CN113943710A - 一种car-t细胞培养用的培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CAR‑T细胞培养用的培养基及其应用。本发明CAR‑T细胞培养用的培养基包括基本培养基和达托霉素。本发明在研究中发现,达托霉素能提高CAR‑T细胞的抗耗竭能力和肿瘤杀伤能力,D‑CAR‑T耗竭水平显著低于普通CAR‑T,在持续杀伤的情况下,D‑CAR‑T仍然保持高效的杀伤能力,增强了CAR‑T细胞的抗肿瘤功能。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程领域,特别是涉及一种CAR-T细胞培养用的培养基及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是通过基因工程技术使T淋巴细胞表达特异性抗体的结合位点,并能通过非主要组织相容性复合体(MHC)限制性的方式特异性识别并杀伤肿瘤细胞的细胞。CAR-T技术的开发与应用在恶性血液病癌症免疫治疗中展现了卓越的应用效果。尤其是近年来开发的CD19靶向的CAR-T技术在急性B淋巴细胞白血病(B-acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)中得到了显著的治疗效果,其中两款(CD28z、4-1BB)被FDA批准为复发性/难治性的B淋巴细胞白血病的有效治疗手段。
尽管在临床中CAR-T细胞疗法对B-ALL完全缓解率已经达到了90%,CAR-T技术仍然面临着复发率高、易于耗竭、特异性靶向开发难等重大挑战。目前,国内外研究者对CAR-T细胞功能的衡量主要集中在细胞亚群、耗竭标志性分子表达、杀伤效果三个层面上。Milone等人在2018年指出减少CAR-T细胞体外培养的时间可以增大其中央记忆型T细胞(CentralMemory T cell,TCM)的比重,从而在小鼠体内发挥更好的疗效,延长肿瘤复发的时间(DufvaO,Koski J,Maliniemi P,et al.Integrated drug profiling and CRISPR screeningidentify essential pathways for CAR T-cell cytotoxicity[J].Blood,The Journalof the American Society of Hematology,2020,135(9):597-609.),说明T细胞亚群的比例变化是影响CAR-T治疗的重要因素。此外,多篇文章已经证实利用GSK3β小分子抑制剂可以显著性下降PD1的蛋白水平,从而延长CAR-T细胞的存活时间([1]Sengupta S,Katz S C,Sengupta S,et al.Glycogen synthase kinase 3inhibition lowers PD-1expression,promotes long-term survival and memory generation in antigen-specific CAR-Tcells[J].Cancer letters,2018,433:131-139.[2]Martinez M,Moon E K.CAR T cellsfor solid tumors:new strategies for finding,infiltrating,and surviving in thetumor microenvironment[J].Frontiers in immunology,2019,10:128.)。而在CAR-T杀伤方面,Lenalidomide(来那度胺)则被证实能够促进CAR-T细胞对多发性骨髓瘤的杀伤作用(Wang X,Walter M,Urak R,et al.Lenalidomide enhances the function ofCS1chimeric antigen receptor–redirected T cells against multiple myeloma[J].Clinical Cancer Research,2018,24(1):106-119.)。总之,从三个方面上对CAR-T细胞功能进行改善有助于提升CAR-T治疗的效果。
达托霉素(分子式C72H101N17O26,CAS号103060-53-3)是一种新型环脂肽类抗生素,对临床上常见的革兰氏阳性菌具有快速杀菌活性,在治疗菌血症、感染性心内膜炎、复杂皮肤软组织感染等方面具有良好的临床应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有研究方案中CAR-T细胞功能减弱的缺点,提供一种提高杀伤能力、抗耗竭能力的CAR-T细胞制备和培养方法,该方法制备和培养的D-CAR-T(Daptomycin-CAR-T)细胞具有更强的肿瘤杀伤能力、更强的抗耗竭能力。
一种CAR-T细胞培养用的培养基,包括基本培养基和达托霉素。
优选的,达托霉素的使用浓度为20~100μM。更优选的,达托霉素的使用浓度为50~100μM。
