜炎、败血症或中毒性休克的药物中的用途。

本申请还提供一种金黄色葡萄球菌抑制剂，以所述的黄酮苷类化合物或其药学上可接受的盐或所述的法国梧桐树叶提取物为活性组分。

本申请还提供一种治疗由金黄色葡萄球菌引起的化脓感染、乳腺炎、肺炎、肠炎、心内膜炎、败血症和中毒性休克的药物，所述药物以法国梧桐树叶提取物或单体化合物为有效成分，包括药物有效量的所述的黄酮苷类化合物或其药学上可接受的盐或所述法国梧桐树叶提取物。

所述的黄酮苷类化合物或其药学上可接受的盐或所述法国梧桐树叶提取物可以单独应用或者合用。

可选的，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

可选的，所述法国梧桐树叶提取物与赋形剂制成制剂的形态为口服制剂、皮肤外用制剂或注射制剂。

可选的，所述菌株优选为Newman金黄色葡萄球菌ATCC 25904。

本申请还提供一种黄酮苷类化合物的制备方法，包括：

(1)以法国梧桐叶子为原料，采用溶剂提取法制成浓缩水提物或浓缩醇提取物；

(2)对所述浓缩水提物或浓缩醇提取物经大孔树脂D101柱，采用乙醇-水溶剂***进行梯度洗脱；其中乙醇的起始体积分数为0～30％，乙醇的最终体积分数为100％；将60～70％的EtOH洗脱流分合并浓缩，得到亚组分Ⅰ；

(3)亚组分I经小孔树脂MCI凝胶柱，采用甲醇-水溶剂***进行梯度洗脱；其中甲醇的起始体积分数为0～30％，甲醇的最终体积分数为100％；将 50～90％的MeOH洗脱流分合并浓缩，得到亚组分Ⅱ；

(4)对亚组分Ⅱ采用半制备HPLC进行纯化，以体积比为66：34的甲醇： 0.05％三氟乙酸水溶液等度洗脱，分别收集保留时间22.5min组分和31.7min组分，得到黄色无定形粉末分别为化合物1(22.5min)和化合物2(31.7min)。

法国梧桐树叶浓缩水提物或浓缩醇提取物中化合物1和化合物2总量的浓度范围为(1～20)mg/kg，亚组分Ⅰ中化合物1和化合物2总量的浓度范围为 (100～500)mg/kg，亚组分Ⅱ中化合物1和化合物2总量的浓度范围为(100～500) g/kg。

本申请还提供一种所述的法国梧桐树叶提取物的制备方法，以法国梧桐叶子为原料，采用溶剂提取法制成浓缩水提物或浓缩醇提取物，或进一步经浓缩水提物或醇提取物分离纯化后得到亚组分Ⅰ和亚组分Ⅱ(方法同黄酮苷类化合物制备方法中的步骤(2)和(3))；浓缩水提物、浓缩醇提取物、亚组分Ⅰ或亚组分Ⅱ均为所述法国梧桐树叶提取物；所述法国梧桐叶子来自二球悬铃木(P. acerifolia)和/或三球悬铃木(P.orientalis)。

