CN113916754B - 用于检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞的细胞表面标志物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞的细胞表面标志物及应用，细胞表面标志物，包括TSPAN1、FAIM2、KCNJ4、GABRD、PDK1L2、OR1OK1、UPK1B和OR51M1；采用细胞表面标志物对应的抗体进行免疫捕获乳腺癌CTC；本发明利用得到的乳腺癌患者循环肿瘤细胞的表面标志物，得到了用于免疫富集筛选的最佳抗体组合，提高了乳腺癌CTC的富集捕获效率，有效提高了CTC捕获特异性及敏感性，具有高效捕获乳腺癌CTC的效果。克服了现有乳腺癌CTC富集标志物种类不足、检出率低、纯度低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤细胞检测技术领域，具体涉及用于检测乳腺癌患者CTC的细胞表面标志物及应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)是指从肿瘤组织脱离并释放进入血液循环***的肿瘤细胞，可真实表征肿瘤负荷和特征，动态反映肿瘤基因组学信息和基因表达谱变化，与患者肿瘤的远处转移有着密切的关系，对于恶性肿瘤诊断和临床分期判断具有重要意义。目前CTC在肿瘤早起筛查、动态监测以及免疫治疗选择等方面的研究取得了显著成果，CTC检测已成为最具发展潜力的非侵入性肿瘤诊疗手段之一。而其所属的液体活检领域被MIT technology review评为十大未来医疗技术之一。与常用的肿瘤诊断方法如影像学证据和组织活检相比，CTC检测具有早期、实时高效、非侵入性、取材方便和可重复监测等优势。与常规肿瘤标志物检测相比，CTC检测通常能更早反映疾病的变化，可更为灵敏地监测肿瘤动态变化，以便在治疗过程中评价治疗疗效、复发转移监测以及靶向药物伴随诊断，在临床治疗方案制定中具有重要指导意义。目前CTC已正式被列入肿瘤分期***中，并已成为继ER/PR、Her-2、Ki-67和肿瘤组织学分级四项生物学指标之后的又一项乳腺癌愈后评估工具。2019年，CTC首次被写入中国乳腺癌诊疗指南，并明确指出CTC能够反映肿瘤组织的情况，可用无创方式替代组织样本进行病理诊断、疾病监测、分子测序等，不仅可以动态监测，还可以用于判断愈后。
但是由于CTC的特殊性质，CTC检测在临床应用中还存在着许多问题和挑战。目前，CTC检测手段主要依据CTC的物理性质和生物学特性进行。包括细胞过滤法、密度梯度离心法、介电泳分离法等，主要基于细胞大小、密度、变形性、电荷特征等生物物理特性进行CTC检测。然而由于CTC具有稀有性和异质性的特点，细胞大小并不均一，且细胞本身具有一定的柔性，导致上述方法在进行CTC分离时缺乏特异性，造成纯度低、效率低等问题。
目前应用最广泛的是以免疫亲和为基础的CTC检测技术，采用与适当基质(如磁珠)结合的抗体、核酸适配体或多肽与CTC表面靶原结合，通过磁力或其它作用力进行阳性或阴性选择实现CTC的富集。阴性选择法是利用白细胞表面特异性抗原(主要为CD45)去除血液中白细胞进而富集CTC，具有抗体成熟、容易获得、捕获白细胞的效率高的特点，但该方法存在一定局限性，需要裂解红细胞，抗体易于状态较差的CTC进行非特异性结合，造成CTC检测纯度低，易导致假阳性结果。阳性选择法即免疫富集法，是直接通过CTC表面某些特殊的生物标志物，如上皮细胞黏附分子(EpCAM)富集相应的抗体捕获CTC。该方法对CTC的状态并不敏感，检测纯度高，同时具有操作较简单、能够实现自动化、较耐用的特点。目前，被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的CellSearch检测***及我国CFDA批准的CellCollector检测***均属于免疫富集法。需要注意的是，CTC具有高度的异质性，且不同类型的肿瘤CTC表面的标志物也存在一定的差异。传统用于捕获CTC的检测***，并未充分考虑到CTC的异质性及肿瘤的特异性，采用相对单一的标志物或标志物组合富集筛选CTC。例如目前，免疫富集法使用的CTC表面的标志物主要是黏附分子EpCAM和细胞角蛋白等。这种固定的抗体组合显然不能适用于所有类型的肿瘤，特别是无法捕获缺少上述表面标志物的CTC，造成漏检。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种用于检测乳腺癌患者CTC的细胞表面标志物及应用。
