CN113930466B - 一种类芽孢杆菌源金雀异黄素及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种类芽孢杆菌源金雀异黄素及其制备方法，基于类芽孢杆菌代谢产物中分离得到金雀异黄素，为金雀异黄素开创了新的来源，建立通过类芽孢杆菌发酵制备金雀异黄素的新途径。填补金雀异黄素的微生物制备途径可以降低生产成本，缩短生产周期，扩大生产率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种类芽孢杆菌源金雀异黄素，同时还提供了其制备方法。
背景技术
金雀异黄素(Genistein,GEN)又称为染料木素或染料木黄酮，分子式为C15H10O5，化学名为4', 5, 7-三羟基异黄酮，广泛存在于大豆等豆科植物和齿状植物中，作为天然有机化合物，凭借其独特的化学结构已作为靶向抗癌制剂在临床应用，并在其他一些疾病治疗中展示出极大的应用潜力。国内外对金雀异黄素的需求量巨大，然而当前主要从豆类植物中提取，也可化工合成。微生物合成因低成本、易于大规模生产、便于遗传操作等优势，在制药中占重要地位。开发微生物源金雀异黄素，利用发酵生产克服当前大规模生产金雀异黄素的固有缺陷，在医药以及食品领域具有良好的应用前景。
发明内容
本发明针对金雀异黄素大规模生产的不足，提供了类芽孢杆菌源金雀异黄素及其制备方法。
基于上述目的，类芽孢杆菌源金雀异黄素及其制备方法包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行：
S1.将细菌发酵液冷冻离心去除菌体和发酵残渣，收集上清液；
S2.将上清液进行酸化沉淀，冷冻离心收集沉淀部分，冷冻干燥，对干燥粉末进行甲醇萃取，收集有机相进行减压旋转蒸发至浸膏，获得粗提取物；
S3.以200-300目硅胶柱对粗提取物进行低压层析，用不同梯度的二氯甲烷甲醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，依次对洗脱液进行减压旋蒸发，获得初步纯化的提取物FrⅠ、FrⅡ、FrⅢ、FrⅣ；
S4.以半制备高效液相色谱法对初步纯化物FrⅡ进一步纯化，获得纯化物F2，其结构式如下：
优选的，所述细菌发酵液为类芽孢杆菌YPG26细菌发酵液，培养基为胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基。
优选的，所述酸化沉淀是利用6M盐酸将上清液pH调至2.0，静置沉淀（4℃，12h~16h）。
优选的，所述半制备高效液相色谱法包含如下工艺参数：
色谱柱: COSMOSIL 5C18-MS-II柱，规格为: 10×250mm I.D.，粒径为:5μm ;流动相:甲醇(A)和水(B)，柱温:RT，检测波长为280nm。
优选的，所述半制备高效液相色谱法包含如下操作：
梯度洗脱：0~15min采用20% ~50%甲醇溶液进行洗脱,15~16min采用50%~80%甲醇溶液进行洗脱,16~40min采用80% ~100%甲醇溶液进行洗脱，40~50min采用100%甲醇溶液进行洗脱。
检测并收集各流出物洗脱峰，得到保留时间Rt为22.035min的洗脱峰，然后减压旋转蒸发冻干，得到纯化物F2（金雀异黄素）。
本发明的积极效果在于：基于类芽孢杆菌代谢产物中分离得到金雀异黄素，为金雀异黄素开创了新的来源，建立通过类芽孢杆菌发酵制备金雀异黄素的新途径。填补金雀异黄素的微生物制备途径可以降低生产成本，缩短生产周期，扩大生产率。
附图说明
图1为本发明类芽孢杆菌源金雀异黄素的半制备液相洗脱峰图；