优选的,基本培养基为:10%体积比的胎牛血清、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素以及200U/ml的白介素2(IL-2),余量为RPMI 1640培养基。
本发明又提供了所述培养基在CAR-T细胞的构建及培养中的应用。
本发明还提供了一种CAR-T细胞的构建及培养方法,包括以下步骤:
(1)准备制备CAR-T细胞所需的T细胞;
(2)利用含有CAR基因表达序列的慢病毒侵染步骤(1)中的T细胞,制成CAR-T细胞;
(3)对步骤(2)制备的CAR-T细胞进行培养,培养时使用所述培养基。
优选的,步骤(3)中,从转入CAR基因后的第6~12天开始使用所述培养基进行培养。更优选的,步骤(3)中每1~3天更换一次所述培养基。
本发明在研究中发现,达托霉素能提高CAR-T细胞的抗耗竭能力和肿瘤杀伤能力,D-CAR-T耗竭水平显著低于普通CAR-T,在持续杀伤的情况下,D-CAR-T仍然保持高效的杀伤能力,增强了CAR-T细胞的抗肿瘤功能。
附图说明
图1为达托霉素处理后的CD19-CAR-T细胞对Nalm6肿瘤细胞的连续杀伤效果,即连续杀伤过程中CAR-T细胞(A)和Nalm6细胞(B)的比例变化情况。
图2为达托霉素处理后的CD19-CAR-T细胞对Nalm6肿瘤细胞的连续杀伤五次后,相应的TCM(Centrol Memory T cell)比例变化情况。
图3为达托霉素处理后的CD19-CAR-T细胞对Nalm6肿瘤细胞的连续杀伤五次后,相应的PD1耗竭指标变化情况。
图4为达托霉素处理后的CD19-CAR-T细胞中TCM比例提高情况。
图5为达托霉素处理后的CD19-CAR-T细胞中PD1耗竭指标降低情况。
图6为达托霉素处理后的CD19-CAR-T细胞中LAG3耗竭指标降低情况。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明,此处描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
第一方面,本发明提供一种D-CAR-T细胞的制备方法,该方法包括将常规CAR-T细胞在达托霉素的处理下进行培养,得到D-CAR-T细胞,所述D-CAR-T细胞具有更高的杀伤能力和抗耗竭能力。
根据本发明,所述达托霉素的加入时期可以在较宽的范围内进行选择。优选的,所述达托霉素在CAR-T细胞培养的第6-12天连续加入,例如,6天、9天、12天加入。
根据本发明,所述CAR-T细胞在达托霉素中培养的时间也可以在较宽的范围内进行选择。优选的,所述CAR-T细胞在达托霉素中培养的时间为48h,即可显著改善CAR-T功能。更为优选的,所述CAR-T细胞在达托霉素处理下长期培养,得到的D-CAR-T细胞可更为有效地促进CAR-T细胞的功能。
根据本发明,对所述达托霉素用量可在较宽的范围内进行选择。优选的,在培养基中,所述达托霉素的用量使得其浓度为20-100μM,例如,20μM、50μM、100μM。
根据本发明,待处理的CAR-T细胞可以为本领域中任意的CAR-T细胞,其可以为单靶标CAR-T细胞和/或多靶标CAR-T细胞。优选的,所述CAR-T细胞选自CD19-CAR-T细胞、CD20-CAR-T细胞、CD22-CAR-T细胞、CD20/CD19-CAR-T细胞。
其中,CAR-T细胞的制备方法如实施例2所示。
第二方面,本发明提供了如上述方法制得的D-CAR-T细胞。
根据本发明,使用达托霉素制备的D-CAR-T细胞,细胞中TCM的比例显著提高;对肿瘤细胞具有更强的杀伤能力,在持续杀伤过程中,更为明显。
第三方面,本发明提供了如上述的D-CAR-T细胞在制备***制剂中的应用。
第四方面,本发明提供了达托霉素在CAR-T临床治疗中的潜在应用价值,任何CAR-T临床治疗中使用达托霉素作为辅助药剂治疗所属权利应包含在本专利发明中。
其中,所述待***的种类可以根据不同的CAR-T细胞类型进行选择,这些均是本领域技术人员所公知的,此处不再详述。
以下,将通过实施例对本发明进行详细描述。
HEK293T细胞,ALL细胞株Nalm6由中科院上海细胞所引进保存。
聚乙烯亚胺酸盐(PEI)购自美国Polysciences公司。
青链霉素混合液(100X)购自北京索莱宝科技有限公司。
RPMI 1640培养基购自美国Corning公司)。
DMEM(High Glucose)培养基购自美国Corning公司。
胎牛血清(FBS)购自美国GIBCO公司。
Ficoll淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。
IL-2购自美国Peprotech公司。
质粒:CD28z,psPAX2和pMD2.G由浙江大学血液病研究所保存。
anti-CD3/CD28磁珠:临床研究级别,购自美国Thermo公司,CAT#40203D。
polybrene购自美国Sigma-Adrich公司。