本发明采用的技术方案是：
用于检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞的细胞表面标志物，包括TSPAN1、FAIM2、KCNJ4、GABRD、PDK1L2、OR1OK1、UPK1B和OR51M1。
用于检测乳腺癌患者CTC的细胞表面标志物的应用，采用细胞表面标志物对应的抗体进行免疫捕获乳腺癌CTC。
进一步的，HER2抗体、EpCam抗体、FAIM2抗体和GABRD抗体联合使用，或HER2抗体、EpCam抗体、KCNJ4抗体和GABRD抗体联合使用。
进一步的，细胞表面标志物对应的抗体在制备检测和/或治疗乳腺癌的试剂和/或药物中的应用。
进一步的，所述免疫捕获乳腺癌CTC细胞的过程如下：
步骤1：将细胞表面标志物抗体包被微流控芯片；
步骤2：将培养好的乳腺癌细胞混悬液或乳腺癌患者血液样本以一定的速度流经芯片；
步骤3：用收集液收集芯片捕获的细胞并进行计数；计数代表抗体对乳腺癌细胞的捕获能力。
用于检测乳腺癌患者CTC的细胞表面标志物的筛选方法，包括以下步骤：
根据公共数据库中乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC样本RNA-seq和scRNA-seq测序数据，解析乳腺癌患者CTC特异性表达谱信息及异质性特征，得到CTC高表达基因；
根据血液样本中其他细胞类型基因表达丰度信息进行过滤，结合表面蛋白表达特征信息，得到CTC特异表面标志物；
将得到的CTC特异表面标志物与公共数据库中乳腺癌患者肿瘤组织样本表达谱进行对比，确定CTC的细胞表面标志物。
本发明的有益效果是：
(1)本发明中的标志物为具有富集能力的新型乳腺癌CTC表面标志物；
(2)本发明利用筛选得到的乳腺癌CTC表面标志物，得到了用于免疫富集筛选的最佳抗体组合，提高了乳腺癌CTC的富集捕获效率，有效提高了CTC捕获特异性及敏感性，具有高效捕获乳腺癌CTC的效果；
(3)本发明克服了现有乳腺癌CTC富集标志物种类不足、检出率低、纯度低的问题，实现了高效捕获乳腺癌CTC，促进了CTC检测在乳腺癌辅助诊断、监测肿瘤动态、临床治疗和愈后评价中的应用；为实现实时精准化个体治疗提供更加精准的信息及有力支持，具有广阔的应用前景和市场价值。
附图说明
图1为乳腺癌CTC表面标志物筛选示意图，a为CTC RNA-seq样本中乳腺癌CTC特异表达标志物表达丰度分布；b为乳腺癌CTC RNA-seq及scRNA-seq数据集中共有CTC特异表达标志物在CTC RNA-seq样本中的表达水平；c为乳腺癌CTC RNA-seq及scRNA-seq数据集中共有CTC特异表达标志物在CTC scRNA-seq样本中的表达水平；d为乳腺癌CTC特异表达标志物蛋白水平表达特异性。
图2为本发明筛选得到的标志物的蛋白序列分析示意图。
图3为本发明中采用微流控芯片捕获血液样本CTC的示意图。
图4为本发明中筛选得到的标志物抗体富集筛选乳腺癌细胞SKBR3和MCF-7的效率图。
图5为本发明中筛选得到的标志物抗体和EpCAM组合富集筛选乳腺癌细胞SKBR3和MCF-7的效率图。
图6为本发明中筛选得到的标志物抗体和HER2组合富集筛选乳腺癌细胞SKBR3和MCF-7的效率图。
图7为本发明中筛选得到的标志物抗体和EpCAM+HER2组合富集筛选乳腺癌细胞SKBR3和MCF-7的效率图。
图8为本发明筛选出的四种抗体(FAIM2、KCNJ4、GABRD、UPK1B)两两组合和EpCAM+HER2组合富集筛选乳腺癌细胞SKBR3和MCF-7的效率图。
图9为本发明筛选出的组合抗体对四种乳腺癌细胞富集筛选效率图。(HER2+EpCAM、EpCAM+HER2+FAIM2+GABRD、HER2+EpCAM+KCNJ4+GABRD)
