CN113906048A - 通用供体干细胞和相关方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了通用供体干细胞及其使用和产生的相关方法。本文公开的通用供体干细胞可用于克服基于细胞的移植疗法中的免疫排斥。在某些实施方案中,本文公开的通用供体干细胞具有一种或多种MHC‑I和MHC‑II人白细胞抗原和一种或多种致耐受性因子的受调节表达。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是2019年10月8日提交的美国申请号16/596,697的延续,所述美国申请号16/596,697是2019年2月15日提交的美国申请号16/277,913的延续,所述美国申请号16/277,913要求2018年2月15日提交的美国临时申请号62/631,393的权益。上述申请的全部教义以引用方式并入本文。
发明背景
利用人多能干细胞衍生细胞进行移植的疗法有可能彻底改变疾病的治疗方式。对于它们临床转化的主要障碍是受体免疫***对同种异体细胞的排斥。旨在克服这种免疫屏障的策略包括将具有所定义的HLA单倍型的细胞建库(Nakajima等人,2007;Taylor等人,2005)和产生患者特异性诱导多能干细胞(iPSC)(Takahashi等人,2007;Yu等人,2007)。然而,多种限制(de Rham和Villard,2014;Tapia和Scholer,2016)阻碍了这些方法的广泛使用,并强调需要“现成”的细胞产品,所述细胞产品可容易施用于任何有需要的患者。
发明内容
本文公开了通过产生通用供体干细胞系来克服基于细胞的移植疗法中的免疫排斥的有效策略。
本文公开了干细胞,其包含相对于野生型干细胞,一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原和一种或多种致耐受性因子的受调节表达。
在一些实施方案中,一种或多种MHC-I人白细胞抗原选自HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些方面,一种或多种MHC-I人白细胞抗原的受调节表达包含一种或多种MHC-I人白细胞抗原的表达减少。在一些实施方案中,从细胞的基因组中缺失一种或多种MHC-I人白细胞抗原,从而调节一种或多种MHC-I人白细胞抗原的表达。
在一些实施方案中,一种或多种MHC-II人白细胞抗原选自HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。在一些方面,一种或多种MHC-II人白细胞抗原的受调节表达包含一种或多种MHC-II人白细胞抗原的表达减少。在一些实施方案中,将一种或多种***缺失引入到CIITA中,从而调节一种或多种MHC-II人白细胞抗原的表达。
在一些实施方案中,细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C。在某些方面,细胞是HLA-A-/-、HLA-B-/-、HLA-C-/-和CIITAindel/indel细胞。
在一些实施方案中,一种或多种致耐受性因子选自HLA-G、PD-L1和CD47。在某些方面,一种或多种致耐受性因子的受调节表达包含一种或多种致耐受性因子的表达增加。在一些实施方案中,将一种或多种致耐受性因子***到AAVS1安全港基因座中。在一些方面,将HLA-G、PD-L1和CD47***到AAVS1安全港基因座中。在一些实施方案中,一种或多种致耐受性因子抑制免疫排斥。
在一些实施方案中,细胞是胚胎干细胞。在一些方面,干细胞是多能干细胞。在一些实施方案中,干细胞是低免疫原性的。在一些方面,干细胞是人干细胞。
在一些实施方案中,干细胞保留多能性。在一些方面,干细胞保留分化潜能。在一些实施方案中,干细胞表现出T细胞反应减少。在一些方面,干细胞表现出免受NK细胞反应的保护。在一些实施方案中,干细胞表现出巨噬细胞吞噬减少。
本文还公开了不表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR的干细胞。
在一些实施方案中,干细胞是HLA-A-/-、HLA-B-/-、HLA-C-/-和CIITAindel/indel细胞。在一些方面,干细胞表达致耐受性因子HLA-G、PD-L1和CD47。在一些实施方案中,将致耐受性因子***到AAVS1安全港基因座中。在某些方面,致耐受性因子抑制免疫排斥。
在一些实施方案中,干细胞是胚胎干细胞。在一些方面,干细胞是多能干细胞。在一些实施方案中,干细胞是低免疫原性的。
本文公开了制备低免疫原性干细胞的方法,所述方法包括相对于野生型干细胞调节干细胞的一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原和一种或多种致耐受性因子的表达,从而制备低免疫原性干细胞。
在一些实施方案中,一种或多种MHC-I人白细胞抗原选自HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些方面,一种或多种MHC-I人白细胞抗原的受调节表达包含一种或多种MHC-I人白细胞抗原的表达减少。在一些实施方案中,从干细胞的基因组中缺失一种或多种MHC-I人白细胞抗原,从而调节一种或多种MHC-I人白细胞抗原的表达。
在一些实施方案中,一种或多种MHC-II人白细胞抗原选自HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。在一些方面,一种或多种MHC-II人白细胞抗原的受调节表达包含一种或多种MHC-II人白细胞抗原的表达减少。在一些实施方案中,将一种或多种***缺失引入到CIITA中,从而调节一种或多种MHC-II人白细胞抗原的表达。
在一些方面,低免疫原性干细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中,低免疫原性干细胞是HLA-A-/-、HLA-B-/-、HLA-C-/-和CIITAindel/indel细胞。
在一些实施方案中,一种或多种致耐受性因子选自HLA-G、PD-L1和CD47。在一些方面,一种或多种致耐受性因子的受调节表达包含一种或多种致耐受性因子的表达增加。在一些实施方案中,将一种或多种致耐受性因子***到AAVS1安全港基因座中。在一些方面,将HLA-G、PD-L1和CD47***到AAVS1安全港基因座中。在一些实施方案中,一种或多种致耐受性因子抑制免疫排斥。
在一些实施方案中,低免疫原性干细胞保留多能性。在一些方面,低免疫原性干细胞保留分化潜能。在一些实施方案中,低免疫原性干细胞表现出T细胞反应减少。在一些方面,低免疫原性干细胞表现出免受NK细胞反应的保护。在一些实施方案中,低免疫原性干细胞表现出巨噬细胞吞噬减少。
在一些实施方案中,将干细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:1-2的第一对核糖核酸接触,从而编辑HLA-A基因以减少或消除干细胞中的HLA-A表面表达和/或活性。在一些方面,将干细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:3-4的第一对核糖核酸接触,从而编辑HLA-B基因以减少或消除干细胞中的HLA-B表面表达和/或活性。在一些方面,将干细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有序列SEQ ID NO:5-6的第一对核糖核酸接触,从而编辑HLA-C基因以减少或消除干细胞中的HLA-C表面表达和/或活性。在一些方面,将干细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:7的核糖核酸接触,从而将***缺失引入到CIITA中以减少或消除干细胞中的MHC-II人白细胞抗原表面表达和/或活性。
本文还公开了制备低免疫原性干细胞的方法,所述方法包括相对于野生型干细胞调节干细胞的一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原和一种或多种致耐受性因子的表达,从而制备低免疫原性干细胞,其中将干细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:1-2的第一对核糖核酸接触,从而编辑HLA-A基因以减少或消除干细胞中的HLA-A表面表达和/或活性,其中将干细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:3-4的第二对核糖核酸接触,从而编辑HLA-B基因以减少或消除干细胞中的HLA-B表面表达和/或活性,其中将干细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:5-6的第三对核糖核酸接触,从而编辑HLA-C基因以减少或消除干细胞中的HLA-C表面表达和/或活性,并且其中将干细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:7的核糖核酸接触,从而将***缺失引入到CIITA中以减少或消除干细胞中的MHC-II人白细胞抗原表面表达和/或活性。
本文还公开了将至少一种低免疫原性干细胞移植到患者中的方法,其中所述低免疫原性干细胞包含相对于野生型干细胞,一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原和一种或多种致耐受性因子的受调节表达。
本文还公开了干细胞。干细胞可包含相对于野生型干细胞MHC-I和MHC-II人白细胞抗原的表达减少和相对于野生型干细胞致耐受性因子的表达增加,其中MHC-I人白细胞抗原是HLA-A、HLA-B和HLA-C,其中MHC-II人白细胞抗原是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR,并且其中致耐受性因子是CD47。
在一些实施方案中,MHC-I人白细胞抗原的表达减少包括从细胞的至少一个等位基因中缺失MHC-I人白细胞抗原。在一些实施方案中,MHC-II人白细胞抗原的表达减少包括将一个或多个***缺失引入到CIITA中。在一些实施方案中,干细胞还包含CIITA的表达减少。在一些实施方案中,将致耐受性因子***到细胞的至少一个等位基因的安全港基因座中。
在一些实施方案中,干细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中,干细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。在一些实施方案中,干细胞不表达CIITA。在一些实施方案中,致耐受性因子还包含HLA-G和/或PD-L1。
本文公开了不表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR并表达CD47的干细胞。在一些实施方案中,细胞是CIITAindel/indel、HLA-A-/-、HLA-B-/-和HLA-C-/-干细胞。
本文还公开了制备低免疫原性干细胞的方法。所述方法可包括降低干细胞的MHC-I和MHC-II人白细胞抗原的表达和增加干细胞致耐受性因子的表达,从而制备低免疫原性干细胞,其中MHC-I人白细胞抗原是HLA-A、HLA-B和HLA-C,其中MHC-II人白细胞抗原是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR,并且其中致耐受性因子是CD47。
在一些实施方案中,减少MHC-I人白细胞抗原的表达包括从干细胞的至少一个等位基因中缺失MHC-I人白细胞抗原。在一些实施方案中,减少MHC-II人白细胞抗原的表达包括将一个或多个***缺失引入到CIITA中。在一些实施方案中,所述方法还包括减少CIITA的表达。
在一些实施方案中,增加致耐受性因子的表达包括将致耐受性因子***到干细胞的至少一个等位基因的安全港基因座中。
在一些实施方案中,致耐受性因子还包含PD-L1和/或HLA-G。
在一些实施方案中,低免疫原性干细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中,低免疫原性干细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。在一些实施方案中,低免疫原性干细胞不表达CIITA。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
图1A-图1J展示了基因组编辑消除了多态性HLA-A/-B/-C和HLA II类表达,并使来自AAVS1安全港基因座的免疫调节因子能够表达。图1A提供了HLA-B和HLA-C CRISPR/Cas9敲除策略的示意图。每把剪刀代表两个sgRNA。紫色、红色和绿色箭头表示用于PCR筛选的引物。图1B提供了HLA-A敲除策略的示意图。每把剪刀代表一个sgRNA。黄色箭头示出了用于PCR筛选的引物。图1C提供了展示出HUES8中HLA-A/B/C的成功消除的FACS等高线图。在将野生型(WT)或HLA-A/B/C敲除(KO)细胞用指定的抗体染色之前,用IFNγ处理48小时。图1D示出了CIITA基因座的靶向策略。蓝色箭头表示用于PCR和Sanger测序的引物。图1E示出了分化的CD144+WT和KO EC中的HLA-DR平均荧光强度(MFI)。图1F提供了描述WT、KO、KI-PHC和KIPC细胞系的基因型的示意图。图1G示出了免疫调节分子的敲入策略。剪刀代表靶向AAVS1基因座的sgRNA。黑色和灰色箭头表示用于PCR筛选的引物。图1H示出了KI-PHC细胞中的PD-L1和HLA-G表达。图1I示出了KI-PHC细胞中的CD47表达。相对于WT细胞的MFI表示在直方图的右侧。图1J示出了KI-PC细胞中的PD-L1和CD47表达。
图2A-图2E展示了KO和KI细胞系保留多能性和分化潜能。图2A示出了免疫荧光,表明多能性标记物由WT、KO、KI-PHC和KI-PC人多能干细胞(hPSC)表达。比例尺,200μm。图2B示出了在将WT、KO、KI-PHC和KI-PC hPSC分化为指定的三个胚层之后,进行qRT-PCR以测量三系标记物。在未修饰的hPSC中将相对定量归一化为每个基因水平。图2C显示出KO、KI-PHC和KI-PC细胞系中染色体的G显带(G-banding)在连续几轮基因组工程之后展示出正常核型。图2D提供了表格,其显示出对工程化hPSC系中外显子脱靶位点的基于PCR的分析。图2E示出了靶标捕获测序结果,其显示了在WT和工程化hPSC系中%脱靶位点序列改变的读数。黑色圆圈,SNP/多态性(PM)位点;红色圆圈,编辑的脱靶点;蓝色圆圈,作为阳性对照的CIITA在靶位点。
图3A-图3D展示了在体外针对KO和KI-PHC细胞系的T细胞活性降低。图3A提供了散点图,其显示了当与WT、KO或KI EC共培养5天时,CD3+(左图,n=8个供体)、CD4+(中图,n=6个供体)和CD8+T细胞群(右图,n=6个供体)中增殖T细胞的百分比。单独培养的T细胞用作阴性对照;用CD3/CD28珠激活的T细胞充当阳性对照。进行配对单因素方差分析(Pairedone-way ANOVA),随后进行Tukey多重比较检验。数据为平均值±平均值标准误差(sem);*p<0.05;**p<0.01。图3B提供了散点图,其显示了在与WT、KO或KI EC共培养五天之后,CD3+(左图)、CD4+(中图)和CD8+T细胞群(右图)中CD69+(上图)和CD25+细胞(下图)的百分比(在所有图中n=11个供体)。如图3A中那样使用相同的阴性和阳性对照。进行配对单因素方差分析,随后进行Tukey多重比较检验。数据为平均值±平均值标准误差;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001。图3C提供了来自一个代表性供体的在WT、KO或KI EC与CD3+T细胞共培养后培养基中IFNγ(左图)和IL-10(右图)浓度的条形图。单独从T细胞自发性释放用作阴性对照。进行普通单因素方差分析,随后进行Tukey多重比较检验。数据为平均值±标准差;**p<0.01;***p<0.001。图3D提供了代表针对WT、KO和KI EC(n=6个供体)的T细胞细胞毒性百分比的条形图。进行LDH释放测定并计算来自每个供体的T细胞细胞毒性的百分比。进行配对单因素方差分析,随后进行Tukey多重比较检验。数据为平均值±平均值标准误差;*p<0.05;**p<0.01。