与现有技术相比，本发明的法国梧桐树叶提取物及其黄酮苷类单体化合物的制备方法和应用至少具有下列有益效果之一：

一方面，本申请提供法国梧桐树叶提取物及2个新型黄酮苷类化合物在制备金黄色葡萄球菌抑制剂方面的用途。

可选的，所述法国梧桐树叶提取物为法国梧桐叶采用溶剂提取法制成浓缩水提物或醇提取物及经分离纯化后的亚组分。新型黄酮苷类化合物可以从法国梧桐提取物分离纯化得到。

另一方面，本申请提供法国梧桐树叶提取物及2个新型黄酮苷类化合物在制备治疗化脓感染、乳腺炎、肺炎、肠炎、心内膜炎、败血症和中毒性休克的药物中的用途。

所述药物以法国梧桐树叶提取物或单体化合物为活性成分，可单独或者联合应用，与药学上可接受的载体或赋形剂结合，按照常规方法制成口服制剂、皮肤外用制剂或注射制剂。

再者，法国梧桐在秋季落叶满地，只需人工收集便可拥有丰富原料。因此本申请变废为宝，极大提高了法国梧桐落叶的附加价值。

附图说明

图1是化合物1的主要COSY和HMBC相关信号；

图2是本申请提供的化合物1的HRESIMS谱图；

图3是本申请提供的化合物1的¹H NMR(400MHz,CD₃OD)谱图；

图4是本申请提供的化合物1的¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)谱图；

图5是本申请提供的化合物1的DEPT 135(600MHz)谱图；

图6是本申请提供的化合物1的HSQC(600MHz)谱图；

图7是本申请提供的化合物1的¹H-¹H COSY(600MHz)谱图；

图8是本申请提供的化合物1的HMBC(600MHz)谱图；

图9是化合物1的主要COSY和HMBC相关信号；

图10是本申请提供的化合物2的HRESIMS谱图；

图11是本申请提供的化合物2的¹H NMR(400MHz,CD₃OD)谱图；

图12是本申请提供的化合物2的¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)谱图；

图13是本申请提供的化合物2的HSQC(600MHz)谱图；

图14是本申请提供的化合物2的¹H-¹H COSY(600MHz)谱图；

图15是本申请提供的化合物2的HMBC(600MHz)谱图。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

本申请从法国梧桐(二球悬铃木(Platanus acerifolia Wild.)和/或三球悬铃木(Platanus orientalis Linn.))树叶中提取法国梧桐树叶提取物及从提取物中分离得到的2个新黄酮苷类化合物—槲皮素-3-O-α-L-(2"-E-对香豆酰基-3"-Z-对香豆酰基)-鼠李糖苷(化合物1)和槲皮素-3-O-α-L-(2"-Z-对香豆酰基-3"-E-对香豆酰基)-鼠李糖苷(化合物2)。

本申请经筛选发现，法国梧桐树叶提取物对Newman金黄色葡萄球菌ATCC 25904呈现一定的抑制作用：亚组分I和亚组分Ⅱ的最小抑菌浓度分别为256 μg/mL和128μg/mL。新单体化合物1和化合物2的最小抑菌浓度均为64μg/mL。该提取物和单体化合物可能在制备治疗由金黄色葡萄球菌引起的化脓感染、乳腺炎、肺炎、肠炎、心内膜炎、败血症和中毒性休克的药物领域有巨大的潜在用途。

本申请的法国梧桐树叶提取物由法国梧桐叶子可经本领域技术人员熟知的方法制备获得。例如，以法国梧桐叶子为原料，可采用溶剂提取法制成浓缩水提物或醇提取物及经分离纯化后得亚组分Ⅰ和亚组分Ⅱ。

所述的溶剂提取法中，可以选用水、甲醇、乙醇等单一溶剂或多种溶剂的混合溶剂。水提物为法国梧桐的干燥叶子粉碎后，加5～20倍的超纯水，加热回流提取1～3h，用纱布过滤得上清液，提取次数为3～4次，合并滤液后减压浓缩至浓度为0.5～1.5g/mL。醇提物选用甲醇或乙醇与水的混合溶剂或多种溶剂的混合溶剂，以75％乙醇为最佳提取溶剂，在室温下浸渍提取24～48h或加热回流提取1～3h，提取次数为3～4次，合并滤液后减压浓缩即得。

所述水提物或醇提取物经大孔树脂D101柱，采用乙醇-水(EtOH/H2O)溶剂***进行梯度；其中乙醇的起始体积分数为0～30％，乙醇的最终体积分数为 100％；优选的，将60～70％的EtOH洗脱流分合并浓缩，得到亚组分Ⅰ。亚组分I经小孔树脂MCI凝胶柱，采用甲醇-水(MeOH/H2O)溶剂***进行梯度洗脱；其中甲醇的起始体积分数为0～30％，甲醇的最终体积分数为100％；优选的，将50～90％的MeOH洗脱流分合并浓缩，得到亚组分Ⅱ。

所述法国梧桐树叶提取物包括新的单体化合物1和2，化合物具有如下分子结构：

其中，化合物1中R₁为E-p-conumaroyl、R₂为Z-p-conumaroyl；化合物2 中R₁为Z-p-conumaroyl、R₂为E-p-conumaroyl。