图10为本发明筛选出的组合抗体对四种乳腺癌细胞富集筛选效率图。(HER2+EpCAM、EpCAM+HER2+FAIM2+GABRD)
图11为本发明筛选出的组合抗体(EpCAM+HER2+FAIM2+GABRD)对乳腺癌患者血液中CTC的捕获能力示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种用于检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞的细胞表面标志物，包括TSPAN1、FAIM2、KCNJ4、GABRD、PDK1L2、OR1OK1、UPK1B和OR51M1中的一种或两种及以上以任意比例混合构成。
筛选方法，包括以下步骤：
根据公共数据库中乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC样本RNA-seq和scRNA-seq测序数据，解析乳腺癌患者CTC特异性表达谱信息及异质性特征，得到CTC高表达基因；
根据血液样本中其他细胞类型基因表达丰度信息进行过滤，结合表面蛋白表达特征信息，得到CTC特异表面标志物；
将得到的CTC特异表面标志物与公共数据库中乳腺癌患者肿瘤组织样本表达谱进行对比，确定CTC的细胞表面标志物，如图1所示。
经过上述筛选初步选定候选CTC特有表面标志物，进一步的对上述得到的基因进行蛋白序列分析，如图2所示。从这些标志物中筛选具有跨膜区段和胞外区段且表达量相对较高的标志物进行测试。图2中为选择的基因包括：TSPAN1、FAIM2、KCNJ4、GABRD、PDK1L2、OR1OK1、UPK1B和OR51M1。
采用如图2所示筛选得到的表面标志物对应的抗体进行相关肿瘤细胞富集筛选实验，包括乳腺癌细胞系和乳腺癌肿瘤患者的血液样本。通过实验验证这些表面标志物对乳腺癌肿瘤细胞和血液中CTC的富集筛选能力。
免疫捕获乳腺癌CTC细胞的过程如下：如图3所示：
步骤1：将细胞表面标志物抗体包被微流控芯片；
步骤2：将培养好的乳腺癌细胞混悬液或乳腺癌患者血液样本以一定的速度流经芯片；其中细胞混悬液为细胞加入7.5mL健康人全血中，混匀后用淋巴细胞分离液处理，收集的细胞沉淀再加入7.5mL保护液形成细胞混悬液。
步骤3：用收集液收集芯片捕获的细胞并进行计数；计数代表抗体对乳腺癌细胞的捕获能力。
实施例1
制备或购买TSPAN1、FAIM2、KCNJ4、GABRD、PDK1L2、OR1OK1、UPK1B和OR51M1抗体，用这些抗体分别包被芯片，测试每种抗体对乳腺癌细胞富集筛选能力(方法如图3所示，不包括血液样本)。本实施例中选择乳腺癌经典细胞SKBR3和MCF-7作为实验细胞。包被好芯片后，将培养好的SKBR3和MCF-7细胞计数，每组1000个细胞，以一定的速度流经芯片，用收集液收集芯片捕获的细胞并进行计数。计数不同抗体对SKBR3和MCF-7乳腺癌细胞的捕获能力。结果如图4，y轴表示捕获效率，即单一抗体富集捕获细胞数百分比。x轴表示新开发的乳腺癌CTC特异表达表面标志物抗体。
从图中可以看出，筛选得出的标志物对SKBR3细胞均具有一定的富集捕获能力，富集捕获效率由高到低依次为TSPAN1、FAIM2、KCNJ4、GABRD、PDK1L2、OR10K1、UPK1B和OR51M1。
实施例2
用筛选得到的表面标志物抗体与EpCam组合，测试叠加抗体富集捕获乳腺癌肿瘤细胞能力(方法如图3所示，不包括血液样本)。结果如图5所示，y轴表示捕获效率，即抗体富集捕获细胞数百分比。x轴表示EpCam及与其他新开发的表面标志物抗体的组合。EpCam和相应抗体的质量比均为1:1。
选择乳腺癌经典细胞SKBR3和MCF-7作为实验细胞。包被好芯片后，将培养好的SKBR3和MCF-7细胞计数，每组1000个细胞，以一定的速度流经芯片，用收集液收集芯片捕获的细胞并进行计数。计数不同抗体对SKBR3和MCF-7乳腺癌细胞的捕获能力。从图中看出，组合抗体对乳腺癌细胞SKBR3和MCF-7均具有较好的捕获能力，捕获能力均大于单一EpCam抗体。
实施例3