图4A-图4E展示了体内针对KO和KI细胞系的T细胞反应减少。图4A提供了示意图,其描述同种异体CD8+T细胞的预致敏和体内T细胞回忆反应测定的工作流程。图4B示出了与第0天相比T细胞注射后第5天或第7天畸胎瘤体积增加的百分比。畸胎瘤的基因型:WT(n=9)、KO(n=7)、KI-PHC(n=6)和KI-PC(n=7)。进行普通单因素方差分析,随后进行Tukey多重比较检验。数据为平均值±平均值标准误差;*p<0.05。图4C示出了与注射前2天相比T细胞注射第0天畸胎瘤体积增加的百分比。畸胎瘤的基因型:WT(n=9)、KO(n=7)、KI-PHC(n=6)和KI-PC(n=7)。图4D示出了在T细胞注射后第8天收获的WT(n=8)、KO(n=7)、KI-PHC(n=6)和KI-PC(n=7)畸胎瘤中的相对hCD8(左图)和IL-2(右图)mRNA表达。将表达归一化为RPLP0。进行普通单因素方差分析,随后进行Tukey多重比较检验。数据为平均值±平均值标准误差;*p<0.05;**p<0.01。图4E示出了在T细胞注射后第8天收获的WT、KO、KI-PHC和KI-PC畸胎瘤的代表性苏木精和伊红(H&E)染色。黑色箭头表示T细胞浸润的部位。比例尺,100μm。
图5A-图5D展示了KI细胞系被保护免受NK细胞和巨噬细胞反应的影响。图5A提供了针对WT、KO或KI-PHC VSMC(n=7个供体)的NK细胞脱颗粒作用的散点图。对于每个供体,将脱颗粒NK细胞的百分比绘制为%表达CD107a的CD56+细胞。将单独培养的NK细胞用作阴性对照;用PMA/离子霉素处理的NK细胞作为阳性对照。进行配对单因素方差分析,随后进行Tukey多重比较检验。数据为平均值±平均值标准误差;**p<0.01。图5B提供了条形图,其代表在指定的效应物/靶标(E/T)比率下来自一个代表性供体的针对WT、KO和KI-PHC VSMC的NK细胞毒性的百分比(n=3次重复)。进行LDH释放测定,并且将%NK细胞毒性计算为NK细胞杀伤的VSMC相对于最大细胞裂解的特异性裂解。进行未配对单因素方差分析,随后进行Tukey多重比较检验。数据为平均值±标准差;*p<0.05;***p<0.001。图5C提供了巨噬细胞吞噬作用测定的延时图(n=5个单核细胞供体)。用星形孢菌素(STS)预处理(右图)或未预处理(左图)的指定基因型的pHrodo-red标记VSMC与单核细胞衍生的巨噬细胞共孵育6小时。使用Celldiscover7活细胞成像***每20min获取一次图像。分析了每个图像的pHrodored+吞噬体的总积分荧光强度。数据为平均值±平均值标准误差。图5D提供了4小时共孵育时巨噬细胞吞噬作用测定的散点图(n=9个单核细胞供体,三个独立实验)。实验条件与图5C相同。进行配对单因素方差分析,随后进行Tukey多重比较检验。数据为平均值±平均值标准误差;*p<0.05;**p<0.01。VSMC=血管平滑肌细胞;NK=自然杀伤细胞。
图6A-图6H展示了基因组编辑消除了多态性HLA-A/-B/-C和HLA II类表达,并使来自AAVS1安全港基因座的免疫调节因子能够表达。图6A示出了使用图1A中所示的引物对HLA-B/-C敲除的PCR确认。图6B示出了使用图1B中所示的引物对HLA-A敲除的PCR确认。图6C示出了使用位于CIITA切割位点侧翼的引物的PCR产物。图6D示出了Sanger测序,其显示在KO细胞系中,将1bp(以红色示出)***到一个CIITA等位基因上,而将12bp(示出为虚线)从另一个等位基因中缺失。图6E示出了分化的WT和KO内皮细胞(EC)中的CD144表达。图6F示出了产生KO和KI ES细胞系的工作流程。图6G示出了使用图1G中所示的引物敲入KI-PHC/KI-PC构建体的PCR确认。
图7A-图7H展示了基因组编辑消除了多态性HLA-A/-B/-C和HLA II类表达,并使来自AAVS1安全港基因座的免疫调节因子能够表达。图7A示出了WT和KI-PC ES细胞中的CD47表达。直方图右侧给出了相对于WT细胞的MFI。图7B示出了IFNγ处理后WT、KI-PHC和KI-PCES细胞中的HLA-A2表达,其确认了KI细胞系中经典HLA Ia类分子的消除。图7C示出了分化的WT、KI-PHC和KI-PC EC中的CD144表达。图7D示出了HLA-DR平均荧光强度(MFI),其确认了分化的KI-PHC和KI-PC EC中HLA II类的消除。在CD144+细胞上分析HLA-DR表达。图7E示出了分化的WT、KO、KI-PHC和KI-PC VSMC中的CD140b表达。图7F提供了显示出分化的WT和KI-PHC VSMC中PD-L1和HLA-G的表达的等高线图(左上图)。在分化的WT和KI-PHC VSMC中的CD47表达(右上图)。显示出分化的WT和KI-PC VSMC中PD-L1和CD47表达的等高线图(左下图)。在分化的WT和KI-PC VSMC中的CD47表达(右下图)。图7G示出了在IFN-γ刺激后分化的WT、B2M-/-、KO和KI-PHC VSMC中的HLA-E表达。灰色,同种型;彩色,抗体。图7H示出了在有或没有IFN-γ刺激的情况下分化的WT、B2M-/-、KO和KI-PHC VSMC中的相对HLA-E mRNA表达。
图8提供了在基因修饰的hPSC系和亲本WT细胞中预测外显子脱靶位点的测序色谱图。
图9示出了来自NGS的序列检查,其显示出在工程化hPSC系中脱靶位点的编辑,以及在工程化系和WT细胞中观察到的SNP/多态位点。
图10A-图10D展示了针对KO和KI-PHC细胞系的T细胞活性降低。图10A示出了在T细胞增殖和激活测定中使用的门控策略。图10B提供了使用WT、KO和KI-PHC EC作为靶细胞的一个代表性供体的T细胞增殖测定。CD3+(上图)、CD4+(中图)和CD8+(下图)。单独培养的T细胞用作阴性对照;用CD3/CD28珠处理的T细胞充当阳性对照。图10C示出了WT VSMC中多西环素诱导型PD-L1表达。图10D提供了在存在或不存在多西环素诱导的PD-L1表达的情况下与VSMC共培养7天的CD3+(左图)、CD4+(中图)和CD8+T细胞群(右图)中增殖T细胞百分比的散点图(n=4个供体)。将CFSE信号减少的T细胞定量为增殖细胞。单独培养的T细胞充当阴性对照;用CD3/CD28珠激活的T细胞用作阳性对照。进行配对二尾t检验;数据为平均值±平均值标准误差;*p<0.05;ns,无显著性。
图11A-图11E展示了KI细胞系被保护免受NK细胞和巨噬细胞反应的影响。图11A示出了在一个代表性CD8+T供体的启动(priming)前和启动后检查的CD69和PD-1表达。图11B提供了NK细胞脱颗粒测定的门控策略。图11C提供了对于一个代表性供体的NK细胞脱颗粒测定的FACS等高线图。图11D示出了CD47 MFI,其确认了分化的CD47-/-VSMC中CD47表达的消除。图11E提供了荧光图像,其显示出来自一个代表性供体的在与巨噬细胞共孵育4h之后用pHrodo-Red预标记的吞噬VSMC。VSMC用星形孢菌素预处理,或者不处理。图像代表明场和红色通道的叠加,并且在通过ZEN成像分析软件屏蔽之后将荧光吞噬体突出显示。比例尺,200μm。
图12A-图12C展示了对HLA屏障的克服。图12A提供了MHC II类和I类增强体(enhanceosome)的示意图。靶向CIITA(MHC II类表达的主调节因子)防止了MHC II类表达。MHC I类基因的启动子更为复杂,因此缺失NLRC5(调节MHC I类表达的CIITA同源物)只会导致MHC I类表达的减少。图12B示出了NLRC5-/-CIITA-/hPSC中IFNg诱导的MHC I类表达的减少。将WT,或指定的KO HUES9细胞用IFNg刺激48小时,并随后针对MHC I类表达进行染色,由FACS记录。辅助链B2M的缺失完全防止了MHC I类表面表达,但会使这些细胞容易受到NK细胞杀伤。图12C示出了从hPSC的基因组中选择性去除多态性HLA基因HLA-A/B/C的靶向策略。提供了靶向策略的示意图。还示出了HUES8的基因组中各个缺失的PCR确认。
图13A-图13E展示了致耐受性因子进入安全港基因座的敲入(KI)策略。图13A-图13B提供了KI构建体的示意图。图13C示出了在两个KI克隆(C8和C12)中HLA I类表达丧失的确认。图13D示出了来自AAVS1安全港基因座的HLA缺陷KI克隆C8和C12中PD-L1和CD47的成功过表达。图13E示出了最终目标是对人滋养细胞(PD-L1、HLA-G、CD47 high)的免疫调节活性进行逆向工程化,所述人滋养细胞在妊娠期间诱导对半同种异体胎儿(50%来源于父亲,因此是外源)的耐受性。
图14A-图14B展示了用于移植的功能性免疫沉默细胞。图14A示出了修饰的hPSC(HUES8)中HLA表达的确认。通过FACS在两个独立的HLA-A/B/C-/-CIITA-/-KO克隆——D1和F2中确认了MHC I类表达的丧失。观察到KO克隆衍生的内皮细胞(EC)的类似形态。指定基因型的EC中IFNγ诱导的MHC II类表达证明了HLA-A/B/C-/-CIITA-/-KO克隆中HLA II类的丧失。图14B示出了T细胞增殖测定(上图)和NK细胞脱颗粒测定(下图)。对于T细胞增殖测定(上图),使用CFSE标记T细胞克隆来评估针对来源于指定基因型的HUES9的EC的T细胞增殖。CFSE信号的丧失与T细胞增殖成正比,所述T细胞增殖是这些细胞免疫刺激活性的代理。虽然WT EC在7天内触发显著的T细胞增殖,但在两个独立的NLRC5-/-CIITA-/-KO克隆存在时,T细胞增殖减少,且当与B2M-/-CIITA-/-KO EC共孵育时T细胞增殖不存在。对于NK细胞脱颗粒测定(下图),当与WT细胞相比时,HLA缺陷VSMC(D1、F2)触发增强的NK细胞脱颗粒。对于NK脱颗粒,PMA/离子霉素或HLA缺陷221细胞用作阳性对照。NC=阴性对照,仅NK细胞。
图15A-图15B展示了临床前数据的产生。图15A示出了人源化小鼠中免疫沉默人多能干细胞的植入改善。用人免疫***(BLT)重建的NSG小鼠被移植了指定基因型的ES细胞,并允许形成畸胎瘤。移植后4-6周的畸胎瘤大小和一致性以盲法进行评分。虽然WT畸胎瘤显示出排斥的标志,但发现NLCR5-/-CIITA-/-和B2M-/-CIITA-/-干细胞的生长受到较少限制,表明它们受到免疫保护。图15B示出了诱导型Caspase9(iCasp9)杀伤开关的引入可以在用CID二聚化因子处理后消除细胞。iCasp9杀伤开关的漫画(左)。瞬时转染的293T细胞中CID二聚化因子的剂量滴定和时间进程(右)。最终,iCasp9杀伤开关将被整合到修饰的免疫沉默干细胞的安全港基因座中。
具体实施方式
本文公开的发明采用基因组编辑技术(例如,CRISPR/Cas或TALEN***)以减少或消除关键免疫基因的表达,或者在某些情况下,在干细胞中***耐受性诱导因子,使它们和由其制备的分化细胞具有低免疫原性且不易受到移植此类细胞的受试者的免疫排斥。
如本文为了表征细胞所用,术语“低免疫原性”通常表示此类细胞不易受到移植此类细胞的受试者的免疫排斥。例如,相对于未改变的野生型细胞,这样的低免疫原性细胞受到移植此类细胞的受试者免疫排斥的倾向可降低约2.5%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97.5%、99%或更多。在一些方面,基因组编辑技术(例如,CRISPR/Cas或TALEN***)用于调节(例如,减少或消除)MHC-I和MHC-II基因的表达。
在某些实施方案中,本文公开的发明涉及干细胞,已将其基因组改变以减少或缺失HLA表达的关键组分。类似地,在某些实施方案中,本文公开的发明涉及干细胞,已将其基因组改变以***一种或多种耐受性诱导因子。本发明设想以本领域技术人员可用的任何方式改变靶多核苷酸序列,例如利用TALEN、ZFN或CRISPR/Cas***。此类CRISPR/Cas***可采用多种Cas蛋白(Haft等人PLoS Comput Biol.2005;1(6)e60)。在一些实施方案中,CRISPR/Cas***是CRISPR I型***。在一些实施方案中,CRISPR/Cas***是CRISPR II型***。在一些实施方案中,CRISPR/Cas***是CRISPR V型***。应当理解,尽管本文详细描述了利用CRISPR/Cas(例如,Cas9和Cpf1)和TALEN的方法的实例,但本发明不限于使用这些方法/***。可在本文中利用本领域技术人员已知的靶向多核苷酸序列以减少或消除靶细胞中的表达的其他方法。
本发明设想出于任何目的改变,例如修饰或切割细胞中的靶多核苷酸序列,但尤其是使得编码产物的表达或活性得以降低或消除。在一些实施方案中,将细胞(例如,ES细胞或iPSC)中的靶多核苷酸序列改变以产生突变细胞。如本文所用,“突变细胞”通常是指具有与其原始基因型或野生型细胞不同的所得基因型的细胞。在一些情况下,例如当使用CRISPR/Cas***改变正常功能的干基因时,“突变细胞”表现出突变表型。在一些实施方案中,改变细胞中的靶多核苷酸序列以校正或修复基因突变(例如,恢复细胞的正常表型)。在一些实施方案中,改变细胞中的靶多核苷酸序列以诱导基因突变(例如,破坏基因或基因组元件的功能)。
在一些实施方案中,改变是***缺失。如本文所用,“***缺失”是指由***、缺失或它们的组合引起的突变。本领域技术人员将理解,基因组序列编码区中的***缺失将导致移码突变,除非***缺失的长度是三的倍数。在一些实施方案中,改变是点突变。如本文所用,“点突变”是指替换其中一个核苷酸的取代。CRISPR/Cas***可以用于在靶多核苷酸序列中诱导任何长度的***缺失或点突变。
在一些实施方案中,改变导致敲除靶多核苷酸序列或其部分。例如,出于治疗和研究目的,细胞中的靶多核苷酸序列可在体外、体内或离体进行敲除。敲除细胞中的靶多核苷酸序列可用于治疗或预防与靶多核苷酸序列的表达相关的病症(例如,通过离体敲除细胞中的突变等位基因并将包含被敲除的突变等位基因的那些细胞引入到受试者中)。
如本文所用,“敲除”包括以干扰靶多核苷酸序列或其表达产物的功能的方式缺失全部或部分靶多核苷酸序列。
在一些实施方案中,改变导致靶多核苷酸序列的表达减少。术语“减少的”、“降低的”、“降低”和“减少”在本文通常均用于表示减少了统计学上显著的量。然而,为免生疑问,“减少的”、“降低的”、“降低”、“减少”包括与参考水平相比减少了至少10%,例如与参考水平相比减少了至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%或多达并包括100%的减少(即与参考样品相比不存在的水平),或10%-100%之间的任何减少。
术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”在本文通常均用于表示增加了统计学上显著的量;为免生任何疑问,术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”表示与参考水平相比至少10%的增加,例如与参考水平相比至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%的增加,或多达并包括100%的增加,或10%-100%之间的任何增加,或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加,或在2倍与10倍或更大之间的任何增加。
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性,并且通常表示低于正常或更低的标记物浓度的两个标准差(2SD)。术语是指有差异存在的统计论据。它被定义为当零假设(null hypothesis)实际上为真时作出否决所述零假设的决定的概率。通常使用p值做出决定。
在一些实施方案中,改变是纯合改变。在一些实施方案中,改变是杂合改变。
在一些实施方案中,改变导致将靶多核苷酸序列从不期望的序列校正为期望的序列。CRISPR/Cas***可以用于校正靶多核苷酸序列中的任何类型的突变或错误。例如,CRISPR/Cas***可以用于***由于缺失而从靶多核苷酸序列中缺少的核苷酸序列。由于***突变,CRISPR/Cas***还可以用于从靶多核苷酸序列中缺失或切除核苷酸序列。在一些情况下,CRISPR/Cas***可以用于用正确的核苷酸序列替换不正确的核苷酸序列(例如,恢复由于功能丧失突变而受损的靶多核苷酸序列的功能)。