法国梧桐树叶提取物中化合物1和2的分离纯化方法为：对亚组分Ⅱ采用半制备HPLC进行纯化，以甲醇：0.05％三氟乙酸水溶液(66：34,v/v)等度洗脱，分别收集保留时间22.5min组分和31.7min组分，得到黄色无定形粉末分别为化合物1(22.5min)和化合物2(31.7min)。

法国梧桐树叶浓缩水提物或浓缩醇提取物中化合物1和化合物2总量的浓度范围为(1～20)mg/kg，亚组分Ⅰ中化合物1和化合物2总量的浓度范围为 (100～500)mg/kg，亚组分Ⅱ中化合物1和化合物2总量的浓度范围为(100～500) g/kg。通过法国梧桐树叶提取物及其黄酮苷类单体化合物对Newman金黄色葡萄球菌ATCC 25904的活性筛选，得知该法国梧桐树叶提取物及其单体化合物对金黄色葡萄球菌具有一定的生长抑制作用，可用于制备金黄色葡萄球菌抑制剂或作为该类抗菌药物的先导化合物。

以下以具体的实施例进行说明：

下述制备例中，NMR用Bruker Avance II 400/600型仪测定；HR-MS由AB SciexTripleTOF 5600型仪测定；MCI Gel CHP 20P(75-150μm)为日本三菱公司生产；半制备HPLC为Waters e2695，配备2998PDA和2424蒸发光散射双检测器以及SunFire ODS(5μm,250×10mm)半制备柱；所使用的大孔吸附树脂 D101和所有试剂均为上海国药集团化学试剂有限公司生产。

下述抗菌活性测试例中，供试菌种为Newman金黄色葡萄球菌ATCC 25904，获赠自中科院上海药物所。脑心浸液(BHI)琼脂和钙离子调节M-H肉汤 (CAMHB)培养基购买于上海索莱宝股份有限公司。超净工作台(SW-CJ-2F) 为苏州安泰空气技术有限公司生产；生化培养箱(SPX-250B-Z)和立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-SII)为上海***实业有限公司生产；酶标仪(Cytation5) 为美国伯腾仪器有限公司生产。

实施例1：法国梧桐提取物的制备

法国梧桐(二球悬铃木(Platanus acerifolia Wild.)树叶或三球悬铃木(Platanus orientalis Linn.))11月份的干燥叶子粉碎后用75％乙醇提取4次，每次提取36小时，得到的浸膏合并后减压浓缩，得到75％乙醇提取物。

将75％乙醇提取物(3.5kg)经大孔树脂D101柱，采用乙醇-水(EtOH/H₂O) 溶剂***进行梯度；其中乙醇的起始体积分数为0～30％，乙醇的最终体积分数为100％；优选的，将60～70％的EtOH洗脱流分合并浓缩，得到亚组分Ⅰ(70 g)。亚组分I经小孔树脂MCI凝胶柱，采用甲醇-水(MeOH/H₂O)溶剂***进行梯度洗脱；其中甲醇的起始体积分数为0～30％，甲醇的最终体积分数为100％；优选的，将50～90％的MeOH洗脱流分合并浓缩，得到亚组分Ⅱ(70.0mg)。

实施例2：法国梧桐提取物的制备

法国梧桐(二球悬铃木(Platanus acerifolia Wild.)树叶或三球悬铃木(Platanus orientalis Linn.))的干燥叶子粉碎后，加10倍的超纯水，加热回流提起2h，用纱布过滤得上清液，提取4次，合并滤液，减压浓缩至浓度为1.0g/mL 的水提物。

将水提物经大孔树脂D101柱，采用乙醇-水(EtOH/H₂O)溶剂***进行梯度；其中乙醇的起始体积分数为0～30％，乙醇的最终体积分数为100％；优选的，将60～70％的EtOH洗脱流分合并浓缩，得到亚组分Ⅰ。亚组分I经小孔树脂 MCI凝胶柱，采用甲醇-水(MeOH/H₂O)溶剂***进行梯度洗脱；其中甲醇的起始体积分数为0～30％，甲醇的最终体积分数为100％；优选的，将50～90％的 MeOH洗脱流分合并浓缩，得到亚组分Ⅱ。