用筛选得到的表面标志物抗体与HER2组合，测试叠加抗体富集捕获乳腺癌肿瘤细胞能力(方法如图3所示，不包括血液样本)。结果如图6所示，y轴表示捕获效率，即抗体富集捕获细胞数百分比。x轴表示HER2及与其他新开发的表面标志物抗体的组合。HER2和相应抗体的质量比均为1:1。
选择乳腺癌经典细胞SKBR3和MCF-7作为实验细胞。包被好芯片后，将培养好的SKBR3和MCF-7细胞计数，每组1000个细胞，以一定的速度流经芯片，用收集液收集芯片捕获的细胞并进行计数。计数不同抗体对SKBR3和MCF-7乳腺癌细胞的捕获能力。从图中看出，组合抗体对SKBR3均具有较好的捕获能力。组合抗体对MCF-7的捕获能力均大于单一的HER2抗体。
实施例4
用筛选得到的表面标志物抗体与EpCam和HER2组合，测试叠加抗体富集捕获乳腺癌肿瘤细胞能力(方法如图3所示，不包括血液样本)。结果如图7所示，y轴表示捕获效率，即抗体富集捕获细胞数百分比。x轴表示EpCam和HER2及与其他表面标志物抗体组合。相应抗体的质量比均为1:1:1。
选择乳腺癌经典细胞SKBR3和MCF-7作为实验细胞。包被好芯片后，将培养好的SKBR3和MCF-7细胞计数，每组1000个细胞，以一定的速度流经芯片，用收集液收集芯片捕获的细胞并进行计数。计数不同抗体对SKBR3和MCF-7乳腺癌细胞的捕获能力。
通过细胞系实验，选出效率较高的从图中看出，组合抗体对SKBR3均具有较好的捕获能力。组合抗体对MCF-7的捕获能力均大于EpCam和HER2组合。
实施例5
用筛选得到的表面标志物抗体(FAIM2，KCNJ4，GABRD，UPK1B)两两组合与EpCam和HER2组合，测试叠加抗体富集捕获乳腺癌肿瘤细胞能力(方法如图3所示，不包括血液样本)。结果如图8所示，y轴表示捕获效率，即抗体富集捕获细胞数百分比。x轴表示EpCam和HER2及与其他表面标志物抗体(FAIM2，KCNJ4，GABRD，UPK1B)两两组合。相应抗体的质量比均为1:1:1:1。
选择乳腺癌经典细胞SKBR3和MCF-7作为实验细胞。包被好芯片后，将培养好的SKBR3和MCF-7细胞计数，每组1000个细胞，以一定的速度流经芯片，用收集液收集芯片捕获的细胞并进行计数。计数不同抗体对SKBR3和MCF-7乳腺癌细胞的捕获能力。
通过细胞系实验，我们选出效率较高的捕获抗体为：FAIM2，KCNJ4，GABRD，UPK1B，将这四种抗体两两组合后与EpCam和HER2组合。从图中可以看出，其捕获效率显著高于现有的EpCam和HER2单独或联合的捕获方案。经过进一步优化发现，效率高的两个组合方案为HER2、EpCam、FAIM2和GABRD以及HER2、EpCam、KCNJ4和GABRD。捕获效率分别可达95％和93％。
实施例6
用HER2、EpCam、FAIM2和GABRD以及HER2、EpCam、KCNJ4和GABRD组合抗体包被芯片，培养四种乳腺癌细胞SKBR3，BT474，MCF-7和MDA-MB-231，每种细胞计数1000个，分别将这1000个四种乳腺癌细胞以一定的流速流经芯片，并用收集液收集芯片捕获的细胞，计数并计算组合抗体对四种乳腺癌细胞的捕获能力。如图9所示，y轴表示捕获效率，即抗体富集捕获细胞数百分比。x轴表示乳腺癌细胞系，抗体组合分别为：HER2+EpCam抗体组合，抗体质量比为1:1。HER2+EpCam+FAIM2+GABRD以及HER2+EpCam+KCNJ4+GABRD，抗体的质量比均为1:1:1:1。
从图中可以看出，组合抗体对四种乳腺癌细胞的捕获效率显著高于HER2+EpCam抗体组合。而且HER2+EpCam+FAIM2+GABRD组合抗体对乳腺癌细胞富集捕获能力优于HER2+EpCam+KCNJ4+GABRD组合抗体。
实施例7
选择HER2+EpCam+FAIM2+GABRD组合抗体包被芯片。将培养的四种乳腺癌细胞SKBR3，BT474，MCF-7和MDA-MB-231，每种细胞计数1000个，分别将这1000个四种乳腺癌细胞加入7.5ml健康人全血中，混匀后用淋巴细胞分离液处理，收集的细胞沉淀再加入7.5ml保护液形成细胞混悬液，细胞混悬液以一定的流速流经芯片，用收集液收集芯片捕获的细胞，并用荧光Marker对收集的细胞进行荧光染色。扫描计数后计算芯片对全血中四种乳腺癌细胞的捕获能力。结果如图10所示，y轴表示捕获效率，即抗体富集捕获细胞数百分比。x轴表示乳腺癌细胞系，抗体组合为：HER2+EpCam抗体组合，抗体质量比为1:1。HER2+EpCam+FAIM2+GABRD，抗体的质量比为1:1:1:1。