CRISPR/Cas***可以惊人的高效率改变靶多核苷酸。在某些实施方案中,改变的效率为至少约5%。在某些实施方案中,改变的效率为至少约10%。在某些实施方案中,改变的效率为约10%至约80%。在某些实施方案中,改变的效率为约30%至约80%。在某些实施方案中,改变的效率为约50%至约80%。在一些实施方案中,改变的效率大于或等于约80%。在一些实施方案中,改变的效率大于或等于约85%。在一些实施方案中,改变的效率大于或等于约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%。在一些实施方案中,改变的效率等于约100%。
在一些实施方案中,靶多核苷酸序列是基因组序列。在一些实施方案中,靶多核苷酸序列是人基因组序列。在一些实施方案中,靶多核苷酸序列是哺乳动物基因组序列。在一些实施方案中,靶多核苷酸序列是脊椎动物基因组序列。
在一些实施方案中,CRISPR/Cas***包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列以及能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的至少一至两种核糖核酸(例如,gRNA)。在一些实施方案中,CRISPR/Cas***包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列以及能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的单核糖核酸或至少一对核糖核酸(例如,gRNA)。如本文所用,“蛋白质”和“多肽”可互换使用,指通过肽键接合的一系列氨基酸残基(即,氨基酸的聚合物),并包括修饰的氨基酸(例如,磷酸化、糖化(glycated)、糖基化(glycosolated)等)和氨基酸类似物。示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、旁系同源物、片段以及前述的其他等效物、变体、片段和类似物。
在一些实施方案中,Cas蛋白包含一个或多个氨基酸取代或修饰。在一些实施方案中,一个或多个氨基酸取代包含保守氨基酸取代。在一些情况下,取代和/或修饰可防止或减少细胞中多肽的蛋白水解降解和/或延长多肽的半衰期。在一些实施方案中,Cas蛋白可包含肽键替换(例如,尿素、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲等)。在一些实施方案中,Cas蛋白可包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中,Cas蛋白可包含替代氨基酸(例如,D-氨基酸、β-氨基酸、高半胱氨酸、磷酸丝氨酸等)。在一些实施方案中,Cas蛋白可包含修饰以包括某部分(例如,聚乙二醇化、糖基化、脂化、乙酰化、封端等)。
在一些实施方案中,Cas蛋白包含核心Cas蛋白。示例性Cas核心蛋白包括但不限于Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas9。在一些实施方案中,Cas蛋白包含大肠杆菌亚型的Cas蛋白(也称为CASS2)。大肠杆菌亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cse1、Cse2、Cse3、Cse4和Cas5e。在一些实施方案中,Cas蛋白包含Ypest亚型的Cas蛋白(也称为CASS3)。Ypest亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csy1、Csy2、Csy3和Csy4。在一些实施方案中,Cas蛋白包含Nmeni亚型的Cas蛋白(也称为CASS4)。Nmeni亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csn1和Csn2。在一些实施方案中,Cas蛋白包含Dvulg亚型的Cas蛋白(也称为CASS1)。Dvulg亚型的示例性Cas蛋白包括Csd1、Csd2和Cas5d。在一些实施方案中,Cas蛋白包含Tneap亚型的Cas蛋白(也称为CASS7)。Tneap亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cst1、Cst2、Cas5t。在一些实施方案中,Cas蛋白包含Hmari亚型的Cas蛋白。Hmari亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csh1、Csh2和Cas5h。在一些实施方案中,Cas蛋白包含Apern亚型的Cas蛋白(也称为CASS5)。Apern亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5和Cas5a。在一些实施方案中,Cas蛋白包含Mtube亚型的Cas蛋白(也称为CASS6)。Mtube亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5。在一些实施方案中,Cas蛋白包含RAMP模块Cas蛋白。示例性RAMP模块Cas蛋白包括但不限于Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5和Cmr6。
在一些实施方案中,Cas蛋白是Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方案中,Cas蛋白是来自任何细菌物种的Cas9或其功能部分。Cas9蛋白是II型CRISPR***的成员,所述CRISPR***通常包括转码小RNA(tracrRNA)、内源性核糖核酸酶3(rnc)和Cas蛋白。Cas9蛋白(也称为CRISPR相关核酸内切酶Cas9/Csn1)是一种包含1368个氨基酸的多肽。Cas9含有2个核酸内切酶结构域,其包括切割与crRNA非互补的靶DNA的RuvC样结构域(残基7-22、759-766和982-989),以及切割与crRNA互补的靶DNA的HNH核酸酶结构域(残基810-872)。
在一些实施方案中,Cas蛋白是Cpf1蛋白或其功能部分。在一些实施方案中,Cas蛋白是来自任何细菌物种的Cpf1或其功能部分。Cpf1蛋白是V型CRISPR***的成员。Cpf1蛋白是包含约1300个氨基酸的多肽。Cpf1含有RuvC样核酸内切酶结构域。Cpf1使用单核糖核酸酶结构域以交错模式切割靶DNA。交错DNA双链断裂导致4或5-nt 5'突出端。
如本文所用,“功能部分”是指肽的保留其与至少一种核糖核酸(例如,向导RNA(gRNA))复合并切割靶多核苷酸序列的能力的一部分。在一些实施方案中,功能部分包含选自DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域的有效连接的Cas9蛋白功能结构域的组合。在一些实施方案中,功能部分包含选自DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域的有效连接的Cpf1蛋白功能结构域的组合。在一些实施方案中,所述功能结构域形成复合物。
应当理解,本发明设想了将靶多核苷酸序列与Cas蛋白(例如,Cas9)接触的各种方式。在一些实施方案中,可将外源性Cas蛋白以多肽形式引入到细胞中。在某些实施方案中,可将Cas蛋白与细胞穿透多肽或细胞穿透肽缀合或融合。如本文所用,“细胞穿透多肽”和“细胞穿透肽”分别是指促进分子吸收到细胞中的多肽或肽。细胞穿透多肽可含有可检测标记。
在某些实施方案中,Cas蛋白可与带电荷蛋白(例如,带有正、负或总体中性电荷)缀合或融合。这种键联可以是共价的。在一些实施方案中,Cas蛋白可与带超正电荷的GFP融合以显著增加Cas蛋白穿透细胞的能力(Cronican等人ACS Chem Biol.2010;5(8):747-52)。在某些实施方案中,Cas蛋白可与蛋白转导结构域(PTD)融合以促进其进入细胞。示例性PTD包括Tat、寡精氨酸和穿透素。在一些实施方案中,Cas蛋白包含与细胞穿透肽融合的Cas多肽。在一些实施方案中,Cas蛋白包含与PTD融合的Cas多肽。
在一些实施方案中,可将Cas蛋白以编码Cas蛋白(例如,Cas9或Cpf1)的核酸形式引入到含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入到细胞中的过程可通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体的转导或感染。在一些实施方案中,核酸包含DNA。在一些实施方案中,核酸包含如本文所述的修饰的DNA。在一些实施方案中,核酸包含mRNA。在一些实施方案中,核酸包含如本文所述的修饰的mRNA(例如,合成的、修饰的mRNA)。
在一些实施方案中,通过病毒转导(例如,慢病毒转导)将编码Cas蛋白的核酸和编码至少一至两种核糖核酸的核酸引入到细胞中。
在一些实施方案中,Cas蛋白与一至两种核糖核酸复合。在一些实施方案中,Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中,Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中,Cas蛋白由如本文所述的修饰的核酸(例如,合成的、修饰的mRNA)编码。
本发明的方法设想使用能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的任何核糖核酸。在一些实施方案中,核糖核酸中的至少一种包含tracrRNA。在一些实施方案中,核糖核酸中的至少一种包含CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方案中,单核糖核酸包含将Cas蛋白引导至细胞中靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的向导RNA。在一些实施方案中,核糖核酸中的至少一种包含将Cas蛋白引导至细胞中靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的向导RNA。在一些实施方案中,一至两种核糖核酸均包含将Cas蛋白引导至细胞中靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的向导RNA。如本领域技术人员将理解,可选择本发明的核糖核酸以与多种不同的靶基序杂交,这取决于所采用的特定CRISPR/Cas***和靶多核苷酸的序列。还可选择一至两种核糖核酸以最小化与靶多核苷酸序列以外的核酸序列的杂交。在一些实施方案中,一至两种核糖核酸与当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时含有至少两个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中,一至两种核糖核酸与当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时含有至少一个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中,将一至两种核糖核酸设计为与紧邻由Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。在一些实施方案中,将一至两种核糖核酸中的每种设计为与紧邻由Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交,所述脱氧核糖核酸基序位于处于靶基序之间的突变等位基因的侧翼。
在一些实施方案中,一至两种核糖核酸中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-7的核糖核酸序列的序列。在一些实施方案中,至少一种核糖核酸包含选自SEQ ID NO:1-7的核糖核酸序列的序列。
在一些实施方案中,一至两种核糖核酸中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:1-7的核糖核酸序列的序列有单核苷酸错配的序列。在一些实施方案中,至少一种核糖核酸包含与选自SEQ ID NO:1-7的核糖核酸序列的序列有单核苷酸错配的序列。
在一些实施方案中,一至两种核糖核酸中的每种包含将Cas蛋白引导至细胞中靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的向导RNA。在一些实施方案中,一种或两种核糖核酸(例如,向导RNA)与靶多核苷酸序列的同一链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中,一种或两种核糖核酸(例如,向导RNA)与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中,一种或两种核糖核酸(例如,向导RNA)不与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中,一种或两种核糖核酸(例如,向导RNA)与靶多核苷酸序列的重叠靶基序互补和/或杂交。在一些实施方案中,一种或两种核糖核酸(例如,向导RNA)与靶多核苷酸序列的偏移靶基序互补和/或杂交。
在一些实施方案中,靶基序是17至23个核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中,靶基序的长度是至少20个核苷酸。在一些实施方案中,靶基序是20个核苷酸的DNA序列。
在一些实施方案中,一至两种核糖核酸与当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时含有至少两个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中,一至两种核糖核酸与当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时含有至少一个错配的靶基序杂交。本领域技术人员将理解,可使用多种技术来选择合适的靶基序用于最小化脱靶效应(例如,生物信息学分析)。在一些实施方案中,将一至两种核糖核酸设计为与紧邻由Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。在一些实施方案中,将一至两种核糖核酸中的每种设计为与紧邻由Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交,所述脱氧核糖核酸基序位于处于靶基序之间的突变等位基因的侧翼。
在一些方面,使用基因编辑***(例如,TALEN、ZFN、CRISPR/Cas等)改变细胞中的靶多核苷酸序列以减少或消除细胞中一种或多种关键免疫基因的表达和/或活性。在一些实施方案中,本公开提供了改变细胞中的靶多核苷酸序列以从细胞的一个或两个等位基因中缺失基因组DNA的连续段(例如,缺失一种或多种关键免疫基因)(例如,使用CRISPR/Cas***)。在一些实施方案中,改变细胞中的靶多核苷酸序列以在细胞的一个或两个等位基因中***基因突变(例如,使用CRISPR/Cas***)。在其他实施方案中,本文公开的通用干细胞可经历互补基因组编辑方法(例如,使用CRISPR/Cas***),由此对此类干细胞进行修饰以从细胞的一个或两个等位基因中缺失基因组DNA的连续段(例如,关键免疫基因),并将一种或多种耐受性诱导因子(诸如HLA-G、CD47和/或PD-L1)***到细胞的一个或两个等位基因中从而局部抑制免疫***和改善移植物植入。
本文公开的通用干细胞可以用于例如诊断、监测、治疗和/或治愈受试者的疾病或疾患(例如,1型糖尿病或多发性硬化症)的存在或进展。如本文所用,“受试者”表示人或动物。在某些实施方案中,受试者是人。在某些实施方案中,受试者是青少年。在某些实施方案中,在体内、体外和/或子宫内治疗受试者。在某些方面,需要根据本文公开的方法进行治疗的受试者患有疾患或被怀疑患有这种疾患或发展这种疾患的风险增加。在一些方面,将通用干细胞移植到受试者中。
本文提供了可用于解决移植细胞的此类基于HLA的免疫排斥的新细胞、组合物和方法。