实施例3：黄酮苷类化合物的制备

上述亚组分Ⅱ(70.0mg，实施例1制备)经半制备HPLC(SunFire柱,3.0 mL/min)以甲醇：0.05％三氟乙酸水溶液(66：34,v/v)等度洗脱，得到新型黄酮苷类化合物1(3.0mg,t_R＝22.5min)和化合物2(3.2mg,t_R＝31.7min)。

化合物通过核磁共振谱(1D/2D核磁共振技术)和HRMS数据进行了阐明：

化合物1的HR-ESI谱(图2)显示其准分子离子峰为m/z 763.1621([M+ Na]⁺,calcd763.1633)，结合碳谱推断其分子式为C₃₉H₃₂O₁₅。

化合物1的氢谱(图3，表1)显示了1个芳香环ABX自旋***[δ_H 7.42(1H, dd,J＝2.0,8.4Hz,H-6′),δ_H 7.38(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′),δ_H 6.96(1H,d,J＝8.4 Hz,H-5′)]，和2个芳香环单峰质子信号[δ_H 6.39(1H，s，H-8)，δ_H 6.21(1H，s， H-6)]，这是槲皮素糖苷的特征信号。氢谱中还包括1个α-L-鼠李糖的特征信号： 5个连氧次甲基质子信号[δ_H 5.53(1H,d,J＝1.6Hz,H-1″),δ_H 5.81(1H,dd,J＝ 1.6,3.6Hz,H-2〞),δ_H 5.25(1H,dd,J＝3.6,9.6Hz,H-3″),δ_H 3.58(1H,t,J＝9.6Hz, H-4″),δ_H 3.60(1H,m,H-5〞)]和1个双峰甲基信号[δ_H1.03(3H,d,J＝5.2Hz, H-6″)]。此外，氢谱中还包括2个1，4-二取代芳环、一对顺式双键和一对反式双键，揭示了化合物含有与α-L-鼠李糖部分相连的反式香豆酰基单元和顺式香豆酰基单元。碳谱(图4)和DEPT-135(图5)显示化合物中含有39个碳：苷元上15个碳，糖有6个碳，剩下的18个为两个香豆酰基的碳。¹H-¹H COSY谱图(图1，图7)中的自旋体系[-CH-CH-CH-CH-CH-CH₃(H-1”/H-2”/H-3”/H-4”/H-5”/H-6”)]可使鼠李糖片段的质子信号全归属。在HMBC 谱图(图1，图8)上能明显看到H-2”(δ5.81),H-3”(δ5.25)分别和反式香豆酰基的羰基碳信号(δ167.77)、顺式香豆酰基的羰基碳信号(δ167.58)的远程相关，证实了反式香豆酰基和顺式香豆酰基单元分别连接在鼠李糖的C-2〞和C-3〞位置。同时，糖的连接位置可通过HMBC谱(图1，图8)中H-1〞(δ5.53)和C-3 (δ135.56)的相关信号得到确证。

因此，化合物1的结构被确定为槲皮素-3-O-α-L-(2"-E-对香豆酰基-3"-Z-对香豆酰基)-鼠李糖苷，结构式如式(1)所示，其二维相关信号如图1所示。

表1.化合物1的核磁共振数据信号归属(CD₃OD)

化合物2的HR-ESI谱(图10)显示其准分子离子峰为m/z 763.1613([M+ Na]⁺,calcd 763.1633)，结合碳谱推断其分子式为C₃₉H₃₂O₁₅。

化合物2的1D/2DNMR谱数据(图11～15，表2)与化合物1高度相似，唯一的区别是L-鼠李糖基上的反式香豆酰基和顺式香豆酰基单元的位置相反。在HMBC谱图(图9，图15)上能明显看到H-2”(δ5.81),H-3”(δ5.25)分别和顺式香豆酰基的羰基碳信号(δ167.58)、反式香豆酰基的羰基碳信号(δ 167.77)的远程相关，证实了顺式香豆酰基和反式香豆酰基单元分别连接在鼠李糖的C-2〞和C-3″位置。