图2为本发明类芽孢杆菌源金雀异黄素的分析型高效液相色谱图；
图3为本发明类芽孢杆菌源金雀异黄素的UPLC/MS-MS二级阳离子质谱图；
图4为本发明类芽孢杆菌源金雀异黄素的1H NMR谱图；
图5为本发明类芽孢杆菌源金雀异黄素的13C NMR谱图。
具体实施方式
下面由特定的具体实施例进一步说明本发明，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，但也并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，或按照商品说明书进行。
实施例1
1、发酵培养：取对数生长期末期类芽孢杆菌YPG26菌液为种子液，按1%（v/v）转接扩大培养，获得细菌发酵液。10000×g，20min，4℃离心去除菌体和发酵残渣，收集上清液；
2、粗提取：利用6M盐酸将上清液pH调至2.0，边加盐酸边搅拌、实时测定pH，静置沉淀（4℃，12h）。8000×g，15min，4℃离心收集沉淀部分，4M NaOH调节pH=6.8,冷冻干燥，干燥粉末进行甲醇萃取，收集有机相进行减压旋转蒸发至浸膏，获得粗提取物；
3、初步纯化：以200-300目硅胶柱对粗提取物进行低压层析，分别以二氯甲烷：甲醇比例为10：0；9:1；8:2；7:3；6:4；5:5；0:10每个洗脱比例洗涤一个柱体积来进行梯度洗脱，收集洗脱液，依次对洗脱液进行减压旋蒸发，获得初步纯化的提取物FrⅠ（10:0洗脱组分）、FrⅡ（9:1、8:2洗脱组分合并）、FrⅢ（7:3、6:4洗脱组分合并）、FrⅣ（5:5、0:10洗脱组分合并）；
4、制备纯化：以半制备高效液相色谱法对初步纯化物FrⅡ进一步纯化，获得纯化物F2。色谱柱: COSMOSIL 5C18-MS-II柱，规格为: 10×250mm I.D.，粒径为:5μm；流动相:甲醇(A)和水(B)，柱温:RT，检测波长为280nm。
梯度洗脱：0~15min采用20% ~50%甲醇溶液进行洗脱,15~16min采用50%~80%甲醇溶液进行洗脱,16~40min采用80% ~100%甲醇溶液进行洗脱，40~50min采用100%甲醇溶液进行洗脱。
检测并收集各流出物洗脱峰，如图1所示得到保留时间Rt为22.035min的洗脱峰，然后减压旋转蒸发冻干，得到纯化物F2。
实施例2
1、发酵培养：取对数生长期末期类芽孢杆菌YPG26菌液为种子液，按1%（v/v）转接扩大培养，获得细菌发酵液。10000×g，20min，4℃离心去除菌体和发酵残渣，收集上清液；
2、粗提取：利用6M盐酸将上清液pH调至2.0，边加盐酸边搅拌、实时测定pH，静置沉淀（4℃，16h）。8000×g，15min，4℃离心收集沉淀部分，4M NaOH调节pH=6.8,冷冻干燥，干燥粉末进行甲醇萃取，收集有机相进行减压旋转蒸发至浸膏，获得粗提取物；
3、初步纯化：以200-300目硅胶柱对粗提取物进行低压层析，分别以二氯甲烷：甲醇比例为10：0；9:1；8:2；7:3；6:4；5:5；0:10每个洗脱比例洗涤一个柱体积来进行梯度洗脱，收集洗脱液，依次对洗脱液进行减压旋蒸发，获得初步纯化的提取物FrⅠ（10:0洗脱组分）、FrⅡ（9:1、8:2洗脱组分合并）、FrⅢ（7:3、6:4洗脱组分合并）、FrⅣ（5:5、0:10洗脱组分合并）；
4、制备纯化：以半制备高效液相色谱法对初步纯化物FrⅡ进一步纯化，获得纯化物F2。
色谱柱: COSMOSIL 5C18-MS-II柱，规格为: 10×250mm I.D.，粒径为:5μm ;流动相:甲醇(A)和水(B)，柱温:RT，检测通道波长为280nm.