MHC I类和MHC II类基因的消除
在某些方面,本文公开的发明涉及干细胞基因组的一种或多种靶多核苷酸序列的基因组修饰,所述基因组修饰调节MHC-I和/或MHC-II人白细胞抗原的表达。在一些方面,基因编辑***用于修饰一个或多个靶多核苷酸序列。在一些方面,CRISPR/Cas***用于缺失一个或多个靶多核苷酸序列和/或将***缺失引入到一个或多个靶向多核苷酸序列中。
可通过直接靶向多态性HLA等位基因(HLA-A、-B、-C)和/或缺失对于HLA表达至关重要的MHC增强体组分(诸如CIITA)来实现HLA屏障的有效去除。
在某些实施方案中,对HLA表达进行干扰。在一些方面,通过靶向单独HLA(例如,敲除HLA-A、HLA-B和/或HLA-C的表达)和/或靶向HLA表达的转录调节因子(例如,CIITA)来干扰HLA表达。在一些方面,可同时靶向多个HLA。例如,HLA-B和HLA-C相邻,可同时被靶向。在一些方面,使用CRISPR/Cas缺失95kb的干细胞基因组可敲除HLA-B和HLA-C,以及这两个基因的启动子。在一些方面,使用CRISPR/Cas缺失13kb的干细胞基因组敲除了HLA-A,以及该基因的启动子。
在某些方面,本文公开的干细胞不表达对应于MHC-I和/或MHC-II的一种或多种人白细胞抗原(例如,HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR),并因此被表征为低免疫原性。例如,在某些方面,已修饰本文公开的干细胞,使得干细胞或由其制备的分化干细胞不表达或表现出以下MHC-I分子中的一种或多种的表达减少:HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些方面,可将HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种从细胞中“敲除”。具有敲除HLA-A基因、HLA-B基因和/或HLA-C基因的细胞可表现出每个敲除基因的表达减少或消除。在一些方面,已修饰本文公开的干细胞,使得干细胞或由其制备的分化干细胞不表达或表现出以下MHC-II分子中的一种或多种的表达减少:HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。在一些方面,将一个或多个***缺失***到HLA II类表达的转录调节因子(例如,CIITA)中。具有***到CIITA(例如,靶向外显子1)中的***缺失的细胞可表现出HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR的表达减少或消除。
在一些方面,本公开提供了干细胞(例如,低免疫原性干细胞)或其群体,在其包含的基因组中HLA-A基因已进行编辑以缺失基因组DNA的连续段,从而减少或消除细胞或其群体中MHC I类分子的表面表达。可通过使细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸以及至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸接触来缺失基因组DNA的连续段,所述至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自SEQ ID NO:1-2。
在某些方面,本公开提供了一种用于改变细胞中靶HLA-A序列的方法,其包括使HLA-A序列与成簇规律间隔短回文重复相关(Cas)蛋白和至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸接触,其中核糖核酸将Cas蛋白引导至靶HLA-A多核苷酸序列的靶基序并与其杂交,其中将靶HLA-A多核苷酸序列切割,并且其中至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自SEQ ID NO:1-2。
在一些方面,本公开提供了干细胞(例如,低免疫原性干细胞)或其群体,在其包含的基因组中HLA-B基因已进行编辑以缺失基因组DNA的连续段,从而减少或消除细胞或其群体中MHC I类分子的表面表达。可通过使细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸以及至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸接触来缺失基因组DNA的连续段,所述至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自SEQ ID NO:3-4。
在某些方面,本公开提供了一种用于改变细胞中靶HLA-B序列的方法,其包括使HLA-B序列与成簇规律间隔短回文重复相关(Cas)蛋白和至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸接触,其中核糖核酸将Cas蛋白引导至靶HLA-B多核苷酸序列的靶基序并与其杂交,其中将靶HLA-B多核苷酸序列切割,并且其中至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自SEQ ID NO:3-4。
在一些方面,本公开提供了干细胞(例如,低免疫原性干细胞)或其群体,在其包含的基因组中HLA-C基因已进行编辑以缺失基因组DNA的连续段,从而减少或消除细胞或其群体中MHC I类分子的表面表达。可通过使细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸以及至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸接触来缺失基因组DNA的连续段,所述至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自SEQ ID NO:5-6。
在某些方面,本公开提供了一种用于改变细胞中靶HLA-C序列的方法,其包括使HLA-C序列与成簇规律间隔短回文重复相关(Cas)蛋白和至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸接触,其中核糖核酸将Cas蛋白引导至靶HLA-C多核苷酸序列的靶基序并与其杂交,其中将靶HLA-C多核苷酸序列切割,并且其中至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自SEQ ID NO:5-6。
在某些方面,本公开提供了干细胞(例如,低免疫原性干细胞)或其群体,在其包含的基因组中II类反式激活因子(CIITA)基因已进行编辑以将一个或多个***缺失引入到外显子1中,从而减少或消除细胞或其群体中MHC II类分子(例如,HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)的表面表达。可以通过使细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸以及由SEQ ID NO:7组成的核糖核酸接触来引入一个或多个***缺失。在一些方面,CIITA的外显子1被由SEQID NO:7组成的核糖核酸和选自SEQ ID NO:1-2的至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸所靶向。
在某些方面,本公开提供了一种用于在细胞中引入一个或多个***缺失的方法,其包括使CIITA序列(例如,CIITA的外显子1)与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸以及核糖核酸接触,其中核糖核酸将Cas蛋白引导至靶CIITA多核苷酸序列的靶基序并与其杂交,其中将一个或多个***缺失引入到CIITA多核苷酸序列的外显子1中,并且其中核糖核酸具有SEQ ID NO:7的序列。在一些方面,CIITA的外显子1被由SEQ ID NO:7组成的核糖核酸和选自SEQ ID NO:1-2的至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸所靶向。
致耐受性因子的***
在某些实施方案中,可将一种或多种致耐受性因子***或重新***到基因组编辑的干细胞系中以产生免疫豁免的(immune-privileged)通用供体干细胞。在某些实施方案中,已进一步修饰本文公开的通用干细胞以表达一种或多种致耐受性因子。示例性致耐受性因子包括但不限于HLA-G、PD-L1和CD47中的一种或多种。此类致耐受性因子的表达可抑制免疫排斥。
本发明人已使用基因组编辑***,诸如CRISPR/Cas辅助同源定向修复(HDR)***,来促进致耐受性因子***到安全港基因座,诸如AAVS1基因座,以积极抑制免疫排斥。在一些方面,供体质粒包含HLA-G表达盒。在一些方面,供体质粒包含PD-L1表达盒。在一些方面,供体质粒包含CD47表达盒。在某些方面,供体质粒包含PD-L1、HLA-G和CD47表达盒。在某些方面,供体质粒包含PD-L1和CD47表达盒。包含表达盒的供体质粒可靶向干细胞(例如,低免疫原性干细胞)的AAVS1基因座。在某些方面,供体质粒以核糖核酸靶向低免疫原性干细胞的AAVS1基因座,其中核糖核酸具有SEQ ID NO:8的序列。
在一些方面,本公开提供了干细胞(例如,低免疫原性干细胞)或其群体,在其包含的基因组中干细胞基因组已进行修饰以表达HLA-G。在一些方面,本公开提供了用于改变干细胞基因组以表达HLA-G的方法。在某些方面,至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可以用于促进HLA-G***到干细胞系中。
在一些方面,本公开提供了干细胞(例如,低免疫原性干细胞)或其群体,在其包含的基因组中干细胞基因组已进行修饰以表达PD-L1。在一些方面,本公开提供了用于改变干细胞基因组以表达PD-L1的方法。在某些方面,至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可以用于促进PD-L1***到干细胞系中。
在一些方面,本公开提供了干细胞(例如,低免疫原性干细胞)或其群体,在其包含的基因组中干细胞基因组已进行修饰以表达CD-47。在一些方面,本公开提供了用于改变干细胞基因组以表达CD-47的方法。在某些方面,至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可以用于促进CD-47***到干细胞系中。
在一些方面,本公开提供了低免疫原性干细胞(例如,被修饰以具有HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR表达消除的干细胞)或其群体,在其包含的基因组中干细胞基因组已进行修饰以表达PD-L1、HLA-G和CD47。在一些方面,本公开提供了用于改变干细胞基因组以表达PD-L1、HLA-G和CD47的方法。
在一些方面,本公开提供了低免疫原性干细胞(例如,被修饰以具有HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR表达消除的干细胞)或其群体,在其包含的基因组中干细胞基因组已进行修饰以表达PD-L1和CD47。在一些方面,本公开提供了用于改变干细胞基因组以表达PD-L1和CD47的方法。
通用干细胞
在某些方面,本文公开的发明涉及通用干细胞。通用干细胞可包含一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原的表达减少和一种或多种致耐受性因子的表达增加或过表达。在某些方面,通用干细胞是HLA-A-/-、HLA-B-/-、HLA-C-/-和CIITAindel/indel细胞,其表现出HLA-G、PD-L1和CD47的表达增加。
在一些方面,本文所述的干细胞(例如,通用干细胞)表现出一种或多种特征。例如,干细胞保留分化潜能,表现出T细胞反应减少,表现出免受NK细胞反应的保护,并表现出巨噬细胞吞噬减少。
通用干细胞可保留多能性,进行三系分化,并保留正常核型。例如,通用干细胞可保留NANOG、OCT4、SSEA3和TRA-1-60中的一种或多种的表达。在一些方面,通用干细胞分化为三个胚层(例如,外胚层、中胚层和内胚层)并保持所有谱系标记物的表达。
在一些方面,通用干细胞展示出T细胞介导的适应性免疫反应减少。例如,T细胞(例如,CD4+和CD8+T细胞)表现出针对通用干细胞的启动和激活减少。此外,T细胞表现出针对通用干细胞的细胞因子分泌减少。HLA-I和HLA-II分子的表达减少可导致针对通用细胞的CD4+和CD8+T细胞启动减少。在一些方面,PD-L1的表达还抑制CD8+T细胞的激活。
在一些实施方案中,通用干细胞被保护免受NK细胞介导的排斥。由于HLA-G表达,通用干细胞可被保护免受NK细胞介导的排斥。在一些实施方案中,通用干细胞表现出巨噬细胞吞噬减少。在通用细胞中CD47的过表达和/或PD-L1的表达可最小化或抑制通用细胞的巨噬细胞吞噬。
一些定义
除非本文另有定义,结合本申请使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外,除非上下文另有要求,单数术语应包括复数,并且复数术语应包括单数。
如本文所用,术语“包含”用于指对本发明是必要的组合物、方法、试剂盒及其各自的组分,但对无论是否为必要的未指定要素的包含是开放性的。
如本文所用,术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。术语允许存在不会实质性影响本发明的这一实施方案的一个或多个基本和新颖或功能特征的额外要素。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法、试剂盒及其各自的组分,其不包括在实施方案的这一描述中未列举的任何要素。
除了在操作实例中或者另有指出的情况外,本文中使用的表示成分量或反应条件的所有数字都应被理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当术语“约”与百分比结合使用时可表示±1%。
除非上下文另有明确指出,否则单数术语“一个(种)”和“所述”包括复数指代物。类似地,除非上下文另有明确指出,否则词语“或”旨在包括“和”。还应理解,对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均为近似值,并且是出于描述而提供。尽管在本公开的实践或测试中可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料,但以下描述合适的方法和材料。术语“包含”表示“包括”。缩写“例如(e.g.)”来源于拉丁语exempli gratia,并在本文中用于表示非限制性实例。因此,缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
2016年5月9日提交的PCT申请PCT/US2016/031551的全部教义以引用方式并入本文。出于描述和公开的目的,所有确认的专利及其他出版物均明确地以引用方式并入本文,例如,此类出版物中描述的方法可与本公开结合使用。这些出版物仅由于其在本申请申请日之前公开而提供。就此而言,决不应解释为承认发明人因现有发明或任何其他原因而无权将此公开提前。所有关于这些文件的日期的陈述或关于这些文件的内容的呈现均基于申请人可获得的信息,并且不应构成有关这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
在尚未指明的范围内,本领域普通技术人员将理解,可进一步修改本文描述和例示的各种实施方案中的任一个以结合本文公开的任何其他实施方案中所示出的特征。
以下实施例例示了本发明的一些实施方案和方面。相关领域的技术人员将明白,在不改变本发明的精神或范围的情况下,可以进行各种修改、添加、取代等,并且此类修改和变化涵盖在如随后的权利要求所定义的本发明的范围内。以下实施例不以任何方式限制本发明。
例证
