CN113951250A - 一种功能性器官保存液 - Google Patents

Abstract

本发明适用于医疗技术领域，提供一种器官保存液及肾脏体外保存方法，所述器官保存液包括以下组分：HC‑A液和18β‑甘草次酸：通过两者的联合使用可使肾损伤标志物和炎症因子水平下降、肾功能改善，说明HC‑A液和18β‑甘草次酸联合使用的功能性器官保存液可有效改善供肾质量，减少肾损伤；尤其对静态冷保存的移植供肾有显著的保护作用；解决了现有的器官保存液很难对供体肾脏产生修复作用的问题，使很多边缘供肾免于沦为废弃肾脏，挽救了大量宝贵肾源。

Description

一种功能性器官保存液

一、技术领域

本发明涉及功能性器官保存液，属于医疗技术领域，具体地，本发明提供了18β-甘草次酸在制备功能性器官保存液中的用途及使用方法。

二、背景技术

器官移植是目前治疗终末期器官衰竭的最佳方法之一，而器官保存质量对移植效果起决定性作用。因此对器官保存液进行改进在器官移植领域正日益受到重视。

现有的器官保存液在应对器官长期运输、保存，低温灌注等方面做出了改良，大大提升了移植物质量。自2015年我国实施公民逝世后器官捐献以来，循环死亡供肾日益增多，成为供器官的主要来源之一。与此同时，边缘供肾也逐渐增多，扩大了供者池。然而，边缘供肾导致的移植物功能延迟(delayed graftfunction，DGF)日益凸显，是移植物失功的独立危险因素，影响着移植物的长期存活率。因此，我国器官移植的发展对器官保存液的研发提出了更高的要求。如若能在器官保存液中加入减轻肾损伤、保护肾功能的有效成分，将在改善移植物长期存活方面做出贡献。

国内器官保存液最成功的是HC-A液(高渗枸橼酸盐腺嘌呤溶液)，由第二军医大学附属长征医院与上海中心血站共同研发，在国外Ross 液配方的基础上加以改良的，其成分均相同于Ross溶液。HC-A液改变的地方有3点:一是渗透压降为380mmol/kg，二是添加腺嘌呤 0.38mmol/L，三是pH值调至7.0。这些改进根据当时有关肾脏低温能量代谢研究的进展以及中国人肾脏的生理特点从而获得了很大的成功。因此，HC-A液的特点为:加入腺嘌呤补充能量底物；液体粘滞度较低，离体灌注效果好；配置简单，使用方便，价格低廉。然而，在减轻DGF发生率方面，HC-A液没有相关报道。

18β-甘草次酸(18β-Glycyrrhetinic acid)，又名甘草亭酸，是多年生豆科草本植物甘草的一种三萜皂苷类提取物，是甘草在体内发挥药理作用的最主要的有效活性成分之一，具有抗炎及增强免疫、抗癌、抗肿瘤、镇咳去痰、降血脂，降血糖等广泛的药理作用。本实验在现有的HC-A液中加入合适剂量的18β-甘草次酸，采用小鼠离体肾脏灌注和低温冷保存的实验方法，探索其对供肾的影响及其潜在作用机制。

本发明提出的18β-甘草次酸联合HC-A液的功能性器官保存液，不仅可以起到保存器官的作用，而且可以减少器官的损伤。本发明主要用于肾脏移植供体肾脏的体外冷保存。包括但不限于静态冷保存和机械灌注冷保存。

三、发明内容

本发明的目的通过向HC-A液中添加18β-甘草次酸，提升器官保存能力，改善移植物功能。

优选地，所述一种功能性器官保存液中18β-甘草次酸浓度为 1-100μmol/L。

优选地，所述一种功能性器官保存液中18β-甘草次酸浓度为 5-75μmol/L。

优选地，所述一种功能性器官保存液中18β-甘草次酸浓度为 10-50μmol/L。

优选地，所述一种功能性器官保存液中18β-甘草次酸浓度为 25μmol/L。

上述功能性器官保存液对肾脏体外保存方法，包括以下步骤：

(1)提取离体肾脏；

(2)将离体肾脏经0～4℃功能性器官保存液灌注，并将器官浸润在功能性器官保存液中，置于0～4℃环境中。

进一步地，所述18β-甘草次酸的单次应用量仅限于不引起中枢抑制的剂量。

本发明中所述一种功能性器官保存液包括但不限于灌注液，如溶液、悬液、乳液等，粉针剂，注射片剂。

除上面所列剂型外，18β-甘草次酸可以被制备入各种临床上可接受的口服和肠胃外给药剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液、透皮给药制剂等。

根据剂型的需要和药剂学常识，所制备的包含甘草次酸的制剂中可以包含各种药学可接受的辅料，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂等。