梯度洗脱：0~15min采用20% ~50%甲醇溶液进行洗脱,15~16min采用50%~80%甲醇溶液进行洗脱,16~40min采用80% ~100%甲醇溶液进行洗脱，40~50min采用100%甲醇溶液进行洗脱。
检测并收集各流出物洗脱峰，半制备高效液相色谱图如图1所示，手动收集保留时间Rt为22.035min的洗脱峰，然后减压旋转蒸发冻干，得到纯化物F2。
纯化物F2由分析型高效液相色谱法检测纯度如图2所示，经高效液相色谱峰面积归一化法分析，F2纯度高于95%。
通过UPLC/MS-MS和1H NMR ,13C NMR，对F2进行组分鉴定，确定为金雀异黄素，具体的数据如下：
如图3，UPLC/MS-MS二级阳离子质谱图结果显示F2分子量为270.05908。
如图4，1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.02 (s, 1H), 7.31 (d, J = 8.6 Hz,2H), 6.82 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.83 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.77 (d, J = 2.3 Hz,1H)；
如图5，13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 157.09 (1C,s), 138.91 (1C,s), 130.43(2C,s), 122.02 (2C,s), 114.88 (2C,s), 103.36 (1C,s), 87.38 1C,s) , 69.77 (1C,s)。
根据上述信息，F2分子式确定为C15H10O5,结构式推演为如下所示：
确定其为金雀异黄素，证实了类芽孢杆菌（Paenibacillus jilinensis sp. nov.YPG26）次级代谢产物中金雀异黄素的产生，且此制备方法切实可行。
由上述实施例可以看出，本发明提供了金雀异黄素新来源，并对类芽孢杆菌源金雀异黄素制备方法进行了说明，但也可以看出，在本发明基础上，可以对之做出一些修改，因此，在不偏离本发明精神和原则的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (1)
1.一种类芽孢杆菌源金雀异黄素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1.将类芽孢杆菌Paenibacillus jilinensis sp. nov. YPG26细菌发酵液冷冻离心去除菌体和发酵残渣，收集上清液；培养基为胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基；
S2.将上清液进行酸化沉淀，冷冻离心收集沉淀部分，冷冻干燥，对干燥粉末进行甲醇萃取，收集有机相进行减压旋转蒸发至浸膏，获得粗提取物；所述酸化沉淀是利用6M盐酸将上清液pH调至2.0，4℃静置沉淀12h~16h；
S3.以200-300目硅胶柱对粗提取物进行低压层析，用不同梯度的二氯甲烷甲醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，依次对洗脱液进行减压旋蒸发，获得初步纯化的提取物 FrⅠ、FrⅡ、FrⅢ、FrⅣ，10:0 洗脱组分为 FrⅠ，9:1、8:2 洗脱组分合并得到 FrⅡ，7:3、6:4 洗脱组分合并得到 FrⅢ，5:5、0:10 洗脱组分合并得到 FrⅣ；
S4.以半制备高效液相色谱法对初步纯化物FrⅡ进一步纯化，具体制备方法包含如下工艺参数：色谱柱: COSMOSIL 5C18-MS-II柱，规格为：10×250mm I.D.，径为：5μm ；流动相：甲醇(A)和水(B)，柱温：RT，检测波长:280nm，梯度洗脱：0~15min采用20% ~50%甲醇溶液进行洗脱，15~16min采用50%~80%甲醇溶液进行洗脱，16~40min采用80% ~100%甲醇溶液进行洗脱，40~50min采用100%甲醇溶液进行洗脱；检测并收集各流出物洗脱峰，得到保留时间Rt为22.035min的洗脱峰，然后减压旋转蒸发冻干，即得。
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| CN202111258828.3A Active CN113930466B (zh) | 2021-10-28 | 2021-10-28 | 一种类芽孢杆菌源金雀异黄素及其制备方法 |
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Families Citing this family (1)
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN105072915A (zh) * | 2013-03-20 | 2015-11-18 | 巴斯夫公司 | 包含枯草芽孢杆菌菌株和生物农药的协同增效组合物 |
| EP2962568A1 (en) * | 2014-07-01 | 2016-01-06 | Basf Se | Mixtures comprising a bacillus amyliquefaciens ssp. plantarum strain and a pesticide |
| CN105439725A (zh) * | 2015-12-19 | 2016-03-30 | 佛山市艳晖生物科技有限公司 | 一种用于农场现场发酵的多粘类芽孢杆菌药肥及其应用 |
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2021
- 2021-10-28 CN CN202111258828.3A patent/CN113930466B/zh active Active
Patent Citations (4)
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