利用人多能干细胞衍生细胞进行移植的疗法有可能彻底改变疾病的治疗方式。对于它们临床转化的主要障碍是受体免疫***对同种异体细胞的排斥。旨在克服这种免疫屏障的策略包括将具有所定义的HLA单倍型的细胞建库(Nakajima等人,2007;Taylor等人,2005)和产生患者特异性诱导多能干细胞(iPSC)(Takahashi等人,2007;Yu等人,2007)。然而,多种限制(de Rham和Villard,2014;Tapia和Scholer,2016)阻碍了这些方法的广泛使用,并强调需要“现成”的细胞产品,所述细胞产品可容易施用于任何有需要的患者。作为产生这种通用干细胞产品的第一步,需要消除HLA I类以防止将细胞肽提呈给细胞毒性CD8+T细胞,因为HLA I类分子几乎在所有有核细胞中都有表达。此外,需要考虑消除HLA II类,因为它们也是高度多态性的,并且可存在于某些hPSC衍生的供体细胞类型中,尤其是在IFNγ刺激后的专职性抗原提呈细胞(APC)和内皮细胞(EC)中(Ting and Trowsdale,2002)。最近,CRISPR/Cas9基因组编辑***的性能提供了一种工具,通过敲除辅助链β-2-微球蛋白(B2M)来干扰hPSC或造血细胞中的HLA I类表达(Mandal等人,2014;Mattapally等人,2018;Meissner等人,2014;Riolobos等人,2013;Wang等人,2015),并通过靶向其转录主调节因子CIITA来消除HLA II类表达(Chen等人,2015;Mattapally等人,2018)。然而,B2M的缺失还阻止了非多态性非经典HLA Ib类分子HLA-E和HLA-G的表面表达,所述分子是保持NK细胞耐受性所需要的(Ferreira等人,2017;Lee等人,1998b)。此外,已发现B2M缺陷细胞仍被同种异体CD8+T细胞排斥(Glas等人,1992)。因此,HLA-A/-B/-C基因的单独缺失可代表更有利的策略,以保护供体细胞免受CD8+T细胞介导的细胞毒性而不丧失HLA Ib类保护功能。
已探究的产生“现成”细胞产品的其他方法包括共抑制性分子的表达和阻断HLA-T细胞受体(TCR)衔接之外的完全T细胞激活所需的共刺激信号。例如,在人源化小鼠模型中,T细胞检查点抑制剂PD-L1和CTLA-4Ig的异位表达已证明可保护干细胞免受排斥(Rong等人,2014)。但是这种方法使HLA屏障完好无损,这可导致由预先存在的抗HLA抗体沉淀的植入细胞的超急性排斥(Iniotaki-Theodoraki,2001;Masson等人,2007)。此外,CTLA-4Ig还可损害调节性T细胞(Treg)的稳态和功能,可能危及操作免疫耐受性的建立(Bour-Jordan等人,2004;Salomon和Bluestone,2001)。
诸如NK细胞和巨噬细胞的先天免疫细胞在许多情况下(包括慢性移植排斥)在启动适应性免疫反应方面发挥重要作用。与B2M缺失相关的主要问题是,这种策略使供体细胞由于“自我缺失”而容易受到NK细胞介导的杀伤(Raulet,2006)。最近,Gornalusse等人在B2M缺陷细胞中表达了B2M-HLA-E融合构建体,以克服NK细胞介导的裂解(Gornalusse等人,2017)。然而,这种方法没有解决缺乏NKG2A(对于HLA-E的抑制性受体)的NK细胞,其反应性仍可能令人担忧(Braud等人,1998a;Pegram等人,2011)。因此,妊娠期间在母胎界面上表达的NK细胞抑制性配体HLA-G,其通过多种抑制性受体发挥作用(Ferreira等人,2017;Pazmany等人,1996),可能是完全克服NK细胞反应更好的候选者。此外,导致移植细胞排斥的巨噬细胞可受到CD47表达的控制,CD47是“不要吃我”的信号,其防止细胞被巨噬细胞吞噬(Chhabra等人,2016;Jaiswal等人,2009;Majeti等人,2009)。然而,尚未探究这种方法来保护hPSC及其分化的衍生物免受巨噬细胞吞噬。此外,尚未提出靶向适应性免疫和先天免疫两者的令人信服的策略。
在此,证明了CRISPR/Cas9***可以用于从hPSC的基因组中选择性切除编码多态性HLA I类成员HLA-A/-B/-C的基因。此外,其复用能力允许使用靶向CIITA的单个向导RNA同时消除HLA II类基因表达。进一步修饰由此产生的多态性HLA缺陷、“免疫不透明”细胞以表达免疫调节性因子PD-L1、HLA-G和CD47,它们分别靶向T细胞、NK细胞和巨噬细胞的免疫监视,进一步减弱体外和体内的同种异体反应。将这些和其他基因修饰组合最终可产生适用于移植到任何患者中的通用“现成”细胞产品。
结果
基因组编辑消除多态性HLA-A/-B/-C和HLA II类表达
鉴于人MHC I类基因HLA-A、HLA-B和HLA-C高度同源,使用CRISPR/Cas9基因组编辑***设计靶向每个基因的编码区的特定短向导RNA(sgRNA)证明具有挑战性。因此,采用双向导复用策略靶向与这些基因相邻的非编码区,以同时从hPSC系(HUES8)的基因组中切除所有三个基因。在HLA基因座中,HLA-B和HLA-C相邻,而HLA-A更靠近端粒。为了同时敲除相邻的HLA-B和HLA-C基因,在HLA-B上游和HLA-C下游的每个位点设计了两个sgRNA(图1A)。预测的95kb缺失还包括两个基因的启动子,在UCSC基因组浏览器(UCSC Genome Browser)上定义为H3K27Ac阳性区域。为了敲除整个HLA-A基因,在HLA-A上游设计了一个sgRNA,并在HLA-A下游设计了另一个sgRNA(图1B)。根据UCSC基因组浏览器,预测的13kb缺失包括HLA-A启动子。通过跨越预测的Cas9切割位点的PCR扩增子确认两种缺失(图6A-图6B)。通过流式细胞术验证最后HLA敲除克隆(KO)中的HLA-A/-B/-C蛋白的消除(图1C)。
靶向HLA II类表达的主调节因子CIITA是有据可查的策略以共同消除三个高度多态性HLA II类等位基因HLADP/-DQ/-DR的表达(Krawczyk和Reith,2006;Reith和Mach,2001)。先前报道了具有高切割效率的靶向CIITA外显子1的sgRNA(图1D)(Ding等人,2013)。此sgRNA与靶向HLA-A基因的sgRNA组合使用。位于CIITA第一个外显子中切割位点侧翼的一对PCR引物用于扩增跨越切割位点的区域。PCR扩增子经Sanger测序以鉴定双等位基因移码(图6C-图6D)。为了证明靶向CIITA导致HLA II类表达丧失,使用先前公布的方案(Patsch等人,2015)将WT和KO hPSC分化为内皮细胞(EC)。值得注意的是,分化的WT和KO EC表达了等同水平的EC标记物CD144(VE-Cadherin),表明所得细胞的分化效率不受基因组编辑的影响(图6E)。重要的是,在KO EC中消除了IFNγ刺激后HLA-DR表达的诱导(图1E)。具有HLA-A-/-HLA-B-/-HLAC-/-CIITAindel/indel基因型的KO hPSC克隆是按照图6F中所描绘的工作流程产生的。总之,结果证明复用CRISPR/Cas9基因组编辑允许hPSC中多态性HLA I类和II类基因表达的组合的和高度特异性的消除。
将免疫调节性因子敲入到HLA敲除细胞系中
假设消除多态性HLA Ia类和II类分子会消除T细胞介导的适应性免疫排斥。然而,HLA敲除细胞可能仍然易受参与同种异体反应的先天免疫细胞(诸如NK细胞和巨噬细胞)的影响,这促进基于以下基本原理对引入免疫调节性因子的作用的探究:1)虽然非多态性HLA-E基因将保持完整,但其表面表达可能会由于去除多态性HLA I类基因而严重受损,因为由HLA-E提呈的主要肽是来源于其他I类分子的前导肽(Braud等人,1998b)。因此,不能表达除HLA-E以外的任何HLA I类可使供体细胞容易受到NK细胞介导的裂解。为了保护工程化细胞免受NK细胞的影响,试图将HLA-G引入到HLA敲除细胞中。2)巨噬细胞被植入部位分泌的细胞因子吸引并通过抗体结合被启动以吞噬外来细胞。已充分记录与巨噬细胞表面上的信号调节性蛋白α(SIRPa)结合,从而充当“不要吃我”信号的CD47,在某些类型的肿瘤中显著增加并帮助它们逃脱巨噬细胞吞噬(Betancur等人,2017;Jaiswal等人,2009;Willingham等人,2012;Zhao等人,2016)。因此,目的是在HLA敲除细胞中过表达CD47。3)HLA-G可将来源于胞内蛋白质的经典肽提呈给T细胞(Diehl等人,1996年),这可能会将细胞系重新暴露于CD8+T细胞免疫监视之下。此外,γδT细胞可直接识别抗原并起始细胞毒性反应(Vantourout和Hayday,2013)。为了抵消任何残留的T细胞反应,决定敲入T细胞检查点抑制剂PD-L1,其可与激活的T细胞上的PD-1受体衔接,直接抑制T细胞活性(Riley,2009)。此外,PD-L1表达还可通过抑制PD-1+NK细胞(Beldi-Ferchiou等人,2016;DellaChiesa等人,2016)和PD-1+巨噬细胞(Gordon等人,2017)来有助于保护移植细胞免受先天免疫排斥。
为了避免在转基因表达上的随机整合和位置效应,试图将免疫调节性因子敲入到AAVS1安全港基因座中(Sadelain等人,2011)。设计了两种供体质粒,一种含有PD-L1;HLA-G;CD47表达盒并且另一种含有PD-L1;CD47表达盒,均由CAGGS启动子驱动,所述启动子两侧是与AAVS1基因座同源的臂(图1G)。将供体质粒与靶向AAVS1基因座的sgRNA一起电穿孔到HLA-A-/-HLAB-/-HLA-C-/-CIITAindel/indel克隆中。通过PCR来验证表达盒于AAVS1基因座中的整合(图6G)。按照图6F中的工作流程分离了两个克隆并通过流式细胞仪进行分析;与WT细胞相比,一种名为KI-PHC,表达PD-L1、HLA-G,但没有显著过表达CD47(图1H-图1I),第二个名为KI-PC,表达PD-L1并显示出CD47水平升高(图1J和图7A)。通过流式细胞术在两个KI克隆中检查表面HLA-A2水平并确认HLA Ia类消除(图7B)。KI-PHC和KI-PC hPSC分化为CD144+EC(图7C),并且在IFNγ刺激后通过流式细胞术没有观察到HLA-DR表达(图7D)。因此,免疫调节性因子被成功***到HLA Ia类和II类空细胞的AAVS1安全港基因座中。总的来说,产生了三个工程化hPSC系:KO、KI-PHC和KI-PC(图1F)。
接下来,试图确认工程化hPSC系的衍生物中的转基因表达以及HLA-E表达。为此,将工程化hPSC分化为血管平滑肌细胞(VSMC)。WT、KO、KI-PHC和KI-PC VSMC表达了等同水平的VSMC标记物CD140b(PDGFRB),确认了类似的分化效率(图7E)。在KI-PHC VSMC中,与WTVSMC相比,观察到PD-L1和HLA-G适度高表达的亚群,以及显示出PD-L1和HLA-G水平显著升高的主群(图7F)。然而,未观察到KI-PHC VSMC中CD47表达增加(图7F),这可能是从靶向盒表达不完全的结果,其中所有三种基因产物都由2A肽连接(图1G)。类似地,与WT VSMC相比,在KI-PC VSMC中观察到PD-L1和CD47适度高水平的小亚群和水平高度升高的主群(图7F)。
当用IFNγ刺激WT VSMC时,它们大幅上调了HLA-E表面表达。相比之下,KO VSMC中细胞表面上的HLA-E蛋白水平大大减少(图7G),这不是由于KO VSMC中HLA-E基因表达受损(图7H)。令人惊讶的是,KI-PHC VSMC的表面HLA-E表达并未通过HLA-G表达而恢复(图7G)。然而,HLA-G表面贩运在KI-PHC VSMC中未受损(图7F),这提供了进一步的激励,将这种致耐受性因子引入到工程化细胞产品中,以补偿HLA-A/-B/-C空背景中HLA-E表面表达的减少。
KO和KI细胞系保留多能性和分化潜能
为了评估工程化hPSC系是否保留多能性,通过KO、KI-PHC和KI-PC hPSC上的免疫荧光评估了NANOG、OCT4、SSEA3、SSEA4和TRA-1-60的表达,并发现与未修饰的hPSC相等(图2A)。此外,将KO、KI-PHC和KI-PC hPSC分化为三个胚层。进行qRT-PCR以检查外胚层、中胚层和内胚层标记物的表达,并与来源于未修饰hPSC的三个胚层进行比较。发现所有分析的谱系标记物都在它们各自的胚层细胞中表达(图2B)。此外,KO、KI-PHC和KI-PC hPSC显示出正常核型(图2C)。因此,尽管进行了多轮基因修饰,这些工程化hPSC系仍保持多能性,进行三系分化,并保留正常核型。
为了分析用于工程化hPSC系的sgRNA的潜在脱靶效应,从工程化hPSC系以及从亲本WT hPSC中PCR扩增了前21个计算机预测的外显子脱靶位点。PCR产物的Sanger测序未显示这些位点上的任何不需要的编辑,除了假基因HLA-H(HFE),其显示出与用于从基因组中缺失HLA-A的HLA-A上游的sgRNA完美匹配(图2D和图8)。更广泛地,对用于本研究的8种sgRNA的所有648个预测脱靶位点进行了靶标捕获测序。在通过专门设计的RNA诱饵富集之后,对于每个预测脱靶位点,将富集的DNA片段通过下一代测序(NGS)进行测序。将每个细胞系的序列读数对齐并与hg38基因组参考序列进行比较,并且计算具有改变序列的读数百分比。因此,除鉴定了12个天然存在的SNP/多态位点外,HLA-H(HFE)在所有三个细胞系中都被确认为脱靶。此外,在所有三种细胞系中的TRAF3中检测到因靶向HLA-C所产生的内含子脱靶位点,以及在KI-PC细胞系中的CPNE5中检测到由于AAVS1 sgRNA的内含子脱靶位点(图2E和图9)。总的来说,尽管检测到三个脱靶事件,但工程化hPSC系保留了多能性及其分化为所有三个胚层的细胞以及分化为VSMC和EC的能力,与其WT对应物具有类似的分化效率。
针对KO和KI细胞系的T细胞反应减少
鉴于预期去除多态性HLA Ia类表达能消除T细胞介导的适应性免疫反应,接下来试图研究与工程化细胞系共培养中的T细胞活性。除KO细胞外,KI-PHC细胞也用于解决T细胞检查点抑制剂PD-L1的表达是否会进一步抑制T细胞活性。进行了四种独立的体外T细胞免疫测定:T细胞增殖、激活、细胞因子分泌和杀伤测定。由于HLA I表达在hPSC中是适度的(de Almeida等人,2013;Drukker等人,2002),在用于各自的免疫测定之前,工程化hPSC和WT hPSC分化为EC,其在IFNγ刺激后表达HLA I和HLA II;或分化为VSMC,其仅表达HLA I。
对于T细胞增殖测定,WT、KO和KI-PHC EC用IFNγ预处理48小时,并随后与CFSE标记同种异体CD3+T细胞共培养五天。然后将T细胞针对CD3/4/8进行染色,并通过流式细胞术分析CFSE信号的稀释,作为对于不同T细胞亚群中T细胞增殖的读出(图10A)。一个代表性T细胞供体的FACS图显示在图10B中。正如预测的那样,与WT EC(8.29%±1.23%SEM)相比,当与KO EC(4.17%±0.89%SEM)或KI-PHC EC(3.87%±0.73%SEM)一起孵育时,总增殖T细胞(CD3+)的百分比减少(图3A,左图)。CD4+T细胞遵循类似的模式,WT EC(5.03%±0.89%SEM)比KO EC(3.58%±0.86%SEM)或KI-PHC EC(3.49%±0.83%SEM)诱导更多的CD4+T细胞增殖(图3A,中图)。此外,与WT EC(14.32%±2.39%SEM)相比,当CD8+细胞毒性T细胞在与KO EC(7.71%±1.89%SEM)或KI-PHC EC(5.95%±1.48%SEM)共培养时表现出显著减少的增殖(图3A,右图)。重要的是,当与KO EC共培养相比时,在KI-PHC EC存在下,CD8+T细胞的增殖显著减少(图3A,右图),这表明HLA空背景中的PD-L1过表达更进一步抑制了CD8+T细胞激活。为了进一步研究PD-L1在不同T细胞亚群反应过程中的抑制作用,在进行T细胞增殖测定之前,产生了诱导型表达PD-L1的hPSC系并使其分化为EC。发现当与WT EC相比时,在表达PD-L1的EC的存在下只有CD8+T细胞增殖减少,而CD4+T细胞增殖不减少,这证明了PD-L1对CD8+T细胞亚群的特异性抑制作用(图10C-图10D)。
利用T细胞与作为靶细胞的EC的相同共培养,检查了T细胞激活标记物CD25和CD69的表达(图3B)。当与T细胞与WT EC共孵育(6.43%±0.71%SEM;9.30%±1.51%SEM)相比时,在与KI-PHC EC(4.91%±0.74%SEM;5.04%±1.24%SEM)或KO EC(5.12%±0.77%SEM;5.40%±1.29%SEM)共培养中发现CD25+和CD69+T细胞(CD3+)的百分比减少(图3B)。在CD4+和CD8+细胞群中观察到相同的趋势(图3B)。还发现当与WT EC共培养时,在CD4+细胞群中观察到CD25+细胞的百分比更高,而在CD8+细胞群中观察到CD69+细胞的百分比更高。然而,当与KO EC相比时,在T细胞中未观察到针对KI-PHC EC的激活标记物的表达显著减少。