流式荧光抗体:anti-human CD62L(PE)、anti-human CD45RO(APC)、anti-humanPD-1(APC)、anti-human LAG-3(PE-cy7);PE、APC、PE-cy7、同型对照均购自美国Biolegend公司。
EasySepTM人T细胞阴选试剂盒购自美国Stem Cell公司,CAT#17951。
实施例1:病毒制备
1、使用DMEM完全培养基培养293T细胞,其中DMEM完全培养基包括DMEM(HighGlucose)培养基、体积比10%FBS、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素。当293T密度达到60%-70%时换液,加入5ml新的DMEM完全培养基,培养30min后进行下一步。
2、配置质粒公共体系,规格为每个10cm培养皿中加入目的质粒(CD28z)7.5μg,psPAX2质粒5.625μg,pMD2.G质粒1.875μg,PEI溶液45μl,DMEM(High Glucose)培养基200μl。按照DMEM(High Glucose)培养基、质粒、PEI的顺序配置DNA混合物
3、静置20min后,按每个皿所需体积取公共体系均匀滴加入培养皿中,十字摇晃2-3次后放入37℃培养箱。
4、6-8h后换液,加入10ml DMEM完全培养基。
5、加完质粒48h后收第一批病毒,放在4℃保存,向培养皿补加10ml DMEM完全培养基。
6、加完质粒72h后收第二批病毒。
7、离心参数设置为400g、10min,离心,去除细胞碎片。
8、用0.45μm黄色滤膜过滤后,超速离心,离心机参数设置为25000rpm、2h、4℃。
9、倒去上清,加RPMI 1640培养基浓缩100-200倍,在4度冰箱静置2h,分装至200μlEP管。
实施例2:CAR-T的制备
1、取健康成年人外周血10ml至含EDTA采血管中,用滴管将血液转移到50ml离心管中,加入血液等体积的PBS溶液,混匀;
2、以血液体积∶Ficoll淋巴细胞分离液体积=1∶1的比例,先把分离液加入新的15mL离心管中,再将与PBS混合后的血液用滴管轻轻加入;
3、离心,设置转速为400g,时长为25min,参数调为升4降0;
4、用移液枪吸取离心管中间部位的外周血单个核细胞组成的白膜层,吸到新的离心管中;
5、用PBS稀释到15ml洗涤,离心,转速为300g,时长7min,参数为升9降9;
6、离心后弃去上清,再加5ml PBS冲洗,计数,将细胞转移至流式管中;
7、使用EasySepTM人T细胞阴选试剂盒,按试剂盒标准量加入isolation cocktail,室温放置5min;
8、将试剂盒中rapid spheres预先斡旋震荡30s;
9、按试剂盒标准量加入rapid spheres beads,将总体积补充至2.5ml,混匀,室温静置3min;
10、将流式管放入小的磁力架中,静置1min,随后将获得的T细胞倒入一个新的15ml离心管中;
11、离心,转速为300g,时长5min,去上清并用1ml基本培养基重悬细胞,计数;
12、取anti-CD3/CD28磁珠,以磁珠∶细胞=3∶1的比例,计算用量
13、吸取磁珠到新的50ml离心管,加入5ml RPMI 1640培养基清洗磁珠,将离心管放磁力架静置1min,用枪吸去废液,洗两次;
14、将1ml细胞加入50ml管中与磁珠混合后,转移至T25培养瓶底部,侧立在摇床上摇20min,使T细胞和磁珠充分接触;
15、补加5ml基本培养基,37℃培养箱培养24h;
16、24h后算作CAR-T细胞的第1天,配置T细胞感染体系,按照每孔(1.5~2)×106个T细胞、每孔600μl体系配置,体系包含T细胞、实施例1中制备的病毒、polybrene、基本培养基,用基本培养基重悬T细胞,所用病毒体积使得病毒量为T细胞量的3~4倍,polybrene转染剂0.25μl,按照200U/ml IL-2和体积比10%FBS的浓度补足IL-2和FBS,体系中剩余体积用基本培养基补足。其中,基本培养基包括RPMI 1640培养基、体积比10%FBS、200U/mlIL-2、体积比1%青链霉素混合液(100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素);
17、6~8h后补充基本培养基1ml,24h后换液,用基本培养基以1×106/ml浓度培养;
18、第6、9、12天将细胞接种在6孔板,每个时间点均分为对照组和实验组,对照组中加入溶解达托霉素相同体积的DMSO,实验组分为达托霉素20μM、达托霉素50μM、达托霉素100μM三种处理浓度,各组分别设立3个复孔,每孔4ml。加药后每3天进行基本培养基换液,并在实验组中加入相应量的达托霉素,将用达托霉素处理过的CAR-T细胞称为D-CAR-T细胞,得到对照组CAR-T和实验组D-CAR-T细胞。
实施例3:连续杀伤实验检测CAR-T细胞的杀伤功能
1、将对照组CAR-T(加入溶解达托霉素相同体积的DMSO)和三种药物浓度梯度(达托霉素20μM、达托霉素50μM、达托霉素100μM)处理3天后的D-CAR-T细胞分别接种到6孔板的不同孔中,每孔加入5×105个细胞;再向每孔中加入5×105个Nalm6(带GFP荧光),用基本培养基将体积补足至2ml,每种CAR-T细胞设置三个复孔,在37℃培养箱中培养24h;