综上所述，由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：本发明提供了一种功能性器官保存液，通过将18β-甘草次酸加入HC-A保存液，具有降低供肾损伤标志物的水平，减轻炎症及提高肾功能，提升移植物长期存活率及患者术后生存水平，而且操作简便，适用性强。

四、附图说明

图1:在HC-A保存液和HC-A+18β-甘草次酸保存液中保存6小时后，肾脏HE染色图；

图2:在HC-A保存液和HC-A+18β-甘草次酸保存液中保存6小时后，两组肾组织中肾损伤标志物的柱状图。

图3：在HC-A保存液和HC-A+18β-甘草次酸液中保存6小时后，两组肾功能的柱状图：A.肌酐水平；B.尿素水平。

图4:在HC-A保存液和HC-A+18β-甘草次酸保存液中保存6小时后，两组肾组织炎症因子水平的柱状图：A.TNF-α；B.INF-γ；C.IL-1β；D. IL-6；E.IL-10；F.TGF-β1。

图5：18β-甘草次酸分子式

五、具体实施方式

为了使本发明实施例的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明实施例进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明实施例，并不用于限定本发明实施例。

传统的HC-A液，以及进口的UW液和HTK液很难对供肾产生修复作用，很多边缘供肾采用传统保存液之后，彻底沦为废弃肾脏，浪费了宝贵的肾源。本发明实施例通过将HC-A液和18β-甘草次酸联合使用，有效改善供肾质量，减少供肾损伤。

1、边缘供肾模型建立

选取SPF级雄性C57小鼠，6～8周龄，体重20～25g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。术前禁食禁饮12小时。经小动物麻醉机用异氟烷行持续气体麻醉，麻醉稳定后，小鼠被固定于手术台上，用脱毛膏腹部备皮，75％酒精消毒，沿腹中线分离皮肤、腹直肌和壁腹膜，切口2cm左右。用棉签向右推开肠管，暴露出小鼠左肾和左肾蒂。采用血管夹夹闭小鼠左侧肾蒂30min，观察到左侧肾脏由鲜红色逐渐变成紫黑色。夹闭过程中将小鼠置于恒温加热垫，使温度稳定于36.5～37.5℃。同时小鼠腹腔内给予0.5mL生理盐水补充体液。 30min后取走血管夹，观察到肾脏由紫黑色迅速变成深红色再变成鲜红色，逐层关腹。

2、获取边缘供肾，离体灌注

实施例1：

术前30min腹腔内注射1ml100U/mL肝素生理盐水。后经小动物麻醉机用异氟烷行持续气体麻醉，麻醉稳定后，小鼠被固定于手术台上，腹部用75％酒精消毒，剪开前日的腹部切口，扩大切口，上至胸骨剑突，下至耻骨上缘，左右沿肋弓下缘水平剪开。

分离腹主动脉，在其远端分叉处阻断；在左肾下0.5cm处腹主动脉上***留置针并固定作为灌注开口，同时阻断肾脏平面以上近胸端腹主动脉。向灌注开口内注射HC-A液+18β-甘草次酸，行重力灌洗，流速12mL/min，压力7.8-9.8kPa，即80-100cmH₂O，并在肾静脉平面下剪开下腔静脉作为引流出口。直至左肾表面转为苍白色且静脉引流出口液体清亮则表示灌洗充分。灌洗完毕后，分离输尿管，摘取肾脏，保存在4℃HC-A+18β-甘草次酸液中6小时。

实施例2：

术前30min腹腔内注射1ml100U/mL肝素生理盐水。后经小动物麻醉机用异氟烷行持续气体麻醉，麻醉稳定后，小鼠被固定于手术台上，腹部用75％酒精消毒，剪开前日的腹部切口，扩大切口，上至胸骨剑突，下至耻骨上缘，左右沿肋弓下缘水平剪开。

分离腹主动脉，在其远端分叉处阻断；在左肾下0.5cm处腹主动脉上***留置针并固定作为灌注开口，同时阻断肾脏平面以上近胸端腹主动脉。向灌注开口内注射HC-A液，行重力灌洗，流速12mL/min，压力7.8-9.8kPa，即80-100cmH₂O，并在肾静脉平面下剪开下腔静脉作为引流出口。直至左肾表面转为苍白色且静脉引流出口液体清亮则表示灌洗充分。灌洗完毕后，分离输尿管，摘取肾脏，保存在4℃ HC-A 液中6小时。

3、实验验证

肾脏分别经实施例1和实施例2中的器官保存液的静态冷保存6 小时后，取各组小鼠肾组织，以冠状面为切面，在肾盂平面平分肾脏，其中一半固定于4％多聚甲醛，用于石蜡切片后病理学观察，剩下一半等分为两份，一份提取肾组织匀浆行ELISA检测，另一份提取RNA 行qPCR检测。