接下来,检查了在为期五天的T细胞-EC共培养过程中分泌到培养基中的T细胞效应细胞因子IFNγ和IL-10的水平。与暴露于WT EC后在培养基中观察到的IFNγ和IL-10水平(4747±556.1SD;54.56±17.22SD)相比,当T细胞暴露于KO(3214±180.5SD;5.09±0.16SD)或KI-PHC EC(2635±132.9SD;3.56±0.63SD)时,在培养基中两种细胞因子的水平更低,这表明T细胞针对KO或KI-PHC细胞系的细胞因子分泌减少(图3C)。
为了定量T细胞杀伤,测量了从VSMC释放的乳酸脱氢酶(LDH)作为对于T细胞细胞毒性的替代指标。在这种情况下,鉴于VSMC仅表达HLA I,预期只有CD8+T细胞会被HLA I-TCR衔接激活。发现当与KO VSMC(18.86%±4.34%SEM)和WT VSMC(37.65%±7.64%SEM)相比时,针对KI-PHC VSMC(15.31%±4.52%SEM)的CD8+T细胞细胞毒性最低(图3D)。此观察表明,在KI-PHC VSMC中,PD-L1更进一步抑制了CD8+T细胞细胞毒性,这与CD8+T细胞增殖测定的结果一致。总的来说,T细胞免疫测定中的观察结果证明,由于HLA I和II分子的去除,针对KO和KI-PHC细胞系的CD4+和CD8+T细胞启动减少。KIPHC细胞系中PD-L1的表达进一步抑制了CD8+T细胞激活。
为了评估体内T细胞反应,将WT和工程化hPSC皮下移植到免疫缺陷小鼠中并允许在4-6周的过程中形成畸胎瘤。然后经由尾静脉注射过继转移预致敏的同种异体CD8+T细胞,并且再监测畸胎瘤生长8天(图4A)。如通过启动前和启动后CD8+T细胞的CD69和PD-1表达所测量,用于注射的T细胞在致敏后被激活(CD69+)并且没有耗竭迹象(PD-1+)(图11A)。与仅WT细胞将会被排斥的假设一致,在注射CD8+T细胞7天之后WT畸胎瘤与KO畸胎瘤相比显示出体积增加较慢,这并不是由于WT畸胎瘤本身的生长速度较慢(图4B-图4C)。这些结果表明KO畸胎瘤被保护免受T细胞介导的排斥。此外,尽管不显著,但在T细胞输注后7天,KI-PHC和KI-PC畸胎瘤的平均体积也大于WT畸胎瘤的平均体积(图4B)。此外,如对于人效应T细胞标记物CD8和IL-2的qPCR(图4D)以及组织学(图4E)所证明,来源于KO和KI细胞系两者的畸胎瘤显示出T细胞浸润减少。总之,这些观察表明,从移植细胞的细胞表面去除多态性HLA分子可有效阻断体内T细胞介导的排斥反应,这与体外观察相匹配。
KI细胞系被保护免受NK细胞和巨噬细胞反应的影响
由于缺乏HLA Ia分子和HLA-E表面表达受损,预期KO hPSC及其衍生物容易受到NK细胞介导的裂解,而由于HLA-G表达,KI-PHC细胞系应被保护免受NK细胞介导的排斥。为了检验所述假设,将同种异体NK细胞从健康供体分离出来,并与WT、KO或KI-PHC VSMC共孵育。通过流式细胞术分析CD56+NK细胞的脱颗粒标记物CD107a的表面表达作为NK细胞激活的读出(图11B)。值得注意的是,在KO VSMC存在下的NK细胞脱颗粒并没有显著高于WT VSMC(10.16%±2.96%SEM)(图5A),这表明在hPSC衍生的VSMC上缺乏NK细胞激活信号。然而,与假设一致的是,发现在与KI-PHC VSMC(5.43%±0.95%SEM)共培养中CD107a+脱颗粒NK细胞的百分比显著低于存在KO VSMC的情况(13.51%±2.51%SEM)(图5A),这表明NK细胞活性确实受到KI-PHC VSMC中HLA-G表达的抑制。一个代表性供体的FACS图显示在图11C中。还检查了与NK细胞共孵育之后从凋亡VSMC中释放的LDH,以定量NK细胞的细胞毒性。与NK细胞脱颗粒一致,观察到当NK细胞与KI-PHC VMSC孵育时,NK细胞细胞毒性减少(图5B)。
最后,使用pH敏感荧光染料(pHrodo-Red)检查巨噬细胞活性,所述荧光染料在吞噬作用后发射信号。假设在工程化hPSC细胞系的衍生物中,巨噬细胞‘不要吃我’信号CD47的过表达会减少巨噬细胞吞噬。鉴于在KI-PHC VSMC中未观察到CD47表达的显著增加(图7F),将从KI-PC细胞系分化的VSMC用于这些测定,其显示出CD47水平远高于WT VSMC(图7F)。此外,产生了CD47敲除(CD47-/-)细胞系作为对于巨噬细胞吞噬的阳性对照,并通过流式细胞术验证CD47细胞表面表达的丧失(图11D)。从WT、CD47-/-和KI-PC细胞分化而来的pHrodo-Red标记的VSMC用星形孢菌素(STS)处理以诱导细胞凋亡,或者不处理,然后与来自健康供体的分离的同种异体巨噬细胞一起孵育。通过活细胞成像监测红色信号的出现(被巨噬细胞吞噬的VSMC的指标),并定量荧光强度。值得注意的是,无论是否用STS处理,当与CD47-/-或WT VSMC相比时,KI-PC VSMC显示出巨噬细胞吞噬显著降低(图5C-图5D和图11E)。这些数据证明CD47的过表达确实可以使工程化hPSC衍生VSMC的巨噬细胞吞噬减至最少,但不能排除PD-L1对抑制巨噬细胞吞噬的贡献,KI-PC VSMC也表达了这一点(图7F)。
讨论
在本研究中,应用多路复用CRISPR/Cas9基因组编辑敲除了高度多态性HLA-A/-B/-C基因,并通过靶向hPSC中的CIITA基因成功地防止了HLA II类基因的表达。此外,CRIPSR/Cas9辅助同源定向修复(HDR)用于将免疫调节性因子PD-L1、HLA-G和CD47引入到AAVS1基因座中。发现工程化hPSC衍生物引起的T细胞和NK细胞的免疫激活和杀伤显著减少,并且显示出巨噬细胞的吞噬最小。
在用于消除HLA Ia类表达的方法中,将多态性HLA Ia类基因HLA-A/-B/-C特异性切除,同时保持基因B2M和非多态性HLA Ib类基因HLA-E、-F和-G完整。虽然由此产生的95kb缺失不仅含有HLA-B/-C基因,还含有MIR6891和四个假基因,但在KO或KI细胞系中没有观察到生长速率或分化效率的变化。有趣的是,由于未知原因,HLA-E表面表达并未通过KI-PHC细胞中HLA-G的表达而恢复,这与先前的报道不一致,即来自HLA-G的前导肽足以促进HLA-E表面贩运(Lee等人,1998a)。
HLA敲除(KO)hPSC系是使用七种不同的sgRNA通过基因组编辑产生的,KI-PHC和KI-PC hPSC是来源于KO系的克隆并由靶向AAVS1基因座的另外sgRNA编辑。在所使用的8个sgRNA的648个预测脱靶位点之中,由于其中一个用于从基因组中缺失HLA-A的sgRNA,在转录的假基因HLA-H中仅观察到一个外显子脱靶事件。如果进行翻译,在两个等位基因中发现的观察到的2bp缺失将会导致移码突变。尽管HLA-H中的突变与遗传性血色素沉着症(一种罕见的铁储存障碍)(Feder等人,1996)有关联,但观察到的HLA-H(HFE)突变并未影响本研究中测试的细胞类型的生长速率或分化效率。值得注意的是,有可能通过涉及一种不同的sgRNA或通过对HLA-H基因座进行基因分型来选择不包含这种特定脱靶突变的克隆来避免这种脱靶事件。此外,使用sgRNA/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)进行靶向,其允许比基于质粒的方法更多的瞬时编辑(Roth等人,2018),应该减少每个细胞系的脱靶事件数量,并因此在将来应用。
正如预期的那样,去除hPSC及其衍生物(诸如EC和VSMC)中的多态性HLA表达会导致体外和体内T细胞反应减少。来自T细胞测定的有趣观察是,检查点抑制剂PD-L1的过表达仅对CD8+T细胞的增殖和细胞毒性产生显著影响。这可能有几种可能的解释:1)CD8+T细胞上的PD-L1受体PD-1的水平高于CD4+T细胞。2)CD8+T细胞是测定中对靶细胞暴露反应最灵敏的细胞类型,并因此也会表达更高水平的负调节因子PD-1。值得注意的是,两种解释并不相互排斥,因为T细胞激活的强度和PD-1表达通过负反馈回路相关联(Riley,2009)。此外,应注意,即使不存在HLA,单独的PD-L1也会对CD8+T细胞增殖产生影响,这表明即使不存在生产性HLA-TCR相互作用,PD-L1也可作为致耐受性因子。此外,在T细胞激活和细胞因子分泌测定中,当与阴性对照相比时,即使在与KIPHC细胞系的共培养中也观察到背景T细胞活性。这可能是由于实验设置,考虑到靶细胞可分泌促进T细胞激活的因子,而与HLA的存在无关。
虽然急性移植排斥主要是T细胞介导的,但在治疗细胞的植入和长期存活方面,还必须考虑其他免疫细胞(诸如巨噬细胞、NK细胞和B细胞)的作用。NK细胞测定表明HLA-G表达能够控制NK细胞活性。此外,CD47的过表达有效减少了巨噬细胞吞噬。然而,如最近所报道,在两种KI细胞系中共表达的PD-L1还可影响PD-1+NK细胞(Beldi-Ferchiou等人,2016;Della Chiesa等人,2016)和PD-1+巨噬细胞(Gordon等人,2017)的活性,这可能有助于所观察到的表型。在长期植入方面,尤其是必须考虑作为慢性移植排斥的主要驱动因素的NK细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和同种抗体介导的补体激活(Baldwin等人,2016;Djamali等人,2014;Michaels等人,2003)。可以想象,引入已知抑制ADCC和补体激活的另外的因子,诸如CD59(Meri等人,1990),可实现持久的植入。最终,体内实验将帮助阐明移植后修饰细胞可具有的保护程度。然而,虽然存在各种人源化小鼠模型,但它们在重现完整的人免疫反应方面受到限制。因此,可能需要开发用于测试细胞移植和排斥的改善体内模型(Brehm等人,2014;Li等人,2018;Melkus等人,2006;Rongvaux等人,2014)。
克服移植的免疫屏障将提供一种令人兴奋的新方式,其不仅能克服同种异体屏障,还有潜力治疗诸如1型糖尿病(T1D)和多发性硬化症的自身免疫性疾病,在所述自身免疫性疾病中一种特定细胞类型受到患者自身免疫***的攻击并需要替换。因此,可安全地移植到任何人中的通用细胞的产生有望释放再生医学的全部潜力。
实验程序
CRISPR gRNA序列
HLA-A上游:5'-GCCGCCTCCCACTTGCGCT-3'(SEQ ID NO:1)
HLA-A下游:5'-CACATGCAGCCCACGAGCCG-3'(SEQ ID NO:2)
HLA-B上游_1:5'-ATCCCTAAATATGGTGTCC-3'(SEQ ID NO:3)
HLA-B上游_2:5'-TCCCTAAATATGGTGTCCCT-3'(SEQ ID NO:4)
HLA-C下游_1:5'-GTGATCCGGGTATGGGCAGT-3'(SEQ ID NO:5)
HLA-C下游_2:5'-TGATCCGGGTATGGGCAGTG-3'(SEQ ID NO:6)
CIITA:5'-TCCATCTGGTCATAGAAG-3'(SEQ ID NO:7)
gRNA_AAVS1-T2:5'-GGGGCCACTAGGGACAGGAT-3'(SEQ ID NO:8)
PCR和qPCR探针/引物
图6中使用的PCR引物:
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图8中使用的PCR引物:
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基于SYBR的qPCR引物:
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BRACHYURY_F:5'-AATTGGTCCAGCCTTGGAAT-3'(SEQ ID NO:67)
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PAX6_R:5'-TAGCCAGGTTGCGAAGAACT-3'(SEQ ID NO:74)
TaqMan基因表达测定:
HLA-E:Hs03045171_m1
CD8:Hs00233520_m1
IL-2:Hs00174114_m1
RPLP0(内部对照):Hs99999902_m1
FACS抗体
α-HLA-A2(PE缀合),克隆BB7.2,Biolegend,Cat#343305
α-HLA-ABC(PE缀合),克隆W6/32,Biolegend,Cat#311406
α-HLA-E(PE缀合),克隆3D12,Biolegend,Cat#342603
α-HLA-G(PE缀合),克隆MEM-G/9,Abcam,Cat#ab24384
α-HLA-DR(APC缀合),克隆MEM-12,ThermoFisher Scientific,Cat#MA1-10347
α-B2M(APC缀合),克隆2M2,Biolegend,Cat#316311
α-PD-L1(APC缀合),克隆29E.2A3,Biolegend,Cat#329708
α-PD-1(APC缀合),克隆EH12.2H7,Biolegend,Cat#329908
α-CD3(APC缀合),克隆UCHT1,Biolegend,Cat#300412
α-CD3(Pacific BlueTM缀合),克隆UCHT1,Biolegend,Cat#300418
α-CD4(PE/Cy7缀合),克隆RPA-T4,Biolegend,Cat#300511
α-CD8(PE缀合),克隆SK1,Biolegend,Cat#344705
α-CD47(PE缀合),克隆CC2C6,Biolegend,Cat#323108
α-CD56(PE缀合),克隆HCD56,Biolegend,Cat#318306
α-CD107a(APC缀合),克隆H4A3,Biolegend,Cat#328620
α-CD144(PE缀合),克隆55-7H1,BD Biosciences,Cat#560410同种型
同种型1:小鼠IgG2b,κ同种型对照(APC缀合),Biolegend,Cat#400322
同种型2:小鼠IgG2b,κ同种型对照(PE缀合),Biolegend,Cat#401208
同种型3:小鼠IgG2a,κ同种型对照(PE缀合),Biolegend,Cat#400214
免疫荧光抗体
α-OCT4,Abcam,Cat#ab19857
α-NANOG,Abcam,Cat#ab21624
α-SSEA3,Millipore,Cat#MAB4303
α-SSEA4,Millipore,Cat#MAB4304
α-TRA-1-60,Millipore,Cat#MAB4360
人ES细胞培养、电穿孔和药物选择
将HUES8细胞(Cowan等人,2004)在Geltrex(Life Technologies)预包被的板上生长,并在补充有青霉素/链霉素的mTeSR1(StemCell Technologies)中培养。对于传代,将细胞用Gentle Cell Dissociation Reagent(StemCell Technologies)解离5-10min,并重新接种到补充有RevitaCellTM(ThermoFisher Scientific)的新鲜培养基中。对于电穿孔,如前所述(Peters等人,2013年),将HUES8细胞解离成单细胞,并用50μg pCas9_GFP(Addgene#44719)和总共50μg gRNA质粒对1000万细胞进行电穿孔,用于基因敲除。对于将基因敲入AAVS1基因座,用50μg pCas9_GFP、25μg gRNA_AAVS1-T2(Addgene#41818)和40μg双链供体质粒对细胞进行电穿孔。出于基因敲除目的,在电穿孔后48小时收集细胞。表达GFP的细胞通过FACS(FACSAria II,BD Biosciences)富集,并在补充有RevitaCellTM的新鲜培养基中以15000细胞/板重新接种在10cm组织培养板上,以允许形成单细胞集落。可选地,对于基因敲入,通过2μg/ml的杀稻瘟菌素(blasticidin)(ThermoFisher Scientific)持续5天选择电穿孔后48小时的细胞。然后手动挑选细胞集落并扩增。