从图中可以看出，组合抗体对四种乳腺癌细胞的捕获效率显著高于HER2+EpCam抗体组合。
实施例8
选择HER2+EpCam+FAIM2+GABRD组合抗体包被芯片。抽取7.5ml乳腺癌患者全血，并用红细胞裂解液进行处理，收集的细胞沉淀再加入7.5ml保护液形成细胞混悬液，细胞混悬液以一定的流速流经芯片，用收集液收集芯片捕获的细胞，并用荧光Marker对收集的细胞进行荧光染色。用荧光扫描计数仪对样本进行扫描计数分析，记录组合抗体包被芯片对乳腺癌患者血液中CTC的捕获数量。结果如图11所示，y轴表示捕获效率，即抗体富集捕获细胞数百分比。x轴表示乳腺癌细胞系，抗体组合为：HER2+EpCam抗体组合，抗体质量比为1:1。HER2+EpCam+FAIM2+GABRD，抗体的质量比为1:1:1:1。
从图中可以看出，组合抗体对四种乳腺癌细胞的捕获能力显著高于HER2+EpCam抗体组合。
本发明利用乳腺癌患者CTC单细胞测序数据准确刻画乳腺癌CTC细胞基因表达特征，通过与正常人血液单细胞基因表达丰度进行比较，筛选乳腺癌CTC特异表达基因，并整合CTC RNA-seq数据及蛋白表达谱，进一步筛选出一系列乳腺癌血液中CTC潜在的表面标志物(FAIM2、KCNJ4、GABRD和UPK1B)。利用包被有表面标志物抗体的微流控芯片，检测乳腺癌CTC特异表面标志物的真实性和有效性。在此基础上，进一步优化、筛选出捕获CTC效率较高的抗体组合HER2、EpCam、FAIM2和GABRD以及HER2、EpCam、KCNJ4和GABRD组合。并在乳腺癌细胞系和乳腺癌肿瘤患者血液样本中进行CTC捕获测试实验，结果表明优化后的抗体组合在捕获效率方面显著优于目前主流的抗体捕获方案。
本发明提供的乳腺癌CTC特异抗体及组合，解决了乳腺癌患者血液CTC检出率低、纯度低的问题。利用本发明所鉴定的新型抗体组合能够显著提高乳腺癌患者CTC的富集捕获效率，有助力于乳腺癌肿瘤患者的肿瘤动态实时监测及治疗效果评估。有效推动实时精准化个体治疗的实现，具有广阔的应用前景，能够创造经济效益的同时提高社会效益。
Claims (3)
1.一种细胞表面标志物对应的抗体在制备检测乳腺癌的试剂中的应用，其特征在于，采用细胞表面标志物对应的抗体进行免疫捕获乳腺癌循环肿瘤细胞CTC；细胞表面标记物包括TSPAN1、FAIM2、KCNJ4、GABRD、PKD1L2、OR10K1、UPK1B和OR51M1；HER2抗体、EpCam抗体、FAIM2抗体和GABRD抗体联合使用，或HER2抗体、EpCam抗体、KCNJ4抗体和GABRD抗体联合使用。
2.根据权利要求1所述一种细胞表面标志物对应的抗体在制备检测乳腺癌的试剂中的应用，其特征在于，所述免疫捕获乳腺癌循环肿瘤细胞CTC的过程如下：
步骤1：将细胞表面标志物抗体包被微流控芯片；
步骤2：将培养好的乳腺癌细胞混悬液或乳腺癌患者血液样本以一定的速度流经芯片；
步骤3：用收集液收集芯片捕获的细胞并进行计数；计数代表抗体对乳腺癌细胞的捕获能力。
3.根据权利要求1所述的一种细胞表面标志物对应的抗体在制备检测乳腺癌的试剂中的应用，其特征在于，细胞表面标志物的筛选方法包括以下步骤：根据公共数据库中乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC样本RNA-seq 和scRNA-seq测序数据，解析乳腺癌患者CTC特异性表达谱信息及异质性特征，得到CTC高表达基因；根据血液样本中其他细胞类型基因表达丰度信息进行过滤，结合表面蛋白表达特征信息，得到CTC特异表面标志物；将得到的CTC特异表面标志物与公共数据库中乳腺癌患者肿瘤组织样本表达谱进行对比，确定CTC的细胞表面标志物。
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