2、用流式细胞仪检测GFP和Mcherry荧光值,观察Naml6残留量和CAR-T细胞剩余量;
3、此后每24h再次向每孔中加入5×105个Nalm6细胞,重复步骤2,从第一次加药时间算起,每72h进行换液并补加达托霉素,直至流式细胞仪显示活细胞比例低于10%时停止本实验;
4、结果显示,第四次加入Nalm6时,对照组CAR-T细胞剩余比例极低,相应的Nalm6残留比例较高,说明对照组CAR-T已无法继续完成杀伤功能;而经过处理的D-CAR-T细胞在加入七次Nalm6后,仍然可以保持较高的CAR-T细胞比例,和较低的Nalm6残留比例,能够较完美地完成肿瘤杀伤功能(如图1所示)。
此外,图2为对照组和达托霉素处理组的CAR-T细胞对Nalm6肿瘤细胞的连续杀伤五次后,相应的TCM(Central Memory T cell,中央记忆型T细胞)比例变化情况。图3为对照组和达托霉素处理组的CAR-T细胞对Nalm6肿瘤细胞的连续杀伤五次后,相应的PD1耗竭指标变化情况。图2、3中所示,经过20μM达托霉素处理的D-CAR-T细胞,在进行第五次加入Nalm6后,相应的CAR-T细胞中TCM比例为17%,经过50μM达托霉素处理的比例为30.1%,而未处理的比例为6.83%,说明达托霉素处理的CAR-T细胞功能性较强。
实施例4:流式细胞术检测CAR-T细胞的亚群分布
1、从对照组和D-CAR-T组中分别取5×105个细胞,转移至流式管中,离心,设置参数为400g、5min;
2、去除上清,并加入1ml PBS清洗,再次离心,参数设为400g、5min;
3、去除上清后,每管加入100μl PBS,再加入抗体anti-human CD62L(PE)、anti-human CD45RO(APC)各0.5μl,室温避光孵育15min;
4、加入1ml PBS清洗抗体,离心,参数设为400g、5min,去上清;
5、加入300μl PBS重悬后,流式细胞仪上机检测;设置每管获得10000个细胞,以CD62L和CD45RO双阳性作为TCM的表型标准,记录TCM占比。检测结果发现随着达托霉素浓度的增加,TCM占比不断上升,且各D-CAR-T组的TCM占比显著高于对照组的数值。结果参见图4的流式分析图,结果表明达托霉素能有效提高CAR-T细胞中TCM的百分比。
实施例5:流式细胞术检测CAR-T细胞的耗竭指标
1、从对照组和D-CAR-T组中分别取5×105个细胞,转移至流式管中,离心,设置参数为400g、5min;
2、去除上清,并加入1ml PBS清洗,再次离心,参数设为400g、5min;
3、去除上清后,每管加入100μl PBS,再加入抗体anti-human PD-1(APC)、anti-human LAG-3(PE-cy7)各0.5μl,室温避光孵育15min;
4、加入1ml PBS清洗抗体,离心,参数设为400g、5min,去上清;
5、加入300μl PBS重悬后,流式细胞仪上机检测。设置每管获得10000个细胞,以PD1、LAG3作为耗竭的表型标准。检测结果发现随着达托霉素浓度的增加,耗竭指标不断降低。如图5的流式分析图所示为PD1指标的变化,图6所示为LAG3指标的变化。以上结果表明达托霉素能有效降低CAR-T细胞的耗竭指标数值。
Claims (8)
1.一种CAR-T细胞培养用的培养基,其特征在于,包括基本培养基和达托霉素。
2.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,达托霉素的使用浓度为20~100μM。
3.如权利要求2所述的培养基,其特征在于,达托霉素的使用浓度为50~100μM。
4.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,基本培养基为:10%体积比的胎牛血清、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素以及200U/ml的白介素2,余量为RPMI 1640培养基。
5.如权利要求1~4任一所述培养基在CAR-T细胞的构建及培养中的应用。
6.一种CAR-T细胞的构建及培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)准备制备CAR-T细胞所需的T细胞;
(2)利用含有CAR基因表达序列的慢病毒侵染步骤(1)中的T细胞,制成CAR-T细胞;
(3)对步骤(2)制备的CAR-T细胞进行培养,培养时使用权利要求1~4任一所述培养基。
7.如权利要求6所述的CAR-T细胞培养方法,其特征在于,步骤(3)中,从转入CAR基因后的第6~12天开始使用权利要求1~4任一所述培养基进行培养。
8.如权利要求7所述的CAR-T细胞培养方法,其特征在于,步骤(3)中每1~3天更换一次所述培养基。
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