CRISPR/Cas9基因组编辑
从HUES8或HEK293T细胞中扩增HLA-A/B/C上游或下游每个区域的500个碱基对,并进行Sanger测序(Genewiz)。选择两个细胞系之间保守的序列作为参考序列,并使用麻省理工学院(MIT)张锋(Feng Zhang)实验室开发的CRISPR设计工具(可在:crispr.mit.edu获得)和CCTop(Stemmer等人,2015)来设计sgRNA。挑选排名靠前的sgRNA并将其克隆到gRNA表达载体(Addgene#41824)中。然后将gRNA质粒转染到HEK293T细胞中,提取基因组DNA并通过TIDE(可在:tide.nki.nl获得)分析覆盖切割位点的PCR扩增子的在靶效率。将具有最高在靶活性的单向导RNA用于HUES8细胞中的基因组编辑。为了构建敲入供体质粒,将PD-L1、HLA-G和CD47的ORF单独克隆并使用Gibson(New England BioLab)通过2A序列连接。在切下Flpe-ERT2之后,将3合1(3-in-1)盒***到AAVS1-Blasticidine-CAG-Flpe-ERT2质粒(Addgene#68461)中的Sal I和Mlu I限制性酶切位点之间。先前描述了人ESC基因组编辑的详细信息(Peters等人,2013年)。
HLA敲除(KO)细胞系的产生
简而言之,为了敲除相邻的HLA-B/-C基因,将总共四种sgRNA与Cas9表达质粒一起共电穿孔到野生型(WT)HUES8中。然后使用图6A中所示的引物筛选纯合敲除克隆(HLA-B/-C-/-效率:1.56%)。还观察到杂合敲除克隆(HLA-B/-C+/-效率:7.8%)。通过RT-PCR进一步验证纯合克隆的HLA-B/-C mRNA表达的消除,并且通过nCounter Human Karyotype Assay确认正常核型(数据未显示)。最后选择了一个核型正常的克隆用于在一次电穿孔中进一步靶向HLA-A和CIITA基因。进行使用图6B中所示引物的PCR和使用α-HLA-A2抗体的流式细胞术以筛选HLA-A敲除克隆。进行图6E中所示的引物和Sanger测序以鉴定CIITA敲除克隆。因此,在第一轮HLAA/CIITA靶向之后仅观察到杂合克隆(HLA-A+/-CIITA+/indel)(HLA-A+/-效率:3.68%)。因此,将另一轮HLA-A/CIITA sgRNA电穿孔应用于一个核型正常的杂合克隆,并采用相同的筛选策略。最后产生一个纯合克隆(HLA-A-/-CIITAindel/indel),但FACS分析显示出这个克隆是混合克隆,其仍保留1%的HLA-A+细胞。在亚克隆之后,获得纯的纯合克隆(HLAKnockout,KO)。
核型分析
核型G显带由Cell Line Genetics进行。
定向分化为三个胚层
将WT和基因编辑的HuES8细胞系按照STEMdiffTM Trilineage DifferentiationKit(StemCell Technologies)的基于单层的方案分化为外胚层、中胚层和内胚层。
分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞
按照已发表的方案来分化人内皮细胞(EC)和血管平滑肌细胞(VSMC)(Patsch等人,2015)。简而言之,对于EC分化,将ESC接种在补充有8uM CHIR99021(Cayman Chemical)和25ng/ml BMP4(Peprotech)的N2B27培养基中持续3天以诱导侧中胚层。然后用补充有200ng/ml VEGF(Peprotech)和2μM forskolin(Abcam)的StemPro-34替换培养基持续2天以诱导EC。然后使用MACS细胞分离(Miltenyi Biotec)使细胞富集CD144+细胞。在补充有EGMTM-2BulletKitTM(Lonza)的EBMTM-2中将CD144+细胞接种在纤连蛋白(Corning)包被板上用于进一步分化至少7天。对于VSMC分化,将ESC接种在与EC分化相同的培养基中持续3天。在第4天和第5天,将培养基更换为补充有12.5ng/ml PDGF-BB(Peprotech)和12.5ng/mlActivin A(Cell Guidance Systems)的N2B27。从第6天起,将细胞解离并在补充有平滑肌生长补充剂(Smooth Muscle Growth Supplement)(ThermoFisher Scientific)的培养基231中接种在明胶包被的培养皿上用于进一步分化。
人原代免疫细胞分离和培养
血液获自来自波士顿麻省总医院(Massachusetts General Hospital)的JacksonTransfusion Center的健康、去识别供体(leukopaks)。人原代T细胞、NK细胞或CD14+单核细胞分别通过阴性选择试剂盒(RosetteSepTM Human T Cell Enrichment Cocktail、RosetteSepTM Human NK Cell Enrichment Cocktail和RosetteSepTM Human MonocyteEnrichment Cocktail,StemCell Technologies)进行分离。将分离的T细胞在补充有5%人AB血清(Valley Biomedical)、5%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、GlutaMAX、MEM非必需氨基酸(ThermoFisher Scientific)和20U/ml IL-2(Peprotech)的X-VIVO 10(Lonza)培养基中培养。将分离的NK细胞在补充有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的含L-谷氨酰胺RPMI1640(Corning)中培养。将分离的单核细胞在补充有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和25-50ng/ml M-CSF(Peprotech)的RPMI 1640中分化为巨噬细胞。
流式细胞术
将含有1%胎牛血清(FBS)的PBS用作洗涤和染色缓冲液;将含有4%FBS的PBS用作封闭缓冲液。就EC和VSMC而言,将FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)以1:1000稀释度加入到封闭缓冲液中。简而言之,将免疫细胞或其他解离的单细胞洗涤一次,并在冰上用封闭缓冲液封闭20min。在FACSCaliburTM或LSR II(BD Biosciences)上分析前,将细胞在冰上用抗体染色30-60min并洗涤两次。使用FlowJo软件(BD)绘制数据。
体外T细胞增殖测定
当使用VSMC时,首先用丝裂霉素(Fisher Scientific)处理细胞。将10万EC或VSMC接种24孔板上并在测定前用IFNγ(100ng/ml)处理48小时。在共孵育的第0天,按照制造商说明用CellTraceTM CFSE(ThermoFisher Scientific)标记分离的CD3+T细胞。用PBS洗涤贴壁EC或VSMC两次,然后与500k CFSE标记T细胞在补充有20U/ml IL-2的T细胞培养基中共孵育5天。然后在LSR II上分析CFSE强度之前,用抗CD3/4/8抗体进行T细胞染色。将无靶细胞培养5天的T细胞用作阴性对照。用DynabeadsTM Human T-Activator CD3/CD28珠(ThermoFisher Scientific)处理5天的T细胞充当阳性对照。
体外T细胞激活测定和细胞因子分泌测定
将ESC衍生的EC用作靶细胞。共培养的条件与在T细胞增殖测定中相同,除了没有标记T细胞。在共培养5天后,将T细胞针对T细胞激活标记物染色,然后在LSR II上进行分析。对于多种分泌细胞因子定量,按照制造商说明通过定制的MSD U-PLEX Platform(MesoScale Discovery)收集并分析上清液。将培养5天的T细胞或靶细胞用作阴性对照。用DynabeadsTM Human T-Activator CD3/CD28珠(ThermoFisher Scientific)激活5天的T细胞充当阳性对照。使用与条件培养基孵育的T细胞从EC或VSMC评估背景激活。条件培养基如上所述制备。
体外T/NK细胞杀伤测定
将ESC衍生的VSMC用作靶细胞。对于T细胞杀伤测定,共孵育的条件与T细胞激活测定相同。对于NK细胞杀伤测定,在收集上清液之前,将40K VSMC和NK细胞以指定的效应物/靶标比在96孔U底中的200μl NK细胞培养基中共孵育20小时。共孵育后,收集上清液并按照制造商说明通过PierceTM LDH Cytotoxicity Assay Kit(ThermoFisher Scientific)进行分析。将T细胞培养基或NK细胞培养基(RPMI-10)用作背景对照。将单独培养的T/NK细胞或单独培养的靶细胞用作自发LDH释放的对照。将在终点处裂解的靶细胞用作最大LDH释放。
同种异体人CD8+T细胞的预致敏
使用RosetteSepTM Human CD8+T Cell Enrichment Cocktail(StemCellTechnologies)分离人原代CD8+T细胞,并如前所述用HUES8衍生的胚状体预致敏(Gornalusse等人,2017)。简而言之,将胚状体悬浮诱导5天,随后再贴壁培养4天。然后将CD8+T细胞与贴壁的胚状体细胞共培养用于预致敏。在这个过程中避免了来自异种资源(诸如明胶)的胞外基质,以防止非特异性T细胞激活。
体内T细胞回忆反应测定
所有动物实验都根据哈佛大学国际动物护理和使用委员会(Harvard UniversityInternational Animal Care and Use Committee)的规定进行。没有使用随机化。所有程序均以盲法进行。将8-10周龄的雄性免疫缺陷SCID Beige小鼠(Taconic)用于形成畸胎瘤。将200万HUES8细胞包裹在血块中,并且将血块皮下***到SCID Beige小鼠的每侧。在畸胎瘤变得可触及之后,每周通过卡尺测量畸胎瘤大小。在hESC移植后4至6周,将100万预致敏的同种异体人CD8+T细胞经由尾静脉注射到小鼠中。T细胞注射后,在第2天、第5天和第7天测量畸胎瘤大小;T细胞注射前2天也测量了畸胎瘤大小。在注射后第8天,收获畸胎瘤并通过qPCR和苏木精和伊红(H&E)染色进行分析。在相同的实验条件下使用两个同种异体CD8+T细胞供体,并且在本研究中将结果合并。组织学由哈佛干细胞研究所(Harvard Stem CellInstitute)的组织学核心进行。
体外NK细胞脱颗粒测定
在测定前24小时,将30万贴壁ESC衍生VSMC接种在24孔板中。第二天,将VSMC用PBS洗涤一次,然后与100K新鲜分离的NK细胞在补充有α-CD107a APC(Biolegend)和eBioscienceTM Protein Transport Inhibitor Cocktail(ThermoFisher Scientific)的NK细胞培养基中共孵育。将NK细胞加入到孔中后,将板以2,000rpm的速度离心5min,以实现充分的效应物-靶标接触。共孵育20h后,将NK细胞用α-CD56 PE(Biolegend)染色,然后在FACSCaliburTM上分析CD107a细胞表面表达。将不含靶细胞的NK细胞培养物用作阴性对照。将用Cell Activation Cocktail(不含Brefeldin A)处理的NK细胞用作对于脱颗粒的阳性对照,Cell Activation Cocktail包括PMA(佛波醇(phorbol)12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯)和离子霉素。
体外巨噬细胞吞噬作用测定
使用RosetteSepTM Human Monocyte Enrichment Cocktail(StemCellTechnologies),经由阴性选择将单核细胞从供体血液中分离出来。将单核细胞接种在无血清培养基中用于在补充有10%FBS、1%青霉素/链霉素和25ng/ml M-CSF(Peprotech)的RPMI 1640中粘附并成熟为巨噬细胞一至三周。在测定前两天,将巨噬细胞以100K/孔的密度重新接种到96孔μ板(ibidi)中。对于测定,将分化的VSMC用200nM星形孢菌素(Sigma)预处理1.5小时以用于“STS处理”组。将VSMC解离并用pHrodo-Red(IncuCyte)在37℃下标记1h。将三万标记VSMC加入到每个含有巨噬细胞的孔中,并将共孵育的培养物立即转移到Celldiscover 7活细胞成像平台(Zeiss)中。每20min获取每孔吞噬作用后红色荧光发射的一个图像持续6小时。使用ZEN成像软件(Zeiss)分析每个图像的总积分强度(平均荧光强度*总面积)。pHrodo-Red+颗粒表示巨噬细胞内已吞噬了VSMC的吞噬体。
CD47-/-和B2M-/-HUES8细胞系的产生
将以下四种CRISPR sgRNA用于靶向HUES8细胞中CD47的第一个编码外显子。
5'-gGTCCTGCCTGTAACGGCGG-3'(SEQ ID NO:75)
5'-gGACCGCCGCCGCGCGTCAC-3'(SEQ ID NO:76)
5'-gCAGCAACAGCGCGCCTACC-3'(SEQ ID NO:77)
5'-gTTCGCCCCCGCGGGCGTGT-3'(SEQ ID NO:78)
将细胞在电穿孔后72小时用抗CD47抗体(Clone CC2C6)染色,并且使用FACS Aria(BD)分离CD47阴性细胞。如前所述获得单细胞衍生的集落(Peters等人,2013),并随后通过FACS分析确认CD47表达的丧失。类似地,使用以下sgRNA产生Beta-2-Microglubulin(B2M)缺陷型HUES8细胞系:
5’-gCTACTCTCTCTTTCTGGCC-3’。(SEQ ID NO:79)
慢病毒转导
通过PCR扩增构建含有PD-L1 ORF的多西环素诱导型慢病毒Gateway载体(Invitrogen)。将PD-L1表达慢病毒通过用PD-L1表达载体和包装质粒pMDL、pVSVG和pREV转染HEK293T细胞进行包装。转染后48小时收集含有慢病毒颗粒的培养基,并与编码多西环素结合反式激活因子rtTA的慢病毒颗粒一起用于转导VSMC。24小时后,用多西环素(10μg/ml)处理VSMC以诱导PD-L1表达,这通过FACS来验证。除了7天的共孵育和在整个共孵育过程中存在多西环素外,如上所述对针对过表达PD-L1的VSMC的T细胞增殖进行评估。加入多西环素未观察到对T细胞增殖的作用。
免疫荧光
含有0.05%Tween-20的PBS是在固定细胞之后每个步骤之间的洗涤缓冲液。简而言之,将细胞用PBS洗涤,用4%多聚甲醛固定,并用0.1%Triton X-100渗透。将细胞用4%驴血清(Donkey Serum)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)在4℃下封闭过夜,并在室温下与在封闭缓冲液中稀释的适当一抗孵育1小时。然后将细胞与Alexa488-或Alexa 555缀合的二抗(Life Technologies)孵育。洗涤细胞,并且用Hoechst对细胞核染色。用Nikon倒置显微镜将图像可视化。
RNA分离、cDNA合成和qPCR
根据制造商说明,使用TRIzol Reagent(ThermoFisher Scientific)提取RNA。根据制造商方案,使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(ThermoFisher Scientific)进行cDNA合成。进行基于SYBR green或基于TaqMan的qPCR,并且使用QuantStudio 12k FlexSystem(ThermoFisher Scientific)确定相对定量,然后通过比较Ct方法(2-ΔΔCt)来计算相对于各自内部对照的表达。
基于下一代测序(NGS)的脱靶分析