因此，化合物2被鉴定为槲皮素-3-O-α-L-(2"-Z-对香豆酰基-3"-E-对香豆酰基)-鼠李糖苷，结构式如式(1)所示，其二维相关信号如图9所示。

表2.化合物2的核磁共振数据信号归属(CD₃OD)

实施例3：对金黄色葡萄球菌抑制活性测试

将Newman金黄色葡萄球菌ATCC 25904接种至BHI培养板，于35℃培养 18～24h，从平皿中挑选几个菌落直接在CAMHB肉汤中制成(1～2)×10⁸CFU/mL的菌悬液。用CAMHB肉汤稀释100倍，使浓度为(1～2)×10⁶CFU/mL (当加入药敏板后浓度约为5×10⁵CFU/mL)。

取无菌96孔板，于第A行孔和第H行孔加入盐水防止内部菌液挥发，第 B～G行孔为以下内容操作孔，每孔终体积为200μL。第1列孔加入液体培养基 200μL，作空白对照。第2～12列孔加入液体培养基100μL：第2～11列为药物孔(复孔为3)，2列孔加入128μg/mL的受试药物100μL，3～11列孔进行倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125……μg/mL。12列孔不含药物，加入与2列孔等量DMSO作为阳性生长对照。第2～12列孔加入(1～2)×10⁶CFU/mL的菌悬液100μL。

药敏反应板于35℃培养箱孵育16～20h，以无菌落生成的最低受试药浓度为最小抑菌浓度(MIC)。以甲氧西林和氯霉素作为阳性对照组。受试物的抗菌活性测定结果参见表3所示。

表3.法国梧桐树叶提取物及新型黄酮苷化合物的抗菌活性数据

由表3可知，阳性对照甲氧西林和氯霉素对Newman金黄色葡萄球菌ATCC 25904的MIC值分别为2和4μg/mL；法国梧桐提取物中亚组分I和亚组分Ⅱ的 MIC值分别为256μg/mL和128μg/mL；新黄酮苷类化合物1和化合物2的最小抑菌浓度均为64μg/mL。表明，本申请法国梧桐树叶提取物及新黄酮苷类化合物1和化合物2对Newman金黄色葡萄球菌ATCC 25904具有一定的抑制作用。

综上，本发明法国梧桐树叶提取物及新黄酮苷类化合物可用于制备金黄色葡萄球抑制剂或作为该类抗菌药物的先导化合物，在制备治疗由金黄色葡萄球感染引起的化脓感染、乳腺炎、肺炎、肠炎、心内膜炎、败血症和中毒性休克的药物领域有巨大的潜在用途。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种黄酮苷类化合物的制备方法，其特征在于，包括：

（1）以法国梧桐叶子为原料，采用溶剂提取法制成浓缩水提物或浓缩醇提取物；

（2）对所述浓缩水提物或浓缩醇提取物经大孔树脂D101柱，采用乙醇-水溶剂***进行梯度洗脱；其中乙醇的起始体积分数为0~30%，乙醇的最终体积分数为100%；将60~70% 的EtOH洗脱流分合并浓缩，得到亚组分Ⅰ；

（3）亚组分I经小孔树脂MCI凝胶柱，采用甲醇-水溶剂***进行梯度洗脱；其中甲醇的起始体积分数为0~30%，甲醇的最终体积分数为100%；将50~90% 的MeOH洗脱流分合并浓缩，得到亚组分Ⅱ；

（4）对亚组分Ⅱ采用半制备HPLC进行纯化，以体积比为66：34的甲醇：0.05%三氟乙酸水溶液等度洗脱，分别收集保留时间22.5min组分和31.7 min组分，得到黄色无定形粉末分别为化合物1和化合物2；

化合物1和化合物2的结构式如式（1）所示：

（1）；

其中，化合物1中R₁为E-p-conumaroyl、R₂为Z-p-conumaroyl；化合物2中R₁为Z-p- conumaroyl、R₂为E-p-conumaroyl。