3.1肾脏组织HE染色

(1)肾组织经***固定后，采用脱水机行脱水处理，包埋机进行包埋，制备蜡块；

(2)切片:每个切片的厚度为4μm；

(3)烤片:将切出的蜡片置于42℃温水中，捞片放在载玻片上；并于70℃下烤片1h；

(4)脱蜡:分别用二甲苯1以及二甲苯2各脱蜡15min；

(5)水化:先使用100％乙醇1以及100％乙醇2各脱苯5min，再依次用95％、85％和75％的乙醇水化5min，最后行蒸馏水洗涤5min；

(6)苏木精染色:染色8min后，纯水冲洗；

(7)分化:1％盐酸-酒精分化几秒钟后，纯水冲洗20min；

(8)伊红染色:染色10min；

(9)脱水:先用80％、90％和95％的乙醇分别脱水5min，然后100％乙醇1以及100％乙醇2分别脱水5min，最后取二甲苯1以及二甲苯 2各脱水5min；

(10)封片:中性树胶封片后，晾干15min，于光学显微镜下观察拍照。

病理科医生对病理结果随机选取400×放大倍数下的5个视野进行单盲分析。光镜下的病理表现为：肾小管扩张，小管上皮刷状缘脱落，上皮细胞空泡化，细胞坏死、脱落。肾间质炎症细胞浸润。根据肾小管损伤评分：无损伤＝0分；受损肾小管<5％＝1分；受损肾小管 5％～25％＝2分；受损肾小管25％～55％＝3分；受损肾小管50％～ 75％＝4分；受损肾小管>75％＝5分。每个视野的得分累计后求平均值为该样本的最终得分。

3.2肾损伤标志物和肾功能检测

1/4肾组织在冰上剪碎，净血，加9倍PBS(pH7.4)制成匀浆。 4℃，3000rpm/min离心20min，取上清待测。采用ELISA试剂盒检测肾损伤标志物NGAL、Kim-1，和肾功能指标：肌酐(SerumCreatinine，SCr)和尿素(Urea)。以NGAL测定为例，具体步骤为：(1)试剂盒恢复至室温下使用，配比工作液，进行标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；(2)加样: 分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；(3)温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟；(4)配液:将30(48T的20倍) 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用；(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；(6)加酶:每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；(7)温育：操作同3；(8)洗涤：操作同5；(9) 显色:每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；(11)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。

3.3肾脏炎症因子检测

将1/4肾组织中加入1mlTrizol，匀浆机研磨制成匀浆，向其中加入200ul三氯甲烷，混匀，冰上静置10min。以12000×g，4℃离心 15min。取上清约400ul，向其中加入等体积异丙醇，震荡混匀冰上静置10min，以12000×g，4℃离心15min后弃上清，向其中加入75％无水乙醇重悬沉淀，再次以12000×g，4℃离心5min，弃上清，晾干。至管壁无液珠后加入20ulDEPC水重悬沉淀得到RNA溶液，用紫外分光光度计测RNA浓度。逆转录获得cDNA，在使用Subgreen试剂进行qPCR检测。检测的炎症因子包括：IL-1β，IL-6，IL-10，TGF-β， TNF-α，INF-γ。

3.4统计学处理方法

实验数据以均数±标准差表示，应用GraphpadPrism 9统计软件对数据进行分析。组间差异采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。 *：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p<0.0001。

4、结果

4.1病理染色显示：相比于HC-A保存液，供肾经过功能性器官保存液保存后，移植肾纤维化减轻

4.2相比于HC-A保存液，移植肾经功能性器官保存液保存后，在转录水平减轻移植肾纤维化

4.3相比于HC-A保存液，移植肾经功能性器官保存液保存后，在蛋白水平减轻移植肾纤维化

上述所有实验结果都证明，功能性器官保存液对发生急性肾损伤的小鼠供肾具有保护作用，无论在宏观的病理水平，还是在微观的转录和蛋白水平。以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种功能性器官保存液，其特征在于，包括以下组分：HC-A液和18β-甘草次酸。所述18β-甘草次酸的分子结构式如式(1)所示：

2.根据权利要求1的用途，其中所述的一种功能性器官保存液，其特征是：所述18β-甘草次酸的浓度为1-100μmol/L。

3.根据权利要求1的用途，其中所述的一种功能性器官保存液，其特征是：所述18β-甘草次酸的浓度为5-75μmol/L。

4.根据权利要求1的用途，其中所述的一种功能性器官保存液，其特征是：所述18β-甘草次酸的浓度为10-50μmol/L。

5.根据权利要求1的用途，其中所述的一种功能性器官保存液，其特征是：所述18β-甘草次酸的浓度为25μmol/L。

6.根据权利要求1的用途，其中所述18β-甘草次酸的单次应用量仅限于不引起中枢抑制的剂量。

7.一种基于权利1-5任一所述的功能性器官保存液的肾脏体外保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取离体肾脏；

(2)将离体肾脏经0～4℃功能性器官保存液灌注，并将器官浸润在功能性器官保存液中，置于0～4℃环境中。

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