使用CCTop预测脱靶位点(Stemmer等人,2015年)。诱饵设计、基因组DNA富集(文库制备)和NGS使用定制靶标捕获试剂盒由Arbor Biosciences来进行。简而言之,对于648个预测脱靶位点中的每一个,跨每个脱靶位点设计了五个RNA诱饵,并且每~26bp放置一次,覆盖181-182bp的窗口。从WT以及三个工程化hPSC系中提取基因组DNA后,将生物素化RNA诱饵与对应的变性基因组DNA文库杂交。随后,将RNA-gDNA杂交体与链霉抗生物素蛋白包被的珠结合,并且洗掉非特异性键。剩余的gDNA文库使用NovaSeq(Illumina)通过双端NGS进行扩增和测序。
除非稍后说明,否则基因组编辑事件由来自CRISPResso套件(第1.0.13版)的CRISPRessoPooled以默认设置定量(Pinello等人,2016)。简而言之,对于四个文库中的每一个,选择最小单碱基对分数(phred33)大于25的读数,并将其与人基因组(hg38)中每个gRNA脱靶位点周围的±100bp窗口进行对齐。过滤掉任何文库中少于5个对齐读数的位点(=3)。通过程序计算了在来自每个文库的每个脱靶位点处与hg38相比具有改变序列(***、缺失和取代)的读数百分比。如果在WT以及在所有三个工程化系中发现具有改变序列的读取百分比>0,则进一步检查序列。如果所有三个工程化系的序列都与WT序列匹配,则将它们归类为SNP/PM;然而,如果工程化细胞系的序列偏离了WT序列,则将它们鉴定为编辑事件。多态性(PM)代表小的缺失/***,而不是已经在WT hPSC中观察到的偏离了hg38的单核苷酸多态性(SNP)。
统计分析
使用Prism 7(Graphpad)生成图,并进行统计分析。
参考文献
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Claims (76)
1.一种干细胞,其包含相对于野生型干细胞MHC-I和MHC-II人白细胞抗原的表达减少和相对于野生型干细胞致耐受性因子的表达增加,
其中所述MHC-I人白细胞抗原是HLA-A、HLA-B和HLA-C,
其中所述MHC-II人白细胞抗原是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR,并且
其中所述致耐受性因子是CD47。
2.如权利要求1所述的干细胞,其中所述MHC-I人白细胞抗原的表达减少包括从所述细胞的至少一个等位基因中缺失所述MHC-I人白细胞抗原。
3.如权利要求1或权利要求2所述的干细胞,其中所述MHC-II人白细胞抗原的表达减少包括将一个或多个***缺失引入到CIITA中。
4.如权利要求1-3中任一项所述的干细胞,其还包含CIITA的表达减少。
5.如权利要求1-4中任一项所述的干细胞,其中将所述致耐受性因子***到所述细胞的至少一个等位基因的安全港基因座中。
6.如权利要求1-5中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C。
7.如权利要求1-6中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。
8.如权利要求1-7中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞不表达CIITA。
9.如权利要求1-8中任一项所述的干细胞,其中所述致耐受性因子还包含HLA-G和/或PD-L1。
10.一种干细胞,其不表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR并表达CD47。
11.如权利要求10所述的干细胞,其中所述细胞是CIITAindel/indel、HLA-A-/-、HLA-B-/-和HLA-C-/-干细胞。
12.一种制备低免疫原性干细胞的方法,所述方法包括减少干细胞的MHC-I和MHC-II人白细胞抗原的表达和增加所述干细胞的致耐受性因子的表达,从而制备所述低免疫原性干细胞,
其中所述MHC-I人白细胞抗原是HLA-A、HLA-B和HLA-C,
其中所述MHC-II人白细胞抗原是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR,并且
其中所述致耐受性因子是CD47。
13.如权利要求12所述的方法,其中减少所述MHC-I人白细胞抗原的表达包括从所述干细胞的至少一个等位基因中缺失所述MHC-I人白细胞抗原。
14.如权利要求12或权利要求13所述的方法,其中减少所述MHC-II人白细胞抗原的表达包括将一个或多个***缺失引入到CIITA中。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法,其还包括减少CIITA的表达。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法,其中增加致耐受性因子的表达包括将所述致耐受性因子***到所述干细胞的至少一个等位基因的安全港基因座中。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法,其中所述致耐受性因子还包含PD-L1和/或HLA-G。
18.如权利要求12-17中任一项所述的方法,其中所述低免疫原性干细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C。
19.如权利要求12-18中任一项所述的方法,其中所述低免疫原性干细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。
20.如权利要求12-19中任一项所述的方法,其中所述低免疫原性干细胞不表达CIITA。
21.一种干细胞,其包含相对于野生型干细胞,一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原和一种或多种致耐受性因子的受调节表达。
22.如权利要求21所述的干细胞,其中所述一种或多种MHC-I人白细胞抗原选自HLA-A、HLA-B和HLA-C。
23.如权利要求21或22所述的干细胞,其中所述一种或多种MHC-I人白细胞抗原的受调节表达包括所述一种或多种MHC-I人白细胞抗原的表达减少。
24.如权利要求21-23中任一项所述的干细胞,其中从所述细胞的基因组中缺失所述一种或多种MHC-I人白细胞抗原,从而调节所述一种或多种MHC-I人白细胞抗原的表达。
25.如权利要求21-24中任一项所述的干细胞,其中所述一种或多种MHC-II人白细胞抗原选自HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。
26.如权利要求21-25中任一项所述的干细胞,其中所述一种或多种MHC-II人白细胞抗原的受调节表达包括所述一种或多种MHC-II人白细胞抗原的表达减少。
27.如权利要求21-26中任一项所述的干细胞,其中将一种或多种***缺失引入到CIITA中,从而调节所述一种或多种MHC-II人白细胞抗原的表达。
28.如权利要求21-27中任一项所述的干细胞,其中所述细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C。
29.如权利要求21-28中任一项所述的干细胞,其中所述细胞是HLA-A-/-、HLA-B-/-、HLA-C-/-和CIITAindel/indel细胞。
30.如权利要求21-29中任一项所述的干细胞,其中所述一种或多种致耐受性因子选自HLA-G、PD-L1和CD47。
31.如权利要求21-30中任一项所述的干细胞,其中所述一种或多种致耐受性因子的受调节表达包括所述一种或多种致耐受性因子的表达增加。
32.如权利要求21-31中任一项所述的干细胞,其中将所述一种或多种致耐受性因子***到AAVS1安全港基因座中。
33.如权利要求21-32中任一项所述的干细胞,其中将HLA-G、PD-L1和CD47***到AAVS1安全港基因座中。
34.如权利要求21-33中任一项所述的干细胞,其中所述一种或多种致耐受性因子抑制免疫排斥。
35.如权利要求21-34中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞是胚胎干细胞。
36.如权利要求21-34中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞是多能干细胞。
37.如权利要求21-34中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞是低免疫原性的。
38.如权利要求21-34中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞是人干细胞。
39.如权利要求21-38中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞保留多能性。
40.如权利要求21-39中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞保留分化潜能。
41.如权利要求21-40中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞表现出T细胞反应减少。
42.如权利要求21-41中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞表现出免受NK细胞反应的保护。
43.如权利要求21-42中任一项所述的干细胞,其中所述干细胞表现出巨噬细胞吞噬减少。
44.一种干细胞,其不表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。
45.如权利要求44所述的干细胞,其中所述干细胞是HLA-A-/-、HLA-B-/-、HLA-C-/-和CIITAindel/indel细胞。
46.如权利要求44或45所述的干细胞,其中所述干细胞表达致耐受性因子HLA-G、PD-L1和CD47。
47.如权利要求46所述的干细胞,其中将所述致耐受性因子***到AAVS1安全港基因座中。
48.如权利要求46或47所述的干细胞,其中所述致耐受性因子抑制免疫排斥。
49.如权利要求44-48所述的干细胞,其中所述干细胞是胚胎干细胞。
50.如权利要求44-48所述的干细胞,其中所述干细胞是多能干细胞。
51.如权利要求44-48所述的干细胞,其中所述干细胞是低免疫原性的。
52.一种制备低免疫原性干细胞的方法,所述方法包括相对于野生型干细胞调节干细胞的一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原和一种或多种致耐受性因子的表达,从而制备所述低免疫原性干细胞。
53.如权利要求52所述的方法,其中所述一种或多种MHC-I人白细胞抗原选自HLA-A、HLA-B和HLA-C。
54.如权利要求52或53所述的方法,其中所述一种或多种MHC-I人白细胞抗原的受调节表达包括所述一种或多种MHC-I人白细胞抗原的表达减少。
55.如权利要求52-54中任一项所述的方法,其中从所述干细胞的基因组中缺失所述一种或多种MHC-I人白细胞抗原,从而调节所述一种或多种MHC-I人白细胞抗原的表达。
56.如权利要求52-55中任一项所述的方法,其中所述一种或多种MHC-II人白细胞抗原选自HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。
57.如权利要求52-56中任一项所述的方法,其中所述一种或多种MHC-II人白细胞抗原的受调节表达包括所述一种或多种MHC-II人白细胞抗原的表达减少。
58.如权利要求52-57中任一项所述的方法,其中将一种或多种***缺失引入到CIITA中,从而调节所述一种或多种MHC-II人白细胞抗原的表达。
59.如权利要求52-58中任一项所述的方法,其中所述低免疫原性干细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C。
60.如权利要求52-59中任一项所述的方法,其中所述低免疫原性干细胞是HLA-A-/-、HLA-B-/-、HLA-C-/-和CIITAindel/indel细胞。
61.如权利要求52-60中任一项所述的方法,其中所述一种或多种致耐受性因子选自HLA-G、PD-L1和CD47。
62.如权利要求52-61中任一项所述的方法,其中所述一种或多种致耐受性因子的受调节表达包括所述一种或多种致耐受性因子的表达增加。
63.如权利要求52-62中任一项所述的方法,其中将所述一种或多种致耐受性因子***到AAVS1安全港基因座中。
64.如权利要求52-63中任一项所述的方法,其中将HLA-G、PD-L1和CD47***到AAVS1安全港基因座中。
65.如权利要求52-64中任一项所述的方法,其中所述一种或多种致耐受性因子抑制免疫排斥。
66.如权利要求52-65中任一项所述的方法,其中所述低免疫原性干细胞保留多能性。
67.如权利要求52-66中任一项所述的方法,其中所述低免疫原性干细胞保留分化潜能。
68.如权利要求52-67中任一项所述的方法,其中所述低免疫原性干细胞表现出T细胞反应减少。
69.如权利要求52-68中任一项所述的方法,其中所述低免疫原性干细胞表现出免受NK细胞反应的保护。
70.如权利要求52-69中任一项所述的方法,其中所述低免疫原性干细胞表现出巨噬细胞吞噬减少。
71.如权利要求52所述的方法,其中将所述干细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:1-2的第一对核糖核酸接触,从而编辑HLA-A基因以减少或消除所述干细胞中的HLA-A表面表达和/或活性。
72.如权利要求52所述的方法,其中将所述干细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:3-4的第一对核糖核酸接触,从而编辑HLA-B基因以减少或消除所述干细胞中的HLA-B表面表达和/或活性。
73.如权利要求52所述的方法,其中将所述干细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:5-6的第一对核糖核酸接触,从而编辑HLA-C基因以减少或消除所述干细胞中的HLA-C表面表达和/或活性。
74.如权利要求52所述的方法,其中将所述干细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ ID NO:7的核糖核酸接触,从而将***缺失引入到CIITA中以减少或消除所述干细胞中的MHC-II人白细胞抗原表面表达和/或活性。
75.一种制备低免疫原性干细胞的方法,所述方法包括相对于野生型干细胞调节干细胞的一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原和一种或多种致耐受性因子的表达,从而制备所述低免疫原性干细胞,
其中将所述干细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ IDNO:1-2的第一对核糖核酸接触,从而编辑HLA-A基因以减少或消除所述干细胞中的HLA-A表面表达和/或活性,
其中将所述干细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ IDNO:3-4的第二对核糖核酸接触,从而编辑HLA-B基因以减少或消除所述干细胞中的HLA-B表面表达和/或活性,
其中将所述干细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ IDNO:5-6的第三对核糖核酸接触,从而编辑HLA-C基因以减少或消除所述干细胞中的HLA-C表面表达和/或活性,并且
其中将所述干细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列以及具有序列SEQ IDNO:7的核糖核酸接触,从而将***缺失引入到CIITA中以减少或消除所述干细胞中的MHC-II人白细胞抗原表面表达和/或活性。
76.一种将至少一种低免疫原性干细胞移植到患者中的方法,其中所述低免疫原性干细胞包含相对于野生型干细胞,一种或多种MHC-I和MHC-II人白细胞抗原和一种或多种致耐受性因子的受调节表达。
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